Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

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Developmental Biology
 

Summary

In diesem Protokoll Eindringmittel beschrifteten T. Trypanosoma wurden in durchsichtigen Zebrafischlarven injiziert und Parasiten Motilität wurde in Vivo mit Lichtblattmikroskopie Fluoreszenz beobachtet.

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Akle, V., Agudelo-Dueñas, N., Molina-Rodriguez, M. A., Kartchner, L. B., Ruth, A. M., González, J. M., et al. Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo. J. Vis. Exp. (127), e56238, doi:10.3791/56238 (2017).

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Abstract

Chagas-Krankheit ist eine parasitäre Infektion durch Trypanosomen Trypanosoma, deren Motilität nicht nur wichtig für die Lokalisierung, sondern auch für zelluläre Bindung und Invasion ist. Aktuelle Tiermodelle für die Untersuchung von T. Trypanosoma ermöglichen begrenzt Beobachtung des Parasiten in-vivo, eine Herausforderung für Verständnis Parasit Verhalten in der Anfangsphase einer Infektion beim Menschen darstellt. Diese Protozoen hat eine flagellar Bühne in Vektor und Säugetieren beherbergt, aber es gibt keine Studien beschreiben die Motilität in Vivo. Das Ziel dieses Projektes war, ein live vertebrate Zebrafisch Modell um T. Trypanosoma Motilität im Gefäßsystem zu bewerten. Transparente Zebrafisch, die Larven mit Gewebekulturen injiziert wurden Trypomastigotes beschriftet und mit leichten Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM), eine nicht-invasive Methode zur Visualisierung von lebenden Organismen mit hoher optischer Auflösung beobachtet. Die Parasiten könnte für längere Zeit aufgrund dieser Technik relativ geringes Risiko von lichtbedingten im Vergleich zu konfokale visualisiert oder Epifluoreszenz Mikroskopie. T. Trypanosoma Parasiten beobachtet Reisen in das zirkulierende System live Zebrafisch in unterschiedlich großen Blutgefäßen und das Eigelb. Sie konnte auch den Dottersack-Wand und der ventrikulären Ventil trotz der starken Kräfte verbunden mit Herz Kontraktionen verbunden gesehen werden. LSFM von T. Trypanosoma-beimpften Zebrafischlarven ist eine wertvolle Methode, kann verwendet werden, um Parasiten im Umlauf zu visualisieren und auswerten ihrer Tropismus Migrationsmuster und Motilität im dynamischen Umfeld des Herz-Kreislauf-Systems von einem lebenden Tier.

Introduction

Chagas-Krankheit wird durch die Protozoen-Parasiten verursacht T. Trypanosoma. T. Trypanosomasind etwa 6 bis 7 Millionen Menschen weltweit infiziert. Die Krankheit ist vor allem in Lateinamerika übertragen, sondern wurde in den Vereinigten Staaten, Kanada und vielen europäischen sowie einigen westpazifischen Ländern, vor allem aufgrund der Migration von infizierten Personen1berichtet. Chagas ist weitgehend vektorübertragene und übertragen auf den Menschen durch Kontakt mit dem Kot von Hematophagic Insekten in der Unterfamilie Triatominae, allgemein bekannt als "Kissing Bugs". T. Trypanosoma kann jedoch auch über Bluttransfusionen, vertikale Übertragung von Mutter auf Kind oder Einnahme von kontaminierten mit Parasiten2übertragen werden. Der akuten Phase, die der Infektion ist vor allem asymptomatisch oder konstitutiv symptomatisch und dauert 6 bis 8 Wochen, nach denen Engagement des immunen Systems steuert Parasit Last, aber die Infektion3nicht vollständig beseitigt. Die meisten Menschen dann eintreten eine chronische asymptomatische Phase; jedoch entwickeln fast 30 % der Patienten eine symptomatische chronische Phase, in der das kardiale System und weniger häufig das Verdauungs- und Nervensystem kompromittierten4sind. Dieses Szenario stellt eine Herausforderung für Behandlung und Kontrolle, da gibt es keine Impfstoffe zur Verfügung, und es nur zwei wirksame Medikamente zur Chagas gibt: Benznidazol und Nifurtimox. Beide Behandlungen erfordern längere Verwaltung und möglicherweise schwere Nebenwirkungen2.

Erhöht das Verständnis des Verhaltens von T. Trypanosoma ist Verhalten in Vivo Schlüssel zur Bestimmung von parasitären Migration, zelluläre Anlage und Invasion in den Host; ein Mangel an in Vivo Modellen schränkt die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. In-vitro- Studien von T. Trypanosoma Infektion haben gezeigt, dass die Beweglichkeit der Trypomastigotes ist wichtig für die Bindung an Host Zellmembranen und anschließende zellulären Invasion5. Energie Erschöpfung in Trypomastigotes in Kokultur mit einer anfälligen Zelllinie hat sich gezeigt, zur Verringerung der zellulären Invasion6. Interessanterweise ist in Trypanosomatids, flagellar Bewegung auch als Steuerhinterziehung Mechanismus gegen Parasiten-spezifische Antikörper7gekennzeichnet.

Flagellar Motilität wurde ausgiebig studiert in Vitro in Trypanosomen Trypanosomen, eine eng verwandte Parasiten, die afrikanische Trypanosomiasis8verursacht. In-vitro- Studien über die Motilität des diese Trypanosomen haben gezeigt, dass Simulation der Bedingungen von Blut oder Körperflüssigkeiten, wie Viskosität und das Vorhandensein von Hindernissen, die Vertreterin der Blutkörperchen, wichtig für Parasiten Vorwärtsbewegung9 . Als der wurde es nicht möglich, die Bewegung des Parasiten in den Blutkreislauf in Vivozu visualisieren noch.

Zebrafisch-Larven sind ein leistungsfähiges Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen in Vivozu studieren. Sie sind klein, kostengünstig und relativ leicht zu erziehen, im Vergleich mit anderen etablierten vertebrate Modelle für die Chagas-Krankheit. Zebrafisch angeborenen und der adaptiven Immunsystem ähnlich wie beim Menschen, aber ihre adaptiven Immunsystems beginnt in 4 Tage Post Düngung (Dpf) zu entwickeln und ist nicht reif für ein weiteres mehrere Wochen10. Während der frühen Entwicklung wenn nur Makrophagen vorhanden sind, gibt es ein großes Fenster für das Studium der Parasit Verhalten ohne sofortige immun Störung10. Allerdings liegt der größte Vorteil der Verwendung von Zebrafischlarven als Wirbeltier Modell für das Studium Erreger Verhalten in ihrer optischen Transparenz macht sie zugänglich für mikroskopische screening und imaging-11. Darüber hinaus gibt es mehrere Tools, Fisch Genetik zu manipulieren. Beispielsweise ist Casper Belastung einer mutierten Zebrafisch mit keine Pigmentierung, wodurch das Tier völlig transparent und nützlich für die Visualisierung der einzelnen Organe und für Echtzeitverfolgung von injizierten Zellen12.

Eine wichtige Einschränkung der longitudinalen Beobachtung schnell bewegenden Parasiten in live Zebrafisch mit konfokale oder Epifluoreszenz Mikroskopie liegt in der Unmöglichkeit der Bildgebung bei hohen Anschaffungs-Geschwindigkeiten und großen Eindringtiefen mit guter Bildqualität und niedrigem Risiko von lichtbedingten. Leichte Blech-Fluoreszenz-Micsroscopy (LSFM) ist ein aufstrebenden bildgebendes Verfahren, das überwindet diese Einschränkungen um diese Beobachtungen zu ermöglichen. Mit ein Ziel erkennen, Fluoreszenz und ein zweites orthogonal Beleuchtung-Ziel, das nur die Brennebene des Ziels Erkennung leuchtet, ist es möglich, hochauflösende optische Teile wie in einem confocal Mikroskop, aber mit zu erhalten deutlich reduzierte lichtbedingten, auch bezüglich Epifluoreszenz Mikroskopie13. Die hier verwendete LSFM-Technik nennt man einzelne Flugzeug Illumination Microscopy (SPIM), in denen eine dünne Folie aus Licht leuchtet auf eine Ebene innerhalb der Zebrafischlarven.

Das Ziel dieser Methodik ist, Larven Zebrafisch als eine tragfähige nicht-Infektionsmodell für das Verständnis von T. Trypanosoma Motilität und ähnliches Verhalten in Vivozu etablieren. Um dies zu erreichen, wir injiziert transparent Zebrafischlarven mit Gewebekulturen beschrifteten Trypomastigotes, zellulären Form verursacht die Infektion des Menschen, und die Bewegung der T. Trypanosoma in den Kreislauf der Zebrafisch identifiziert verwenden LSFM.

Protocol

die folgenden Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Los Andes Universität (CICUAL) genehmigt. Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Leitlinien sollten strikt befolgt werden, um Verunreinigungen mit dem Erreger zu verhindern T. Trypanosoma.

Hinweis: Tier Pflege und Wartung: Casper Zebrafisch, eine gentechnisch veränderte Sorte Zebrafisch (Danio rerio) dient in diesem Protokoll aufgrund ihrer wertvollen optischen Transparenz in allen Entwicklungsstadien. Fische sind mit optimalen Bedingungen für die Arten 14, in einem 14 h Licht-10 h dunklen Zyklus, bei 28 ± 1 ° C bei einem pH-Wert (7,0-7,4) gesteuert Multi-Tank rezirkulierenden Wasser Pflegesystem manipuliert. Tiere sind mit live Artemia (Artemia Salina) zweimal täglich gefüttert und mit der Aufzucht Lebensmittel angereichert. Alle Protokolle von CICUAL an der Universidad de Los Andes (C.FUA_14-017) genehmigt wurden.

1. Vorbereitung der Ei Wasser

  1. Prepare 0,6 g/L Aquarium Salz in umgekehrte Osmose (RO) oder deionisiertes Wasser (DI) und 0,01 mg/L Methylenblau der Projektmappe hinzufügen.
    Hinweis: Die gemessene Leitfähigkeit von 400-500 µS/cm und der pH-Wert auf 7.2-7.9 sollte. Um den pH-Wert zu senken, das Ei Wasser für ein paar Stunden belüften.

2. Vorbereitung der Tricaine-Lager-Lösung

  1. Prepare 0,4 % Tricaine Stammlösung durch Auflösen von 400 mg Tricaine (MS-222) 97,9 mL destilliertem Wasser (DdH 2 O). Nachdem das Pulver komplett aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 2,1 mL 1M Tris (pH 9,0) und die Lösung im Kühlschrank.

3. Vorbereitung von 1,0 % niedriger Schmelzpunkt Agarose

  1. lösen sich die niedrig schmelzenden Punkt Agarose-Pulver in Ei Wasser, eine Endkonzentration von 1,0 %. Erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte unter ständigen rühren bis die Agarose-Lösung homogen erscheint.
  2. Speichern die Aliquote bei 4 ° C nicht länger als eine Woche.

4. Paarung-Assay und Embryo Sammlung

  1. drei Tage vor Injektionen richten Sie Verpaarungen mit gesunden Paaren von männlichen und weiblichen Fisch für die Zucht von Panzern. Anreicherung mit Glasmurmeln und künstlichen Pflanzen verbessert laichen. Verpaarungen sollten im Laufe des Nachmittags einrichten und über Nacht gelassen.
  2. Am nächsten Morgen sammeln die erzeugten Eiern durch Entleerung des Tanks durch ein Sieb passieren und die Eiern mit dem Ei Wasser waschen. Entfernen Sie alle Eizellen durch Umkehrung der Sieb und gießt Ei Wasser durch das Sieb in eine Petrischale. Um die Embryonen gesund zu halten, ihr Wasser zu reinigen, indem Trümmer und Tote Embryos mit einem Kunststoff Transferpipette.
  3. Transfer der Embryonen zum Inkubator bei einer stabilen Temperatur von 28,5 ° C erlauben die Entwicklung der Embryonen nach dem Zebrafisch staging Standards 15. Untersuchen Sie die Embryonen zwei Mal am Tag, und entsorgen Sie therapeu Eiern um die Kupplung gesund zu halten.

5. Embryo-Dechorionation

Hinweis: Diese Vorgehensweise ist erforderlich, wenn die Embryonen nicht zum Zeitpunkt der Injektion geschlüpft sind. In diesem Verfahren " Larven " sind Tiere aus ihren Chorion ab 48 h post an Düngung (hpf).

  1. Am Tag des Experiments, legen Sie die Petrischale mit den gesunden Embryonen unter einen sezierenden Stereoskop.
  2. Entgegengesetzte Enden der Chorion mit zwei scharfen Pinzetten (Dumont Nr. 5) greifen und vorsichtig reißen und ziehen das Chorion öffnen. Etwa 5-6 Larven werden zu einem Zeitpunkt injiziert, und in der Regel 3-4 abgebildet.
  3. Des Chorions aus dem Wasser mit einer Transferpipette nehmen.

6. Vorbereitung von Injektionsmaterial

  1. bereiten 1.0 mm Nadeln dünnwandige Glaskapillaren mit einer Mikropipette Puller Gerät mit den folgenden Einstellungen: 2 leichte Gewichte 1 schweres Gewicht, 2 mm Top Pull + 5 mm bottom Pull, 75,9 ° C (Schritt 1) + () 78,2 ° C (Schritt 2). Speichern Sie die Nadeln in einer Petrischale auf einem Streifen Knetmasse. Die ideale Nadel hätte eine schmale Spitze, als T. Trypanosoma ca. 20 x 1-3 µm zu messen und wird durch die Nadel leicht passieren. Die Länge der Spitze kann variieren: ein längerer Tipp ist nützlich, um die tiefere Strukturen zu erreichen, aber eine kürzere Spitze steifere Injektion für den Benutzer einfacher machen werden.
    Hinweis: Die Nadel Spitzengröße hängt von der Temperatur verwendet: eine höhere Temperatur für Schritt2 ergibt sich eine längere und feiner Spitze.
  2. Bereiten Sie eine 1,5 % Agarose-Lösung in DdH 2 O und gießen Sie sie in einer 10 cm Petrischale. Deckung eine Tiefe von ca. 1,0 cm.
  3. Legen Sie eine vorgefertigte Mikroinjektion Form über die Agarose und festigen lassen.
  4. Heben die vorgefertigten Mikroinjektion Form heraus und fügen Sie Ei Wasser für die Lagerung bei 4 ° C. Dadurch wird verhindert, dass die Agarose austrocknen.
  5. Add Ei Wasser Tricaine-Stammlösung, eine Endkonzentration von 150 mg/L. Store bei 4 ° c

7. Zellkultur für Parasiten Wachstum

  1. Parasiten in einer menschlichen Astrozytom-Zelllinie (CRL-1718) mit der Methode von Vargas-Zambrano Et Al. beschrieben gepflegt werden 16
  2. beginnen die Kultur der menschlichen Zellen in ein T25 Kulturflaschen (Fläche = 25 cm 2) bei einer Dichte von 2 x 10 5 oder 4 x 10 5 Zellen in 4 mL RPMI-1640 Medium mit 10 % der fetalen Kälberserum (FCS), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 4,5 g/L Glukose 10 mM HEPES, 1 mM Pyruvat und 1 % Penicillin-Streptomycin (genannt " komplette Medien "). Inkubieren Astrozytom Kulturen bei 37 ° C in einer 5 % CO 2 Umgebung.
  3. Nach einer Monoschicht konfluierende lösen die Zellen mit 2 mL von 0,25 % des Trypsin-EDTA durch Inkubation sie für 3 min bei 37 ° C. visuell überprüfen Zellen für Ablösung, und blockieren die Trypsin-Lösung mit 3 mL RPMI-1640 mit 10 % FCS in der 15 mL Tube.
  4. Zentrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 1.350 x g.
  5. Waschen die daraus resultierenden zellulare Pellet in DMEM Medium in einem 15-mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g bei 22 ° c
  6. Zählen die Zellen manuell in einer Neubauer Kammer und suchen Sie nach Rentabilität in einem Lichtmikroskop bei 40 X Vergrößerung.
  7. Sanft wieder ausgesetzt die zelluläre pellet in 4 mL komplette Medien und neuen Zellkulturen mit 2 x 10 5 Zellen pro T25 Kultur Kolben erstellen.

8. T. Trypanosoma Kultur und Beschriftung

  1. Parasiten sind eine Sorte, die ursprünglich von einem infizierten Menschen erhalten und zeichnet sich als T. Trypanosoma DA Belastung (MHOM/CO/01/DA), Genotyp diskrete Eingabe Einheit (DTU) TcI 16. Nach 3 oder 4 Tage der Kultivierung, erfassen die bewegenden Parasiten von den menschlichen Astrozytom Zelle Kultur überstand und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g. verwerfen das Medium.
    Hinweis: Parasiten im kompletten Medium eignet sich für die Kultur wieder im Verhältnis 1:1 mit Astrozytom Zellen in T25 Kulturflaschen.
  2. Vorsichtig wieder auszusetzen das Pellet in 10 mL sterile 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 % FCS und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g.
  3. Den Überstand verwerfen und neu in 1 mL PBS auszusetzen. 10 µL für die Zählung der freischwimmenden Parasiten in einer Neubauer-Kammer nehmen.
  4. Nehmen den Rest neu suspendierten Parasiten (990 µL) und fügen Sie 1 µL Carboxyfluorescein Diacetat SuccinimiDyl Ester (CFSE), Endkonzentration 5.0 µM. für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Sollte die CFSE-Lager bei 5 mM regelmÄÑig und gepflegt bei-20 ° c
  5. Pellet-Parasiten (1.350 x g, 5 min). Der Parasit Pellet durch Streichen der Röhre zu rekonstruieren und in 10 mL 1 X PBS-0.1% FCS von einem anschließenden Spin (1.350 x g, 5 min gefolgt) waschen.
  6. Überstand verwerfen und sanft wieder auszusetzen beschrifteten Parasit Pellet mit 1 X PBS-Puffer mit dem entsprechenden Volumen erhalten eine Endkonzentration von etwa 10-20 Parasiten/nL Injektionslösung.
  7. Verwenden Sie ein kleines Volumen (∼ 10 µL, ca. 1 x 10-4 -2 x 10-4-Parasiten) von Trypomastigotes, Rentabilität und Kennzeichnung zu beurteilen. Ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop einsetzbar für direkte Visualisierung der Parasiten. Überprüfen Sie in der übertragenen Lichtmodus, dass die Parasiten bewegen. Im Fluoreszenz-Modus mithilfe des Filters Fluorescein erfolgt (FITC) Parasit Kennzeichnung bewerten.

9. Injektion von Zebrafischlarven

    1. Parasit laden
    2. nehmen 10 µL des Parasiten aus der Wiederfreisetzung (100 µL) und laden sie in die verschlossenen Glas Nadeln mit einer Pipettenspitze 10 µL Microloader.
    3. Glas Nadel in den Nadelhalter der Mikromanipulator, verwenden ein Magnetstativ, und neben das Stereoskop.
    4. Mit feinen Pinzetten unter das Stereoskop, schneiden Sie die Nadel ein stumpfes offen erstellen beenden und messen die Tropfengröße um ein Injektionsvolumen von 1 zu erhalten (Dies entspricht einem Wulst-Durchmesser von 0,12 0,13 mm gemessen in Mineralöl 17) nL. Ein längerer Tipp wird bevorzugt, so dass die Nadel Strukturen erreichen kann tief in die Fische ohne das Gewebe zu schädigen. In diesem Protokoll eine stumpfe Nadel verwendet, sondern eine abgeschrägte Nadel kann auch verwendet werden.
  1. Montage
    1. Larven von 48 zu betäuben hpf, mit 150 mg/L Tricaine. Prüfung, die sie nicht ansprechen, berühren, sondern sorgen dafür, dass das Herz schlägt.
    2. Legen Sie die Larven in die Mikroinjektion Agarose Schimmel in Seitenlage.
    3. Legen Sie den Nadelhalter neben das Stereoskop und dem Mikromanipulator so einstellen, dass die Spitze der Nadel in der Mitte des Sichtfeldes ist. Verschieben der Petrischale in Schritten 6.2 - 6.4 vorbereitet, so dass die Larven Eigelb in der Nähe der Spitze der Nadel ist. Überprüfen Sie den Zustand der Larve um sicherzustellen, dass das Herz schlagen weiter.
    4. Legen Sie die Microinjector-Werte wie folgt: Injektion Druck 9,6 Pfund pro Zoll (Psi), Nachdruck: 20 Psi; 100 ms-Reihe von Anspritzung; Periodenwert von 1,9 (entspricht 10,9 ms). Das Laufwerk der Injektion sollte zwischen 1-3 nL, mit ca. 10-20 Parasiten/nL.

10. Injektion des Parasiten

  1. Spritzen die Fische in der Superior-vorderen Teil das Eigelb auf den Kanal von Cuvier. Dieser Schritt sollte geübt werden, um Tiere überleben nach der Injektion zu gewährleisten. Es dauert ca. 10 min. 5-6 Larven erfolgreich Spritzen.
  2. Als ein Steuerelement Spritzen 1-2 Larven mit dem gleichen Fahrzeug Volumen (1 X PBS).
  3. Übertragen die Larve auf frisches Ei Wasser sofort.

11. LSFM Montage der injiziert Larven

  1. übertragen die Larve mit Parasiten zu einer leeren Petrischale injiziert und entfernen Sie vorsichtig das umgebende Wasser eine Plastik-Pipette mit saugfähigem Papier. Fügen Sie sofort 100 µL vorgewärmten 1,0 % niedrig schmelzenden Punkt Agarose (siehe Schritt 3 Vorbereitung Agarose) um die Larve zu decken. Sicherzustellen, dass die Agarose nicht über 40 ° c
  2. Fügen Sie einen geraden Draht im Inneren ein 1,0 mm Glas Kapillare und verwenden Sie es als ein Kolben um zu saugen bis die Larve in einer senkrechten Position. Stellen Sie sicher, eine kleine Menge Agarose über die Larve zu verlassen. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt vor der Belichtung der Larve (Dies erfordert wenige Minuten). Falls erforderlich, push-out überschüssige Agarose unterhalb der Larve und schneiden Sie es aus
  3. Die Kapillare in das Mikroskop Probenhalter und schieben Sie das Ende mit der Larve, bis es frei von der Kapillare hängt. Die Probenkammer mit Tricaine Lösung (150 mg/L) und die Temperatur bei 28 gefüllt werden ° C.
  4. Positionieren die Larve vor der Schüler von der Erkennung Ziel mit einem XYZ-Mikromanipulator-System. Verwenden Sie für Drehungen um die Hochachse eine Rotationstisch. Positionierung der Larve im übertragenen Lichtmodus larvale Strukturen identifizieren getan werden.

12. LSFM Imaging von injiziert Parasiten

  1. Veränderung zu Fluoreszenz-Modus und stellen Sie die Beleuchtungsstärke als auch die Belichtungszeit verringern lichtbedingten und Zeitauflösung zu optimieren. Für diese besondere Experimente wir eine Leistung von 2,8 bis 3,0 mW für das Beispiel verwendet und jedes Bild für 200 ms mit einer Kamera mit 6,45 µm Pixel und ~ 70 % Quantenausbeute bei der Erkennung Wellenlängen ausgesetzt. Diese Einstellungen sollten ausreichend belichtete Aufnahmen bei ca. 5 Bildern/s. Achten Sie darauf, ein Ziel mit der höchsten möglichen numerischen Apertur verwenden führen.
  2. Starten Sie eine Videoaufnahme der Region of Interest (ROI). In unserem Fall sind Parasiten an Ventilen und frei beweglichen rund um den Bereich des Herzens beobachtet. Es wird empfohlen, eine Video von einer Ebene im Laufe der Zeit zu nehmen, oder das Mikromanipulator oder Piezo-Galvo-System verwenden, um verschiedene Ebenen zu konzentrieren, während der Parasit bewegt.
    Hinweis: Dieses Verfahren eignet sich für kurze Erfassungszeiten von bis zu 2 h. Für langfristige Anschaffung, die Larven montiert werden sollte mit alternativen Methoden 20.

13. Bildverarbeitung und Analyse der erworbenen Daten

Hinweis: Bildverarbeitung erfolgte auf einem Personal Computer mit einem 2,90 GHz Prozessor, 8,00 GB Arbeitsspeicher und eine Grafikkarte mit 1,00 GB Speicher.

  1. Öffnen die erworbenen Dataset in der Bildverarbeitungs-Software der Wahl. Die offene Software Fidschi empfiehlt sich für LSFM Datenverarbeitung und Analyse 21.
  2. In der Bildanalyse-Software passen Sie Helligkeit und Kontrast Ebenen, um die Bilder zu optimieren.
    Hinweis: Keine festen Parameter sind in diesem Fall verwendet, aber die Auswahl der " Auto " Option kann hilfreich sein, eine erste Erweiterung zu erhalten.
  3. Wählen Sie den ROI.
    Hinweis: Für die Verfolgung von einzelnen Parasiten, Fidschi hat sowohl manuelle als auch automatische Tracking-Plugins zur Verfügung.

14. Erholt sich abgebildet Larven

  1. entfernen die Larve sorgfältig aus dem Agarose mit feinen Zangen und ein Haar-Loop-Werkzeug. Die Fische wieder auf frisches Ei Wasser und suchen Sie nach Wiederherstellung übertragen, nach 15 min. zurück die Larve an Inkubator an 28 ± 0,5 ° c
  2. Fahren Sie alternativ mit der abgebildeten Larven mit einer Überdosis Tricaine einschläfern. Dann stellen die Larven in einer Lösung von Natriumhypochlorit (6,15 % NaClO) für 5 min um den Parasiten zu töten. Nach der Einrichtung entsorgen ' s Standardprotokolle.

Representative Results

Optimale Bedingungen für die Injektion:

Gruppen von Zebrafischlarven wurden in 24, 48, 72, 96 und 120 injiziert hpf, an verschiedenen anatomischen Standorten und ihr Überleben war jeden Tag für 5 Tage untersucht. Nach 5 Tagen-Injektion Post, Embryonen injiziert um 24 Uhr hpf hatte 6,25 % (2/32) überleben, während 95 % (38/40) der Larven an 48 injiziert hpf überlebt. Als Kontrolle wurden Larven mit 1 X PBS als Vehikel injiziert. Es gab keine Unterschiede im Überleben zwischen Fahrzeug injiziert und Parasiten injiziert Larven, zeigt keine parasitären abhängigen Auswirkungen auf die Überlebensrate der Fische (p = 0,08). Larven, die zwischen 72-120 hpf injiziert hatte vergleichbare Überlebensraten für 48 hpf injiziert Larven bei konstanter Injektionsvolumen. Für alle hier vorgestellten Verfahren dienten 48 hpf-Larven durch ihre einfache Manipulation und Organe und leicht durchlässigen Haut ohne offensichtlich Schaden nach Injektion entwickelt haben.

Larven an 48 injiziert hpf waren in den Perikardialraum injiziert, tail, Muskel, Hinterhirn Ventrikel Gleichheitspartei Vesikel, Chorda und Leitung des Cuvier in dem Dottersack. Es gab keine Unterschiede für das Überleben der Larven an unterschiedlichen anatomischen Standorten injiziert. Allerdings war die schnellste und einfachste Region zu injizieren, dass das Rohr von Cuvier befindet sich im vorderen Teil der Dottersack (Abbildung 1, Film 1). Injektionen an diesem Standort erlaubt die Einführung von höheren Volumen mit einem geringeren Risiko von Verletzungen zu lebenswichtigen Strukturen. Darüber hinaus ist diese Region zwischen 24-72 hpf, einen optimalen Standort zu entwickelnden Gefäßsystem und Herz11direkt zugreifen.

Parasit-Visualisierung mit LSFM:

Im Zebrafischlarven mit LSFM aufgrund ihrer CFSE-Fluoreszenzsignal und die optische Transparenz der die Larven wurden innerhalb von 8-10 min nach Injektion von T. Trypanosoma in den Kanal von Cuvier Parasiten identifiziert. Nach der Inokulation wurden Parasiten beobachtet, dass entweder Mauern um das Herz-Kreislauf-System oder in die Richtung des Blutflusses (Abbildung 2, Abbildung 3) eingehalten. Wenn ein Parasit an einer kardialen Struktur wie der ventrikulären Ventil bleibt schwingt es mit Herz Kontraktionen, darauf hinweist, dass die molekularen Mechanismen für die Einhaltung des Parasiten in unserem vertebrate Modell (Film 2, Film 3 wirksam sein könnte Ergänzende Film 1). T. Trypanosoma eingehalten werden auch die Wände des larvalen Dottersack ( Abbildung 2, Movie 2), eine Struktur, die später resorbiert werden und werden Sie Teil der Zebrafisch Darm22. Dies könnte ähnlich wie was passiert während der Phase der chronischen Krankheit bei infizierten Menschen, wo sind Parasiten in Kardiomyozyten und in der Verdauung Nervensystem23,24gefunden werden. Wenn nicht angeschlossen, trieb die Parasiten durch den Blutfluss in die gleiche Richtung wie die Erythrozyten ( Abbildung 3, Movie 4). Parasiten in verschiedenen großen Gefäßen der Fische beobachtet werden konnte, aber wurden häufiger in den Perikardialraum und in der angrenzenden Eigelb-Region, die Durchblutung ( Abbildung 2, Abbildung 3, ergänzende Film 2) enthalten.

10 min Post Injektion war es schwieriger, vor Ort einzelne Formen des Parasiten aufgrund ihrer Verbreitung auf das Gefäßsystem und die Unfähigkeit, schnell Bildschirm verschiedene anatomische Standorte der Fische durch eine eingeschränkte Sichtfeld LSFM (bei 40 X Vergrößerung ). Nach 24 Stunden post Injection (Hpi), das CFSE-Signal beginnt in der Region in der Nähe von den Entwicklungsländern Darm (ergänzende Abbildung 1) ansammeln.

Figure 1
Abbildung 1: Optimalen Injektionsstelle. (A) Bild der Larve 48 hpf zeigt der optimalen Injektionsstelle auf den Kanal von Cuvier (gelber Pfeil) mit einem regelmäßigen Stereoskop. (B) Magnified anzeigen Box in eine zeigt den Kanal von Cuvier (gelber Pfeil). Maßstabsleiste = 200 µm (A), 50 µm (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: LSFM Bilder eines statischen Parasiten in 48 hpf Larve. T. Trypanosoma Parasit (gelber Pfeil) bleibt an den Wänden der Dottersack, während die Zeitraffer-Sequenz eingehalten (7,2 s, 17,2 s und 27,2 s), ca ~ 15 min nach der Injektion von Parasiten. Keine Änderung der Stellung des Parasiten wird beobachtet, während eines Erwerb mindestens 30 s. a, Atrium; V, Ventrikel. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flugbahn eines Parasiten Reisen in den Perikardialraum mit LSFM. T. Trypanosoma Parasiten kann beim driften in den Perikardialraum (PS), nach der Richtung des Blutflusses (Track in rot dargestellt) nachverfolgt werden etwa ~ 15 min nach der Injektion von Parasiten. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Movie 1: Blutzirkulation Tal von Eigelb in eine Larve 48 hpf. Film von einer Larve 48 hpf zeigt die Blut-Zirkulation-Tal oder Kanal von Cuvier mit einem regelmäßigen Stereoskop. Verschiedene Regionen konzentrieren während des Videos, roten Blutkörperchen zirkulieren in den Kanal zu zeigen. Gelber Pfeil zeigt die optimalen Injektionsstelle. Film aufgenommen wurde ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Movie 2
Film 2: T. Trypanosoma Parasiten an Wände von dem Dottersack befestigt. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigen, dass T. Trypanosoma Parasiten nach Parasiten Injektion der Dottersack ca 10-15 min eingehalten bleiben. Keine Änderung in der Position des Parasiten beobachtet während eines Erwerb mindestens 30 s. a, Atrium; V, Ventrikel. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Movie 3
Film 3: T. Trypanosoma Parasiten an die Wände des Herzens befestigt. LSFM Film von einer Larve 48 zeigt, dass T. Trypanosoma Parasiten Dreijahres hpfn an der Herz-Kreislauf-Wand, trotz starken Herzen Kontraktionen eingehalten ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. Erythrozyten können als schwarze abgerundete Schatten beobachtet werden. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Movie 4
Movie 4: Parasiten bewegt sich in den Perikardialraum. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigt T. Trypanosoma Parasiten treiben in den Perikardialraum. Zwei Parasiten können zu verschiedenen Zeitpunkten (ID 1, im roten Kreis und ID 2 im gelben Kreis), zurückverfolgt werden, nach einem ähnlichen Flugbahn. Der Film verzeichnete ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung1: Akkumulation von CFSE-Fluoreszenzsignal im Eigelb. Stereoskop-Bildern der Wildtyp Larve injiziert um 48 hpf auf den Kanal von Cuvier. CFSE-Fluoreszenzsignal sammelt sich nach und nach in das Eigelb nach zwei Tagen-Injektion (48 Hpi Post). Maßstabsleiste = 500 µm. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Film 1: Parasiten an Wänden und Ventile des Kreislaufsystems befestigt. Stereoskop Zeit Reihe Bilder der Wildtyp Larve injiziert um 48 hpf. Bilder werden in 0,2 s Abständen Erfassung T. Trypanosoma Parasiten bewegen im Gleichtakt mit Kontraktionen des Herzmuskels bei ventrikulären Valve aufgenommen. Film war ca. 30 min nach der Injektion der Parasit aufgezeichnet. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Ergänzende Movie 2: Bewegung und eingehalten Parasiten in der periventrikulären Raum und Eigelb. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigt T. Trypanosoma Parasiten driften oder den Perikardialraum oder das Eigelb eingehalten. Übertragene Licht Blick beobachtet für die ersten 5 s. Die Fluoreszenz-Ansicht wurde vom 5.2-25,8 s beobachtet. Der Film verzeichnete ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Discussion

Diese Studie zeigt die Vorteile der Zebrafisch als Tiermodell für Erreger Verhalten in Vivozu studieren. Insbesondere diese Studie schlägt vor, eine Methode, um den Erreger Trypanosoma T. in seiner natürlichen Umgebung zu visualisieren: hematic Zirkulation. Die Umgebung des Kreislauf Mikroumgebung in Fisch ist vergleichbar mit der von Säugetieren und Trypanosomatids Mechanismen für Reisen, das Immunsystem auszuweichen und Anfügen an Zellen für eine Infektion in diesem Umfeld25entwickelt haben. Dieses Protokoll bietet eine Beschreibung der ein optimales Verfahren zur Kultur der T. Trypanosoma in einer menschlichen Zelllinie und anschließende Isolierung von flagellar Formulare für fluoreszierende Kennzeichnung. Es zeigt dann die passenden Einstellungen für erfolgreiche Injektion der Parasiten in durchsichtigen Zebrafisch für später Montage und Visualisierung mit LSFM. Dieses Protokoll bietet Anregungen für die effiziente und effektive in-Vivo Bildgebung der Parasit Lage und Bewegung im Umlauf mit LSFM.

Die Geissel der Trypanosomen ergibt sich aus seiner hinteren Region, fließt aus dem Zellkörper und hängt frei in den vorderen Teil des Organismus26. T. Trypanosoma treibt sich durch winken die Geissel vor den Körper, der der Parasit ganzen Körper schaukelt. Flagellar Bewegung ist nicht nur unverzichtbar für Parasiten Motilität, wie im Fall von T. Trypanosomen27 (der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis), aber es ist auch für zelluläre Infektion verwendet, wie in T. Trypanosoma5 nachgewiesen ,28. Zebrafisch sind, zwar nicht der natürliche Wirt für T. Trypanosomakann der Parasit Motilität in ein sich entwickelndes Kreislaufsystem mit den Protokollen beschrieben hier studiert werden. Darüber hinaus gibt es Trypanosomen-Arten, die infizieren Cypriniden, die Klasse der Zebrafisch, z. B. T. Carassii und T. Borreli25. Dieser Parasit Arten könnte verwendet werden, um in Echtzeit die Bewegungen und Befestigung Mechanismen von diesen Trypanosomatids zu studieren; solche Studien können Einblick in den Säugetier-Zelle Infektionsprozess verleihen.

In dieser Studie injiziert bewegliche T. Trypanosoma Parasiten waren, beobachteten Reisen durch den Kreislauf der beimpften Fisch, bewegen zusammen mit undurchsichtigen Erythrozyten und Strukturen in den Wänden des Herz-Kreislauf-System an. Wir verwendeten eine selbst gebaute LSFM mit 10 X achromatisch lange Arbeitsabstand Luft Ziel (17,6 mm) für die Beleuchtung-Arm mit einer numerischen Apertur von 0,25. Eine 40 X apochromatische Wasser eintauchen Ziel mit einer numerischen Apertur von 0,8 und einem Arbeitsabstand von 3,5 mm wurde für die Erkennung Arm verwendet. Die Erkennung Ziel war in die Probenkammer vertieft, während der Beleuchtung Ziel außerhalb der Kammer war. Ein Hafen in der Kammer mit einem Deckgläschen versiegelt und optische Kleber für die Beleuchtung-Strahl, den Plenarsaal betreten erlaubt, Lorenzo Et Al. dargestellt 18 für Beleuchtung, verwendeten wir ein 50 mW DPSS Laser bei 488 nm deren Kraft wurde durch einen akusto optischen durchstimmbare Filter moduliert. Der Erkennung Pfad verwendet Filter kompatibel mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) oder FITC. Ein leichtes Blatt Mikroskop mit einer Kapillare Probenhalter (idealerweise mit automatischen Drehung) und Temperierung von die Probenkammer ausgestattet sollte für diese Anwendung geeignet. Das Mikroskop sollte ausgerichtet und kalibriert gemäß den Anweisungen des Herstellers oder des Benutzers standard Laborprotokolle vor Erwerb, wenn nötig. In diesem Protokoll gesteuert wir das Mikroskop mit der SPIM Software19.

Es ist wichtig zu beachten, dass in der Zirkulation der Zebrafisch, parasitäre Larven Anlage wirksam ist. In der Kardinal Ader blieb Parasiten beigefügten für bis zu mehreren Minuten; im Herzen hielt sie an Ventilen und Wände, oszillierende mit Herz Kontraktionen. Weitere Studien zu bleiben, um aufzuklären, ob T. Trypanosoma interagiert mit der fließenden Erythrozyten, die in die Richtung des Blutflusses zu treiben. In-vitro- Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein von festen Strukturen (z.B. Blutzellen) oder erhöhte Viskosität der Flüssigkeit, Blut in Vitrozu imitieren, hat erhebliche Auswirkungen auf die Beweglichkeit und Geschwindigkeit des Parasiten 9.

Es gibt viele Fragen über den Verlauf der Infektion von T. Trypanosoma beim Menschen nach Amastigoten phagocytic Zellen, die ursprünglich infizierten Zelle Typ29entkommen. Zum Beispiel, wie kommen sie zu ihren Zielorganen? Was sind die Mechanismen für Tropismus für die bevorzugte Organe, wie Herz-Kreislauf, Magen-Darm und zentralen Nervensystem? In dieser Studie wurden die Parasiten interessanterweise zunächst im Herzen abgebildet, weil es die höchste Dichte an Parasiten wurde. Das CFSE-Signal gesammelt jedoch anschließend 7 Tage Post Injektion in den Entwicklungsländern Darm. Obwohl die Anatomie der Fische und Säugetiere unterscheidet, zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine Form der Tropismus, da es beobachtet wurde, dass Parasiten Tropismus gegenüber bekannten bevorzugte Zielorgane organismal Unterschiedlichkeit ausgestellt. Eine erhebliche Einschränkung dieser Studie betrifft die Temperatur in den Experimenten verwendet. Zebrafisch-Larven sollten während des gesamten Verfahrens rund 28 °C gehalten werden. Wenn diese Temperatur ähnlich dem Vektor-Host (Insekten der Unterfamilie Triatominae) sein mag, ist es ganz anders als die warmblütigen Säugetiere, die die endgültige Gastgeber (etwa 37 ° C) bilden. T. Trypanosoma ist bekannt, dass flagellar Wohnformen in beide Hosts; Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass dieser Faktor im Verhalten der Tiere in Vivoauswirken könnten.

Obwohl das adaptive Immunsystem Fish´s bis 4 Wochen-Düngung Post nicht ausgereift ist, ist das angeborene Immunsystem aktiv in Entwicklung10. So früh wie 48 oder 96 hpf, wurden phagocytic Zellen beobachtet, dass verschlungen Trypanosomen (Daten nicht gezeigt) beschriftet. Dies schränkt das Zeitfenster für die Visualisierung des Parasiten. Wenn eine Studie war es, auf die Bewertung der Fish´s Immunantwort konzentrieren, kann Injektion in einem späteren Stadium empfohlen werden. Darüber hinaus können Injektion von Parasiten in transgene Fische Linien mit beschrifteten Makrophagen und andere Zellen des Immunsystems beim Studium von Parasiten Anlage und möglichen Endozytose Mechanismen nützlich sein. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn die Parasiten mit CFSE beschriftet sind, transgenen Zelle Etiketten nicht GLP sollte und eine Markierung in der gelben oder roten Ende des Spektrums erforderlich ist.

Um die genaue Bewegungsrichtung Parasit zu beurteilen, kann es sinnvoll, ihre Flugbahn in 3 Dimensionen (3D) zu folgen sein. Für 3D Visualisierung und Rekonstruktion des Prozesses ist ein High-Speed-System notwendig. Mit der Ausrüstung, die in diesem Protokoll verwendet ist es nur möglich, die Parasiten in einer Ebene sichtbar zu machen. In diesem Fall priorisiert wir Brennebene Stabilität während der Parasit-Bewegung, und die Aufnahme seiner Flugbahn in einer Ebene.

Die hier vorgeschlagene Methode ebnet den Weg für weitere Parasiten Verhalten im Kreislauf zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen sind die wesentlichen Schritte zu imaging live fluoreszierende Parasiten im Zebrafischlarven:(i) verwenden der frühen geschlüpfte Embryonen (24-48 hpf) oder Larven oder Tiere zwischen 72-96 hpf mit keine Pigmentierung, damit sind transparent und leicht zu injizieren; (Ii) Bild Larven so bald wie möglich nach der Injektion, Parasit Freigabe durch phagocytic Zellen zu vermeiden; und (Iii) die LSFM auf der Website von Interesse (z.B. Herzbeutel Region) zu konzentrieren und den Fokus zu erhalten. Dieses neuartige Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Trypomastigotes in einem Umfeld vergleichbar mit seiner natürlichen Infektion Nische, bietet erstmals die Möglichkeit T. Trypanosoma in einem lebenden Organismus zu studieren.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Convocatoria Interfacultades von Vicerrectoría de Investigaciones De La Universidad de Los Andesund USAID Forschung und Innovation-Fellowship-Programm unterstützt. Wir danken Juan Rafael Buitrago und Yeferzon Ardila für Fisch Wartung und Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-10 μL Micropipette Fisherbrand 21-377-815
Agarose RA Amresco N605 Regular
Agarose SFR Amresco J234 Low Melting point
Aquarium salt Instant ocean SS15-10
Cell Count chamber Boeco Neubauer 
Cell culture flasks Corning 430639
Centrifuge Sorvall Legend RT
CFSE ThermoFisher C34554
Detection objective Nikon 40x 0.8NA  40x CFI APO NIR
DMEM medium Sigma-Aldrich D5648
Dumont #5 fine forceps World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Fetal calf serum (FCS) Eurobio CVFSVF00-01
Filter Chroma ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting Vitrez Medical 160215
Glass capillaries for pulling needles World precision instruments TW100-4
Glucose Gibco A2494001
HEPES Gibco  156300-80
Incubator Thermo Corporation Revco
Larval microinjection mold Adaptive Science Tools I-34
Laser Crystalaser DL488-050
L-glutamine Gibco 250300-81
Methylene blue Albor Químicos 12223
Micromanipulator  Narishige MN-153
Micromanipulator system Sutter Instrument MP-200 For LSFM 
Micropipette puller device  Narishige PC-10
Microscope  Olympus CX31
Microscope (inverted) Olympus CKX41
Multipurpose microscope Nikon AZ100M
Neubauer counting chamber Boeco Germany
Penicillin-streptomycin Gibco  15140-163
Petri dish 94x16 Greiner bio-one 633181
Plastic pasteur pipette Fisherbrand 11577722
Rotation stage Newport CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R4130
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Stereoscope Nikon C-LEDS
Tricaine (MS-222) Sigma-Aldrich 886-86-2
TRIS Amresco M151
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco R-001-100
Tubes 15 ml Corning 05-527-90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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