Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Medicine

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Summary

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

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Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

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Abstract

O objectivo do presente protocolo apresenta um procedimento otimizado para purificação e cultivo de pBECs e para estabelecer em vitro barreira hemato - encefálica (BBB) modelos baseados em pBECs em mono-cultura (MC), MC com astrocyte-condicionado médio (ACM), e sem contato co-cultura (NCC) com astrócitos de suínos ou rato origem. pBECs foram isoladas e cultivadas de fragmentos de capilares dos córtices cerebral de suínos domésticos 5-6 meses de idade. Esses fragmentos foram purificados por remoção cuidadosa de meninges, isolamento e homogeneização da massa cinzenta, filtração, centrifugação e digestão enzimática. Para eliminar mais células contaminantes, os fragmentos capilares foram cultivados com puromicina contendo médio. Quando 60-95% de confluencia, pBECs crescente dos fragmentos capilares foram passadas para filtro de membrana permeável insere e estabelecidos nos modelos. Para aumentar a tensão de barreira e fenótipo característico de BBB de pBECs, as células foram tratadas com os seguintes factores de diferenciação: permeant 8-CPT-acampamento da membrana (acampamento abreviado aqui), hidrocortisona e um inibidor da fosfodiesterase, 1724-RO-20 (RO). O procedimento foi realizado durante um período de 9 a 11 dias, e ao estabelecer o modelo do NCC, os astrócitos foram cultivados 2-8 semanas de antecedência. Aderência aos procedimentos descritos no protocolo permitiu a criação de camadas endoteliais com permeabilidade restrita paracellular, com o NCC modelo mostrando uma resistência elétrica média transendothelial (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω 2e paracellular permeabilidade (P.app) para Lúcifer amarelo de 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (quer dizer SEM ±, n = 55). Nova avaliação deste fenótipo pBEC mostrou boa expressão da proteínas juncionais apertado claudin 5, ZO-1, occludin e adherens junção catenina p120 de proteína. O modelo apresentado pode ser usado para uma variedade de estudos do BBB na saúde e na doença, e, com a permeabilidade de paracellular altamente restritiva, este modelo é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular.

Introduction

A estrutura celular e função da barreira sangue - cérebro

Na interface do sistema nervoso central e circulatório (CNS), o BBB atua como um site chave reguladora para controle homeostáticos do microambiente do CNS, que é essencial para o bom funcionamento e proteção do sistema nervoso. O site do BBB é as células endoteliais que revestem o lúmen do vaso sanguíneo. Nos capilares do cérebro, as células endoteliais formam complexas intercelulares junções apertadas e testes padrões da expressão fortemente polarizada de transportadores de influxo e efluxo particulares assegurar transporte molecular altamente específica entre o sangue e o cérebro 1. Os componentes estruturais dos complexos junção apertada incluem proteínas da família occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin e associado a moléculas de adesão (compotas). Claudin 5 é particularmente importante na restrição paracellular juncional. Indução e manutenção deste fenótipo endotelial do BBB característico envolvem interações dinâmicas com células circundantes, incluindo pericitos, astrócitos, neurônios e as membranas do porão, que, juntamente com o cérebro endotelial, células de forma a neurovascular unidade (NVU)2,3. Os mecanismos envolvidos nessas interações não são compreendidos ainda inteiramente, mas incluem a troca de sinais químicos entre as células, que permite a modulação da permeabilidade do BBB a curto prazo e induz a longo prazo BBB características4. Astrócitos, especialmente, são conhecidos por contribuir para o fenótipo de células endoteliais do cérebro e são uma fonte de fatores regulatórios como gliais-derivado neurotrophic factor (afetando cAMP intracelular)5, de fator de crescimento fibroblástico básico6, Hidrocortisona7e transformadora fator de crescimento β (TGF-β)8. O efeito de TGF-β, no entanto, tem sido debatida9.

In Vivo em Vitro BBB

Estudos in vivo continuam a fornecer informações valiosas sobre a biologia do BBB. No entanto, modelos de cultura celular podem fornecer insights adicionais e constituem ferramentas úteis para a compreensão de aspectos moleculares e funcionais detalhados do BBB na saúde e na doença. Embora as interações complexas entre os tipos de células e constituintes do BBB são difíceis de alcançar plenamente em modelos em vitro , tem havido, desde a primeira purificação de células endoteliais do cérebro e aplicação destes em mono-culturas 10 , 11 , 12, o desenvolvimento extensivo dos processos de purificação e condições de crescimento do BBB celulares modelos de cultura, resultando em maior semelhança com a barreira na vivo . Os modelos usados em vitro BBB baseiam-se em células primárias de roedor, suínos e bovina de origem e em linhas celulares imortalizado. Cada modelo tem diferentes vantagens e desvantagens. Para a escolha do modelo e comparação, marcadores de validação como expressão de enzimas, transportadores, receptores e proteínas estruturais BBB são usados para criar visões gerais do atual estabelecido modelos1.

O protocolo

Uma característica importante do BBB é tensão de barreira e TEER alta, ainda um grande número de modelos disponíveis não refletem bem os níveis na vivo . Incorporando contribuições de desenvolvimento e otimização de vários laboratórios, o objectivo do presente protocolo é apresentar um método para estabelecer um alta TEER em vitro BBB modelo baseado na pBECs primária no MC com ou sem ACM, ou no NCC com primário astrócitos de ratos ou de origem porcina. Os procedimentos aplicados e o estabelecimento do modelo incluem esforços para eliminar as células contaminantes e melhorar a diferenciação de pBECs em um fenótipo BBB. Este trabalho resultou na criação de modelos TEER confiáveis e de alta com paracellular baixa permeabilidade e boa expressão funcional de proteínas juncionais apertadas chaves, transportadores e receptores. No entanto, como os astrócitos são um fator contribuinte para o fenótipo de células endoteliais do cérebro, as três condições diferentes da cultura representam três diferentes fenótipos das células endoteliais do cérebro. O modelo NCC é especificamente útil para estudos de determinados mecanismos especializados envolvidos na descoberta de medicamentos, estudos de transporte e o tráfico intracelular, bem como para a investigação das interações célula-célula, onde é a máxima expressão de características BBB vantajoso.

Origem e história do protocolo

O modelo de pBEC descrito aqui baseia-se em grande parte no modelo porcino desenvolvido nos laboratórios Eisai (Londres) por Dr. Louise Morgan e seus colegas, que é baseado em um sucesso anterior cérebro bovino endothelial da pilha modelo13. O método original de preparação da pilha foi um dois-fase de filtragem usando nylon malhas para pegar o microvessels, seguido por uma etapa de subculturing para melhorar a pureza. No desenvolvimento do método anterior, tensão do fenótipo e barreira BBB ideal foram atingidos pelo crescimento médio e completados, incluindo ACM. Modificações adicionais para o método foram feitas por R. Skinner no laboratório do Prof N. Rothwell em Manchester UK14,15. O método foi adotado pelo laboratório Abbott, KCL de Londres, onde Patabendige fez significativamente mais simples de preparar, evitando o uso de astrócitos ou ACM e eliminando células contaminantes como pericitos com puromicina. Os primeiros artigos confirmou que o modelo MC preservadas várias características importantes do na vivo BBB, incluindo junções apertadas eficazes, sistemas de transporte de membrana e mediada transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. mais tarde S. Yusof novamente testado co-cultura astrocyte e melhorou significativamente TEER, então esta é a variante preferencial usado atualmente na Abbott laboratório21. O modelo agora tem sido com sucesso transferido para o M. Nielsen laboratório em Aarhus, onde novas modificações foram introduzidas (este protocolo), incluindo simplificadora cinza importa extração, usando malha apenas uma etapa de filtração e uma etapa de revestimento de filtro único combinação de colágeno e fibronectina. O procedimento aplicado para isolamento de suínos astrócitos (este protocolo) foi baseado em protocolos desenvolvidos pelo laboratório T. Moos em Aalborg, descrito por Thomsen et al.22. A TEER e outras propriedades do modelo gerado em Londres e Aarhus são semelhantes, que empresta a confiança para a noção de que o modelo é facilmente transferido entre laboratórios e responde bem a observação cuidadosa e racionalização das etapas do método. Com efeito, S. Yusof criou o modelo MC em um país tropical (Malásia)23, que envolveu a nova adaptação para as condições locais e fontes de tecido.

Vantagens sobre métodos alternativos e atualmente estabeleceram modelos

Em comparação com células endoteliais do cérebro de origem bovina e roedor, pBECs oferecem a vantagem de ter uma menor taxa de perda do fenótipo BBB na vivo após isolamento24. Além disso, os pBECs são capazes de formar barreiras endoteliais relativamente apertadas, mesmo quando cultivadas em MC (Ω 800 cm2)16 , em comparação com os níveis comumente relatados por monocamadas de linhas celulares, tais como bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrais primários células endoteliais de rato (100-300 Ω cm2)SS = "xref" > 33,34,35,36 e rato (100-300 Ω cm2)37,38. No entanto, a TEER demonstrou dependência sobre os procedimentos de purificação e de cultura. Na maioria dos casos, a adição de ACM ou co-cultura com astrócitos mostra diferenciação efeitos sobre as células endoteliais e um aumento na tensão das camadas endoteliais1. No entanto, com os esforços para otimizar as condições de cultivo, apenas os modelos baseados em bovinos mostraram valores TEER comparável aos modelos baseados em suínos (médias de 800 Ω cm2 no MC, até 2500 Ω cm2 em co-cultura astrocyte)13 ,39,40,41,42,,43,44,45. Como os modelos baseados no cérebro bovino primário, células endoteliais mostraram grandes variações, tanto entre como dentro de laboratórios14,,45,46,,47,48, reprodutibilidade pode ser um problema. No modelo de pBEC relatado aqui, os laboratórios contribuindo alcançaram TEER muito semelhante e valores de permeabilidade paracellular com baixa variabilidade, tanto em e entre laboratórios. Daí, é possível que outros laboratórios estabelecer um modelo robusto com baixa variabilidade, usando o método apresentado aqui. Além de formar camadas endoteliais apertadas, modelos com pBECs anteriormente foram validados pela expressão de proteínas de junção apertada, transportadores BBB funcionais, receptores e enzimas e aptidão demonstrada para uma gama de estudos15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Além disso, dados de transcriptoma inéditos sobre as culturas co de pBECs mostram um perfil esperado do BBB transportadores e receptores (resultados não publicados, Nielsen et al).

O modelo baseado em suínos de BBB tem uma vantagem adicional como o genoma, anatomia, fisiologia, e progressão da doença do porco refletem a biologia humana para um grau mais elevado do que outros modelos estabelecidos dispõe de60, que são favoráveis para o indústria farmacêutica. Como cérebros de suínos são um subproduto comum da indústria da carne, eles constituem uma fonte facilmente acessível de cérebro células endoteliais, minimizando o número de animais necessários para as experiências e fornecendo um rendimento elevado da purificação de um cérebro de suínos. Apesar de purificação e cultivo de células primárias é um pouco demorados e exige conhecimentos especializados de normalização na criação do modelo, as células primárias gerar os modelos BBB mais confiáveis. Linha celular imortalizado não pode ser um substituto, como propriedades importantes, tais como tensão de barreira, perfis de expressão do transportador e regulamento do microambiente não refletem os resultados experimentais na vivo61, 62. em vitro modelos oferecem a vantagem de viver-pilha de imagens com maior resolução, possibilitando a visualização de processos intracelulares, permitindo uma abordagem de proximidade para as células da amostra ou observadas, com objectivos com ampliação maior e melhor qualidade óptica63. Isto não é o caso para o uso da microscopia de dois fotões em animais vivos. Além disso, em vitro modelos fornecem a capacidade de transfect células, permitindo a visualização de proteínas etiquetadas e investigação do seu tráfico.

Aplicações do modelo

A função do BBB não é fixo e pode ser modulada dinamicamente na fisiologia e patologia. Em muitas doenças neurológicas, incluindo neurodegenerativas, doenças inflamatórias e infecciosas, interrupções e aumento da permeabilidade do BBB é observado64,,65,66,67 . Para reduzir e prevenir a progressão da doença e danos subsequentes, identificação e caracterização dos mecanismos moleculares subjacentes à modulação do BBB são de grande importância. Neste contexto, confiável em vitro modelos estão em alta demanda pela indústria farmacêutica, em Além disso desempenham papéis importantes na previsão de permeabilidade BBB de drogas ao SNC. Qualquer modelo in vitro , servindo como uma tela de permeabilidade deve exibir um caminho paracellular restritiva, uma arquitetura cell fisiologicamente realistas e expressão funcional de mecanismos de transporte68. Demonstrado em estudos anteriores16,17,57e por paracellular permeabilidade e expressão de proteínas TJ e AJ aqui, o modelo apresentado atende a todos esses critérios e é adequado para uma variedade de BBB estudos em ambos fisiologia normal e em patologia. Os pontos fortes do método de purificação e cultivo apresentado incluem uma combinação de simplicidade e reprodutibilidade e a capacidade de incluir hamartomas influenciaram com um robusto e fiável alta TEER em vitro BBB modelo resultante. Para esta finalidade, astrócitos de suínos e rato origem têm sido mostrados para aumentar o fenótipo BBB de pBECs em um similar de maneira22.

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Protocol

suínos cérebros foram obtidos como subprodutos da indústria alimentar dinamarquês. Matadouros dinamarqueses estão sob estrita supervisão e observação pelo dinamarquês Ministério do meio ambiente e alimentos.

usados para a isolação de astrócitos de ratos foram criados e alojados em grupo na instalação de animais local a uma temperatura ambiente de 22 ° C - 23 ° C e em um ciclo claro/escuro de 12/12 h sob a inspeção do veterinário e de acordo com o dinamarquês regulamentos para animais de laboratório. Os ratos foram sacrificados antes de que foram sacrificados em conformidade com as diretrizes internacionais sobre o uso ético de animais (Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986; 86/609/CEE) e diretrizes dinamarquês. Não na vivo experiências com animais ou material humano foram utilizadas nesses experimentos.

Nota: a seguir é um protocolo principal pBEC descrevendo a purificação (etapa 1), cultivo (etapa 2) e (etapa 3) TEER medições. Para a instalação de um NCC com astrócitos, é apresentado um protocolo alternativo (etapa 4) descrevendo a purificação e cultivo de rato e astrócitos porcinos.

1. purificação de suínos cérebro capilares

  1. recolher cérebros de 8-10 de 5-6-mês-velho suínos domésticos (por exemplo, de um matadouro nas proximidades) e transportá-los no gelo para o laboratório. Recomendamos iniciar o seguinte procedimento de purificação dentro de 2-3 h de terminação do animal.
  2. Coloque os cérebros em um banco do fluxo estéril e delicadamente, lave-os com 1 L de PBS em um béquer colocado no gelo
  3. Cuidadosamente remover meninges do um cérebro de cada vez usando pinças de ponta fina e transferir o cérebro livre de meninges para outro recipiente de 1 L com PBS colocado no gelo. Estender o tempo despendido pode complicar a remoção. O tempo aproximado usado por cada cérebro deve ser 10-15 min.
  4. Usando um bisturi, raspar a matéria cinzenta do cérebro de um de cada vez e transferir o material isolado para placas de Petri (8,8 cm 2) contendo 20 mL de DMEM nutriente mistura F-12 (DMEM/F-12) colocado no gelo. Isole-se como muito cinzenta quanto possível sem retirar material de matéria branca. Para a fragmentação inicial, execute o material de matéria cinzenta através de uma seringa de 50 mL sem uma agulha. Continue por todo o cérebro e o material coletado cinzenta da piscina. Estender o tempo despendido pode complicar a remoção. O tempo aproximado usado por cada cérebro deve ser 10-15 min.
  5. Transferir o material isolado de matéria cinzenta para o tubo de moedor de um homogeneizador de mão na proporção de 50/50 com mídia DMEM/F-12. Homogeneizar o material, fazendo 8 subindo e descendo traçados com um pilão solto, seguido por 8 e descer traçados com um pilão apertado. Continue até que todos os isolados material tem sido homogeneizado, então transferir o homogeneizado para uma garrafa de 500 mL e diluir com DMEM/F-12 para o volume total de aproximadamente 450 mL.
  6. Filtrar o homogenate usando uma garrafa de tampa azul 500 mL com porta-filtro e filtro de 140 µm-malha e isolar capilares executando o tecido através do filtro. Use um filtro por 50 mL de homogeneizado e lavar cada filtro com DMEM/F-12 depois.
  7. Lugar o capilar contendo filtros em caixas de Petri com uma solução de digestão de tripsina/EDTA (tripsina de 2,5%, 0.1 nM EDTA em PBS), colagenase CLS2 (2.000 U/mL) e 1 (3.400 U/mL) de DNase em DMEM/F-12. Use 1 placa de Petri (8,8 cm 2, 20 mL de solução) por 3 filtro malhas.
  8. Coloque os pratos de Petri a 37 ° C, durante 1 h em um agitador orbital a 180 rpm ou misture-os delicadamente a cada 10 min. Depois de 1 h, lave os capilares no filtros com suspensão da caixa de Petri com uma pipeta de 1 mL.
  9. a suspensão de 3 pratos, divididos em 2 tubos de 50 mL e parar a digestão, adicionando 10 mL DMEM/F-12 para cada tubo de 50 mL.
  10. Centrifugar as suspensões celulares-250 x g, 4 ° C por 5 min. Aspire os sobrenadantes e ressuspender cada pellet em 10 mL de DMEM/F-12. Adicione mais 20 mL de DMEM/F12 para cada tubo. Repita essa etapa de centrifugação duas vezes.
  11. Deixar os tubos arrefecer no gelo por 5 min e transferir as soluções para 2 novos tubos de 50 mL.
  12. Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g, 4 ° C durante 5 minutos e ressuspender cada pellet em 8-10 mL (aproximadamente 1 mL/cérebro usado) da solução de congelação consistindo de 10% de DMSO em FBS.
  13. Transferir a suspensão de eritrócitos para cryovials, usando 1ml por cryovial. Em média, uma purificação resulta em 1 frasco por cérebro usado, em média, fornecendo células endoteliais para inserções de 12-16. Coloca os frascos em uma caixa de congelamento a-80 ° C durante pelo menos 4 h até durante a noite. Depois, guarde o cryovials em um cryotank com nitrogênio líquido.
    Atenção: O nitrogênio líquido tem temperaturas extremamente baixas. Por favor, use proteção adequada.

2. Cultivo de pBECs primário (8-10 dias)

  1. Cultura inicial (3-5 dias)
    1 dia
    1. para otimizar as condições de fixação do pBECs, executar o revestimento de um balão T75 pela adição de uma solução com final concentrações de colágeno IV (150 µ g/mL) e fibronectina (50 µ g/mL) em ddH 2 O no balão, certificando-se que a solução cobre toda a superfície. Uso 10 mL para cada frasco de T75. Incubar a 37 ° C por 2 h.
      Nota: O revestimento pode ser realizado imediatamente antes da utilização ou até uma semana antes e armazenado com PBS a 4 ° C. O revestimento não deve secar, ou que já não vai formar uma superfície de fixação e crescimento adequada.
    2. Preparar 16 mL de pBEC crescimento médio composto por DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro plasma-derivado (PDS), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e heparina (15 U/mL). Completar o médio com puromicina (4 µ g/mL) para selecionar para células endoteliais. Esteja ciente de que a puromicina só pode ser usada por um período máximo de 5 dias.
    3. Alíquota do meio preparado em volumes 6 mL e 10 mL em dois tubos de 15 mL.
    4. Trazer um frasco com capilares do nitrogênio líquido (passo 1.13) e descongelar os capilares pelo uso do banho maria a 37 ° C ou adicionando 750 µ l do meio de preparados de alíquota 6 mL. Se descongelar adicionando médio, pipete cuidadosamente acima e para baixo para descongelar e homogeneizar a suspensão. Quando descongelado, transferir a suspensão de células para o meio de 6 mL alíquota.
    5. Para remover o meio de congelação, girar os capilares para baixo a 250 x g, 4 ° C por 7 min.
    6. Cuidadosamente Aspire o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1-2 mL da alíquota de 10mL. Quando re-suspenso, transferir a solução para o meio de 10mL alíquota.
    7. Transferir a suspensão capilar no balão T75 revestido e inclinar suavemente o frasco para assegurar a distribuição igual sobre a superfície. Colocar o balão de T75 a 37 ° C, 5% de CO 2.
      Dia 2
    8. Após incubação durante a noite, prepare-se 10 mL pBEC crescimento suplementado com puromicina (4 µ g/mL) para um balão de T75 e realizar uma mudança de média. Esteja ciente que todas as soluções médias aplicadas às células devem ser previamente aquecidas a 37 ° C antes do uso.
      Nota: Como alternativa, uma mudança de médio pode ser realizada 4-6 h pós-chapeamento quando capilares devem ter ligado à superfície. Incube as células até 60-95% confluência é alcançada, geralmente 3-5 dias de descongelamento. Fazer não allocrescimento da pilha mais células w para alcançar a confluência de 100% para evitar contato-inibição que pode interromper a.
      Dia 4-6
    9. Quando a confluência desejada é alcançada, passagem das células endoteliais para inserções de membrana permeável (ver seção 2.2). Se a confluência desejada não é alcançada no dia 4, mudança do meio é executada. O mais tardar no dia 6, as células devem ser passadas para as inserções de membrana permeável. Se a confluência necessária não é alcançada pelo dia 6, as células não são adequadas para uso experimental.
      Nota: preparação de astrócitos para NCC: ao configurar o modelo de cultura co, 2 - 8 semanas astrócitos na cultura (ver secção 4) devem estar preparados para o modelo de co-cultura realizando uma mudança média no dia anterior a passagem das células endoteliais para inserções. Para cada astrocyte bem, preparar 1500 µ l do meio de crescimento astrocyte composto por DMEM baixa glicose suplementado com 10% FBS, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µ g/mL) e em seguida, executar a mudança média.
  2. Crescimento de pBECs na membrana permeável que insere (5 dias)
    dia 4-6
    1. membrana permeável preparar insere (12-placa com inserções de 1,12 cm 2 de área de superfície, 0,4 µm poros) para semeadura de pBEC pelo revestimento com colagénio IV (500 µ g/mL) e fibronectina (100 µ g/mL) em ddH 2 O. Use aproximadamente 300 µ l de cada inserir e certifique-se de que a solução cobre toda a superfície crescente. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 por um período mínimo de 2 h.
    2. Preparar 30 mL de meio de crescimento de pBEC (para composição de mídia, consulte a seção 2.1.2) sem puromicina.
    3. Aspire delicadamente lave duas vezes com 5 mL PBS estéril à temperatura ambiente e médio de cultura pBEC no frasco T75.
    4. Trypsinize as células, adicionando 2 mL de solução de tripsina-EDTA (tripsina de 2,5%, 0.1 nM EDTA em PBS) para o T75 e colocar o balão a 37 ° C, 5% de CO 2 por 5-7 min.
    5. Para separar as células endoteliais do cérebro, bata levemente o lado do balão T75 com as pontas dos dedos, eventualmente deixando pericitos sobreviventes e anexar mais forte na superfície do balão. Visualmente investiga o destacamento sob um microscópio. Quando 80% distanciamento é observado, pare tripsinização adicionando 5 mL de meio.
    6. Transferir a solução de célula para um tubo de 15 mL, usando uma pipeta de 10 mL e spin para baixo as células endoteliais do cérebro por centrifugação a 250 x g, 4 ° C por 7 minutos.
    7. , Cuidadosamente, remover o sobrenadante e resuspenda o pellet em 1mL de meio. Quando suspenso, adicionar 2 mL de meio para trazer o volume total de 3 mL
    8. contar o número de células manualmente pelo uso de uma célula de contagem de câmara ou uma célula automática sistema de contagem. Preparar uma solução de célula de 2,2 x 10 5 células/mL de meio de, resultando em uma densidade de semeadura final de 1.1 x 10 5 células/inserção.
    9. Remover a solução de revestimento das inserções de membrana permeável e transferir 500 µ l de suspensão de célula para cada inserção. Em uma das pastilhas, adicionar apenas médio e usar esta inserção como um ' filtrar somente ' controle para as medições de TEER.
    10. Estabelecer as células endoteliais MC, MC com ACM, ou no NCC com astrócitos da seguinte maneira:
      1. para MC: adicionar 1500 µ l de pBEC crescimento médio/ACM por alvéolo da placa 12-bem embaixo as inserções de membrana permeável. Coloque as inserções de membrana permeável a 37 ° C, 5% de CO 2 e incubar durante 2 dias.
      2. Para NCC: transferência insere a poços com astrócitos refrescados com meio de crescimento astrocyte no dia anterior. Coloque as inserções de membrana permeável a 37 ° C, 5% de CO 2 e incubar durante 2 dias.
        Nota: Esteja ciente da utilização de diferentes tipos de mídia em poços de fundo dos três modelos.
        Dia 6-8
    11. No dia 2, mudar os meios de comunicação sobre as inserções de membrana permeável com pBECs. Preparar 500 µ l do meio de crescimento de pBEC por inserir e executar cuidadosamente a mudança para minimizar o rompimento da camada de células. Incube as celulas por dois dias. Esteja ciente de que a mudança de mídia é executada em inserções apenas e não em poços fundo.
  3. Estimulação com factores de diferenciação (1-2 dias)
    dia 8-10
    1. para cada um dos diferentes modelos, os meios de estimulação devem estar preparados como seguindo:
      1. para MC: para cada um inserir e prepare-se 500 µ l do meio de crescimento de pBEC contendo cAMP (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC: Prepare-se adicionalmente 1500 µ l do meio de crescimento de pBEC contendo cAMP (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC com ACM: descongelar 1500 µ l de ACM e completá-lo com cAMP (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM).
      2. Para NCC: para cada inserção, preparar 500 µ l do meio de crescimento de pBEC contendo cAMP (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM). Para cada astrocyte bem, preparar 1500 µ l de DMEM/F-12 suplementado com penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µ g/mL), heparina (15 U/mL), acampamento (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM).
    2. Para cada um dos diferentes modelos, realizar a troca de mídia da seguinte forma:
      1. para MC: cuidadosamente Aspire médio de wells e inserções e adicionar o meio de diferenciação de ambos os compartimentos, usando 500 µ l para cada inserção e 1500 µ l para cada poço. Estar ciente de que a interrupção em ambos os lados da inserção pode afetar e perturbar a camada de células.
      2. Para NCC: cuidadosamente Aspire médio de poços e adicionar meio de diferenciação 750 µ l por bem. Cuidadosamente Aspire médio das inserções e adicionar meio de diferenciação 500 µ l por inserção. Em seguida, adicione o restante meio de diferenciação de 750 µ l de cada astrocyte bem.
    3. Para todos os modelos: Coloque as células a 37 ° C, 5% de CO 2 e incubar com meio de diferenciação, até o próximo dia.
      Nota: Esteja ciente de que, para o NCC com astrócitos, astrócitos são deste ponto mantidas em meio livre de soro.

3. Medições de TEER

  1. no dia depois estimulando as células com o meio de diferenciação, preparar o sistema de câmara de medição de resistência de tecido para medições de TEER enxaguando a câmara duas vezes com o ddH 2 O, uma vez com 70% EtOH por 5 min e 2 vezes mais com o ddH 2 O.
  2. Adicionar 4 mL de DMEM/F-12 para a câmara de medição de resistência de tecido, conectá-lo ao sistema e calibrar para aproximadamente 30 min de acordo com as seguintes configurações: R = 0, teste R = 1000, Mode = R.
  3. Realizar as medições de TEER colocando cuidadosamente as inserções na câmara de medição de resistência do tecido. Para cada inserção, realizar medições em triplicado e calcular a média Ω cm 2.
    Nota: Para o modelo de co-cultura, TEER valores são esperados alcangar > 500 Ω cm 2. Se o nível apropriado de TEER não for atingido no primeiro dia de medição TEER, adicionar novos fatores de diferenciação (acampamento (250 µM), hidrocortisona (550 nM) e RO (17,5 µM)) e medir TEER novamente no dia seguinte. Quando são atingidos níveis adequados, o modelo deve ser preparado para a experiência planejada. Esteja ciente de que as células devem descansar pelo menos 3 h antes de realizar o experimento para se recuperar após medições TEER. Após a estimulação, TEER valores em geral permanecem aceitáveis por 24-48 h após estimulação.
    Observação: Um método alternativo e mais rápido usando o par de eletrodo STX - 100C rígida também registra alta TEER neste modelo 81. O ele STX2 flexívelctrode par dá leituras menos confiáveis.

4. PREPARAÇÃO de ASTRÓCITOS para co-cultura NON-CONTACT: Método alternativo

  1. Purificação de astrócitos
    1. para cada rato cérebro usado, casaco 2 frascos T75 adicionando 10 mL de poli-L-lisina (5 µ g/mL) em ddH 2 O para cada um T75 balão. Incubar os frascos a 37 ° C por 30 min.
    2. Isolamento de astrócitos pode ser executado da seguinte forma:
      1. rato astrócitos:
        1. Decapitate 2 1 - 2 dias de idade ratos usando um método aprovado.
        2. Cortar a pele do crânio a partir do pescoço em direção ao nariz e cortar o osso com uma incisão sagital.
        3. Abrir o crânio com pinça curvada, tirar o cérebro e colocá-lo em um tubo de 15 mL (tubo 1), com 11 mL de glicose baixa DMEM, suplementado com 10% FBS e gentamicina sulfato (125 µ g/mL).
        4. Cuidadosamente remover meninges usando pinças de ponta fina e suspender o material do cérebro usando uma pipeta de 1 mL.
      2. Suínos astrócitos:
        1. obter 1 cérebro de um porco doméstico de 5-6 meses de idade.
        2. Remova cuidadosamente as meninges do cérebro usando pinças de ponta fina e/ou mãos.
        3. Coletar 4 g de cinza importa do cérebro e coloque os pedaços no 1-2 mL DMEM baixos de glicose suplementado com 10% FBS e gentamicina sulfato (125 µ g/mL) em uma placa de Petri. Se as peças forem grandes, picar com bisturis ou fórceps.
        4. Suspender o material isolado usando uma pipeta de 1 mL, movê-lo para um tubo de 15 mL (tubo 1) e preenchimento com glicose baixa DMEM, suplementado com 10% FBS e gentamicina sulfato (125 µ g/mL) para um volume total de 11 mL.
        5. Continuar a homogeneizar o material isolado com uma agulha longa, ligada a uma seringa de 10 mL e suspender e descer 3 vezes. Espere até as peças grandes instalaram-se na parte inferior do tubo e, em seguida, coletar 7 mL de meio da parte superior do tubo (tubo 1).
        6. Filtrar num filtro de nylon de 40 µm para um novo tubo de 50 mL (tubo 2) a suspensão de células de 7 mL.
        7. Médio e
        8. Adicionar 7 mL tubo 1 com o cérebro. Continue a homogeneização e filtragem de 4.1.2.2.5-6 passos até o volume da suspensão de células filtrado em tubo 2 é cerca de 35 mL.
    3. Remover a solução de revestimento dos frascos T75 [passo 4.1.1]. Uma lavagem rápida com 5 mL de PBS após incubação com poli-L-lisina pode ser usada para garantir que as células não são prejudicadas por quaisquer efeitos tóxicos da solução de revestimento.
    4. Dividir e propagar a solução isolada astrocyte igualmente entre os frascos T75. Incubar os frascos a 37 ° C, 5% de CO 2 para 3-5 dias.
  2. Cultivo astrócitos e preparando o NCC com células endoteliais (3 semanas)
    1. Cultura inicial
      1. após 3-5 dias de incubação, realizar uma alteração de médio cuidadosamente por meio de aspiração e adicionando 10 mL de glicose baixa DMEM, suplementado com 10% FBS e gentamicina sulfato (125 µ g/mL).
        Nota: Após a primeira mudança de médio, médio deve ser mudado em 5 dias. Durante as primeiras 2 semanas, agitar os frascos e lavar as células completamente com PBS, quando se muda o meio. Isso ajuda na remoção de contaminante microglia.
      2. Após 3 semanas de cultivo, trypsinize as células, adicionando 2 mL de solução de EDTA de tripsina no fundo de cada frasco de T75 e incube-os a 37 ° C, 5% de CO 2 por 5-7 min.
      3. Parar tripsinização pela adição de 5 mL de meio, transferir a solução de célula para um tubo de 15 mL e centrifugue os astrócitos a 250 x g, 4 ° C por 7 min.
      4. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em congelamento solução consiste em 10% de DMSO em FBS.
      5. Contar o número de células e preparar uma solução de célula de 4,0 x 10 6 células/mL. Congelar as células cryovials, adicionando 1 mL por frasco.
    2. Crescimento em permeável membrana inserir sistema poços do fundo (2-12 semanas)
      1. preparar placas 12-boas para o crescimento de astrócitos, adicionando 1 mL de poli-L-lisina (5 µ g/mL) em ddH 2 O a cada poço. Colocar as placas a 37 ° C por 2 h.
      2. Para cada placa de 12, prepare-se 25 mL de meio de crescimento astrocyte (DMEM baixos de glicose suplementado com 10% FBS e penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µ g/mL)).
      3. Trazer o frasco de astrócitos do nitrogênio líquido e descongelar as células pela adição de meio de baixos de glicose 750 µ l DMEM. Cuidadosamente Pipete para cima e para baixo para descongelar e homogeneizar a suspensão. Quando descongelado, transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL e adicionar suporte para um volume total de 7 mL.
        Atenção: O nitrogênio líquido é extremamente baixa temperatura, então use proteção pessoal como luvas.
      4. Para remover o meio de congelação, girar os capilares para baixo a 250 x g, 4 ° C por 7 min.
      5. Cuidadosamente Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em meio.
      6. Remover o revestimento dos poços das 12 placas bem e transferir a suspensão de eritrócitos para poços usando 1ml por bem. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 células.
      7. Atualizar o médio a cada três dias e cultura de células para um mínimo de 2 semanas antes de usar as células para co-cultura com células endoteliais. As células podem ser usadas para co-cultura por até 12 semanas após o descongelamento, com a idade ideal, sendo 2-8 semanas.

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Representative Results

Estabelecimento dos modelos In Vitro de BBB

No método apresentado, otimizado, a cultivo de pBECs e o estabelecimento do sistema de inserção de membrana permeável com MC ou sem ACM ou NCC com astrócitos (Figura 1) foi realizadas por um período de 9-11 dias (Figura 2). Para a seleção das células endoteliais, uma cultura inicial de fragmentos capilares purificados foi combinada com puromicina para um máximo de 5 dias, que eliminou a maioria das células contaminantes e promoveu o crescimento de células endoteliais fusiformes do capilares fragmentos (Figura 3A-C). No dia 4-6, pBECs tinha se proliferaram de uma confluência de 60 a 95%, crescendo como não-sobreposição, células inibida pelo contato, alinhadas longitudinalmente. Quando as células alcançou a confluência desejada, pBECs foram banhados em colágeno IV e fibronectina revestido de membrana permeável inserir filtro membranas (área de superfície 1,12 cm2 , 0,4 µm poros) com uma densidade de 1,1 x 105 células/inserir, no qual eles Normalmente formada monocamadas confluentes depois de 4 dias (dia 8-10 post isolamento). Quando cultivo co pBECs, astrócitos de ratos ou de origem porcina foram banhados em poços de fundo revestido de poli-L-lisina, por um período mínimo de 2 semanas antes de iniciar o NCC (Figura 3D). Ao estabelecer o NCC, a experiência demonstrou que astrócitos cultivados para 2-8 semanas fornecem o melhor suporte para promover o fenótipo BBB em pBECs; dentro deste tempo, os astrócitos formaram culturas confluentes com células organizadas em uma estrutura de favo de mel (Figura 3E-F). No dia 4 no modelo de sistema de inserção de membrana permeável (isolamento de post de 8-10 dias), as células foram estimuladas com acampamento, hidrocortisona e RO para aumentar a tensão da barreira e o padrão de expressão característica BBB de proteínas juncionais apertadas, transportadores, e receptores.

Caracterização de pBEC fenótipo e permeabilidade Paracellular

Inspeção Visual célula combinada com medição de TEER rotineiramente são as maneiras mais confiáveis para avaliar a confluência e o aperto da camada de células endoteliais crescendo sobre as inserções de membrana permeável antes de experimentos. A Figura 4 mostra os resultados de duas séries de experimentos para avaliar a permeabilidade de droga pequena molécula através do BBB, os parâmetros de controle de TEER (refletindo a permeabilidade iônica) combinados com permeabilidade aparente21 (P.app, cm s-1) de sacarose radiolabeled ou corante marcador Lúcifer amarelo (LY), refletindo paracellular permeabilidade das moléculas da droga pequena típica (~ 200-600 Da). Um composto de interesse com um Papp maior que o de Papp de sacarose ou LY (dependendo do peso molecular da droga) poderia sugerir transcellular permeabilidade e/ou transporte através das células. A Figura 4 mostra que na membrana permeável insere com pBECs cultivadas acima de astrócitos de ratos, bons lotes de pBEC (por exemplo, aqui o LY definido) irá gerar sença no intervalo 500-2000 Ω cm2, com um pouco mais alto ou mais baixo. Alguns lotes, especialmente durante as fases iniciais de aprendizagem o protocolo, podem ter sença inferior em torno de 100-900 Ω cm2 (por exemplo, aqui a sacarose definido). Medição de TEER permite a seleção de filtros, com por exemplo começando TEER > 500 Ω cm2, e sobre o intervalo de TEER mostrado, Papp é relativamente independente de TEER, indicativo de uma camada de barreira suficientemente apertado para estas experiências. O protocolo para medir a permeabilidade depende do tipo de soluto/construção. Para obter uma descrição do procedimento para medir a permeabilidade de pequenas moléculas no NCC, um protocolo é descrito no SR. Encik Yusof, et. Al21. Avaliação da expressão das proteínas de junção apertada em pBECs no NCC com astrócitos de ratos mostrou a localização de claudin 5 occludin e ZO-1 ao longo das junções célula-célula, como mostrado por imunofluorescência (Figura 5A-C). Também, a junção de adherens proteína p120 catenina mostrou distribuição bem definida ao longo das junções célula-célula (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: representação esquemática dos aplicados modelos in vitro BBB. Representação esquemática da membrana permeável inserir modelos de sistema de pBECs no MC (A), o MC com ACM (B)e o NCC com astrócitos (C). No MC, ou meio de crescimento de pBEC ou ACM foram aplicados em poços de fundo, enquanto no NCC, inserções com pBECs foram colocadas em poços com astrócitos de 2-8-semana de idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: fluxograma das principais etapas durante pBEC cultivo e a criação dos modelos apresentados. Para uma visão geral e um cronograma para o método, esta apresentação esquemática resume as principais etapas no processo de cultivo de pBECs e estabelecimento dos modelos apresentados, ou seja, MC com ou sem ACM e NCC com astrócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: curso de tempo representativa das culturas iniciais de pBECs e rato astrócitos. Contraste de fase imagens de microscopia de culturas de pBECs (A-C) e astrócitos (D-F) visualizaram durante 5 dias. Purificado fragmentos capilares no primeiro dia da cultura inicial mostrou a presença de capilares e células contaminantes (A, dia 1,), que após mudança média no dia 2 e um dia adicional de crescimento, mostrou a seleção para pBECs, seu crescimento a partir dos fragmentos capilares (B, dia 3). Confluentes monocamadas de pBECs geralmente foram alcançadas no dia 4-6, momento em que o pBECs mostrou a morfologia fusiforme e estavam alinhados longitudinalmente (C). Astrócitos de ratos semeados no fundo poços normalmente se proliferaram de camadas confluentes no prazo de 5 dias (D-F)e foram usados para modelos NCC após 2 semanas de crescimento. Barra de escala para todas as imagens: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: integridade de junção apertada de pBECs. Permeabilidade aparente (P.app) de pBECs para paracellular marcadores sacarose (MW 342.5 14C-rotulados, 14,8 25,9 GBq/mmol) e Lúcifer amarelo (521.57 MW, 10 µ g mL-1), plotados contra TEER. pBECs foram cultivadas em filtros de inserção de membrana permeável 1,12 cm2 acima astrócitos de ratos na base do poço e marcadores adicionados à câmara apical. Depois de 1 hora a 37 & #730; C, aparência do marcador na câmara basal foi medido e apical-para-basal Papp (x 10-6 cm s-1) calculado. TEER foi medido > 3h antes Papp, utilizando eletrodos de STX100C EVOM, corrigido para o filtro de inserção de membrana permeável em branco com resistência 150 Ω. TEER média para o conjunto de dados amarelo de Lúcifer foi 1249 Ω de ± 80 cm2 (quer dizer SEM ±, n = 55). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterização de Immunocytochemical de pBECs. Para pBECs crescido em 1,12 cm2 membrana permeável inserir filtro insere acima astrócitos de ratos no poço base, análise de microscopia de imunofluorescência dos componentes junção apertada Claudin de (A) 5 (B) Occludin (C) ZO-1, e a catenina p120 adherens junção proteína (D) mostrou a localização bem definida em junções célula-célula e revelou as camadas de células endoteliais cérebro confluente com células fusiformes, sem sobreposição. Barra de escala para todas as imagens: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Purificação e proliferação de pBEC

Durante o processo de purificação, passos críticos incluem remoção rápida e eficaz das meninges e separação da matéria branca e cinza, que é importante para o rendimento de purificação e a pureza e para o estabelecimento adequado do modelo. Para o apresentado em vitro BBB modelo usando pBECs, nós temos melhorado e simplificado de um processo de purificação, com base na homogeneização mecânica de matéria cinzenta isolada, tamanho-seletiva de filtragem para isolamento de microvessels, digestão com colagenase , DNase e tripsina, com uma cultura inicial de fragmentos de microvessel. Em geral, um dos principais desafios durante a purificação e cultivo de células primárias é a eliminação de células contaminantes. Experiência com purificação de células endoteliais cerebrais primários indicou que completa remoção de meninges e resultados de substância branca no melhor pureza e rendimento dos capilares, bem como aumentou o crescimento da célula endotelial e expressão do BBB características. Por esta razão, cuidado de remoção das meninges (incluindo dentro sulci) no protocolo apresentado foi concebida para assegurar a remoção de células leptomeníngeo (que tem propriedades semelhantes a fibroblastos), bem como de células de músculo liso de arterial e arteriolar, que crescem mais rapidamente do que células endoteliais em cultura. Da mesma forma, minimização de matéria branca material resultou em culturas de células endoteliais mais puras, com poucas células contaminantes crescente a partir de fragmentos isolados capilares. No entanto, simplificado e rápido método aplicado para isolamento reduz o rendimento dos capilares isolados, e otimização de matéria cinzenta isolamento poderia melhorar o rendimento de cada cérebro significativamente. Um gradiente de densidade, que é incluído em um protocolo de purificação alternativa69, pode ser usado para isolar as células endoteliais livres e melhorar a pureza da célula endotelial, mas é demorado e pode também diminuir o rendimento. Ambos os métodos de purificação foram extensivamente usados e caracterizados e possuem as características de gerar modelos de pBEC TEER alta em ambos MC e astrocyte co-cultura (normalmente 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,,49,57,70,71.

A fim de estabelecer monocamadas com alta paracellular restritividade, a experiência demonstrou que pericitos devem ser eliminados de culturas endoteliais16. Perícitos cérebro porcina geralmente crescem abaixo das camadas de pBEC e não causam buracos nas camadas endoteliais, como observado por culturas de cérebro de rato a células endoteliais72,73. Pericitos em pBEC culturas que, no entanto, tendem a afetar a morfologia das células endoteliais, que aparecem mais amplas e com célula irregular pensionistas16. Porque as células endoteliais do cérebro expressam níveis mais elevados de transportadores de efluxo (por exemplo, P-glicoproteína) que outros tipos de células no microvessels, o número de células contaminantes pode ser reduzido por puromicina tratamento74. Além disso, usar do soro plasma-derivado (PDS), ao invés de vitela fetal ou neonatal derivados soro favores o crescimento das células endoteliais, como o PDS tem uma baixa concentração de fatores de crescimento tais como fator de crescimento derivado de plaquetas e de crescimento endotelial vascular fator, que são mostrados para aumentar a permeabilidade BBB e estimular a angiogênese14,,75,76,77. Introduzindo uma cultura inicial de fragmentos isolados capilares e combinar isso com puromicina (4 µ g/mL) e uso de PDS, conseguimos reduzindo o número de contaminar as células remanescentes após a purificação, para que depois disso pudéssemos estabelece apertadas monocamadas endoteliais em inserções de membrana permeável. Para garantir a melhor fixação de células endoteliais em ambos os pratos da cultura e superfícies de inserção de membrana permeável, tem sido observado que uma mistura de revestimento de colágeno tipo IV (a partir de placenta humana) e fibronectina aumenta a proliferação rendimentos e a mistura combinada foi favorecido, portanto, sobre o método tradicional, usando somente o colágeno tipo I78.

Diferenciação de células e o estabelecimento de um modelo de alta TEER em Vitro BBB

Os pBECs no MC geralmente manter muitas características chaves BBB após isolamento, de modo que co-cultura com astrócitos não é essencial para a indução de junções apertadas funcionais e alcançar alta TEER valores16,57. Os esforços para otimizar as condições para a diferenciação das células endoteliais em fenótipo BBB incluem o uso de soro contendo suplementado com 8-CPT-cAMP, hidrocortisona7 (aumentando o nível cAMP intracelular13) e RO 20-1724 (mantendo o nível de cAMP intracelular), que em conformidade com as anteriores conclusões74,79 juntos com sucesso melhorou a tensão de barreira e aumentou TEER e também pode ter ajudado a restaurar uma mais na vivo como expressão de gene perfil80. No entanto, o uso de hidrocortisona para o reforço da camada endotelial pode modificar a resposta das células endoteliais a certos estímulos e com a finalidade de usar o modelo para a investigação de respostas a quimio - e citocinas durante a inflamação, a uso de hidrocortisona pode precisar de ser evitado.

A partir de estudos comparativos com MC, MC com ACM e astrocyte co culturas em ambos os laboratórios participantes e em outros lugares, tem sido demonstrado que a contribuição hamartomas é capaz de melhorar características endothelial do BBB e aumentando a tensão de barreira 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. para alcançar tal alta expressão do fenótipo BBB em pBECs, estabeleceu um NCC com astrócitos e descobri que ambos porcina e astrócitos primário de rato foram benéficos, como também observado em outros laboratórios22. Durante o estabelecimento da astrocyte CNCC, a experiência demonstrou que a pureza e a idade das culturas astrocyte influenciaram a tensão da barreira endotelial resultante, wIth a idade ideal dos astrócitos sendo 2-8 semanas, que se correlaciona com uma mudança observada na morfologia astrocyte ao longo do tempo. No dia antes de estabelecer o NCC, uma mudança de médio para os astrócitos destina-se a remover metabólitos nocivos e permitir tempo suficiente para os astrócitos liberar a estimulação e sinalização fatores que influenciam o desenvolvimento da barreira. Quando co cultivo as células endoteliais e astrócitos no sistema de inserção de membrana permeável, é importante prestar atenção especial para a manipulação do modelo barreira. Durante a mudança de médio, aspiração e adição de médio porte e os movimentos das pastilhas devem ser feitos com cuidado para minimizar o rompimento da barreira endotelial.

Reprodutibilidade e confiabilidade

Um grande desafio quando usando células primárias para o estabelecimento de modelos em vitro é alcançar alta reprodutibilidade entre culturas. Essa normalização pode ser atendida pela escolha do método, uso de ferramentas de alta qualidade e reagentes e experiência em microdissection. A grande reprodutibilidade com baixa variação de lotes para o método apresentado, portanto, é altamente dependente da aderência estrita aos procedimentos descritos.

Para alcançar uma boa reprodutibilidade entre lotes e frascos durante o TEER medições, uma câmara de medição de resistência de tecido epiteliais voltímetros com eletrodos rígida em miniatura, ao invés de eletrodos de pauzinho flexível podem ser usados, reduzindo o variabilidade dos valores observados de TEER. Além de atingir valores elevados de TEER (Figura 4), a confiabilidade do modelo apresentado é confirmada pela correspondente baixa pequena soluto permeabilidade (Figura 4) e pela caracterização immunocytochemical da pBECs (Figura 5 ).

Limitações do método aplicado e modelo

O uso de porcos transgênicos e miniatura tem aumentado durante as últimas décadas, mas a quantidade de dados em vivo ainda é limitada em comparação com dados disponíveis para modelos de roedores e, portanto, pode representar um desafio para comparar os dados dos suínos em vitro com resultados na vivo . No entanto, como a biologia do porco reflete a biologia humana mais pròxima do que muitos animais de laboratório estabelecidas, e porco transgénico modelos para estudar doenças neurológicas como a doença de Alzheimer agora têm sido estabelecidos84, a disponibilidade de na vivo dados deverá tornar-se menos problemático com o tempo.

Uma limitação de membrana permeável inserir sistema modelos atuais do BBB é a incapacidade de imitar o fluxo de sangue no microvessels. In vivo, tensão de cisalhamento foi mostrado para afetar muitos aspectos da fisiologia da célula endotelial como divisão, diferenciação, migração e apoptose85,86e para influenciar características BBB importantes tais como a expressão de proteínas juncionais, indução e polarização dos transportadores61,85,87. Para introduzir tais condições, sistemas microfluídicos recentemente desenvolvido podem ser considerados88,89,90.

Um método útil para corrigir o efeito da camada de água unstirred (camada aquosa de limite) em vitro dados de permeabilidade é derivar o previsto 'permeabilidade intrínseca' na vivo, usando a abordagem de software baseado em21. Este software também pode ser usado para dados de permeabilidade detalhada análise21.

Futuras aplicações e indicações para o método

Como os componentes da unidade neurovascular foram mostrados para desempenhar um papel importante na indução e manutenção de características do BBB, e não atual modelo in vitro ainda foi capaz de imitar totalmente as condições na vivo , constituintes importantes e interações podem ainda estar falta. Os actuais esforços no desenvolvimento do modelo apresentado incluem o estabelecimento de modelos triple-cultura com astrócitos e pericitos e experiências combinando células de diferentes espécies. Incorporação de pericitos até agora não tem sido observada para aumentar significativamente os níveis TEER da barreira. No entanto, modelos de suínos syngeneic foram observados para ser comparável ao triplo culturas usando células endoteliais do cérebro porcina, astrócitos de rato e rato pericitos em relação a tensão de barreira e expressão da característica de proteínas hallmark do cérebro endotélio22. A fim de desenvolver um modelo baseado em células humanas, futuros desenvolvimentos do in vitro modelos BBB para entrega e descoberta da droga podem depender a derivação de células-tronco pluripotentes humanas e tronco adulto e/ou progenitoras células21.

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Disclosures

Os autores não relatam nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen para assistência técnica, e a Fundação Lundbeck conceder número 14113-R155-2013.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

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References

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