एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बैरियर मॉडल सुअर मस्तिष्क Endothelial कोशिकाओं पर आधारित की स्थापना के लिए बेहतर विधि

Medicine

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Summary

प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) प्राथमिक सुअर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (pBECs) के आधार पर मॉडल की स्थापना के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया मौजूद है । मॉडल उच्च reproducibility, उच्च तंगी से पता चलता है, और दवा की खोज में परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।

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Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शुद्धि और pBECs की खेती के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया प्रस्तुत करता है और इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मोनो में pBECs पर आधारित मॉडल-संस्कृति (mc), astrocyte के साथ mc-वातानुकूलित माध्यम (ACM), और स्थापित करने के लिए सुअर या चूहा मूल के astrocytes के साथ गैर संपर्क सह संस्कृति (एन सी सी) । pBECs घरेलू सूअरों 5-6 महीने पुराने के मस्तिष्क cortices से केशिकाओं के टुकड़े से अलग और संस्कृति थे । इन टुकड़ों मेनिन्जेस, अलगाव और ग्रे मैटर, निस्पंदन, एंजाइमी पाचन, और केंद्रापसारक के homogenization के सावधान हटाने के द्वारा शुद्ध थे । आगे दूषित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, केशिका टुकड़े puromycin युक्त माध्यम से संस्कृति थे । जब 60-95% धाराप्रवाह, केशिका टुकड़ों से बढ़ pBECs पारगंय झिल्ली फ़िल्टर आवेषण के लिए पारित किया गया और मॉडलों में स्थापित । बाधा जकड़न और pBECs के BBB विशेषता phenotype बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं को निंनलिखित विभेद कारकों के साथ इलाज किया गया: झिल्ली permeant 8-CPT-शिविर (यहां संक्षिप्त शिविर), hydrocortisone, और एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला, आरओ-20-1724 (आरओ) । प्रक्रिया 9-11 दिनों की अवधि में किया गया था, और जब एनसीसी मॉडल की स्थापना, astrocytes 2-8 सप्ताह पहले से संस्कृति थे । प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन उच्च प्रतिबंधित paracellular पारगम्यता के साथ endothelial परतों की स्थापना की अनुमति दी गई है, एनसीसी मॉडल के साथ एक औसत transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) दिखा रहा है १२४९ ± ८० Ω मुख्यमंत्री 2, और paracellular पारगम्यता (Papp) के लूसिफ़ेर पीला के लिए ०.९० 10-6 ± ०.१३ 10-6 सेमी सेक-1 (मतलब ± SEM, n = 55) । इसके अलावा इस pBEC phenotype के मूल्यांकन ने तंग जंक्शन प्रोटीन्स claudin 5, ZO-1, occludin और adherens जंक्शन प्रोटीन p120 catenin की अच्छी अभिव्यक्ति दिखाई । प्रस्तुत मॉडल स्वास्थ्य और रोग में BBB के अध्ययन की एक सीमा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, अत्यधिक प्रतिबंधात्मक paracellular पारगम्यता के साथ, इस मॉडल परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

सेलुलर संरचना और रक्त मस्तिष्क बाधा के समारोह

संचार और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इंटरफेस में, BBB सीएनएस microenvironment के homoeostatic नियंत्रण के लिए एक प्रमुख विनियामक स्थल के रूप में कार्य करता है, जो कि उचित कार्य और तंत्रिका तंत्र के संरक्षण के लिए आवश्यक है । BBB की साइट endothelial रक्त वाहिका लुमेन अस्तर कोशिकाओं है । मस्तिष्क केशिकाओं में, endothelial कोशिकाओं जटिल सेलुलर तंग जंक्शनों के रूप में और विशेष रूप से आमद और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों की दृढ़ता से ध्रुवीकरण अभिव्यक्ति पैटर्न रक्त और मस्तिष्क के बीच अत्यधिक विशिष्ट आणविक परिवहन सुनिश्चित 1। तंग जंक्शन परिसरों के संरचनात्मक घटकों में occludin और claudin परिवार, zonula occludens (ZO) प्रोटीन, cingulin, और संबद्ध जंक्शनीय आसंजन अणु (जैम) से प्रोटीन शामिल हैं । Claudin 5 paracellular जंक्शन प्रतिबंध में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । प्रेरण और इस विशेषता BBB endothelial phenotype के रखरखाव pericytes, astrocytes, ंयूरॉंस और तहखाने झिल्ली, जिसमें मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के साथ मिलकर फार्म सहित आसपास के कोशिकाओं के साथ गतिशील बातचीत शामिल neurovascular इकाई (NVU),. इन बातचीत में शामिल तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं, लेकिन कोशिकाओं के बीच रासायनिक संकेतों के आदान प्रदान शामिल हैं, जो अल्पावधि में BBB पारगम्यता के मॉडुलन की अनुमति देता है और लंबी अवधि के BBB सुविधाएँ4. Astrocytes विशेष रूप से मस्तिष्क endothelial कोशिका phenotype में योगदान करने के लिए जाना जाता है और glial-व्युत्पन्न neurotrophic फैक्टर (प्रभावित intracellular शिविर) के रूप में नियामक कारकों का एक स्रोत हैं5, बुनियादी fibroblast विकास फैक्टर6, hydrocortisone7, और रूपांतरित विकास कारक β (TGF-β)8. TGF-β के प्रभाव, हालांकि,9पर बहस हो गई है ।

से Vivo में इन विट्रो BBB

vivo में अध्ययन BBB जीव विज्ञान पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने के लिए जारी है । हालांकि, सेल संस्कृति मॉडल अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करने और स्वास्थ्य और रोग दोनों में BBB के विस्तृत आणविक और कार्यात्मक पहलुओं को समझने के लिए उपयोगी उपकरण का गठन कर सकते हैं । हालांकि कोशिका प्रकार और BBB के घटकों के बीच जटिल बातचीत पूरी तरह से में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है इन विट्रो मॉडल में , वहां गया है, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और मोनो में इन के आवेदन की पहली शुद्धि के बाद से संस्कृतियों 10 , 11 , 12, शुद्धि प्रक्रियाओं और BBB सेल संस्कृति मॉडल की वृद्धि की स्थिति के व्यापक विकास, vivo बैरियर में अधिक से अधिक समानता में जिसके परिणामस्वरूप । इन विट्रो BBB मॉडल में सामांय रूप से इस्तेमाल किया कुतर, सुअर, और गोजातीय मूल के प्राथमिक कोशिकाओं पर आधारित हैं, और अमर सेल लाइनों पर । प्रत्येक मॉडल अलग फायदे और कमियां है । तुलना और मॉडल की पसंद के लिए, BBB एंजाइमों, ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के रूप में इस तरह के सत्यापन मार्करों, और संरचनात्मक प्रोटीन के लिए वर्तमान स्थापित मॉडल1का पूर्वावलोकन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है ।

प्रोटोकॉल का उद्देश्य

BBB की एक महत्वपूर्ण विशेषता बाधा जकड़न और उच्च तीळ है, अभी तक उपलब्ध मॉडलों की एक बड़ी संख्या अच्छी तरह से vivo में स्तर को प्रतिबिंबित नहीं है. कई प्रयोगशालाओं से विकास और अनुकूलन योगदान को शामिल करते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य MC BBB में प्राथमिक pBECs के आधार पर इन विट्रो में उच्च तीळ की स्थापना के लिए एक विधि प्रस्तुत करना है या ACM के बिना, या एनसीसी में प्राथमिक मूषक या सुअर मूल के astrocytes । एप्लाइड प्रक्रियाओं और मॉडल की स्थापना के लिए प्रदूषित कोशिकाओं को खत्म करने और एक BBB phenotype में pBECs के भेदभाव में सुधार करने के प्रयास शामिल हैं । यह काम कम paracellular पारगम्यता और महत्वपूर्ण तंग जंक्शन प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों, और रिसेप्टर्स के अच्छे कार्यात्मक अभिव्यक्ति के साथ विश्वसनीय, उच्च तीळ मॉडल की स्थापना में हुई है । हालांकि, के रूप में astrocytes मस्तिष्क endothelial कोशिका phenotype के लिए एक योगदान कारक हैं, संस्कृति के तीन विभिंन परिस्थितियों मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के तीन विभिंन phenotypes प्रतिनिधित्व करते हैं । एनसीसी मॉडल विशेष रूप से दवा की खोज में शामिल कुछ विशेष तंत्र के अध्ययन के लिए उपयोगी है, परिवहन अध्ययन और intracellular तस्करी, साथ ही सेल सेल बातचीत की जांच के लिए जहां BBB सुविधाओं के अधिक से अधिक अभिव्यक्ति है लाभप्रद.

मूल और प्रोटोकॉल का इतिहास

pBEC मॉडल यहां वर्णित मुख्यतः सुअर Eisai प्रयोगशालाओं (लंदन) में डॉ लुईस मॉर्गन और सहयोगियों द्वारा विकसित मॉडल पर आधारित है, whichis एक सफल पहले गोजातीय मस्तिष्क endothelial सेल मॉडल13पर आधारित है । सेल तैयार करने की मूल विधि एक दो चरण microvessels को पकड़ने के लिए नायलॉन जाल का उपयोग छानने का यंत्र था, पवित्रता में सुधार करने के लिए एक subculturing कदम के बाद । विधि के पूर्व विकास में, इष्टतम BBB phenotype और बाधा तंगी ACM सहित पूरक माध्यम में वृद्धि से प्राप्त किया गया था । विधि में और संशोधन आर स्किनर द्वारा मैनचेस्टर यूके14,15में प्रो एन Rothwell लैब में किए गए । यह विधि एबॉट लेबोरेटरी, KCL लंदन द्वारा अपनायी गई, जहां Patabendige ने astrocytes या ACM के प्रयोग से परहेज करके और pericytes के साथ puromycin जैसे प्रदूषित कोशिकाओं को नष्ट करके तैयार करने को काफी सरल बनाया । पहले कागजात की पुष्टि की है कि एम सी मॉडल vivo में BBB के कई महत्वपूर्ण सुविधाओं को संरक्षित, प्रभावी तंग जंक्शनों सहित, झिल्ली परिवहन प्रणालियों और रिसेप्टर मध्यस्थता transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. बाद में एस Yusof फिर से astrocyte सह संस्कृति का परीक्षण किया और पाया कि यह काफी सुधार हुआ है, तो इस समय एबॉट लैब21में प्रयुक्त पसंदीदा संस्करण है । मॉडल अब सफलतापूर्वक आर्हस, जहां आगे संशोधनों में शुरू किया गया है एम. नीलसन लैब में स्थानांतरित किया गया है (इस प्रोटोकॉल), ग्रे बात निष्कर्षण सरल बनाने सहित, केवल एक जाल निस्पंदन कदम का उपयोग कर, और एक एकल फिल्टर कोटिंग कदम कोलेजन और fibronectin का मेल । सुअर astrocytes के अलगाव के लिए लागू की गई प्रक्रिया (इस प्रोटोकॉल) ऑलबोर्ग में मूॉ प्रयोगशाला द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित था, Thomsen एट अल22द्वारा वर्णित है । तीळ और लंदन और आर्हस में उत्पन्न मॉडल के अन्य गुण समान हैं, जो धारणा है कि मॉडल आसानी से प्रयोगशालाओं के बीच स्थानांतरित कर दिया है और अच्छी तरह से सावधान अवलोकन और विधि कदम के युक्तिसंगत के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए विश्वास उधार देता है. दरअसल, एस Yusof अब एक उष्णकटिबंधीय देश (मलेशिया) में एम सी मॉडल की स्थापना की है23, जो स्थानीय परिस्थितियों और ऊतक स्रोतों के लिए आगे समायोजन शामिल है ।

वैकल्पिक तरीकों पर लाभ और वर्तमान में स्थापित मॉडल

गोजातीय और मूषक मूल के ब्रेन endothelial कोशिकाओं की तुलना में, pBECs अलगाव24के बाद vivo BBB phenotype में के नुकसान की कम दर होने का लाभ प्रदान करते हैं । इसके अलावा, pBECs अपेक्षाकृत तंग endothelial बाधाओं बनाने में सक्षम हैं, यहां तक कि जब एम सी में हो (८०० ω cm2)16 के रूप में इस तरह के बेंड .5 और बेंड के रूप में सेल लाइनों के monolayers के लिए आमतौर पर रिपोर्ट के स्तर की तुलना में । 3 (५० ω cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 ω cm2)28,29,30, और cerebEND (५०० ω cm2)29,31,३२, और प्राथमिक मस्तिष्क माउस के endothelial कोशिकाओं (100-300 Ω cm2)ss = "xref" > 33,३४,३५,३६ और चूहा (100-300 Ω cm2)३७,३८. हालांकि, तीळ शुद्धि और संस्कृति प्रक्रियाओं पर निर्भरता दिखाई गई है । ज्यादातर मामलों में, astrocytes के साथ ACM या सह संस्कृति के अलावा endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव अंतर से पता चलता है और endothelial परतों की तंगी में एक वृद्धि1. फिर भी, संवर्धन शर्तों को अनुकूलित करने के प्रयासों के साथ, केवल गोजातीय आधारित मॉडल को दिखाया गया है तीळ सुअर आधारित मॉडल के तुलनीय मूल्यों (८०० ω सेमी2 के औसत दर्जे का एम सी में, २५०० ω सेमी2 में astrocyte सह संस्कृति)13 ,३९,४०,४१,४२,४३,४४,४५. प्राथमिक गोजातीय मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं पर आधारित मॉडल के रूप में बड़े बदलाव दिखाया गया है, दोनों के बीच और प्रयोगशालाओं के भीतर14,४५,४६,४७,४८, reproducibility एक मुद्दा हो सकता है । यहां pBEC मॉडल में, कालाबाजारी प्रयोगशालाओं कम परिवर्तनशीलता के साथ बहुत ही तीळ और paracellular पारगम्यता मूल्यों को हासिल किया है, दोनों में और प्रयोगशालाओं के बीच. अतः, अन्य प्रयोगशालाओं के लिए यह संभव होना चाहिए कि यहाँ प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करके कम परिवर्तनशीलता के साथ एक सुदृढ़ मॉडल स्थापित किया जाए. तंग endothelial परतों के गठन के अलावा, pBECs के साथ मॉडल पहले तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा मान्य किया गया है, कार्यात्मक BBB ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स और एंजाइमों, और अध्ययन की एक सीमा के लिए उपयुक्तता का प्रदर्शन15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , ४९ , ५० , ५१ , ५२ , ५३ , ५४ , ५५ , ५६ , ५७ , ५८ , ५९. इसके अलावा, pBECs की सह संस्कृतियों पर अप्रकाशित transcriptome डेटा BBB ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स (अप्रकाशित परिणाम, नीलसन एट अल) के एक अपेक्षित प्रोफ़ाइल से पता चलता है ।

सुअर आधारित BBB मॉडल जीनोम, शरीर रचना विज्ञान, फिजियोलॉजी के रूप में एक और लाभ है, और सुअर के रोग प्रगति अंय स्थापित मॉडल६०, जो के लिए अनुकूल विशेषताएं है की तुलना में एक उच्च डिग्री के लिए मानव जीवविज्ञान को प्रतिबिंबित दवा उद्योग । के रूप में सुअर दिमाग एक आम द्वारा मांस उद्योग के उत्पाद हैं, वे मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के एक आसानी से सुलभ स्रोत का गठन, प्रयोगों के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करने, और एक सुअर मस्तिष्क से एक उच्च शोधन उपज प्रदान । हालांकि शुद्धि और प्राथमिक कोशिकाओं की खेती कुछ समय लेने वाली है और मॉडल की स्थापना में मानकीकरण के लिए विशेषज्ञता की आवश्यकता है, प्राथमिक कोशिकाओं सबसे विश्वसनीय BBB मॉडल उत्पन्न करते हैं । अमरता सेल लाइनों एक विकल्प नहीं हो सकता है, जैसे महत्वपूर्ण गुण के रूप में बाधा तंगी, ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति प्रोफाइल, और microenvironment विनियमन vivo मेंप्रयोगात्मक निष्कर्षों को प्रतिबिंबित नहीं करते६१, ६२. इन विट्रो मॉडल उच्च संकल्प के साथ लाइव सेल इमेजिंग का लाभ प्रदान करते हैं, intracellular प्रक्रियाओं का दृश्य नमूना या मनाया कोशिकाओं के लिए एक करीबी निकटता दृष्टिकोण की अनुमति से संभव बनाने, उद्देश्यों का उपयोग उच्च आवर्धन और बेहतर ऑप्टिकल गुणवत्ता६३के साथ । जीवित पशुओं में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के इस्तेमाल के लिए यह मामला नहीं है । इसके अलावा, इन विट्रो मॉडल में कोशिकाओं transfect करने की क्षमता प्रदान करते हैं, टैग प्रोटीन और उनके तस्करी की जांच के दृश्य की अनुमति ।

मॉडल के अनुप्रयोग

BBB का समारोह तय नहीं है और गतिशील दोनों फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान में संग्राहक किया जा सकता है । neurodegenerative, भड़काऊ और संक्रामक रोगों, विघटन और BBB की वृद्धि हुई पारगम्यता सहित कई स्नायविक रोगों में मनाया जाता है६४,६५,६६,६७ . आदेश में कम करने और रोग की प्रगति और बाद में नुकसान को रोकने के लिए, BBB के मॉडुलन अंतर्निहित आणविक तंत्र के पहचान और लक्षण वर्णन प्रमुख महत्व के हैं । इस संदर्भ में, विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल दवा उद्योग द्वारा उच्च मांग में हैं, और इसके अलावा सीएनएस के लिए दवाओं की BBB पारगम्यता की भविष्यवाणी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । किसी भी इन विट्रो मॉडल एक पारगम्यता स्क्रीन के रूप में सेवारत एक प्रतिबंधक paracellular मार्ग, एक शारीरिक यथार्थवादी सेल वास्तुकला और परिवहन तंत्र के कार्यात्मक अभिव्यक्ति६८प्रदर्शित करना चाहिए । पिछले अध्ययन16,17,५७में प्रदर्शन किया, और paracellular पारगम्यता और टी जे और ए जे प्रोटीन की अभिव्यक्ति यहां से, प्रस्तुत मॉडल इन सभी मानदंडों को पूरा करती है और BBB की एक सीमा के लिए उपयुक्त है दोनों सामान्य फिजियोलॉजी में और पैथोलॉजी में अध्ययन. प्रस्तुत शुद्धि और खेती विधि की शक्तियों में सादगी और reproducibility का एक संयोजन और एक जिसके परिणामस्वरूप मजबूत और विश्वसनीय उच्च तीळ के साथ astrocytic प्रभाव शामिल करने की क्षमता शामिल है इन विट्रो BBB मॉडल । इस प्रयोजन के लिए, सुअर और चूहे मूल के astrocytes एक समान तरीके से22में pBECs के BBB phenotype बढ़ाने के लिए दिखाया गया है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सुअर दिमाग डेनिश खाद्य उद्योग के शोधकार्य के रूप में प्राप्त किया गया । डेनिश बूचड़खानों सख्त पर्यवेक्षण और पर्यावरण और खाद्य मंत्रालय डेनमार्क द्वारा निरीक्षण के अधीन हैं ।

< p class = "jove_content" > astrocytes के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया चूहों पैदा कर रहे थे और समूह-22 के एक परिवेश के तापमान पर स्थानीय पशु सुविधा में ईमारत & #176; सी-23 & #176; सी और एक 12/12 ज अंधेरे/पशुचिकित्सा के निरीक्षण के तहत और डेनिश के अनुसार प्रयोगशाला जानवरों के लिए विनियम । चूहों से पहले वे जानवरों के नैतिक उपयोग पर अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार बलिदान दिया गया euthanized थे (यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश 24 नवंबर १९८६; 86/609/EEC) और डैनिश दिशानिर्देश । कोई में vivo प्रयोगों पर जानवरों या मानव सामग्री का इस्तेमाल इन प्रयोगों में किया गया.

< p class = "jove_content" > नोट: निम्नलिखित एक pBEC मुख्य प्रोटोकॉल का वर्णन है ( step 1 ) शुद्धि, ( step 2 ) खेती और ( step 3 ) तीळ माप. astrocytes के साथ एक एनसीसी के सेटअप के लिए, एक वैकल्पिक protcol ( कदम 4 ) शुद्ध और चूहे और सुअर astrocytes की खेती का वर्णन प्रस्तुत किया है ।

< p class = "jove_title" > 1. सुअर मस्तिष्क केशिकाओं का शुद्धिकरण

  1. 5-6 से 8-10 दिमाग इकट्ठा-महीने पुराने घरेलू सूअरों ( उदाहरण के पास एक से) और उंहें बर्फ पर परिवहन प्रयोगशाला के लिए । हम पशु की समाप्ति के 2-3 ज के भीतर निंनलिखित शुद्धि प्रक्रिया शुरू करने की सलाह देते हैं ।
  2. एक बाँझ प्रवाह पीठ में दिमाग जगह और धीरे से उन्हें 1 एल पंजाबियों के साथ एक चोंच बर्फ पर रखा में धोने.
  3. ध्यान से एक समय में एक मस्तिष्क से मेनिन्जेस ठीक टिप संदंश का उपयोग कर निकालें और मेनिन्जेस-मुक्त दिमाग एक और 1 एल चोंच के लिए पंजाबियों के साथ बर्फ पर रखा स्थानांतरण । समय का विस्तार हटाने जटिल कर सकते हैं । अनुमानित समय प्रत्येक मस्तिष्क के लिए इस्तेमाल किया 10-15 min.
  4. होना चाहिए
  5. एक स्केलपेल का उपयोग कर, एक समय में एक मस्तिष्क से भूरे रंग की बात बंद परिमार्जन और पेट्री व्यंजन को अलग सामग्री हस्तांतरण (८.८ सेमी 2 ) 20 मिलीलीटर DMEM पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/ सफेद पदार्थ को वापस लेने के बिना जितना संभव हो उतना ग्रे मैटर को अलग कर लें । प्रारंभिक विखंडन के लिए, एक सुई के बिना एक ५० मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से ग्रे बात सामग्री चलाते हैं । सभी दिमाग और पूल एकत्र ग्रे बात सामग्री के लिए जारी रखें । समय का विस्तार हटाने जटिल कर सकते हैं । अनुमानित समय प्रत्येक मस्तिष्क के लिए इस्तेमाल किया 10-15 min.
  6. होना चाहिए
  7. DMEM/F-12 मीडिया के साथ 50/50 के अनुपात में एक हाथ से आयोजित ऊतक homogenizer की चक्की ट्यूब करने के लिए अलग ग्रे पदार्थ पदार्थ हस्तांतरण । Homogenize एक ढीला मूसल के साथ 8 ऊपर और नीचे स्ट्रोक बनाने के द्वारा सामग्री, 8 के बाद ऊपर और एक तंग मूसल के साथ स्ट्रोक नीचे । जारी रखें जब तक सभी अलग सामग्री homogenized गया है, तो एक ५०० मिलीलीटर की बोतल के लिए homogenate हस्तांतरण और DMEM के साथ पतला/एफ 12 के लिए लगभग ४५० मिलीलीटर कुल मात्रा ।
  8. फ़िल्टर धारक और १४० & #181 के साथ एक ५००-एमएल ब्लू-कैप बोतल का उपयोग कर homogenate फ़िल्टर
  9. ; एम फिल्टर-मेष, और फिल्टर के माध्यम से ऊतक चलाकर केशिकाओं को अलग करें । homogenate के ५० मिलीलीटर प्रति एक फिल्टर का प्रयोग करें और DMEM के साथ प्रत्येक फिल्टर धोने/
  10. जगह trypsin/EDTA (२.५% trypsin, पंजाब में ०.१ एनएम EDTA), collagenase CLS2 (२,००० u/एमएल) और DNase 1 (३,४०० u/एमएल) के पाचन समाधान के साथ पेट्री डिश में केशिका युक्त फिल्टर DMEM/एफ-12 में । 3 फिल्टर जाल प्रति 1 पेट्री डिश (८.८ सेमी 2 , 20 मिलीलीटर समाधान) का उपयोग करें ।
  11. जगह पर पेट्री व्यंजन ३७ & #176; C 1 h के लिए १८० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर या उंहें धीरे से हर 10 मिनट हलचल । 1 घंटे के बाद, एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पेट्री डिश से निलंबन के साथ फिल्टर से केशिकाओं को धो लें ।
  12. 3 बर्तन से निलंबन २ ५०-एमएल ट्यूबों में विभाजित है और 10 मिलीलीटर DMEM/एफ-12 प्रत्येक ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए जोड़कर पाचन बंद करो ।
  13. केंद्रापसारक पर सेल-सस्पेंशन २५० x g, 4 & #176; C 5 min. महाप्राण के लिए supernatants और फिर से DMEM के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली निलंबित/एफ-12 । प्रत्येक ट्यूब के लिए DMEM/F12 के एक और 20 मिलीलीटर जोड़ें । दोहराएं इस केंद्रापसारक कदम दो बार ।
  14. चलो ट्यूबों 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा और 2 नए ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए समाधान हस्तांतरण ।
  15. केंद्रापसारक सेल-सस्पेंशन पर २५० x g, 4 & #176; C 5 मिनट के लिए, और फिर से 8-10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली को निलंबित (लगभग 1 मिलीलीटर/FBS में 10% DMSO से मिलकर ठंड समाधान का इस्तेमाल किया.
  16. प्रति cryovial 1 मिलीलीटर का उपयोग कर, cryovials करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । औसतन, मस्तिष्क प्रति 1 शीशी में एक शुद्धि परिणाम इस्तेमाल किया, 12-16 आवेषण के लिए endothelial कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के औसत पर । शीशियों को एक जमने वाले डब्बे में रखें-८० & #176; सी के लिए रात भर से कम 4 ज । बाद में, तरल नाइट्रोजन के साथ एक cryotank में cryovials की दुकान ।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन बहुत कम तापमान है । कृपया उचित सुरक्षा पहनें ।
< p class = "jove_title" > 2. प्राथमिक pBECs की खेती (8-10 दिन)

  1. प्रारंभिक संस्कृति (3-5 दिन)
    Day 1
    1. pBECs के लगाव के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, अंतिम के साथ एक समाधान जोड़कर एक T75 कुप्पी की कोटिंग प्रदर्शन कोलेजन IV की सांद्रता (१५० & #181; जी/एमएल) और fibronectin (५० & #181; जी/एमएल) ddH में 2 हे कुप्पी के लिए, सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी सतह को कवर कर रही है । प्रत्येक T75 कुप्पी के लिए 10 मिलीलीटर का उपयोग करें । ३७ पर मशीन & #176; ग के लिए 2 ज.
      नोट: कोटिंग बस का उपयोग करने से पहले या एक सप्ताह तक प्रदर्शन किया जा सकता है और 4 पर पंजाबियों के साथ संग्रहित & #176; सी. कोटिंग बाहर शुष्क नहीं करना चाहिए, या यह अब एक उपयुक्त लगाव और विकास की सतह के रूप में होगा ।
    2. 10% प्लाज्मा व्युत्पन्न सीरम (पीडीएस), पेनिसिलिन (१०० यू/एमएल), streptomycin (१०० & #181; g/एमएल), और हेपरिन (15 यू/एमएल) के साथ पूरक 12 pBEC विकास माध्यम के 16 मिलीलीटर तैयार करते हैं । endothelial कक्षों के लिए चयन करने के लिए puromycin (4 & #181; g/mL) के साथ मध् यम का पूरक करें । ध्यान रखें कि puromycin उपचार केवल अधिकतम 5 दिनों के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
    3. Aliquot तैयार मध्यम में 6 मिलीलीटर और 10 मिलीलीटर की मात्रा में २ १५ मिलीलीटर ट्यूबों में ।
    4. तरल नाइट्रोजन (स्टेप १.१३) से केशिकाओं के साथ एक शीशी लाते हैं, और गल केशिकाओं का उपयोग करके ३७ & #176; C जल स्नान या जोड़कर ७५० & #181; L 6-एमएल aliquot से तैयार माध्यम के एल. अगर गल को मीडियम से जोड़कर, ध्यान से पिपेट ऊपर और नीचे गल जाए और homogenize सस्पेंशन हो जाए । गल जाने पर, सेल सस्पेंशन को 6-एमएल मीडियम aliquot पर ट्रांसफर करें ।
    5. ठंड से दूर करने के लिए, केशिकाओं स्पिन नीचे २५० x g , 4 & #176; C के लिए 7 min.
    6. सावधानी से महाप्राण supernatant और फिर से 10 मिलीलीटर aliquot के 1-2 मिलीलीटर में गोली निलंबित । जब पुन: निलंबित कर दिया, 10-एमएल मध्यम aliquot के लिए समाधान स्थानांतरण ।
    7. लेपित T75 कुप्पी के लिए केशिका निलंबन हस्तांतरण और धीरे सतह पर बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए कुप्पी झुकाव । जगह T75 कुप्पी पर ३७ & #176; ग, 5% कं 2 .
      दिन २
    8. रात भर के बाद, 10 मिलीलीटर pBEC विकास मध्यम puromycin के साथ पूरक तैयार (4 & #181; g/एमएल) एक T75 कुप्पी के लिए और एक मध्यम परिवर्तन करने के लिए । ध्यान रखें कि कक्षों पर लागू किए गए सभी मध्यम समाधान ३७ & #176; C का उपयोग करने से पहले पूर्व-उष्ण होना चाहिए.
      नोट: केशिकाओं सतह से जुड़ा होना चाहिए जब वैकल्पिक रूप से, एक मध्यम परिवर्तन 4-6 एच पद चढ़ाना किया जा सकता है । जब तक 60-95% संगम हासिल की है, आमतौर पर 3-5 दिन गल से कोशिकाओं की मशीन । एलो न करेंडब्ल्यू कोशिकाओं १००% संगम तक पहुंचने के लिए संपर्क-निषेध है कि आगे सेल विकास रुक सकता है से बचने के लिए ।
      दिन 4-6
    9. जब वांछित प्रवाह हासिल की है, endothelial कोशिकाओं पारगंय झिल्ली आवेषण को पारित (२.२ अनुभाग देखें) । यदि वांछित प्रवाह 4 दिन पर प्राप्त नहीं है, मध्यम के परिवर्तन किया जाता है । 6 दिन पर नवीनतम, कोशिकाओं पारगंय झिल्ली आवेषण पर पारित किया जाना चाहिए । यदि आवश्यक प्रवाह 6 दिन से प्राप्त नहीं है, कोशिकाओं प्रयोगात्मक उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं ।
      नोट: एनसीसी के लिए astrocytes की तैयारी: जब सह संस्कृति मॉडल की स्थापना, 2-8 सप्ताह पुरानी संस्कृति में astrocytes (देखें अनुभाग 4) के लिए तैयार किया जाना चाहिए सह संस्कृति मॉडल के लिए एक मध्यम परिवर्तन करने से पहले दिन पर passaging endothelial कोशिकाओं को सम्मिलित करता है । प्रत्येक astrocyte के लिए, १५०० & #181 तैयार करें; L astrocyte वृद्धि से मिलकर DMEM कम ग्लूकोज के साथ पूरक 10% FBS, पेनिसिलिन (१०० U/ml) और streptomycin (१०० & #181; g/एमएल) और फिर मध्यम परिवर्तन करें.
  2. की वृद्धि pBECs पर पारगंय झिल्ली आवेषण (5 दिन)
    दिन 4-6
    1. तैयार पारगंय झिल्ली आवेषण (12-अच्छी तरह से प्लेट के साथ आवेषण के १.१२ सेमी 2 सतह क्षेत्र, ०.४ & #181; m pores) के लिए कोलेजन IV के साथ कोटिंग द्वारा pBEC के सीडिंग (५०० & #181; g/ml) और fibronectin (१०० & #181; g/ml) इन ddH 2 O. प्रत्येक सम्मिलित के लिए लगभग ३०० & #181; L का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी बढ़ती हुई सतह को कवर करता है. ३७ पर मशीन & #176; ग, 5% कं 2 ज.
    2. की कम
    3. pBEC विकास माध्यम के 30 मिलीलीटर तैयार (मीडिया संरचना के लिए, अनुभाग 2.1.2 को देखें) बिना puromycin.
    4. महाप्राण T75 कुप्पी में pBEC संस्कृति से मध्यम और धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों के साथ दो बार धो.
    5. Trypsinize Trypsin-EDTA हल (२.५% Trypsin, पंजाब में ०.१ एनएम EDTA) के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को T75, और कुप्पी पर ३७ & #176; C, 5% सह 2 के लिए 5-7 min.
    6. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए, धीरे उंगलियों के साथ T75 कुप्पी की ओर नल, अंत में जीवित और मजबूत-कुप्पी की सतह पर pericytes संलग्न छोड़ने. नेत्रहीन एक खुर्दबीन के नीचे टुकड़ी की जांच । जब ८०% टुकड़ी मनाया जाता है, मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़कर trypsinization बंद करो ।
    7. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल समाधान हस्तांतरण और २५० x g , 4 & #176; C 7 मिनट के लिए पर केंद्रापसारक द्वारा मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
    8. ध्यान से supernatant निकालें और 1mL माध्यम में गोली reसस्पेंड । जब निलंबित, मध्यम के एक और 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए कुल मात्रा 3 मिलीलीटर
    9. एक सेल गिनती कक्ष या एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली के उपयोग के द्वारा मैंयुअल रूप से कोशिकाओं की संख्या गिनती लाने के लिए । २.२ x 10 5 कोशिकाओं/एमएल मध्यम, १.१ x 10 5 कोशिकाओं के एक अंतिम बोने घनत्व में जिसके परिणामस्वरूप/
    10. के एक सेल समाधान तैयार करें
    11. से कोटिंग समाधान निकालें पारगंय झिल्ली आवेषण और हस्तांतरण ५०० & #181; प्रत्येक सम्मिलित करने के लिए सेल निलंबन के एल. एक सम्मिलित करता है पर, केवल माध्यम जोड़ें और एक & #39 के रूप में इस सम्मिलित का उपयोग करें; फ़िल्टर केवल & #39; तीळ माप के लिए नियंत्रण.
    12. में endothelial कोशिकाओं की स्थापना या तो mc, ACM के साथ mc, या एन सी सी में astrocytes के साथ निंनलिखित तरीके से:
      1. के लिए एम सी: जोड़ें १५०० & #181; एल के pBEC वृद्धि मध्यम ACM झिल्ली आवेषण के नीचे 12 अच्छी तरह थाली के प्रति अच्छी तरह से पारगंय । पर पारगंय झिल्ली आवेषण प्लेस ३७ & #176; ग, 5% कं 2 और 2 दिनों के लिए मशीन ।
      2. एनसीसी के लिए: astrocytes के साथ कुओं के लिए स्थानांतरण आवेषण astrocyte विकास मध्यम दिन पहले के साथ ताजा । पर पारगंय झिल्ली आवेषण प्लेस ३७ & #176; ग, 5% कं 2 और 2 दिनों के लिए मशीन ।
        नोट: तीन मॉडलों के नीचे कुओं में अलग मीडिया प्रकार के उपयोग के बारे में पता हो ।
        दिन 6-8
    13. दिन 2 पर, pBECs के साथ पारगंय झिल्ली आवेषण पर मीडिया बदल जाते हैं । तैयार ५०० & #181; pBEC वृद्धि मध्यम प्रति सम्मिलित करें, और कक्ष परत के व्यवधान को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक परिवर्तन करने के लिए । दो दिनों के लिए कोशिकाओं की मशीन । मीडिया परिवर्तन केवल सम्मिलित करता है, और नहीं नीचे कुओं पर किया जाता है कि ध्यान रखें ।
  3. उत्तेजना with विभेद कारक (1-2 दिन)
    दिन 8-10
    1. विभिंन मॉडलों में से प्रत्येक के लिए, उत्तेजना मीडिया निंनलिखित के रूप में तैयार किया जाना चाहिए:
      1. MC के लिए: के लिए प्रत्येक डालने और अच्छी तरह से, तैयार ५०० & #181; pBEC ग्रोथ मीडियम युक्त शिविर (२५० & #181; m), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; m) के.
        MC: इसके अतिरिक्त १५०० & #181; pBEC ग्रोथ मीडियम युक्त शिविर (२५० & #181; m), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; m) के साथ तैयार करें.
        ACM के साथ एम सी: गल १५०० & #181; ACM के एल और यह शिविर के साथ पूरक (२५० & #181; m), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; m).
      2. for एनसीसी: प्रत्येक डालने के लिए, तैयार ५०० & #181; pBEC वृद्धि मध्यम युक्त शिविर (२५० & #181; m), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; m) के एल. प्रत्येक astrocyte के लिए, तैयार १५०० & #181; L के DMEM/F-12 के साथ पूरक पेनिसिलिन (१०० U/mL) और streptomycin (१०० & #181; जी/एमएल), हेपरिन (15 यू/एमएल), कैंप (२५० & #181; एम), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; एम).
    2. विभिंन मॉडलों में से प्रत्येक के लिए, इस प्रकार के रूप में मीडिया एक्सचेंज करते हैं:
      1. एम सी के लिए: ध्यान से कुओं और आवेषण से महाप्राण माध्यम है और दोनों डिब्बों के लिए भेदभाव मध्यम जोड़ने के लिए, का उपयोग ५०० & #181; L प्रत्येक डालने के लिए और १५०० & #181; L येक कुआं के लिए । ध्यान रखें कि संमिलित करें के दोनों ओर से व्यवधान कक्ष की परत को प्रभावित और बाधित कर सकता है ।
      2. For एनसीसी: जतन महाप्राण माध्यम कुओं से और जोड़ ७५० & #181; L विभेद मध्यम प्रति कुआं. जतन महाप्राण माध्यम से न्या और add ५०० & #181; L विभेद मध्यम प्रति सम्म । इसके बाद शेष ७५० & #181; L विभेद मध्यम से प्रत्येक astrocyte को अच्छी तरह जोड़ें.
    3. सभी मॉडलों के लिए: ३७ & #176 पर कोशिकाओं प्लेस; सी, 5% सह 2 और अगले दिन तक भेदभाव मध्यम के साथ मशीन ।
      नोट: ध्यान रखें कि astrocytes के साथ एन सी के लिए, astrocytes इस बिंदु से कर रहे है सीरम मुक्त माध्यम में रखा ।
< p class = "jove_title" > 3. तीळ माप

  1. दिन में भिंनता मध्यम के साथ उत्तेजक के बाद, कक्ष को दो बार ddH 2 O के साथ, 5 मिनट के लिए ७०% ेतोः के साथ एक बार धोने से, तीळ माप के लिए ऊतक प्रतिरोध मापन चैंबर प्रणाली तैयार और ddH 2 O.
  2. के साथ 2 अधिक बार
  3. ऊतक प्रतिरोध मापन कक्ष के लिए DMEM/F-12 के 4 मिलीलीटर जोड़ें, यह प्रणाली से कनेक्ट और निम्नलिखित सेटिंग्स के अनुसार लगभग 30 मिनट के लिए जांचना: r = 0, परीक्षण r = १०००, मोड = r.
  4. ध्यान से ऊतक प्रतिरोध माप चैंबर में आवेषण रखकर तीळ माप प्रदर्शन करते हैं । प्रत्येक डालने के लिए, तपसिल में माप प्रदर्शन और औसत & #937 की गणना; सेमी 2 .
    नोट: सह-संस् कृत मॉडल के लिए, तीळ मानों तक पहुंचने की आशा है & #62; ५०० & #937; सेमी 2 . यदि उचित तीळ तर तीळ मापने के प्रथम दिन पर न पहुँचे तो नए विभेदक कारकों (केम्प (२५० & #181; m), hydrocortisone (५५० एनएम) और आरओ (१७.५ & #181; m)) और उपाय तीळ को अगले दिन फिर से जोड़ दीजिये. जब उचित स्तर प्राप्त कर रहे हैं, मॉडल योजनाबद्ध प्रयोग के लिए तैयार किया जाना चाहिए । ध्यान रखें कि कोशिकाओं के लिए प्रयोग प्रदर्शन करने से पहले कम 3 ज के लिए आराम करना चाहिए तीळ माप के बाद ठीक । उत्तेजना के बाद, सामान्य में तीळ मान उत्तेजना के बाद 24-48 एच के लिए स्वीकार्य रहते हैं.
    नोट: एक वैकल्पिक और त्वरित विधि कठोर STX-100C इलेक्ट्रोड जोड़ी का उपयोग भी इस मॉडल में उच्च तीळ रिकॉर्ड < सुप वर्ग = "xref" > ८१ . फ्लेक्सिबल STX2 एलेाctrode जोड़ी कम विश्वसनीय रीडिंग देता है.
< p class = "jove_title" > 4. गैर-संपर्क सह-संस् कृति के लिए ASTROCYTES की तैयारी: वैकल्पिक विधि

  1. शुद्धि के ASTROCYTES
    1. प्रत्येक चूहे मस्तिष्क के लिए इस्तेमाल किया, कोट 2 T75 कुप्पी के 10 मिलीलीटर जोड़कर पाली-L-lysine (5 & #181; g/mL) में ddH 2 O को प्रत्येक T75 कुप्पी. ३७ & #176 पर कुप्पी की मशीन, 30 min.
    2. के लिए C astrocytes के
    3. अलगाव निम्नानुसार किया जा सकता है:
      1. चूहा astrocytes:
        1. Decapitate २ १-2 दिन पुराने एक अनुमोदित विधि का उपयोग चूहों ।
        2. नाक की ओर गर्दन से शुरू खोपड़ी से त्वचा में कटौती, और एक sagittal चीरा के साथ हड्डी में कटौती.
        3. घुमावदार संदंश के साथ खोपड़ी खोलें, मस्तिष्क बाहर ले जाओ और यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह (ट्यूब 1) के साथ 11 मिलीलीटर DMEM कम ग्लूकोज के साथ पूरक 10% FBS और गेन्तमयसीं सल्फेट (१२५ & #181; g/एमएल).
        4. ध्यान से ठीक टिप संदंश का उपयोग मेनिन्जेस निकालें और एक 1 मिलीलीटर पिपेट.
        5. का उपयोग कर मस्तिष्क सामग्री को निलंबित
      2. सुअर astrocytes:
        1. एक 5-6 महीने पुराने घरेलू सुअर से 1 मस्तिष्क प्राप्त ।
        2. ध्यान से मस्तिष्क से मेनिन्जेस दूर ठीक-टिप संदंश और/
        3. मस्तिष्क से भूरे पदार्थ के 4 जी इकट्ठा और 1-2 मिलीलीटर DMEM कम ग्लूकोज में एक पेट्री डिश में 10% FBS और गेन्तमयसीं सल्फेट (१२५ & #181; जी/एमएल) के साथ पूरक के टुकड़े जगह । अगर टुकड़े बड़े हैं, नश्तर या संदंश के साथ कीमा.
        4. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर अलग सामग्री को निलंबित, एक 15 एमएल ट्यूब (ट्यूब 1) के लिए ले जाएँ और DMEM कम ग्लूकोज के साथ पूरक 10% FBS और गेन्तमयसीं सल्फेट (१२५ & #181; g/एमएल) कुल मात्रा के लिए 11 मिलीलीटर.
        5. १० एमएल सिरिंज से जुड़ी लम्बी सुई के साथ पृथक सामग्री अनुमन्य और ऊपर और नीचे 3 बार निलंबित जारी रखें । रुको जब तक बड़े टुकड़े ट्यूब के नीचे में बसे हैं, तो ट्यूब (ट्यूब 1) के ऊपर से 7 मिलीलीटर मध्यम इकट्ठा ।
        6. फ़िल्टर 7-एमएल सेल निलंबन के माध्यम से एक ४० & #181; एक नया ५०-एमएल ट्यूब (ट्यूब 2) में मीटर नायलॉन फिल्टर.
        7. 7 मिलीलीटर मध्यम से ट्यूब 1 के लिए मस्तिष्क के साथ जोड़ें । homogenization और निस्पंदन कदम 4.1.2.2.5-6 से जारी रखें जब तक ट्यूब 2 में फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन की मात्रा लगभग ३५ मिलीलीटर है ।
    4. से कोटिंग समाधान निकालें T75 कुप्पी [कदम शुू] । पाली-एल-lysine के साथ मशीन के बाद 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ एक त्वरित धुलाई कि कोशिकाओं कोटिंग समाधान के किसी भी विषाक्त प्रभाव से नुकसान नहीं कर रहे है यह सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    5. विभाजित और बीज T75 कुप्पी के बीच समान रूप से अलग astrocyte समाधान । ३७ & #176; ग, 5% कं 2 के लिए 3-5 दिनों में मशीन ।
  2. संवर्धन Astrocytes और Endothelial कोशिकाओं के साथ एनसीसी की तैयारी (3 सप्ताह)
    1. प्रारंभिक संस्कृति
      1. के बाद 3-5 दिन की मशीन, ध्यान से aspirating माध्यम से एक मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन और 10 मिलीलीटर जोड़ने DMEM कम ग्लूकोज 10% FBS और गेन्तमयसीं सल्फेट (१२५ & #181; g/एमएल) के साथ पूरक.
        नोट: पहले मध्यम परिवर्तन के बाद, मध्यम हर 5 दिन में बदल जाना चाहिए । पहले 2 हफ्तों के दौरान, बोतल हिला और जब माध्यम बदलते पंजाबियों के साथ अच्छी तरह से कोशिकाओं को धो लें । दूषित microglia को हटाने में यह एड्स.
      2. खेती के 3 हफ्तों के बाद, trypsinize Trypsin-EDTA समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को प्रत्येक T75 कुप्पी के नीचे, और उंहें ३७ & #176 पर मशीन; C, 5% सह 2 के लिए 5-7 min.
      3. रोक trypsinization 5 मिलीलीटर के माध्यम से जोड़ कर, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल समाधान हस्तांतरण और २५० x g पर astrocytes, 4 & #176; C के लिए 7 min.
      4. सावधानी से supernatant निकालें और FBS में 10% DMSO से मिलकर ठंड समाधान में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
      5. कोशिकाओं की संख्या की गणना और ४.० x 10 6 कोशिकाओं/एमएल के एक सेल समाधान तैयार करते हैं । cryovials में कोशिकाओं को फ्रीज 1 मिलीलीटर प्रति शीशी जोड़ने ।
    2. वृद्धि में पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली नीचे वेल्स (2-12 सप्ताह)
      1. की वृद्धि के लिए 12-well प्लेट्स तैयार करें पाली-L-astrocytes की 1 मिलीलीटर जोड़कर lysine (5 & #181; g/mL) में ddH 2 हे को प्रत्येक वेल. प्लेट्स को ३७ पर रखें & #176; ग के लिए 2 ज.
      2. प्रत्येक 12-well प्लेट के लिए, astrocyte विकास मध्यम (DMEM कम ग्लूकोज 10% FBS और पेनिसिलिन (१०० U/एमएल) और streptomycin (१०० & #181; g/एमएल) के साथ पूरक के 25 मिलीलीटर तैयार) ।
      3. तरल नाइट्रोजन से astrocytes की शीशी लाते हैं और गल कर कोशिकाओं को जोड़कर ७५० & #181; L DMEM कम ग्लूकोज मीडियम. ध्यान से पिपेट ऊपर और नीचे गल जाए और homogenize सस्पेंशन हो जाए । गल जाने पर, सेल-सस्पेंशन को 15 एमएल वाली ट्यूब पर ट्रांसफर करें और मीडियम को 7 मिलीलीटर की कुल मात्रा में डालें ।
        चेतावनी: तरल नाइट्रोजन अत्यंत कम तापमान है, इसलिए दस्ताने के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा पहनते हैं ।
      4. ठंड से दूर करने के लिए, केशिकाओं स्पिन नीचे २५० x g , 4 & #176; C के लिए 7 min.
      5. ध्यान से महाप्राण को supernatant और फिर से मध् यम में कोशिकाओं को सस्पेंड करें ।
      6. 12 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं से कोटिंग हटाने और प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर का उपयोग कर कुओं के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण । ३७ पर कोशिकाओं मशीन & #176; ग, 5% कं 2 .
      7. मध्यम हर तीसरे दिन और संस्कृति endothelial कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले 2 सप्ताह की एक ंयूनतम के लिए कोशिकाओं को ताज़ा करें । कोशिकाओं के लिए सह संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 12 सप्ताह के बाद गल, इष्टतम उंर के साथ 2-8 सप्ताह जा रहा है ।

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Representative Results

BBB इन विट्रो मॉडल की स्थापना

प्रस्तुत, अनुकूलित विधि में, pBECs की खेती और एम सी के साथ या ACM या astrocytes के साथ एन सी सी के बिना पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली की स्थापना (चित्रा 1) 9-11 दिनों की अवधि के लिए किया गया था (चित्रा 2). endothelial कोशिकाओं के चयन के लिए, शुद्ध केशिका टुकड़े की एक प्रारंभिक संस्कृति 5 दिनों की एक अधिकतम के लिए puromycin उपचार के साथ संयुक्त किया गया था, जो सबसे दूषित कोशिकाओं को समाप्त और धुरी के आकार का endothelial कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा केशिका टुकड़े (चित्रा 3सी) । 4-6 दिन में, pBECs 60-95% की एक प्रवाह के लिए proliferated था, गैर के रूप में बढ़-अतिव्यापी, संपर्क-बाधा, longitudinally संरेखित कोशिकाओं । जब कोशिकाओं वांछित प्रवाह तक पहुंच गया था, pBECs कोलेजन IV और fibronectin लेपित पारगंय झिल्ली डालने फिल्टर झिल्ली पर चढ़ाया गया था (१.१२ सेमी2 सतह क्षेत्र, ०.४ µm pores) १.१ x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर/insert, जिस पर वे सामान्य रूप से गठित धाराप्रवाह monolayers के बाद 4 दिन (दिन 8-10 पद अलगाव). जब सह संवर्धन pBECs, चूहे या सुअर मूल के astrocytes पाली-एल-lysine लेपित नीचे कुओं पर एक ंयूनतम 2 सप्ताह की एनसीसी (चित्रा 3 डी) शुरू करने से पहले के लिए चढ़ाया गया । जब एनसीसी की स्थापना, अनुभव से पता चला है कि 2-8 सप्ताह के लिए astrocytes संस्कृति pBECs में BBB phenotype को बढ़ावा देने के लिए सबसे अच्छा समर्थन प्रदान करते हैं; इस समय के भीतर, astrocytes एक छत्ते की तरह संरचना (चित्रा 3E-F) में व्यवस्थित कोशिकाओं के साथ धाराप्रवाह संस्कृतियों का गठन किया । दिन में 4 पर पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली मॉडल (दिवस 8-10 पद अलगाव), कोशिकाओं शिविर, hydrocortisone और आरओ के साथ उत्तेजित करने के लिए बाधा तंगी और तंग जंक्शनीय प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों की BBB विशेषता अभिव्यक्ति पैटर्न में वृद्धि हुई थी, और रिसेप्टर्स.

pBEC Phenotype और Paracellular पारगम्यता का लक्षण वर्णन

दृश्य सेल निरीक्षण के साथ संयुक्त तीळ माप नियमित रूप से कर रहे हैं प्रवाह का आकलन करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीके और endothelial कोशिका परत की जकड़न पारगंय झिल्ली आवेषण पर बढ़ रही प्रयोगों से पहले. चित्रा 4 BBB के माध्यम से छोटे अणु दवा पारगम्यता का आकलन करने के लिए प्रयोगों की दो श्रृंखला से परिणाम दिखाता है, तीळ के नियंत्रण मापदंडों (ईओण पारगम्यता को प्रतिबिंबित) स्पष्ट पारगम्यता के साथ संयुक्त21 (Papp, सेमी एस-1) या तो radiolabeled सुक्रोज या डाई अनुरेखक लूसिफ़ेर पीले (के), ठेठ छोटे दवा अणुओं की paracellular पारगम्यता को प्रतिबिंबित (~ 200-600 Da). सुक्रोज या (दवा के आणविक वजन पर निर्भर करता है) के पीअनुप्रयोग से अधिक से अधिक एक पीअनुप्रयोग के साथ ब्याज की एक यौगिक transcellular पारगम्यता और कोशिकाओं में परिवहन/ चित्रा 4 से पता चलता है कि pBECs के साथ पारगंय झिल्ली आवेषण में चूहे astrocytes, pBEC के अच्छे बैचों (जैसे यहां निर्धारित सेट) रेंज में TEERs उत्पंन होगा ~ 500-2000 Ω cm2, कुछ उच्च या निंन के साथ । कुछ बैचों, विशेष रूप से प्रोटोकॉल सीखने के प्रारंभिक चरणों के दौरान, 100-900 Ω सेमी2 (जैसे यहां सुक्रोज सेट) के आसपास कम TEERs हो सकता है । तीळ माप फिल्टर के चयन की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए के साथ शुरू तीळ & #62; ५०० Ω cm2, और दिखाए गए तीळ की सीमा से अधिक, Pअनुप्रयोग , इन प्रयोगों के लिए पर्याप्त रूप से तंग बाधा परत का संकेत, तीळ से अपेक्षाकृत स्वतंत्र है । पारगम्यता को मापने के लिए प्रोटोकॉल घुला हुआ पदार्थ के प्रकार पर निर्भर करता है/ एन सी सी में छोटे अणुओं की पारगम्यता को मापने के लिए प्रक्रिया का एक विवरण के लिए, Yusof, SR, एट में एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । अल21. pBECs में तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन चूहे के साथ एनसीसी में astrocytes ने सेल-सेल जंक्शनों के साथ claudin 5, occludin, और ZO-1 का स्थानीयकरण दिखाया, जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्र 5-सी) द्वारा दिखाया गया है । साथ ही, adherens जंक्शन प्रोटीन p120 catenin ने सेल-सेल जंक्शन (चित्र 5d) के साथ अच्छी तरह से परिभाषित वितरण दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1: लागू इन विट्रो BBB मॉडल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । pBECs के पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली मॉडल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एम सी में (ए), ACM के साथ एम सी (बी), और astrocytes के साथ एन सी सी (सी)। एम सी में, या तो pBEC वृद्धि मध्यम या ACM नीचे के कुओं में लागू किया गया है, जबकि एन सी सी में, pBECs के साथ आवेषण 2-8 सप्ताह पुरानी astrocytes के साथ कुओं में रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: pBEC की खेती के दौरान मुख्य चरणों का प्रवाह चार्ट और प्रस्तुत मॉडलों की स्थापना. एक सिंहावलोकन और विधि के लिए समयरेखा के लिए, इस योजनाबद्ध प्रस्तुति pBECs और प्रस्तुत मॉडलों की स्थापना की संवर्धन प्रक्रिया में मुख्य कदम संक्षेप, यानी MC के साथ या ACM के बिना, और astrocytes के साथ एन सी सी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: pBECs और चूहे astrocytes की प्रारंभिक संस्कृतियों के प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम । pBECs की संस्कृतियों के चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवियां (A-C) और astrocytes (D-F) 5 दिनों में देखा । प्रारंभिक संस्कृति के पहले दिन पर शुद्ध केशिका टुकड़े दोनों केशिकाओं और प्रदूषित कोशिकाओं की उपस्थिति दिखाई दिया (एक, दिन 1), जो 2 दिन पर मध्यम परिवर्तन और विकास के एक अतिरिक्त दिन के बाद, pBECs के लिए चयन दिखाया, केशिका टुकड़े से उनके विकास शुरू (बी, 3 दिन)। pBECs के धाराप्रवाह monolayers आमतौर पर 4-6 दिन पर प्राप्त किया गया, जिस पर समय pBECs धुरी के आकार आकृति विज्ञान दिखाया और longitudinally गठबंधन (ग) थे । चूहे astrocytes नीचे कुओं में वरीयता प्राप्त आम तौर पर proliferated 5 दिनों के भीतर धाराप्रवाह परतों के लिए (डी एफ), और एन सी सी मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया विकास के 2 सप्ताह के बाद । सभी चित्रों के लिए स्केल बार: २०० µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: pBECs के तंग जंक्शन अखंडता । स्पष्ट पारगम्यता (पीअनुप्रयोग) pBECs के लिए paracellular मार्करों सुक्रोज (मेगावाट ३४२.५ 14सी-बला, 14.8-25.9 GBq/mmol) और लूसिफ़ेर पीला (मेगावाट ५२१.५७, 10 µ जी एमएल-1), तीळ के खिलाफ साजिश रची । pBECs पर उगाए गए थे १.१२ cm2 पारगंय झिल्ली संमिलित फ़िल्टर के ऊपर चूहे astrocytes के आधार में अच्छी तरह से और मार्करों शिखर चैंबर में जोड़ा । 1 घंटे के बाद ३७ पर & #730; सी, बेसल चैंबर में मार्कर की उपस्थिति मापा गया था और शिखर-टू-बेसल पीअनुप्रयोग (एक्स 10-6 सेमी सेक-1) गणना की । तीळ को मापा & #62; 3 एच पीअनुप्रयोगसे पहले, STX100C इवोम इलेक्ट्रोड का उपयोग, प्रतिरोध के साथ खाली पारगंय झिल्ली डालने फिल्टर के लिए ठीक किया १५० ω. लूसिफ़ेर पीले डेटा सेट के लिए औसत तीळ १२४९ ± ८० Ω cm2 (मतलब ± SEM, n = 55) था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: pBECs के Immunocytochemical लक्षण वर्णन. pBECs के लिए १.१२ cm पर उगाए गए2 पारगंय झिल्ली सम्मिलित करें फ़िल्टर सम्मिलित करता है ऊपर चूहे astrocytes बेस में ठीक है, तंग जंक्शन घटकों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, और adherens जंक्शन प्रोटीन (डी) p120 catenin सेल-सेल जंक्शनों पर अच्छी तरह से परिभाषित स्थानीयकरण दिखाया और धुरी के आकार का, गैर अतिव्यापी कोशिकाओं के साथ धाराप्रवाह मस्तिष्क endothelial सेल परतों का पता चला । सभी चित्रों के लिए स्केल बार: 10 µm. इस आंकड़े का बड़ा वर्शन देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

pBEC का शुद्धिकरण और प्रसार

शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, महत्वपूर्ण कदम मेनिन्जेस और सफेद और भूरे रंग की बात है, जो शुद्धि उपज और पवित्रता और मॉडल की उचित स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है की जुदाई के तेजी से और प्रभावी हटाने शामिल हैं । इन विट्रो BBB मॉडल में प्रस्तुत के लिए pBECs का उपयोग कर, हम सुधार और एक शुद्धि प्रक्रिया अलग ग्रे बात की यांत्रिक homogenization के आधार पर सरलीकृत, microvessels के अलगाव के लिए आकार-चयनात्मक फ़िल्टरिंग, collagenase के साथ पाचन , DNase और trypsin, microvessel टुकड़े की एक प्रारंभिक संस्कृति के साथ । सामान्य तौर पर, शुद्धिकरण और प्राथमिक कोशिकाओं की खेती के दौरान प्रमुख चुनौतियों में से एक प्रदूषित कोशिकाओं का उन्मूलन है. प्राथमिक मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की शुद्धि के साथ अनुभव संकेत दिया है कि दोनों मेनिन्जेस और सफेद मामले में सुधार की शुद्धता और केशिकाओं की उपज में पूरी तरह से हटाने, साथ ही वृद्धि हुई endothelial कोशिका वृद्धि और BBB की अभिव्यक्ति विशेषताओं. इस कारण से, मेनिन्जेस के सावधान हटाने (sulci अंदर सहित) प्रस्तुत प्रोटोकॉल में leptomeningeal कोशिकाओं को हटाने सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था (जो fibroblast गुण की तरह है), के रूप में अच्छी तरह से धमनी और arteriolar चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के रूप में, जो बढ़ने संस्कृति में endothelial कोशिकाओं की तुलना में अधिक तेजी से । इसी तरह, सफेद पदार्थ की ंयूनतम सामग्री purer endothelial कोशिका संस्कृतियों के परिणामस्वरूप, कम दूषित अलग केशिका टुकड़े से बढ़ रही कोशिकाओं के साथ । हालांकि, इस सरलीकृत और त्वरित विधि अलगाव के लिए लागू पृथक केशिकाओं की उपज कम करती है, और ग्रे बात अलगाव का अनुकूलन प्रत्येक मस्तिष्क की उपज में काफी सुधार हो सकता है । एक घनत्व ढाल, जो एक वैकल्पिक शोधन प्रोटोकॉल६९में शामिल है, मुक्त endothelial कोशिकाओं को अलग करने और endothelial सेल शुद्धता में सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह समय लगता है और इसी तरह उपज कम कर सकते हैं । इन शुद्धि तरीकों के दोनों बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और विशेषता है, और दोनों MC और astrocyte सह संस्कृति में उच्च तीळ pBEC मॉडल पैदा करने की विशेषताओं का हिस्सा (सामांय रूप से 500-1500 Ω मुख्यमंत्री2)7,16, 21,22,४९,५७,७०,७१.

आदेश में उच्च paracellular restrictiveness के साथ monolayers स्थापित करने के लिए, अनुभव से पता चला है कि pericytes endothelial संस्कृतियों से सफाया कर दिया जाना चाहिए16। सुअर मस्तिष्क pericytes आम तौर पर pBEC परतों से नीचे जाना और endothelial परतों में छेद का कारण नहीं है, के रूप में चूहे मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की संस्कृतियों के लिए मनाया७२,७३। pBEC संस्कृतियों में Pericytes, तथापि, endothelial कोशिकाओं है, जो व्यापक और अनियमित सेल बोर्डर16के साथ प्रदर्शित की आकृति विज्ञान को प्रभावित करते हैं । क्योंकि मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं microvessels में अन्य कोशिका प्रकार की तुलना में समाप्ति ट्रांसपोर्टरों (जैसे पी-ग्लाइकोप्रोटीन) के उच्च स्तर व्यक्त, दूषित कोशिकाओं की संख्या puromycin उपचार७४द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा व्युत्पंन सीरम (पीडीएस) के बजाय भ्रूण या नवजात बछड़ा व्युत्पंन सीरम का उपयोग endothelial कोशिकाओं के विकास के पक्ष में है, के रूप में पीडीएस जैसे प्लेटलेट-व्युत्पंन विकास कारक और संवहनी endothelial वृद्धि के रूप में वृद्धि कारकों की एक कम एकाग्रता है कारक है, जो BBB पारगम्यता बढ़ाने के लिए और उत्तेजित angiogenesis14,७५,७६,७७दिखाया जाता है । पृथक केशिका टुकड़े की एक प्रारंभिक संस्कृति शुरू करने और puromycin उपचार (4 µ g/एमएल) और पीडीएस के उपयोग के साथ इस संयोजन के द्वारा, हम काफी शुद्धि के बाद शेष प्रदूषित कोशिकाओं की संख्या को कम करने में सफल रहा, ताकि उसके बाद हम कर सकते है त्यामध्ये कडी endothelial monolayers पारगंय झिल्ली न्या. आदेश में दोनों संस्कृति व्यंजन और पारगंय झिल्ली डालने सतहों पर endothelial कोशिकाओं का सबसे अच्छा लगाव सुनिश्चित करने के लिए, यह देखा गया है कि कोलेजन प्रकार चतुर्थ का एक कोटिंग मिश्रण (मानव अपरा से) और fibronectin बहुत प्रसार बढ़ जाती है पैदावार, और संयुक्त मिश्रण इसलिए परंपरागत केवल कोलेजन प्रकार मैं७८का उपयोग कर विधि पर इष्ट था ।

कोशिकाओं का भेदभाव और एक उच्च तीळ की स्थापना इन विट्रो BBB मॉडल

MC में pBECs आमतौर पर अलगाव के बाद कई BBB कुंजी सुविधाओं को बनाए रखने, ताकि astrocytes के साथ सह संस्कृति कार्यात्मक तंग जंक्शनों उत्प्रेरण और उच्च तीळ मूल्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है16,५७। BBB phenotype में endothelial कोशिकाओं के अंतर के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए प्रयास शामिल सीरम युक्त मध्यम 8-CPT-शिविर, hydrocortisone7 के साथ पूरक का उपयोग (intracellular शिविर स्तर13बढ़ रही है) और RO 20-1724 (intracellular शिविर स्तर को बनाए रखने), जो पिछले निष्कर्षों के अनुसार७४,७९ एक साथ सफलतापूर्वक बाधा जकड़न और बढ़ा हुआ तीळ में सुधार, और भी एक और अधिक बहाल करने में मदद कर सकता है जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल८०की तरह वीवो में । हालांकि, endothelial परत के कस के लिए hydrocortisone का उपयोग कुछ उत्तेजनाओं को endothelial कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकते हैं, और chemo के लिए प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए मॉडल का उपयोग करने के प्रयोजन के लिए-और सूजन के दौरान साइटोकिंस, hydrocortisone के प्रयोग से बचना पड़ सकता है ।

एम सी के साथ तुलनात्मक अध्ययन से, ACM और astrocyte सह के साथ एम सी दोनों भाग लेने प्रयोगशालाओं में संस्कृतियों और कहीं और, यह दिखाया गया है कि astrocytic योगदान endothelial BBB सुविधाओं में सुधार लाने और बाधा तंगी को बढ़ाने में सक्षम है 21 , ४० , ४२ , ४९ , ७९ , ८१ , ८२ , ८३. pBECs में BBB phenotype की ऐसी उच्च अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, हमने astrocytes के साथ एक एनसीसी की स्थापना की और पाया कि दोनों सुअर और चूहे प्राथमिक astrocytes लाभकारी थे, जैसा कि अंय प्रयोगशालाओं में भी22में मनाया गया । astrocyte NCCs की स्थापना के दौरान, अनुभव से पता चला है कि पवित्रता और astrocyte संस्कृतियों की उंर के परिणामस्वरूप endothelial बाधा जकड़न प्रभावित, डब्ल्यूastrocytes की इष्टतम आयु 2-8 सप्ताह जा रहा है, जो समय के साथ astrocyte आकृति विज्ञान में एक मनाया परिवर्तन के साथ संबद्ध है । एनसीसी की स्थापना के पहले दिन, astrocytes के लिए एक मध्यम परिवर्तन के लिए हानिकारक चयापचयों को दूर करने और astrocytes के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए उत्तेजना और संकेत कारक बाधा विकास को प्रभावित जारी करने के लिए करना है । जब पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली में endothelial कोशिकाओं और astrocytes को सह-संवर्धन, तो बैरियर मॉडल की हैंडलिंग पर विशेष ध्यान देना जरूरी है । मध्यम परिवर्तन के दौरान, दोनों आकांक्षा और माध्यम के अलावा और आवेषण की गतिविधियों को ध्यान से किया जाना चाहिए ताकि endothelial बाधा के विघटन को कम करने के लिए ।

Reproducibility और विश्वसनीयता

इन विट्रो मॉडल में स्थापित करने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करते समय एक बड़ी चुनौती संस्कृतियों के बीच उच्च reproducibility को प्राप्त करने के लिए है । इस तरह के मानकीकरण विधि के चयन, उच्च गुणवत्ता वाले उपकरणों और रिएजेंट के उपयोग से मुलाकात की जा सकती है, और microdissection में अनुभव । प्रस्तुत विधि के लिए कम बैच-to-बैच भिन्नता के साथ उच्च reproducibility इसलिए वर्णित प्रक्रियाओं के लिए सख्त पालन पर अत्यधिक निर्भर है ।

को तीळ माप के दौरान बैचों और शीशियों के बीच एक अच्छा reproducibility प्राप्त करने के लिए, एक ऊतक प्रतिरोध मापन कक्ष या कठोर लघु इलेक्ट्रोड के साथ उपकला voltmeters, बजाय लचीला chopstick इलेक्ट्रोड इस्तेमाल किया जा सकता, को कम करने स्वीकार्य तीळ मूल्यों की परिवर्तनशीलता । उच्च तीळ मूल्यों को प्राप्त करने के अलावा (चित्रा 4), प्रस्तुत मॉडल की विश्वसनीयता इसी कम छोटे घुला हुआ पारगम्यता (चित्रा 4) द्वारा पुष्टि की है, और pBECs के immunocytochemical लक्षण वर्णन (चित्रा 5 ).

लागू की गई विधि और मॉडल की सीमाएं

पिछले दशकों के दौरान ट्रांसजेनिक और लघु सूअरों का उपयोग बढ़ा है, लेकिन vivo डेटा की मात्रा अभी भी कुतर मॉडलों के लिए उपलब्ध डेटा की तुलना में सीमित है, और इसलिए इन विट्रो सुअर डेटा की तुलना के लिए एक चुनौती पैदा कर सकता है vivo में परिणाम के साथ । हालांकि, सुअर के जीवविज्ञान के रूप में मानव जीव विज्ञान कई स्थापित प्रयोगशाला पशुओं की तुलना में अधिक निकटता को दर्शाता है, और अल्जाइमर रोग जैसे स्नायविक रोगों का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक सुअर मॉडल अब स्थापित किया गया है८४, की उपलब्धता vivo में डेटा समय के साथ कम समस्याग्रस्त बनने की उंमीद है ।

BBB के वर्तमान पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली मॉडलों की एक सीमा microvessels में रक्त के प्रवाह की नकल करने में असमर्थता है । vivo में, कतरनी तनाव विभाजन के रूप में endothelial कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित दिखाया गया है, भेदभाव, माइग्रेशन और apoptosis८५,८६, और जैसे महत्वपूर्ण BBB विशेषताओं को प्रभावित करने के लिए जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति है, और प्रेरण और ट्रांसपोर्टरों के ध्रुवीकरण६१,८५,८७। ऐसी स्थितियों को लागू करने के लिए, नव विकसित microfluidic सिस्टम को८८,८९,९०माना जा सकता है ।

एक उपयोगी विधि से उभारा पानी परत (जलीय सीमा परत) के प्रभाव के लिए सही करने के लिए इन विट्रो पारगम्यता डेटा में से अनुमान लगाया गया है ' आंतरिक पारगम्यता ' vivo में, सॉफ्टवेयर आधारित का उपयोग कर21दृष्टिकोण. यह सॉफ्टवेयर भी विस्तृत पारगम्यता डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है21.

भविष्य अनुप्रयोगों और विधि के लिए दिशा-निर्देश

neurovascular इकाई के घटक के रूप में उत्प्रेरण और BBB सुविधाओं को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, और कोई वर्तमान इन विट्रो मॉडल अभी तक पूरी तरह से vivo परिस्थितियों में नकल करने में सक्षम है, महत्वपूर्ण घटक और इंटरैक्शन अभी भी अनुपलब्ध हो सकते हैं. प्रस्तुत मॉडल विकसित करने में वर्तमान प्रयासों astrocytes और pericytes दोनों के साथ ट्रिपल संस्कृति मॉडल की स्थापना शामिल है, और प्रयोगों विभिन्न प्रजातियों की कोशिकाओं के संयोजन. pericytes के शामिल अभी तक काफी बाधा के तीळ स्तर को बढ़ाने के लिए नहीं मनाया गया है । हालांकि, syngeneic सुअर मॉडल ट्रिपल संस्कृतियों सुअर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं, चूहे astrocytes का उपयोग करने के लिए तुलनीय होना करने के लिए मनाया गया है, और चूहे की पहचान की जकड़न और मस्तिष्क की बानगी प्रोटीन विशेषता की अभिव्यक्ति के संबंध में pericytes endothelium२२. मानव कोशिकाओं के आधार पर एक मॉडल विकसित करने के लिए, इन विट्रो में BBB दवा की खोज और वितरण के लिए मॉडल मानव pluripotent स्टेम सेल और वयस्क स्टेम और/या जनक कोशिकाओं21के व्युत्पत्ति पर भरोसा कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट में हितों का टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Elisabeth हेलेना Bruun, सारा क्रिस्टीन Christensen, और नील्स एम Kristiansen तकनीकी सहायता के लिए, और Lundbeck फाउंडेशन अनुदान संख्या R155-2013-14113 स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

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