Forbedret metode til etablering af et In Vitro blod - hjerne barrieren Model baseret på svin hjernen Endothelial Cells

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Formålet med protokollen er at præsentere en optimeret procedure for etableringen af et in vitro- blod - hjerne barrieren (BBB) model baseret på primær svin hjernen endothelial celler (pBECs). Modellen viser høj reproducerbarhed, høj tæthed, og er velegnet til studier af transport og intracellulære menneskehandel drug discovery.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Formålet med denne protokol præsenterer en optimeret procedure for rensning og dyrkning af pBECs og at etablere in vitro- blod - hjerne barrieren (BBB) modeller baseret på pBECs i mono-kultur (MC), MC med astrocyte-aircondition medium (ACM), og ikke-kontakt Co kultur (NCC) med astrocytter af svin eller rotte oprindelse. pBECs blev isoleret og kulturperler fra fragmenter af kapillærer fra hjernens cortex af tamsvin 5-6 måneder gamle. Disse fragmenter blev renset ved omhyggelig fjernelse af meninges, isolation og homogenisering af grå materie, filtrering, enzymatisk fordøjelse og centrifugering. Du kan yderligere fjerne forurenende celler, kapillær fragmenter blev kulturperler med puromycin-holdige medium. Når 60-95% sammenflydende, pBECs vokser fra de kapillære fragmenter blev passaged til permeabel membranfilter indsætter og etableret i modellerne. For at øge trykken for barriere og BBB karakteristiske Fænotypen af pBECs, cellerne blev behandlet med følgende differentiering faktorer: membran permeant 8-CPT-cAMP (her forkortet cAMP), hydrocortison og en phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). Proceduren blev udført over en periode på 9-11 dage, og ved fastsættelsen af NCC model, astrocytter var kulturperler 2-8 uger på forhånd. Overholdelse af de beskrevne procedurer i protokollen har tilladt oprettelsen i endothelial lag med meget begrænset paracellular permeabilitet, med NCC model viser en gennemsnitlig transendothelial elektrisk modstand (TEER) i 1249 ± 80 Ω cm 2, og paracellular permeabilitet (Papp) for Lucifer gule af 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sek-1 (betyde ± SEM, n = 55). Yderligere evaluering af denne pBEC fænotype viste godt udtryk for den stramme junctional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin og adherens krydset protein p120 catenin. Modellen præsenteres kan bruges til en række undersøgelser af BBB i sundhed og sygdom, og med yderst restriktive paracellular permeabilitet, denne model er velegnet til studier af transport og intracellulære handel.

Introduction

Cellulære struktur og funktion af blod - hjerne barrieren

På grænsefladen af kredsløbssygdomme og centrale nervesystem (CNS) fungerer BBB som et centralt regulerende site for homoeostatic kontrol af CNS mikromiljø, der er afgørende for korrekt funktion og beskyttelsen af nervesystemet. Webstedet for BBB er i endothelial celler foring blodkar lumen. I hjernen kapillærerne, endotelceller danner komplekse intercellulære stramme kryds og stærkt polariseret udtryk mønstre af særlig tilstrømning og efflux transportvirksomheder sikre meget specifikke molekylære transport mellem blod og hjerne 1. De strukturelle komponenter af stram vejkryds komplekser omfatter proteiner fra occludin og claudin familie, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin og tilknyttede junctional adhæsionsmolekyler (syltetøj). Claudin 5 er særlig vigtigt i paracellular junctional begrænsning. Induktion og vedligeholdelse af denne karakteristiske BBB endotel fænotype inddrage dynamiske interaktioner med omkringliggende celler, herunder pericytes, astrocytter, neuroner og kælderen membraner, der sammen med hjernen endothelial celler form de neurovaskulære enhed (NVU)2,3. De mekanismer, der er involveret i disse interaktioner er endnu ikke fuldt forstået, men omfatter udveksling af kemiske signaler mellem cellerne, som gør det muligt for graduering af BBB permeabilitet i kortsigtet og inducerer langsigtede BBB funktioner4. Astrocytter især er kendt for at bidrage til hjernen endotel celle fænotype og er en kilde til regulerende faktorer såsom glial-afledte neurotrope faktor (påvirker intracellulære cAMP)5, basic fibroblast vækstfaktor6, hydrocortison7, og omdanne vækst faktor β (TGF-β)8. Effekten af TGF-β, har imidlertid været debatteret9.

Fra In Vivo til In vitro- BBB

In vivo undersøgelser fortsat at give værdifulde oplysninger om BBB biologi. Dog kan celle kultur modeller give yderligere indsigt og udgør nyttige værktøjer for at forstå detaljeret molekylær og funktionelle aspekter af BBB i både sundhed og sygdom. Selv om det komplekse samspil mellem celletyper og bestanddele af BBB er vanskeligt at opnå fuldt i in vitro- modeller, har der været, siden den første oprensning i endothelial hjerneceller og anvendelsen af disse i mono-kultur 10 , 11 , 12, omfattende udvikling af rensning procedurer og vækstbetingelser for BBB celle kultur modeller, resulterer i større lighed i vivo barriere. De almindeligt anvendte in vitro- BBB modeller er baseret på primærelementer gnaver, svin og kvæg, og udødeliggjort cellelinjer. Hver model har forskellige fordele og ulemper. Til sammenligning og model valg, er validering markører som udtryk for BBB enzymer, transportører, receptorer og strukturelle proteiner brugt til at oprette oversigter over de aktuelle etablerede modeller1.

Formålet med protokollen

Et vigtigt element i BBB barriere tæthed og høj TEER, endnu et stort antal af de tilgængelige modeller afspejler ikke godt in vivo -niveauer. Indarbejde udvikling og optimering bidrag fra flere laboratorier, er formålet med denne protokol at præsentere en metode til fastlæggelse af en høj TEER i vitro BBB model baseret på primær pBECs i MC med eller uden ACM eller i NCC med primær astrocytter rotte eller svinecellekulturer. De anvendte procedurer og etableringen af model omfatter bestræbelser på at fjerne forurenende celler og forbedre differentiering af pBECs i en BBB fænotype. Dette arbejde har resulteret i oprettelsen af pålidelige, høj TEER modeller med lav paracellular permeabilitet og gode funktionelle udtryk for centrale stramme junctional proteiner, transportvirksomheder og receptorer. Men som astrocytter er en medvirkende faktor til hjernen endotel celle fænotype, de tre forskellige betingelser for kultur repræsenterer tre forskellige fænotyper i endothelial hjerneceller. NCC model er specielt nyttigt for studier af visse specialiserede mekanismer involveret i drug discovery, transport studier og intracellulære handel, samt for undersøgelsen af celle-celle interaktioner hvor maksimal udtryk for BBB funktioner er fordelagtig.

Oprindelse og historie af protokollen

PBEC model beskrevet her er stort set baseret på svin model udviklet på Eisai laboratorier (London) af Dr. Louise Morgan og kolleger, Religious baseret på en vellykket tidligere bovin hjernen endotel celle model13. Den oprindelige metode til celle forberedelse var en to-trins filtrering ved hjælp af nylon masker for at fange microvessels, efterfulgt af en podning skridt til at forbedre renhed. I den tidligere udvikling af metoden, optimal BBB fænotype og barriere trykken blev opnået ved vækst i suppleres med medium, herunder ACM. Yderligere ændringer af metoden, der blev foretaget af R. Skinner i Prof N. Rothwell lab i Manchester UK14,15. Metoden blev vedtaget af Abbott laboratorium, KCL London, hvor Patabendige gjort det betydeligt enklere at forberede ved at undgå brug af astrocytter eller ACM og ved at fjerne forurenende celler som pericytes med puromycin. De første aviser bekræftet at MC model bevaret flere vigtige funktioner i vivo BBB, herunder effektiv stramme kryds, membran transportsystemer og receptor-medieret transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. senere S. Yusof igen testet astrocyte Co kultur og fundet det væsentligt forbedret TEER, så dette er den foretrukne variant i øjeblikket anvendes i Abbott lab21. Modellen er nu blevet overført til M. Nielsen lab i Århus, hvor yderligere ændringer er blevet indført (denne protokol), herunder forenkling grå sagen udvinding, ved hjælp af kun én maske filtrering skridt og et enkelt filter belægning skridt kombinere kollagen og fibronektin. Den anvendte procedure for isolation af svin astrocytter (denne protokol) var baseret på protokoller udviklet af T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrevet af Thomsen mfl22. TEER og andre egenskaber for den model, der er genereret i London og Aarhus er lignende, som giver tillid til forestillingen om, at modellen overføres let mellem labs og reagerer godt på omhyggelig observation og rationalisering af metode trin. Faktisk, S. Yusof har nu etableret MC model i et tropisk land (Malaysia)23, som involverede yderligere tilpasning til lokale forhold og væv kilder.

Fordele over Alternative metoder og i øjeblikket etableret modeller

I forhold til hjerne endotelceller af kvæg og gnaver oprindelse, giver pBECs fordelen at have en lavere sats for tab af den i vivo BBB fænotype efter isolation24. PBECs er desuden i stand til at danne relativt stram endotel barrierer, selv når der dyrkes i MC (800 Ω cm2)16 i forhold til de almindeligt rapporterede niveauer for encellelag af cellelinjer som bEND.5 og bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, cenden (300-800 Ω cm2)28,29,30, og cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32og primære hjerne endotelceller mus (100-300 Ω cm2)SS = "xref" > 33,34,35,36 og rotte (100-300 Ω cm2)37,38. TEER har imidlertid vist afhængighed på procedurerne for rensning og kultur. I de fleste tilfælde viser tilføjelsen af ACM eller fælles kultur med astrocytter differentiering effekter på i endothelial celler og en stigning i trykken i endothelial lag1. Ikke desto mindre med bestræbelser på at optimere dyrkningsbaserede betingelser, kun kvæg-baserede modeller har vist TEER værdier sammenlignes med de svin-baserede modeller (gennemsnit af 800 Ω cm2 i MC, op til 2500 Ω cm2 i astrocyte fælles kultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Som modeller baseret på primære bovine hjernen har endotelceller vist store variationer, både mellem og inden for laboratorier14,45,46,47,48, reproducerbarhed kunne være et problem. I den pBEC model rapporteret her, har de medvirkende laboratorier opnået meget lignende TEER og paracellular permeabilitet værdier med lav variabilitet, både i og mellem laboratorier. Derfor bør det være muligt for andre laboratorier til at etablere en robust model med lav variabilitet ved hjælp af den metode, der præsenteres her. Ud over danner stramme endotel lag, har udtryk for tight junction proteiner, funktionelle BBB transportvirksomheder, receptorer og enzymer og demonstreret egnethed til en række undersøgelser15 tidligere valideret modeller med pBECs , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Desuden upublicerede transkriptom data på fælles kulturer af pBECs viser en forventet profil af BBB transportvirksomheder og receptorer (ikke-offentliggjorte resultater, Nielsen et al.).

Svin-baserede BBB model har en yderligere fordel som genom, anatomi, fysiologi og sygdomsprogression grisen afspejler den menneskelige biologi i højere grad end andre etablerede modeller60, som er gunstige egenskaber for den lægemiddelindustrien. Som svin hjerner er en fælles biprodukt af kødindustrien, udgør de en let tilgængelig kilde til hjernen endotelceller, minimere antallet af dyr behov for eksperimenter, og leverer en høj rensning udbytte fra et svin hjernen. Selv om rensning og dyrkning af primærelementer er lidt tidskrævende og kræver ekspertise for standardisering i opsætning af modellen, generere primærelementer de mest pålidelige BBB modeller. Udødeliggjort cellelinjer kan ikke være en erstatning, som vigtige egenskaber såsom barriere trykken, transporter udtryk profiler og mikromiljø forordning ikke afspejler eksperimentelle resultater i vivo61, 62. in vitro modeller giver fordel af live-celle imaging med højere opløsning, hvilket gør visualisering af intracellulære processer mulige ved at tillade en tæt på tilgang til stikprøven eller observerede cellerne, ved hjælp af mål med højere forstørrelse og bedre optisk kvalitet63. Dette gælder ikke for anvendelse af to-foton mikroskopi i levende dyr. Derudover giver in vitro- modeller evnen til at transfect celler, giver mulighed for visualisering af mærket proteiner og undersøgelse af deres handel.

Anvendelser af modellen

Funktionen af BBB er ikke faste og kan moduleres dynamisk i både fysiologi og patologi. I mange neurologiske sygdomme, herunder neurodegenerative, er inflammatoriske og smitsomme sygdomme, forstyrrelser og øget gennemtrængelighed af BBB observeret64,65,66,67 . For at mindske og forhindre sygdomsprogression og efterfølgende skader, er identifikation og karakterisering af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for gradueringen af BBB af stor betydning. I denne forbindelse pålideligt in vitro- modeller er i høj efterspørgsel af den farmaceutiske industri, og desuden spille en vigtig rolle i at forudsige BBB permeabilitet af narkotika til CNS. Enhver i vitro model tjener som en permeabilitet skærm skal vise en restriktiv paracellular pathway, en fysiologisk realistisk celle arkitektur og funktionelle udtryk for transporter mekanismer68. Demonstreret i tidligere undersøgelser16,17,57, og af paracellular permeabilitet og udtryk for TJ og AJ proteiner her, præsenteres modellen opfylder alle disse kriterier og er velegnet til en vifte af BBB studier i både normal fysiologi og patologi. Styrkerne ved den præsenterede rensning og dyrkning metode omfatter en kombination af enkelhed og reproducerbarhed og evnen til at omfatte astrocytic indflydelse med en deraf følgende robust og pålidelig høj TEER i vitro BBB model. Til dette formål, astrocytter af svin og rotte oprindelse har vist sig at forøge BBB Fænotypen af pBECs i en lignende måde22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

svin hjerner blev fremstillet som biprodukter af den danske fødevareindustri. Danske slagterier er under streng kontrol og observation af danske Ministeriet for miljø og fødevarer.

rotter bruges til isolering af astrocytter blev avlet og opstaldes i den lokale Dyrefacilitet ved en omgivende temperatur på 22 ° C - 23 ° C og på en 12/12 h mørk/lys cyklus under inspektion af en dyrlæge og efter dansk regler for lab dyr. Rotterne blev aflivet før de blev ofret i overensstemmelse med internationale retningslinjer for den etiske brug af dyr (Europæiske Fællesskabers Rådetsdirektiv af 24 November 1986; 86/609/EØF) og danske retningslinjer. Ingen i vivo eksperimenter på dyr eller menneskeligt materiale blev anvendt i disse eksperimenter.

Bemærk: nedenstående er en pBEC vigtigste protokol beskriver (trin 1) vandrensning, (trin 2) dyrkning og (trin 3) TEER målinger. Opsætning af en NCC med astrocytter, præsenteres en alternativ protcol (trin 4) beskriver rensning og dyrkning af rotte og svin astrocytter.

1. rensning af svin hjernen kapillærerne

  1. indsamle 8-10 hjerner fra 5-6-måned-forhenværende tamsvin (f.eks. fra en nærliggende slagteri) og transportere dem på is til laboratoriet. Vi anbefaler at starte følgende rensning fremgangsmåde inden for 2-3 h for dyret afslutning.
  2. Placere hjerner i en steril flow-bænk og forsigtigt vaske dem med 1 L PBS i et bægerglas anbragt på ice.
  3. Omhyggeligt fjerne meninges fra en hjerne på et tidspunkt ved hjælp af fine-spids pincet og overføre de meninges-fri hjerner til en anden 1 L bæger med PBS placeret på is. Udvide den tid, det tager kan komplicere fjernelse. Den omtrentlige tid for hver hjerne skal være 10-15 min.
  4. Ved hjælp af en skalpel, skrabe ud grå materie fra en hjerne på et tidspunkt og overføre den isolerede materiale til petriskåle (8,8 cm 2) indeholdende 20 mL DMEM næringsstof blanding F-12 (DMEM/F-12) placeret på is. Isolere som meget grå materie som muligt uden at trække hvide substans materiale. For indledende fragmentering, køre det grå materie materiale gennem en 50 mL sprøjte uden nål. Fortsæt til alle hjerner og samle materialet, der opsamlet grå materie. Udvide den tid, det tager kan komplicere fjernelse. Den omtrentlige tid for hver hjerne skal være 10-15 min.
  5. Overføre isolerede grå materie materiale til grinder tube af en håndholdt væv homogeniseringsapparat i et forhold på 50/50 med DMEM/F-12 medier. Homogeniseres materialet ved at gøre 8 op og ned slagtilfælde med en løs pistil, efterfulgt af 8 op og ned slagtilfælde med en stram pistil. Fortsætte indtil alle isoleret materiale har været homogeniseret, derefter overføre homogenatet til en 500 mL flaske og fortyndes med DMEM/F-12 til ca 450 mL samlede volumen.
  6. Filtrer homogenatet ved hjælp af en 500 mL blå-cap flaske med filterholder og 140 µm filter-mesh og isolere kapillærerne ved at køre vævet gennem filteret. Bruge ét filter per 50 mL af homogenatet og vask hver filter med DMEM/F-12 bagefter.
  7. Sted kapillær-holdige filtre i petriskåle med en fordøjelsen løsning af trypsin/EDTA (2,5% trypsin, 0,1 nM EDTA i PBS), collagenase CLS2 (2.000 U/mL) og DNase 1 (3400 U/mL) i DMEM/F-12. Brug 1 petriskål (8,8 cm 2, 20 mL opløsning) pr. 3 filter masker.
  8. Sted i petriskåle ved 37 ° C i 1 time på en orbitalryster på 180 rpm eller rør dem forsigtigt hver 10 min. Efter 1 time, vaske af kapillærer fra filtrene med suspension fra petriskål ved hjælp af 1 mL pipette.
  9. Opdelt suspension fra de 3 retter i 2 50 mL rør og stopper fordøjelsen ved at føje 10 mL DMEM/F-12 til hver 50 mL tube.
  10. Centrifuge celle-suspensioner på 250 x g, 4 ºC i 5 min. Opsug analysere og genopslæmmes hver pellet i 10 mL af DMEM/F-12. Tilføje en yderligere 20 mL DMEM/F12 til hver tube. Gentag trinnet centrifuge dobbelt.
  11. Lad rør køle ned i isbad i 5 min og overføre løsningerne til 2 nye 50 mL rør.
  12. Centrifugeres celle-suspensioner på 250 x g, 4 ºC i 5 minutter, og genopslæmmes hver pellet i 8-10 mL (ca. 1 mL/hjerne brugt) af indefrysning løsning bestående af 10% DMSO i FBS.
  13. Overføre cellesuspension til cryovials, ved hjælp af 1 mL pr cryovial. I gennemsnit resulterer en rensning i 1 hætteglas pr. hjerne bruges, i gennemsnit giver endotelceller til 12-16 skær. Placer hætteglassene i en indefrysning boks ved-80 ° C i mindst 4 h op til natten. Bagefter, gemme cryovials i en cryotank med flydende nitrogen.
    Forsigtig: Flydende nitrogen har ekstremt lave temperaturer. Venligst bære passende beskyttelse.

2. Dyrkning af primære pBECs (8-10 dage)

  1. Oprindelige kultur (3-5 dage)
    dag 1
    1. at optimere betingelserne for fastgørelse af pBECs, udfører belægning af en kolbe på T75 ved at tilføje en løsning med endelige koncentrationer af kollagen IV (150 µg/mL) og fibronektin (50 µg/mL) i ddH 2 O kolben, og sørg for, at løsningen dækker hele overfladen. Brug 10 mL for hver T75 kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 h.
      Bemærk: Belægningen kan være udført lige før brug eller op til en uge før og opbevares med PBS ved 4 ° C. Belægningen må ikke tørre ud, eller det vil ikke længere være en egnet vedhæftet fil og vækst overflade.
    2. Forberede 16 mL af pBEC vækst medium bestående af DMEM/F-12 suppleret med 10% plasmaafledte serum (PDS), (100 U/mL) penicillin, streptomycin (100 µg/mL) og heparin (15 U/mL). Supplere medium med puromycin (4 µg/mL) til at vælge i endothelial celler. Vær opmærksom på at puromycin behandling kan kun bruges til højst 5 dage.
    3. Alikvot rede medium i 6 mL og 10 mL diskenheder i to 15 mL rør.
    4. Bringe et hætteglas med kapillærer fra flydende kvælstof (trin 1.13) og tø kapillærerne ved brug af et 37 ° C vandbad eller ved at tilføje 750 µL af den forberedte medium fra 6-mL delprøve. Hvis optøning ved at tilføje medium, omhyggeligt pipetteres op og ned for at tø og homogeniseres suspension. Når optøet, overføre cellesuspension til 6 mL medium alikvot.
    5. Hvis du vil fjerne indefrysning medium, spin kapillærer ned på 250 x g, 4 ° C i 7 min.
    6. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og genopslæmmes toerstoffet i 10mL delprøve 1-2 mL. Når opløsningen re suspenderet, overføres til 10mL medium alikvot.
    7. Overføre kapillær suspension coated T75 kolben og vippe forsigtigt kolben for at sikre ligelig fordeling over overfladen. Kolben T75 anbringes ved 37 ° C, 5% CO 2.
      Dag 2
    8. Efter natten inkubation, forberede 10 mL pBEC vækstmediet suppleret med puromycin (4 µg/mL) for en T75 kolben og udføre en medium forandring. Vær opmærksom på at alle mellemstore løsninger anvendes på celler bør være pre opvarmet til 37 ° C før brug.
      Bemærk: Alternativt en medium forandring kan være udført 4-6 h post plating når kapillærer bør have knyttet til overfladen. Inkuber cellerne indtil 60-95% sammenløbet er opnået, normalt 3-5 dage efter optøning. Gør ikke allow celler at nå 100% sammenløbet for at undgå kontakt-hæmning, der kan standse yderligere celle vækst.
      Dag 4-6
    9. Når den ønskede confluency er opnået, passage i endothelial celler til at permeabel membran skær (Se afsnit 2.2). Hvis den ønskede confluency ikke er opnået på dag 4, udføres ændring af medium. Senest på dag 6 skal celler være passaged på permeabel membran skær. Hvis den krævede confluency ikke opnås ved dag 6, cellerne er ikke egnet til eksperimenterende brug.
      Bemærk: forberedelse af astrocytter for NCC: når du opretter fælles kultur model, 2 - 8 uger gamle astrocytter i kultur (Se afsnit 4) bør være forberedt på fælles kultur model ved at udføre en mellemlang ændring på dagen før passaging endotelceller til skær. For hver astrocyte, forberede 1500 µL af astrocyte vækstmediet bestående af DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS, (100 U/mL) penicillin og streptomycin (100 µg/mL) og derefter udføre medium ændringen.
  2. Vækst i pBECs på permeabel membran indsætter (5 dage)
    dag 4-6
    1. Forbered permeabel membran indsætter (12-godt plade med skær af 1.12 cm 2 areal, 0,4 µm porer) for såning af pBEC ved coating med kollagen IV (500 µg/mL) og fibronektin (100 µg/mL) i ddH 2 O. brug ca. 300 µL for hvert sæt, og sørge for, at løsningen dækker hele vækstarealet. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 for et minimum af 2 h.
    2. Udarbejde pBEC vækstmediet. 30 mL (for medierne sammensætning, der henvises til afsnit 2.1.2) uden puromycin.
    3. Opsug medium fra pBEC kultur i T75 kolbe og forsigtigt vaskes to gange med 5 mL steril PBS ved stuetemperatur.
    4. Trypsinize celler ved tilsætning 2 mL Trypsin-EDTA-oploesning (2,5% trypsin, 0,1 nM EDTA i PBS) til T75, og kolben anbringes ved 37 ° C, 5% CO 2 til 5-7 min.
    5. At løsne i endothelial hjerneceller, tryk forsigtigt på siden af T75 kolben med fingerspidserne, til sidst forlader overlevende og stærkere knyttet pericytes på overfladen af kolben. Visuelt undersøge detachement under et mikroskop. Når 80% udstationering er observeret, stop trypsinization ved at tilføje 5 mL medium.
    6. Celle opløsning overføres til en 15 mL rør ved hjælp af en 10 mL pipette og spin ned i endothelial hjerneceller ved centrifugering ved 250 x g, 4 ° C i 7 minutter.
    7. Omhyggeligt fjernes supernatanten og resuspenderes i 1mL medium. Når suspenderet, tilføje yderligere 2 mL af medium til at bringe den samlede mængde til 3 mL
    8. tæller antallet af celler manuelt ved hjælp af en celle tæller kammer eller en automatisk celle tælle system. Forberede en celle løsning 2.2 x 10 5 celler/mL medium, hvilket resulterer i en endelig seeding tæthed af 1,1 x 10 5 celler/insert.
    9. Fjerne belægning løsning fra permeabel membran skær og overføre 500 µL af cellesuspension til hver Indsæt. På en af skærene, tilføje eneste medium og bruge denne Indsæt som et ' filter kun ' kontrol for TEER målinger.
    10. Etablere i endothelial celler i MC, MC med ACM, eller i NCC med astrocytter på følgende måde:
      1. For MC: tilføje 1500 µL af pBEC vækst medium/ACM pr. brønd af 12-godt pladen nedenunder permeabel membran skær. Placer permeabel membran skær ved 37 ° C, 5% CO 2 og inkuberes i 2 dage.
      2. For NCC: overførsel indsætter brønde med astrocytter forfrisket med astrocyte vækstmediet dagen før. Placer permeabel membran skær ved 37 ° C, 5% CO 2 og inkuberes i 2 dage.
        Bemærk: Vær opmærksom på brugen af forskellige medietyper i bunden wells af de tre modeller.
        Dag 6-8
    11. På dag 2, ændre medier på permeabel membran skær med pBECs. Forberede 500 µL af pBEC vækstmediet pr. insert, og omhyggeligt udføre Skift for at minimere forstyrrelser af cellelag. Inkuber cellerne i to dage. Være opmærksom på, at medierne ændringen udføres på skær kun, og ikke på bunden wells.
  3. Stimulation med differentiering faktorer (1-2 dage)
    dag 8-10
    1. For hver af de forskellige modeller, stimulation medier bør forberedes som følgende:
      1. For MC: For hver Indsæt og godt, forberede 500 µL af pBEC vækstmediet indeholdende cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM).
        MC: Forbereder desuden 1500 µL af pBEC vækstmediet indeholdende cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM).
        MC med ACM: tø 1500 µL af ACM og supplere det med cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM).
      2. For NCC: For hver Indsæt, forberede 500 µL af pBEC vækstmediet indeholdende cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM). For hver astrocyte godt, forberede 1500 µL af DMEM/F-12 suppleret med penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 µg/mL), heparin (15 U/mL), cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM).
    2. For hver af de forskellige modeller, udføre medier udveksling som følger:
      1. For MC: omhyggeligt Aspirér medium fra brønde og skær og tilføje differentiering medium til begge rum, bruger 500 µL til hver Indsæt og 1500 µL til hver brønd. Vær opmærksom på at forstyrrelser på begge sider for skæret kan påvirke og forstyrre cellelag.
      2. For NCC: omhyggeligt Aspirér medium fra brønde og tilføje 750 µL differentiering medium pr. brønd. Omhyggeligt Aspirér medium fra skær og tilføje 500 µL differentiering medium pr. Indsæt. Derefter tilføje de resterende 750 µL differentiering medium til hver godt astrocyte.
    3. For alle modeller: placere cellerne ved 37 ° C, 5% CO 2 og inkuberes med differentiering medium indtil næste dag.
      Bemærk: Være opmærksom på at for NCC med astrocytter, astrocytter er fra dette punkt, holdt i serumfrit medium.

3. TEER målinger

  1. på dagen efter stimulerende celler med differentiering medium, Forbered væv modstand kammer målesystem TEER målinger ved skylning salen to gange med ddH 2 O, én gang med 70% EtOH for 5 min og 2 gange mere med ddH 2 O.
  2. Tilsættes 4 mL af DMEM/F-12 til væv modstand måling kammer, tilsluttes systemet og kalibrere i ca 30 min pr følgende indstillinger: R = 0, Test R = 1000, Mode = R.
  3. Udføre TEER målinger af omhyggeligt placere indsætter i væv modstand måling kammer. For hver Indsæt, udføre målinger i tre eksemplarer og beregne den gennemsnitlige Ω cm 2.
    Bemærk: For modellens Co kultur TEER værdier er forventes at nå > 500 Ω cm 2. Hvis den relevante TEER niveau ikke er nået på den første dag i måling TEER, tilføje nye differentiering faktorer (cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) og RO (17,5 µM)) og måle TEER igen på den følgende dag. Når passende niveauer er opnået, skulle modellen være klar til den planlagte eksperiment. Være opmærksom på, at cellerne skal hvile i mindst 3 timer før du udfører eksperimentet at inddrive efter TEER målinger. Efter stimulation, TEER værdier generelt er acceptable i 24-48 timer efter stimulation.
    NOTE: En alternativ og hurtigere metode ved hjælp af stive STX - 100C elektrode parret også registrerer høj TEER i denne model 81. Den fleksible STX2 electrode par giver mindre pålidelige aflæsninger.

4. FORBEREDELSE af ASTROCYTTER FOR ikke-kontakt Co kultur: Alternativ metode

  1. Rensning af astrocytter
    1. For hver rotte hjernen anvendes, pels 2 T75 kolber ved tilsætning af 10 mL af poly-L-lysin (5 µg/mL) i ddH 2 O til hver T75 kolbe. Inkuber kolberne ved 37 ° C i 30 min.
    2. Isolation af astrocytter kan udføres som følger:
      1. rotte astrocytter:
        1. Decapitate 2 1 - 2 dage gamle rotter ved hjælp af en godkendt metode.
        2. Skæres skindet kraniet start fra nakken mod næsen, og skåret ben med en sagittal indsnit.
        3. Åbne kraniet med buet pincet, tegne hjernen og placere det i en 15 mL tube (tube 1) med 11 mL DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og phosphatbufferet sulfat (125 µg/mL).
        4. Forsigtigt fjerne meninges ved hjælp af fine-spids pincet og suspendere hjernen materiale ved hjælp af 1 mL pipette.
      2. Svin astrocytter:
        1. få 1 hjernen fra en 5-6-måned-forhenværende indenlandsk gris.
        2. Forsigtigt fjerne meninges fra hjernen bruger bøde-spids pincet og/eller hænder.
        3. Indsamle 4 g grå sagen fra hjernen og placere brikkerne i 1-2 mL DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og phosphatbufferet sulfat (125 µg/mL) i en petriskål. Hvis stykker er store, hakkekød med skalpel eller pincet.
        4. Suspendere den isolerede materiale ved hjælp af 1 mL pipette, flytte den til en 15 mL tube (tube 1) og fyld med DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og phosphatbufferet sulfat (125 µg/mL) til en samlet maengde paa 11 mL.
        5. Fortsætte homogenisering isolerede materialet med en lang nål knyttet til en 10-mL sprøjte og suspendere op og ned 3 gange. Vent, indtil de store stykker har slået sig ned i bunden af røret, så indsamle 7 mL medium fra toppen af røret (tube 1).
        6. 7-mL cellesuspension filtreres på et 40 µm nylon filter ind i en ny 50 mL tube (tube 2).
        7. Tilføje 7 mL medium til tube 1 med hjernen. Fortsætte homogenisering og filtrering fra trin 4.1.2.2.5-6 indtil mængden af filtreret cellesuspension i tube 2 er ca. 35 mL.
    3. Fjerne belægning løsning fra T75 kolber [trin 4.1.1]. En hurtig vask med 5 mL PBS efter inkubation med poly-L-lysin kan bruges til at sikre, at cellerne ikke er skadet af eventuelle toksiske effekter af belægning løsning.
    4. Kløft og seed de isolerede astrocyte løsning ligeligt mellem T75 kolber. Inkuber kolberne ved 37 ° C, 5% CO 2 til 3-5 dage.
  2. Dyrkning astrocytter og forberede NCC med Endothelial celler (3 uger)
    1. Oprindelige kultur
      1. efter 3-5 dages inkubation, udføre en mellemlang ændring af omhyggeligt sugning medium og tilsætning af 10 mL af DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og phosphatbufferet sulfat (125 µg/mL).
        Bemærk: Efter den første medium forandring, medium bør ændres hver 5 dage. I de første 2 uger, ryste kolberne og cellerne vaskes grundigt med PBS når skiftende medium. Dette hjælpemidler i fjernelse af kontaminerende mikroglia.
      2. Efter 3 uger af dyrkning, trypsinize celler ved tilsætning 2 mL Trypsin-EDTA-oploesning til bunden af hver T75 kolben, og der inkuberes dem ved 37 ° C, 5% CO 2 til 5-7 min.
      3. Stop trypsinization ved tilsætning af 5 mL af medium, overføre den celle løsning til en 15 mL tube og centrifugeres astrocytter på 250 x g, 4 ° C i 7 min.
      4. Omhyggeligt fjernes supernatanten og cellerne i frysning løsning, der består af 10% DMSO i FBS genopslæmmes.
      5. Tæller antallet af celler og forberede en celle løsning af 4,0 x 10 6 celler/mL. Fryse cellerne i cryovials tilsætning af 1 mL per vial.
    2. Vækst i permeabel membran indsætte System bunden Wells (2-12 uger)
      1. forberede vækst af astrocytter 12-godt plader ved tilsætning af 1 mL af poly-L-lysin (5 µg/mL) i ddH 2 O til hver brønd. Læg pladerne ved 37 ° C i 2 h.
      2. For hver 12-godt plade, udarbejde af astrocyte vækstmediet (DMEM lav glucose suppleret med 10% FBS og penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 µg/mL)) 25 mL.
      3. Bringe hætteglas af astrocytter fra flydende kvælstof og tø cellerne ved at tilføje 750 µL DMEM lav glucose medium. Omhyggeligt pipetteres op og ned for at tø og homogeniseres suspension. Når optøet, overføre cellesuspension til en 15 mL tube og tilføje medium til en samlet maengde paa 7 mL.
        Forsigtig: Flydende nitrogen er ekstremt lav temperatur, så bære personlige værnemidler som handsker.
      4. Hvis du vil fjerne indefrysning medium, spin kapillærer ned på 250 x g, 4 ° C i 7 min.
      5. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og cellerne i medium genopslæmmes.
      6. Fjerne belægningen fra wells af 12 godt pladerne og overføre cellesuspension til brønde ved hjælp af 1 mL pr. brønd. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Opdater medium hver tredje dag og kultur celler i mindst 2 uger før du bruger cellerne for Co kultur med endotelceller. Cellerne kan bruges til fælles kultur i op til 12 uger efter optøning, med den optimale alder at være 2-8 uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering af BBB In Vitro modeller

I metoden præsenteret, optimeret gennemført dyrkning af pBECs og oprettelse af permeabel membran Indsæt system med MC eller uden ACM eller NCC med astrocytter (figur 1) i en periode på 9-11 dage (figur 2). For udvalg i endothelial celler, en indledende kultur af renset kapillær fragmenter blev kombineret med puromycin behandling af højst 5 dage, hvilket eliminerede de fleste forurenende celler og fremmet vækst af spindel-formet endotelceller fra den kapillar fragmenter (fig. 3A-C). På dag 4-6, havde pBECs tilvækst til en confluency på 60-95%, vokser som ikke-overlappende, kontakt-hæmmede, langs justerede celler. Når cellerne havde nået de ønskede confluency, pBECs var belagt på kollagen IV og fibronektin belagt permeabel membran Indsæt filter membraner (1,12 cm2 areal, 0,4 µm porer) med en tæthed på 1,1 x 105 celler/insert, på hvilken de normalt dannes Konfluerende monolag efter 4 dage (dag 8-10 post isolation). Når Co dyrkning pBECs, var astrocytter rotte eller svinecellekulturer belagt på poly-L-lysin belagt bunden brønde i mindst 2 uger før du starter NCC (figur 3D). Ved fastlæggelsen af NCC, har erfaringen vist, at astrocytter kulturperler for 2-8 uger giver den bedste støtte til fremme af BBB fænotype i pBECs; inden for dette tidsrum dannede astrocytter sammenflydende kulturer med celler arrangeret i en honeycomb-lignende struktur (figur 3E-F). På dag 4 i permeabel membran Indsæt systemmodel (dag 8-10 indlæg isolation), celler blev stimuleret med cAMP, hydrocortison og RO til at øge barriere tæthed og BBB karakteristiske udtryk mønster af stramme junctional proteiner, transportvirksomheder, og receptorer.

Karakterisering af pBEC fænotype og Paracellular permeabilitet

Visuelle celle inspektion kombineret med TEER måling er rutinemæssigt de mest pålidelige måder at vurdere confluency og tæthed af i endothelial cellelag vokser på permeabel membran skær før eksperimenter. Figur 4 viser resultaterne fra to serier af eksperimenter til at vurdere lille molekyle narkotikamisbrug permeabilitet gennem BBB, TEER (afspejler ionisk permeabilitet) kontrolparametre, kombineret med tilsyneladende permeabilitet21 (Papp, cm s-1) af enten radiolabeled saccharose eller farvestof tracer Lucifer gul (LY), som afspejler paracellular permeabilitet af typiske små drug molekyler (~ 200-600 Da). En sammensat af interesse med et Papp større end Papp af saccharose eller LY (afhængigt af molekylevægt af narkotika) kunne foreslå transcellular permeabilitet og/eller transport på tværs af cellerne. Figur 4 viser, at i permeabel membran indsætter med pBECs kulturperler ovenfor rotte astrocytter, gode partier af pBEC (f.eks. her i LY indstillet) vil generere sine opdagere i området 500-2000 Ω cm2, med et par højere eller lavere. Nogle partier, især i tidlige stadier af læring i protokollen, kan have lavere sine opdagere omkring 100-900 Ω cm2 (f.eks. her saccharose sæt). TEER måling giver mulighed for valg af filtre, for eksempel med begyndende TEER > 500 Ω cm2, og over udvalg af TEER vist, Papp er relativt uafhængig af TEER, vejledende af en tilstrækkelig stram barriere lag for disse eksperimenter. Protokol til måling af permeabilitet afhænger af opløst stof/konstruktion. En beskrivelse af proceduren for måling permeabilitet af små molekyler i NCC, er en protokol, der beskrevet i Yusof, SR, et. Al21. Evaluering af udtryk for tight junction proteiner i pBECs i NCC med rotte astrocytter viste lokalisering af claudin 5, occludin og ZO-1 langs celle-celle vejkryds, som vist ved immunfluorescens (figur 5A-C). Adherens junction protein p120 catenin viste også, veldefinerede distribution langs celle-celle vejkryds (fig. 5 d).

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af de anvendte modeller, in vitro-BBB. Skematisk fremstilling af permeabel membran indsætte systemmodeller af pBECs i MC (A), MC med ACM (B)og NCC med astrocytter (C). I MC, enten pBEC vækstmediet eller ACM blev anvendt i bunden wells, mens i NCC, skær med pBECs blev placeret i brønde med 2-8-uge-forhenværende astrocytter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Flow diagram af de vigtigste skridt under pBEC dyrkning og etableringen af de præsenterede modeller. For et overblik og tidslinje for metoden opsummerer denne skematisk præsentation de vigtigste trin i proceduren dyrkning af pBECs og etableringen af de præsenterede modeller, dvs MC med eller uden ACM og NCC med astrocytter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant tidsforløb for oprindelige kulturer af pBECs og rotte astrocytter. Fase kontrast mikroskopi billeder af kulturer af pBECs (A-C) og astrocytter (D-F) set på over 5 dage. Renset kapillær fragmenter på den første dag i den oprindelige kultur viste tilstedeværelsen af både kapillærer og kontaminerende celler (A, dag 1), som efter medium forandring på dag 2 og en ekstra dag i vækst, viste udvalg for pBECs, deres vækst med udgangspunkt i de kapillære fragmenter (B, dag 3). Konfluerende monolag af pBECs blev normalt opnået på dag 4-6, på hvilket tidspunkt pBECs viste spindel-formet morfologi og blev justeret langs (C). Rotte astrocytter seedede i bunden brønde normalt tilvækst til sammenflydende lag inden for 5 dage (D-F), og blev brugt til NCC modeller efter 2 uger af vækst. Skalalinjen for alle billeder: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tight junction integriteten af pBECs. Tilsyneladende permeabilitet (Papp) af pBECs til paracellular markører saccharose (MW 342.5 14C-mærkede, 14,8-25,9 GBq/mmol) og Lucifer gul (MW 521.57, 10 µg mL-1), plottes TEER. pBECs blev dyrket på 1,12 cm2 permeabel membran Indsæt filtre ovenfor rotte astrocytter i bunden af brønden og markører tilføjet til den apikale kammer. Efter 1 time på 37 & #730; C, udseendet af markør i basal salen var målt og apikale til basal Papp (x 10-6 cm sek-1) beregnes. TEER blev målt > 3 h før Papp, ved hjælp af STX100C EVOM elektroder, korrigeret for Tom permeabel membran Indsæt filter med modstand 150 Ω. gennemsnitlige TEER for Lucifer gule datasæt var 1249 ± 80 Ω cm2 (betyde ± SEM, n = 55). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: andre karakterisering af pBECs. For pBECs dyrkes på 1,12 cm2 permeabel membran Indsæt indsætter filter ovenfor rotte astrocytter i base brønden, immunofluorescens mikroskopi analyse af stram vejkryds komponenter (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, og adherens krydset protein (D) p120 catenin viste veldefinerede lokalisering i celle-celle vejkryds og afslørede sammenflydende hjernen endotel cellelag med spindel-formet, ikke-overlappende celler. Skalalinjen for alle billeder: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rensning og spredning af pBEC

Under proceduren rensning omfatter kritiske trin hurtig og effektiv fjernelse af meninges og adskillelsen af hvide og grå sagen, hvilket er vigtigt for rensning udbytte og renhed og ordentlig etableringen af modellen. Præsenteres i vitro BBB model ved hjælp af pBECs, har vi forbedret og forenklet en rensning procedure baseret på mekanisk homogenisering af isolerede grå materie, størrelse-selektiv filtrering til isolation af microvessels, fordøjelsen med collagenase , DNase og trypsin, med en indledende kultur af microvessel fragmenter. Generelt er en af de største udfordringer under rensning og dyrkning af primærelementer afskaffelsen af kontaminerende celler. Erfaring med rensning af primære hjerne endotelceller har tilkendegivet, at grundig fjernelse af både meninges og hvide substans resulterer i forbedret renhed og udbytte af kapillærer, samt øget endotel cellevækst og udtryk for BBB karakteristika. Af denne grund, omhyggelig fjernelse af meninges (herunder inde sulci) præsenteres protokollen var designet til at sikre fjernelse af leptomeningeal celler (som har fibroblast-lignende egenskaber) samt af arteriel og arteriolære glatte muskelceller, der vokser hurtigere end endotelceller i kultur. Ligeledes, minimering af den hvide substans materiale resulteret i renere endotel cellekulturer, med færre forurenende celler vokser fra de isolerede kapillær fragmenter. Men dette forenklet og hurtig metode anvendes for isolation sænker udbyttet af isolerede kapillærer, og optimering af grå materie isolation kunne forbedre udbyttet af hver hjerne betydeligt. En tæthed farveforløb, som er inkluderet i en alternativ rensning protokol69, kan bruges til at isolere gratis endotelceller og forbedre endotel celle renhed, men det er tidskrævende og kan ligeledes sænke udbyttet. Begge disse rensning metoder er blevet flittigt brugt og karakteriseret, og karakteristika som genererer høj TEER pBEC modeller i både MC og astrocyte fælles kultur (normalt 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

For at etablere encellelag med høj paracellular restriktive, har erfaringen vist, at pericytes skal elimineres i endothelial kulturer16. Svin hjernen pericytes generelt vokser under pBEC lag og forårsager ikke huller i endothelial lag, som observeres for kulturer af rotte hjernen endotelceller72,73. Pericytes i pBEC kulturer gøre, dog, tendens til at påvirke morfologi i endothelial celler, der vises bredere og med uregelmæssige celle pensionærer16. Fordi hjernen endotelceller express højere niveauer af efflux transportører (f.eks. P-glykoprotein) end andre celletyper i microvessels, kan antallet af kontaminerende celler reduceres ved puromycin behandling74. Desuden brug af plasmaafledte serum (PDS) i stedet for føtal eller neonatal kalv afledt serum favoriserer væksten i endothelial celler, som PDS har en lavere koncentration af vækstfaktorer som Trombocyt-afledt vækst faktor og vaskulære endotel vækst faktor, som er vist at øge BBB permeabilitet og stimulere angiogenese14,75,76,77. Ved at indføre en indledende kultur af isolerede kapillær fragmenter og kombinere dette med puromycin behandling (4 µg/mL) og brug af PDS, lykkedes det os i høj grad reducere antallet af kontaminerende celler tilbage efter rensning, så, derefter kunne vi fastlægge stramme endotel encellelag på permeabel membran skær. For at sikre bedste udlæg i endothelial celler på både kultur retter og permeabel membran Indsæt overflader, har man konstateret, at en belægning blanding af kollagen type IV (fra menneskelige placenta) og fibronektin øger spredning udbytter og kombinerede blandingen var derfor foretrak frem for den traditionelle metode at bruge kun kollagen type I78.

Differentiering af celler og etableringen af en høj TEER In Vitro BBB Model

PBECs i MC generelt bevarer mange BBB nøglen egenskaber efter isoleret, således at co kultur med astrocytter ikke er afgørende for inducerende funktionelle stramme kryds og opnå høj TEER værdier16,57. Bestræbelser på at optimere betingelserne for differentiering i endothelial celler i BBB fænotype omfatter brug af serum-holdige medium suppleret med 8-CPT-cAMP, hydrocortison7 (øger det intracellulære cAMP niveau13) og RO 20-1724 (opretholde det intracellulære cAMP niveau), som i henhold til tidligere resultater74,79 sammen med held forbedret barriere tæthed og øget TEER, og kan også har bidraget til at genskabe en mere profil80 i vivo som genekspression. Brugen af hydrocortison til stramning af i endothelial lag kan dog ændre svar i endothelial celler for visse stimuli, og ved hjælp af modellen for efterforskning af svar til kemo- og cytokiner under betændelse, den Brug af hydrocortison skal undgås.

Fra sammenlignende undersøgelser med MC, MC med ACM og astrocyte Co kulturer i begge de deltagende laboratorier og andre steder, det har vist sig at astrocytic bidrag er i stand til at forbedre endotel BBB funktioner og øge barriere tæthed 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. for at opnå en sådan højt udtryk af BBB fænotype i pBECs, vi etableret en NCC med astrocytter og fandt der både svin og rotte primære astrocytter var gavnlige, som også observeret i andre laboratorier22. Under oprettelsen af astrocyte NCCs, har erfaringen vist, at renhed og alder af astrocyte kulturer påvirke den resulterende endotel barriere trykken, wITH den optimale alder af astrocytter bliver 2-8 uger, som korrelerer med en observeret ændringer i astrocyte morfologi over tid. Dagen før oprettelse af NCC, er en mellemlang ændring for astrocytter beregnet til at fjerne skadelige metabolitter og give mulighed for tilstrækkelig tid til astrocytter at frigive stimulation og signalering faktorer, der påvirker barriere udvikling. Når Co dyrkning i endothelial celler og astrocytter i permeabel membran Indsæt system, er det vigtigt at lægge særlig vægt på håndtering af modellens barriere. Under medium forandring, skal både aspiration og tilsætning af medium og bevægelser i skærene gøres omhyggeligt for at minimere forstyrrelser i endothelial barrieren.

Reproducerbarhed og pålidelighed

En stor udfordring, når du bruger primærelementer til oprettelse af in vitro- modeller er at opnå høj reproducerbarhed mellem kulturer. Sådan standardisering kan opfyldes ved valg af metode, brug af høj kvalitetsværktøjer og reagenser og erfaring i microdissection. Høj reproducerbarhed med lave batch til batch variationer for præsenteres metoden er derfor meget afhængige af streng overholdelse af de beskrevne procedurer.

At opnå en god reproducerbarhed mellem partier og hætteglas under TEER målinger, et væv modstand måling kammer eller epitelial voltmetre med stive miniature elektroder, snarere end fleksible chopstick elektroderne kan anvendes, at reducere den variation af observerede TEER værdier. Ud over at opnå høj TEER værdier (figur 4), bekræftes pålideligheden af de præsenterede model af den tilsvarende lave små opløste permeabilitet (figur 4), og af andre karakterisering af pBECs (figur 5 ).

Begrænsninger af den anvendte metode og Model

Brugen af transgene og miniature svin steget i de sidste årtier, men mængden af data, in vivo er stadig begrænsede i forhold til data tilgængelige for gnavere modeller, og derfor kan udgøre en udfordring for sammenligning af in vitro- svin data med i vivo resultater. Men som biologi af grisen afspejler menneskelige biologi tættere end mange etablerede laboratoriedyr, og transgene gris modeller at studere neurologiske sygdomme som Alzheimers sygdom har nu været etableret84, tilgængeligheden af i vivo data forventes at blive mindre problematisk med tiden.

En begrænsning af de nuværende permeabel membran Indsæt systemmodeller af BBB er den manglende evne til at efterligne blodgennemstrømningen i microvessels. In vivo, shear stress har vist sig at påvirke mange aspekter i endothelial celle fysiologi som division, differentiering, migration og apoptose85,86, og at påvirke vigtige BBB egenskaber såsom udtryk for junctional proteiner, og induktion og polarisering af transportvirksomheder61,85,87. For at indføre sådanne betingelser, kan nyudviklede mikrofluid systemer anses for88,89,90.

En nyttig metode til at korrigere for effekt af unstirred vandet lag (vandig grænselag) fra in vitro- permeabilitet data er at udlede den forudsagte iboende permeabilitet i vivo, ved hjælp af software baseret tilgang21. Denne software kan også bruges til detaljeret permeabilitet data analyse21.

Fremtidige ansøgninger og retninger for metoden

Som komponenter af neurovaskulære enhed har vist sig at spille en vigtig rolle i overtalelse og opretholde BBB funktioner, og ingen nuværende in vitro- model har endnu været i stand til at fuldt ud efterligne i vivo betingelser, vigtige bestanddele og interaktioner kan stadig mangle. Nuværende indsats i udviklingen af præsenteres modellen omfatter etablering af triple-kultur modeller med både astrocytter og pericytes og eksperimenter kombinerer celler af forskellige arter. Indarbejdelse af pericytes har hidtil ikke har været observeret til betydeligt øge TEER barrierens. Dog er syngeneic svin modeller blevet observeret til at være sammenlignelig med tredobbelt kulturer ved hjælp af svin hjernen endotelceller, rotte astrocytter og rotte pericytes barriere tæthed og udtryk for hallmark proteiner kendetegn af hjernen endotel22. For at udvikle en model baseret på menneskelige celler, fremtidige udvikling af in vitro- BBB modeller for drug discovery og levering kan påberåbe sig derivering af humane pluripotente stamceller og voksne stamceller og/eller stamfader celler21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapportere nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen og Niels M. Kristiansen for teknisk bistand, og Lundbeckfonden giver nummer R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0, (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7, (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57, (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261, (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35, (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244, (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15, (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17, (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14, (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115, (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280, (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441, (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8, (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10, (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8, (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565, (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179, (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42, (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506, (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116, (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425, (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36, (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54, (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12, (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12, (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60, (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19, (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16, (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15, (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19, (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818, (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43, (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111, (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27, (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156, (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64, (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118, (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14, (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42, (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4, (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40, (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16, (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90, (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5, (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68, (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32, (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049, (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93, (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27, (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193, (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271, (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28, (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51, (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22, (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88, (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125, (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13, (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics