إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

المكتشفة حديثا المؤكسد أشكال 5-ميثيلسيتوسيني (أوكسي-mCs)، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) قد تمثل تعديلات الحمض النووي متميزة مع أدوار وظيفية فريدة من نوعها. هنا هو وصف سير عمل شبه كمي للتصور oxi-الإشراف على التوزيع المكاني والتنميط كثافة إشارة كولوكاليزيشن.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

لعدة عقود، قد تم 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) يعتقد أن تعديل الحمض النووي فقط مع دلالة وظيفية في ميتازوانس. اكتشاف الانزيمية أكسدة 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC)، فضلا عن الكشف عن N6-ميثيلادينيني (6mA) في الحمض النووي للكائنات الحية متعددة الخلايا تقدم درجات إضافية التعقيد لأبحاث جينية. وفقا لمجموعة متزايدة من الأدلة التجريبية، قد تلعب هذه التعديلات الحمض النووي رواية أدوار محددة في العمليات الخلوية وإنمائية مختلفة. الأهم من ذلك، نظراً لأن بعض هذه الأنسجة معرض علامات (هاء زاي 5hmC ونادي 5 5caC)-والتنموية الخاصة بمرحلة التواجد في الفقاريات، immunochemistry يمثل أداة هامة للسماح بتقييم التوزيع المكاني لتعديلات الحمض النووي في سياقات البيولوجية المختلفة. ويرد هنا أساليب التحليل الحسابي لتعديلات الحمض النووي تصور طريق immunostaining تليها مجهرية [كنفوكل]. على وجه التحديد، توليد البعد 2.5 (2.5 D) إشارة المؤامرات كثافة، إشارة تظهر كثافة، والتقدير الكمي لتلطيخ كثافة في الخلايا وتحديد الإشارات كولوكاليزيشن معاملات متعددة. جماعياً، قد تكون هذه التقنيات التشغيلية في تقييم مستويات والتعريب من هذه التعديلات الحمض النووي في النواة، المساهمة في توضيح أدوارهم البيولوجية في ميتازوانس.

Introduction

مثلايشن الحمض النووي، إليه موثقة توثيقاً جيدا المرتبطة بتنظيم النسخي يستتبع تعديل بقايا السيتوزين في 5 '-سيتوزين-فوسفات-جوانين-3' سياق dinucleotide (البد) عن طريق إضافة مجموعة الميثيل (-CH3) 5- ذرة كربون حلقة بيريميدين السيتوزين لتشكيل 5-ميثيلسيتوسيني (5mC)1. في الثدييات، وحوالي 70% المعبأة هي ميثليته الذي يشكل 1% فقط من مورثات بهم كما أنها تنضب من هذا التسلسل المتناوب نظراً لميل مطفرة 5mC شكل عفوي دياميناتي إلى الثايمين2. وتبين وجود مجموعات الميثيل على تسلسل الجين المروج علاقة قوية مع القمع النسخي في الفقاريات3،،من45. بالإضافة لهذه المجموعات الميثيل هو تحفزها عاليا المصانة الحمض النووي الإنزيمات ميثيلترانسفيراسي (دنمت) DNMT3a 3b و 3 لتر و DNMT1 وتعديل سيتوسينيس البد في سياقات مثلايشن حيثياته والصيانة على التوالي6. DNMT3A/ب التعبير مرتفعة خلال التنمية في الخلايا الجذعية الجنينية وابيبلاست؛ لكن يلاحظ التعبير عن تقلص عقب pluripotent خلية نسب الالتزام بمصائر جسدية أثناء تمايز8. بينما تقاسم التكرار الوظيفي، DNMT3a و 3b عرض أنماط التعبير الخاصة بالانسجة، مع 3a الكشف عن شكل موحد في الأجنة الماوس لكن 3b الغالب مترجمة إلى نيوروكتوديرم و أنسجة المشيمة الأديم الظاهر8.

يمكن توارث التوقيعات مثلايشن أثناء الانقسام والانقسام الاختزالي10. مثلايشن الصيانة ينطوي على تعديل DNMT1 سهلت البد السيتوزين المخلفات الموجودة في نصفي ميثليته باليندروميس في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل11. يربط DNMT1 الحمض النووي في النسخ المتماثل شوك11 ونتيجة لذلك، مثلايشن الجينوم المستويات الذروة خلال المرحلة S من دورة الخلية12. DNMT1 ميثيلاتيس سيتوسينيس غير معدلة وبالتالي التمييز المركب حديثا خيوط الحمض النووي وتعزيز المنظمة إكستشروموسومي والحفاظ على القمع النسخي الملامح13. ويحتفظ DNMT1 من خلال الاعتراف بتسلسل "الحمض النووي البد" هيمي ميثليته، الأنماط المتبعة في مثلايشن التي خططتها حيثياته مثلايشن مثل القمع الطويل ويتخلل النووية العنصر 1 (LINE1) ريتروترانسبوسون المروجين تمنع نشر مسرطنة محتملة لها14. على الرغم من امتلاك هيمي ميثليته تقارب ملزم التفضيلية الحمض النووي، DNMT1 يمكن أن ميثيلاتي البد أونميثيلاتيد الجزيرة (CGI) تسلسل في خلايا متحولة DNMT3a/b -/- ، الاضطلاع بدور مثلايشن طوارئ دي نوفو 15 . وهكذا نظراً لطبيعة الحمض النووي النسخ المتماثل16شبه المحافظ، الخص مثلايشن الصيانة يمكن إخلاص التوقيعات مثلايشن من الوالد إلى ابنه خلية17.

ومع ذلك، للجينات التعبير أن يكون التعديل مثلايشن التضمين بشكل حيوي، والقمعية يجب محو، الذي يمكن أن تحققه demethylation السلبي والإيجابي آليات18. البروتينات ترانسلوكاسي (TET) 10-أحد عشر ينتمون إلى عائلة مصانة من البروتينات ديوكسيجيناسي قادرون على أكسدة متكررة من مجموعات الميثيل في البد بقايا19. هذه البروتينات تيت، مثلى لقاعدة ي ملزم البروتينات (إدارة) اكتشفت في برسي المثقبيات، الاعتراف وربط الحمض النووي تعديل قواعد مثل 5mC والأوكسجين هذه المخلفات إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5- كاربوكسيلسيتوسيني (5caC)20. البروتين تيت يسرت أكسدة 5mC النتائج في تغيير تشكيل تدريجي من الميثيل إلى تكوينات الهيدروكسيل والكربونيل وكاربوكسيلات، لكن يمكن توليفها التعديلات 5fC و 5caC مباشرة من 5mC الأكسدة21، 22 , 23 , 24.

مؤشرا مفيدة نشاط البروتين تيت في فهم تنظيمها بدراسة توزيع ووفرة من علامات أوكسي-الميثيل-السيتوزين. وجود 5mC كبير في البد الفقيرة المروجين قابلاً للاكتشاف وعلى النقيض من المناطق الغنية البد أونميثيلاتيد، لأنها مميزة من البد جزر25. عبر الأنسجة، والأنسجة أعلى مثلايشن محددة ويلاحظ في المخ والخصية والدم بينما يحمل مخاطية الفم هيبوميثيليشن أكبر، تشير إلى نمط مثلايشن تفاضلية التي تحدث في أنسجة محددة المروجين26.

من خلال استخدام 5mC مكافحة حساسة ومكافحة 5hmC أظهر الأضداد في انتقائية الميثيل/هيدروكسيميثيل الحمض النووي إيمونوبريسيبيتيشن (مدب/هميديب)، وتسلسل الإنتاجية العالية اللاحقة، فوكلاند et al. شغل 5hmC عالية على المروجين، exons ومتواليات ريتروترانسبوسون الخط-1 الذي يرتبط بمستويات انخفاض 5mC في هذه المواقع في الماوس الجنينية الجذعية الخلايا27. عكسيا، لوحظ أكبر 5mC الإثراء في تسلسل الساتلية المتكررة حيث كان الوجود 5hmC المحدودة28. وتكشف الدراسات التي أجريت على أنسجة المخ البشري فص جبهي تخصيب 5hmC هامة للغاية، وأربعة إضعاف عما كانت عليه في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس28. في التوافق مع الملاحظات السابقة، مترجمة عالية الإنتاجية تسلسل فص جبهي الأنسجة تبين الأغلبية 55-59% من إشارة 5hmC في الكثافة السكانية المنخفضة البد مروج المناطق، 35-38 في المائة داخل الهيئات الجينات وحوالي 6% نسبة أشغال في إينتيرجينيك المناطق. وفي المقابل، اثريت 5mC في المناطق إينتيرجينيك (25-26 في المائة) وأعلى داخل الهيئات الجينات (52-55%) لكن انخفاض (22-24 ٪) في مروج تسلسل29. هذه الدراسات تشير إلى وفرة 5hmC في الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة الجسمانية، وخاصة في الدماغ، بيد أن تقتصر تحقيقات بشأن توزيعات 5fC و 5caC.

من المثير للاهتمام، اكتشفت مؤخرا في حقيقيات النوى، مثلايشن بقايا الأدنين في موقف 6 النيتروجين (N6) العرض (6mA) وفرة الجينوم الشخصية معكوس لأن 5mC30. وتكشف الملاحظات من الترادف اللوني السائل إلى جانب الطيف الكتلي 6mA المستويات المطلقة وجود فائض في سمك الزرد والخنزير الأجنة في وقت مبكر مقارنة بالحيوانات المنوية مع المستويات (0.003% أدينينيس الجينوم) تزداد باطراد على الإخصاب، وتبلغ ذروتها في مرحلة إنمائية morula (33 إضعاف أعلى من الحيوانات المنوية) وبلوغ مستويات جسدية حالة ثابتة من 0.004% من الجينوم أدينينيس31. إيمونوبريسيبيتيشن 6mA أثري تسلسلات الحمض النووي أثبت شغل الغالبة (حوالي 80% الإثراء) هذه العلامة في مناطق العنصر المتكرر وبدء النسخي مواقع32. تأطير هذه الملاحظات والتحقق من اكتشاف 6mA فارغة ديميثيلاسي هبوساطة الخلايا الجذعية مبريونيك العارضة 6mA المتراكمة إسكات ريتروترانسبوسون الخط-1 مقارنة بالعناصر النشطة ترانسكريبتيونالي في خلايا wildtype. تشير هذه البيانات إلى دالة تنظيمية النسخي ل 6mA33.

بينما العلامات البيوكيميائية مترافق بالإضافة إلى فحوصات DIP اللاحقة تشير إلى وجود أو عدم وجود مشتقات ميثيلسيتوسيني المؤكسدة (أوكسي-mCs)، لا يمكن نقلها التوزيع المكاني أو المعلومات القابلة للقياس الكمي لهذه العلامات34، 35-بروتوكول للكشف عن حساسية 5hmC و 5caC قد وضعت مؤخرا36. هذا الأسلوب إيمونوستينينج الثانوي القائم على جسم fluorophore مترافق مقترنة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] الليزر يمتلك ميزة فريدة من نوعها لتوفير الترجمة المرئية لهذه التعديلات الحمض النووي داخل الخلايا، وبالتالي، إذ تؤكد الفردية سلبا أو إيجاباً الملون الخلايا المقابلة مع وجود هذه العلامات غير متجانسة. كثافة مطلقة إشارة 5hmC و 5caC كما تتضخم بالأجسام المضادة مترافق تمكين تفسيرات شبه كمي المقترح حول حجم والمواقف من هذه العلامات داخل النواة مثلاً في منطقتي هيتيروتشروماتيك يوتشروماتيك 37 , 38-هنا يتم وصف أسلوب للتحليل الحسابي للصور مجهرية [كنفوكل]. توليد التوزيع المكاني د 2.5 المؤامرات لعرض 5hmC متميزة ويتجلى 5caC إشارة قمم كل بكسل ومواقعها داخل الأنوية. المدرج التكراري يرسم من 5hmC وكثافة في إشارة 5caC يمكن أن توضح الاتجاهات في وفرة من هذه العلامات كالقمم وأحواض يتم رسمها كقنوات منفصلة غير متداخلة. أخيرا، من خلال تنفيذ الدالة كولوكاليزاتيون، يمكن تحديد درجة قرب إشارة واحدة إلى أخرى ونتيجة لذلك، يمكن تحديد إحداثياتها الجينوم كل منهما.

Protocol

1-توليد الصور [كنفوكل]

  1. استعدادا لتحليل نماذج معدلة من السيتوزين، أداء المناعي تلطيخ كما هو موضح بقوة et al. 34-
  2. القيام بتصوير الشرائح باستخدام مجهر وحفظ الملفات في تنسيق LSM.
    ملاحظة: عند مقارنة كثافة الملامح بين عينات القيم المستخدمة للطاقة الليزر ومكسب لكل قناة ويجب الحفاظ على في جميع أنحاء الصورة اتخاذ الإجراء للسماح للمقارنة المباشرة في مرحلة تحليل الصورة.

2. جيل من "المؤامرات كثافة" 2.5 د

  1. فتح البرنامج (مثلاً، زن الأسود) وحدد ' "معالجة الصور" '.
  2. انتقل إلى القائمة ملف وحدد فتح. حدد الصورة التي تتطلب المعالجة.
  3. فوق ' "إظهار الكل" ' أسفل الصورة لجعل كافة عناصر التحكم الرسومية مرئية. في النصف السفلي من الشاشة، هناك ثلاثة علامات التبويب؛ ' الأبعاد '، ' عرض ' و ' الرسومات '، حدد ' الرسومات ' التبويب
    1. اختيار ' مستطيل ' أداة لتحديد الأنوية/منطقة الاهتمام.
    2. تحديد ' قص المنطقة ' لاقتصاص الصورة. سيؤدي هذا إلى إنشاء صورة جديدة للمنطقة المزروعة في علامة الجدولة منفصلة
    3. انتقل إلى القائمة ملف وحدد "حفظ as. إعطاء" اسم الملف وحفظه كملف LSM أو الاتحاد-
  4. فتح البرامج (مثلاً، زن الأزرق) وحدد ' "مكتب زن" '.
  5. إرسال الصورة المقتصة من "زن الأسود" إلى "الأزرق زن" بتحديد الملف ثم النقر فوق القائمة ملف، وحدد إرسال إلى الطبعة الزرقاء 2012 زن. ثم سيتم فتح الصورة المقتصة في البرنامج ذات الصلة-
    ملاحظة: يتم نقل ملف الصورة لأن ميزة الأرض كثافة د 2.5 في زن الأسود 2012 لا يتم عرض صور قناة متعددة في وقت واحد.
  6. على الجانب الأيسر من الصورة، اختر علامة التبويب المسمى ' د 2.5 '، تمكن هذا التصور للصورة في 2.5 D. انقر فوق ' "إظهار الكل" ' لجعل كافة عناصر التحكم الرسومية مرئية.
  7. تغيير التصور الإعدادات باستخدام أربعة أشرطة رمادية يقع إلى اليسار وأسفل الصورة.
    ملاحظة: شريط اليد اليسرى، أعلى الشاشة = التكبير. شريط اليد اليسرى، وأسفل الشاشة = الصورة بدوره على المحور. أسفل الشاشة، اليد اليسرى قضيب = دوران للصورة. أسفل الشاشة، حق اليد بار = توسيع والعقد أشرطة مقياس.
  8. التأكد من أن تجعل الوضع المحدد هو السطح كما يعطي هذا التصور أفضل من قمم الفردية-
  9. تغيير الشبكة عن بعد عن طريق تغيير النسبة المئوية، انخفضت النسبة المئوية المحددة الأكثر كل ذروة الفردية-
  10. لحفظ الصورة 2.5D، أولاً بإخفاء قائمة ملف على الجانب الأيمن والأدوات الرسومية أسفل الصورة بالنقر على السهم رمادي أسفل الأرض د 2.5 (بعد ذلك إلى ' إظهار جميع ')، هذا وسوف إخفاء علامات التبويب رسومية تسمح بالصورة لتوسيع لملء حصاة أ. لإنقاذ الأرض 2.5D، اضغط ' PrtSc ' مفتاح على لوحة المفاتيح. هذا وسوف التقاط لقطة للشاشة. لصق الصورة في الرسام، واقتصاص الصورة قبل الحفظ.

3. التنميط كثافة

  1. فتح البرنامج (مثلاً، زن الأسود) وحدد "معالجة الصور"-
  2. انتقل إلى القائمة ملف وحدد فتح. حدد الصورة التي تتطلب المعالجة.
  3. كما سوف تظهر الصورة على الشاشة، على الجانب الأيسر من الصورة حدد علامة التبويب المسمى ' الشخصية '-
  4. بانخفاض نصف الشاشة حدد (التجزئة) ' "إظهار الكل" ' علامة التبويب. وهذا سيمكن الوصول إلى كافة خيارات التنسيق-
  5. في النصف السفلي من الشاشة، هناك ثلاثة تبويبات؛ ' الأبعاد '، ' عرض ' و ' حدد ProfileƆ ' الشخصية ' وحدد (التجزئة) ' الجدول ' مربع. حدد ' السهم ' زر.
  6. على الصورة استخدم الماوس لتحديد نقطة بدء واسحب الماوس فوق عدد متواصل من الخلايا. حرر زر الماوس لإنتاج مؤامرة كثافة للخلايا على طول الخط؛ بالإضافة إلى ذلك سيتم ملء الجدول ببيانات قياس كثافة بكسل على طول الخط لكل طول موجي.
    ملاحظة: الجدول سوف يوفر المسافة (ميكرومتر) في بكسل التي تتم قراءة الكثافة للأسفار الحمراء والخضراء والزرقاء-
  7. لتصدير هذه البيانات، انقر على الحق في الجدول، حدد ' احفظ الجدول … ' وحفظه إلى موقع مناسب كملف.txt.
  8. لحفظ الصورة الشخصية كثافة المحدد حدد من القائمة ملف وحدد ' تصدير … '. في النافذة المنبثقة اختر ' "معلم ملف صورة" (تنسيق) ' و ' "محتويات إطار الصورة"-جزء واحد (البيانات) ' متبوعاً بالنقر فوق ' حدد اسم الملف وحفظ … ' اختر مكان مناسب ثم انقر فوق ' حفظ '.
  9. كرر هذه العملية لكل ملف تعريف كثافة الفردية تبعاً لرؤية الحقول وعدد التشكيلات الجانبية لتحليل-
  10. كثافة استيراد تعريف البيانات المحفوظة (انظر 3.7) وتحليل في جدول متبوعاً بالتحليل الإحصائي-

4. تحليل المشارك الترجمة

  1. افتح البرنامج وحدد ' معالجة الصور '.
  2. انتقل إلى القائمة ملف وحدد فتح. حدد الصورة التي تتطلب المعالجة.
  3. كما سوف تظهر الصورة على الشاشة، على الجانب الأيسر من الصورة حدد علامة التبويب المسمى ' كولوك '.
  4. بانخفاض نصف الشاشة حدد (التجزئة) ' "إظهار الكل" ' علامة التبويب. وهذا سيمكن الوصول إلى كافة خيارات التنسيق-
  5. في النصف السفلي من الشاشة، هناك أربع علامات تبويب؛ ' الأبعاد '، ' عرض '، ' الرسومات ' و ' حدد ColocalizationƆ ' كولوكاليزيشن ' ووضع علامة في المربع ل ' الجدول ' و ' الصورة '. حدد الرمز الثالث على طول في الجزء العلوي من علامة التبويب هذه (وثيقة بيزيه سوف يظهر النص عند مرور الماوس فوق الأداة) ثم استخدام هذه الأداة لتطويق نواة واحدة، وقيم لهذه الإرادة الأنوية ثم تظهر في الجدول
    1. .
      ملاحظة: لكل الأنوية المحاصرة ويتم إنتاج مؤامرة مبعثر للاحمر مقابل الفلورية الخضراء مما هو متصور في لوحة اليد اليسرى على الشاشة. ثم يتم نقل المحور من أجل بوابة خارج الخلايا اعتماداً على العتبة. كالنواة للفائدة المحددة يدوياً في الصور، ضبط عتبات النابضة فوق الصفر غير مطلوب. جميع قيم الكثافة بكسل ولاحظ داخل محيط النووية تعتبر بمثابة إشارة إيجابية.
  6. تكرار هذه العملية بواسطة تحديد الرمز الثالث في علامة التبويب وتطويق نويات اللاحقة حتى يتم إكمال dataset.
  7. لتصدير هذه البيانات، انقر على الحق في الجدول، حدد حفظ الجدول وحفظ إلى موقع مناسب.
  8. لحفظ الصورة كولوكاليزيشن، حدد من القائمة ملف وحدد ' تصدير … ' ثم اختر؛ معلم "ملف صورة" (تنسيق) و ' "محتويات إطار الصورة" – طائرة واحدة (البيانات) ' متبوعاً بالنقر فوق ' حدد اسم الملف وحفظ … '، واختيار موقع مناسب وانقر فوق ' حفظ '.
  9. الأرض كولوكاليزيشن البيانات في جدول بيانات متبوعاً بالتحليل الإحصائي-

Representative Results

لتحديد التوزيع المكاني ل 5hmC و 5caC في التفريق بين فروعه الكبدية إيمونوستاينيد الشرائح لهذه التعديلات الحمض النووي تم تصويرها باستخدام مجهر.

أجرى تحليل أولى للتوزيع المكاني لهذه أوكسي-الإشراف من خلال توليد 2.5D كثافة قطع (الشكل 1A، 1B). يبدو أن على قمم الأحمر والأخضر تحديداً جيدا مع وجود محدود من قمم البرتقالي تشير فقط تداخل صغيرة الإشارات التي 5caC و 5hmC. الاتفاق مع هذه النتائج، لا تتطابق التشكيلات الجانبية لكثافة 5hmC و 5caC في الخلية المقابلة بشدة مع بعضها البعض (الشكل 1). وهذا يوضح أن 5caC و 5hmC معرض أنماط التوزيع النووي في فروعه الكبدية مما يوحي بأن أكسدة تعتمد على تيت 5mC يؤدي إلى توليد المشتقات المؤكسد مختلفة لهذا التعديل الحمض النووي في الكروماتين محددة متميزة المناطق.

لمقارنة مستويات 5caC و 5hmC في ميدولوبلاستوما ضاوي وخلايا ependymoma بكسد-1425EPN، أجرى إيمونوستينينج لهذه أوكسي-الإشراف على كل العينات تحت ظروف تجريبية مماثلة. ثم قورنت شدة الإشارات 5caC و 5hmC في 20 ملفات التعريف التي تم إنشاؤها عبر الخلايا 3-5 المسجلة لكل خط الخلية (الشكل 2A--2D). التحديد الكمي لهذه النتائج كشفت عن أن الخلايا بكسد-1425EPN يحمل مستويات أدنى بكثير من إيمونوستينينج 5hmC و 5caC بالمقارنة مع الخلايا ضاوي (الشكل 2D).

وبالنظر إلى قناتين الأحمر (5hmC) والأخضر (5caC) الذي يمكن الإشارة إلى ك R و G على التوالي، معامل الارتباط لبيرسون (PCC) يصف درجة التداخل المكاني والفصل المشترك للبحث والتطوير & ز افتراض كلا علامات موجودة في خطي العلاقة مع بعضها البعض، إلى بواسطة إحصاء ص34. تربيع قيمة المجلس المركزي الفلسطيني، النطاق المرمز إليه بواسطة R2 يتيح قياس تباين كثافة إشارة خضراء الذي يتأثر بإشارة حمراء كثافة34. وهذا لا لزوم له لتحليلنا التعريب المشارك 5hmC مقابل 5caC.

دراسة التوزيع المكاني ل 5caC و 5hmC في هيبسكس (أونديف) غير متمايزة والأنسجة الكبدية (HE24) بعد التعريفي 24 ساعة، أجرى تحليل كولوكاليزيشن لهذه التعديلات الحمض النووي في نفس الصور [كنفوكل]، مع قيم ص 20 تحليل الأنوية لكل خط الخلية (الشكل 3 ألف-3 ج).

التحديد الكمي لهذه النتائج أظهرت أن درجة كولوكاليزيشن أعلى بكثير (ف < 0.05) في HE24 بالمقارنة مع أونديف (الشكل 3 ج). وهذا يمكن أن يعزى إلى انخفاض حجم الوجود 5caC، ومن ثم شدته إشارة انخفاض في الخلايا أونديف.

Figure 1
رقم 1: تلوين المناعي للأنسجة الكبدية فروعه في 72 ساعة بعد التعريفي للتمايز. شارك تلطيخ (A) 5hmC (أحمر)، 5caC (الأخضر) و DAPI العداد النووية وصمة عار (أزرق). سهم متقطع أبيض 'ب' يشير إلى اتجاه التنميط عينات من خلال النواة، يتضح في ج 1. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. القناة الحمراء: كسب 800، 1% بالليزر. قناة الأخضر: الحصول على 750، الليزر 2.4 في المائة. قناة DAPI: الحصول على 750، الليزر 2.6 في المائة. (ب) د 2.5 كثافة الأرض 5hmC و 5caC وإشارات DAPI. قمم الفردية تمثل كثافة الإشارات المطلقة لكل بكسل. وترد آراء المدمجة والقنوات الفردية. (ج) إشارات كثافة 5hmC و 5caC و DAPI في فروعه الكبد في 72 ساعة بعد التعريفي للتمايز. سجلت على طول أبعاد سهم متقطع أبيض 'ب' ذروة الشدة والمشار إليها على طول المحور السيني كثافة الشخصية بواسطة سهم أسود متقطع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل 5hmC و 5caC إشارة الكثافات في ميدولوبلاستوما ضاوي وخطوط الخلايا ependymoma بكسد-1425EPN- (أ) إيمونوفلوريسسينت تلطيخ 5hmC (أحمر) و 5caC (الأخضر) في الخلايا ضاوي وبكسد-1425EPN. تم القبض على الصور مع 63 × النفط غمر عدسة الهدف، سواء على نفس الإعدادات. وترد آراء المدمجة والقنوات الفردية. تمثل أشرطة مقياس 10 ميكرون. القناة الحمراء: كسب 746، الليزر 1%. قناة الأخضر: الحصول على 750، الليزر 2.4 في المائة. يتم توسيع الخلايا الفردية ضاوي (ب) و (ج) بكسد-1425EPN في أرقام متجاورة. تغيير حجم أشرطة (ب) وتمثل 5 (ج) ميكرومتر. (د) شدة الأسفار يعني إشارات 5caC مقابل 5hmC في خلايا ضاوي وبكسد-1425EPN (n = 20، التنمية المستدامة). تم تقييم أهمية استخدام اختبار F واثنين--نموذج تي-Test. العلامات النجمية تدل القيم ف يعتد به إحصائيا من * * ف < 0.01 و * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تحليل كولوكاليزيشن الإشارات المطلقة 5hmC و 5caC في هيبسكس غير متمايز (أونديف) مقارنة بالانسجة الكبدية 24 ساعة السلف بعد متمايزة خلايا (HE24)- صور مجهرية [كنفوكل] (أ) متمايز هيبسكس والخلايا HE24 (ب) الملون 5hmC (أحمر)، 5caC (الأخضر) و DAPI (أزرق). خلايا تم تصويرها مع X 63 النفط غمر عدسة في إعدادات متطابقة. 20 نواة مطوقة بتوضيح الخلايا عينات لتحليل كولوكاليزيشن. تمثل أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. القناة الحمراء: كسب 800، 1% بالليزر. قناة الأخضر: الحصول على 750، الليزر 2.4 في المائة. قناة DAPI: الحصول على 750، الليزر 2.6 في المائة. (ج) تحليل كولوكاليزيشن لوجود إشارة 5caC ضمن نطاق قرب 5hmC في أونديف و HE24 (n = 20، التنمية المستدامة). تم تقييم أهمية استخدام اختبار F واثنين--نموذج تي-Test. العلامات النجمية تدل القيم ف يعتد به إحصائيا من * ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول عملية تدريجية لإنشاء عروض تقديمية مرئية لتعديلات الحمض النووي داخل نواة. بينما حساسية وتأثيراً، تمتلك هذه التقنيات عددا من أوجه القصور.

فإنه من الضروري التأكيد على أن قطع البيانات التي تم إنشاؤها من 2.5 د، وكثافة الإشارات والتحليل كولوكاليزاتيون شبه كمي في الطبيعة. سبب الإضاءة نقطة بنقطة العينة أثناء الحصول على الصور في ليزر المسح مجهر [كنفوكل]، يتم تسجيل كثافات إشارة المطلق لكل قناة. ومع ذلك، هذه ليست المقادير المطلقة ل 5hmC و 5caC التي تم الكشف عنها وفقط تمثل مؤشرات على وجود أو غياب أو حجم هذه علامات جينية.

نظراً للطبيعة المتكررة لإشارة إيضاحات مسهبة، إرباك القيود متسقة مع الحجم الآلية المطبقة لتعزيز الإشارات حتما تقريبية لشغل الجينوم المادية الحقيقية لهذه علامات34. قد تحجب التعريب الجينوم الحقيقية لهذه العلامات بهذه البروتينات الضخمة، التي تحتل فعلياً المناطق قابل للحل حتى في حدود 200-300 نانومتر34القرار الأمثل [كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، لا يمكن مقارنة كثافة إشارة القنوات الفردية لكل علامة لبعضها البعض نظراً للاختلافات في جسم حساسية و تصريف فلوروفوري34. ولكن المعلومات التي تم الحصول عليها مع التصوير يلقي الضوء على المنظمة المكانية والزمانية للعلامات الجينية.

لدقة كوانتيتيشن إشارات 5hmC و 5caC، سلط الضوء على الأنوية وطوق ضد كونتيرستين DAPI، وضوح ترسيم المنطقة ليتم تحليلها. يوزع هذا الإجراء مع الحاجة إلى معايرة عتبات النابضة كما يتم تجاهل ضجيج الخلفية من خلال دليل عملية اختيار نواة1. يمكن أن يتحقق أتمتة هذه العملية في أحدث البرامج التي تسمح بتجزئة النووية التي يتعين القيام بها. حين حزم البرمجيات الحرة البديلة مثل فيجي المتاحة للتحليل كولوكاليزيشن، وعيوب كشرط لتحويل الصور إلى صيغ ثنائية 8 بت، إخفاء الصور وإدخال البيانات حجم الاستبعاد لتحديد مناطق لمصلحة الحد إمكانية المستخدم لهذا البرنامج. بالإضافة إلى ذلك، النظر الشاملة محدودية مستويات 5hmC و 5caC في الجينوم مقترنة بموقعها المهيمن في مناطق يوتشروماتيك، ونضوب الجينوم البد تسلسل بشكل عام، يطوق اليدوي نويات يدخل المستخدم--التحيز. ولذلك، تسليط الضوء على نويات تلقائياً تفترض جميع الأحداث التي تقع داخل منطقة مرسمه لتكون إيجابية ويتجاهل أي بكسل الخلفية التي قد تكون موجودة. وهكذا، تحليل الصور استناداً إلى كثافة بكسل قد يكون أكثر جدوى. هذه العوامل مهمة عند النظر في استخدام معامل كولوكاليزيشن ماندر لتحليل درجة التداخل المكاني بين إشارتين، بصرف النظر عن كثافة إشارة بهم كمعارضة لمعامل الارتباط بيرسون الذي يفترض العلاقة الخطية بين الإشارات.

عموما، تحمل التقنيات المبينة هنا موضوع تمثيل مرئي للبيانات البيولوجية في شكل بديهية. بينما تحليل الصور شبه كمي لا يمكن أن تحل محل تقنيات قوية مثل الطيف الكتلي من حيث الحساسية أو الجينوم قرار وحيد بقاعدة واسعة تتابعها، أنها توفر بيانات تكميلية تسمح الاستنتاجات والفرضيات أن تصور من تحليل الصور بدقة.

Disclosures

تم الكشف عن لا تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

العمل تدعمها التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية [BB/N005759/1 إلى أ. ر.]. ومولت نرفه روسيتريس الثقة والأمانة ستونيجاتي [A1130/M546]. ومولت المجهر زايس اليرا PS.1، وتجهيز أجهزة الكمبيوتر والبرامج ب BBSRC BB/L013827/1 (التخصصات سوبر القرار مجهرية مرفق في منحة جامعة نوتنغهام)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics