DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

몇 십년 동안 5-methylcytosine (5mC) metazoans에 기능적 의미와 함께 유일한 DNA 수정 될 생각 되었다. 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxylcytosine (5caC)의 효소 산화 N6-methyladenine (6mA) 다세포 생물의 DNA에서의 검색의 검색의 추가 제공 후 성적인 연구를 복잡성입니다. 실험적 증거의 성장 시체에 따르면 이러한 소설 DNA 수정 다른 셀룰러 및 개발 프로세스에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. Immunochemistry에 DNA 개조의 공간 분포의 평가 허용 하는 중요 한 도구를 대표 하는 중요 한 것은, 이러한 표시 (e. g. 5hmC, 5 fC와 5caC) 전시 조직-및 척추 동물, 발달 단계-특정 발생의 일부 다른 생물학 문맥입니다. 여기 DNA 수정 immunostaining 뒤에 confocal 현미경 검사 법에 의해 시각의 계산 분석에 대 한 방법은 설명 합니다. 특히, 2.5 차원 (2.5 D)의 신호 강도 플롯, 신호 강도 프로필, 여러 셀에 신호 colocalization 계수의 강렬을 얼룩이 지기의 부 량 표시 됩니다. 샨 다, 이러한 기술 평가 수준 및 이러한 DNA 수정 elucidating metazoans에 그들의 생물학 역할에 기여 하는 핵에의 지역화에 있을 수 있습니다.

Introduction

DNA 메 틸 화, 문서화 메커니즘 transcriptional 규제와 관련 된 임무는 5'-시 토 신-인산 염-구 아닌-3 시 토 신 잔류물의 수정 ' 메 틸 그룹의 추가 통해 (CpG) 디뉴클레오티드 컨텍스트 (-CH3) 5- 5-methylcytosine (5mC)1를 시 토 신 pyrimidine 링의 탄소 원자. 포유류에서 약 70%의 cpgs 내 겠은 thymine2를 자발적으로 deaminate를 5mC 돌연변이 성향 때문이 갑자기 시퀀스의 고갈로 그들의 게놈의 1%를 창설 하 갠. 유전자 발기인 순서에 메 틸 그룹의 존재는 척추3,,45에 transcriptional 억제로 강한 상관 관계를 표시 합니다. 이 메 틸 그룹의 추가 높은 보존 DNA methyltransferase (DNMT) 효소 DNMT3a, 3b 및 3 L, 그리고 각각 드 노 보 및 유지 보수 메 틸 화 문맥에서 CpG cytosines 수정 DNMT1 촉매는6. 배아 줄기 세포와 epiblast; 개발 중 DNMT3A/B 식 상승 그러나 그것의 감소 식 만능 세포 계보 하겠다는 체세포 운명 차별화8동안 다음과 같은 관찰 됩니다. 기능 중복을 공유 하는 동안 DNMT3a와 3b 표시 조직 특정 식 패턴, 3a 마우스 배아에 균일 하 게 감지 하지만 주로 neuroectoderm와 chorionic ectoderm 조직8지역화 3b.

메 틸 화 서명 유사 분열, 감수 분열10동안 상속 될 수 있습니다. 유지 보수 메 틸 화는 이중 가닥 DNA11반의 갠 palindromes에 존재 하는 CpG 시 토 신 잔류물의 촉진 DNMT1 수정을 포함 됩니다. DNMT1 바인드 DNA 복제 포크11 하 고 따라서, 게놈 메 틸 화 세포 주기12의 S 단계 피크 레벨. DNMT1 methylates 수정된 cytosines 그로 인하여 새로 합성된 DNA 가닥을 구별, x 염색체 비활성화 홍보 및 transcriptional 억제 프로필13유지. Hemi 갠 DNA CpG 시퀀스의 인식를 통해 DNMT1 de novo 메 틸 화 의 억압 긴 Interspersed 핵 요소 1 (LINE1)로 구분 하는 메 틸 화의 설립된 패턴 유지 그것의 잠재적으로 발암 성 전파14를 억제 하기 위해 retrotransposon 발기인. 비록 hemi 갠 DNA 우선 바인딩 선호도 보유, DNMT1 수 methylate unmethylated CpG 섬 (CGI) 시퀀스 DNMT3a/b -/- 돌연변이 세포, 긴급 de novo 메 틸 화 역할15 이루고 . 따라서 DNA 복제16의 반 보수적인 성격으로 인하여 유지 보수 메 틸 수 충실 하 게 정리 딸 셀17부모에서 메 틸 화 서명.

그러나, 유전자에 대 한 수 동적으로 변조, 억압 적인 메 틸 화 수정 식 해야 합니다 삭제는 수동 및 활성 demethylation 메커니즘18에 의해 달성 될 수 있다. 10-11 Translocase (TET) 단백질 dioxygenase 단백질의 보존된 가족에 속하는 소비재 잔류물19에 메 틸 그룹의 반복 산화 할 수 있다. 이러한 Tet 단백질, J 자료 바인딩 단백질 (JBP) Trypanosome bruceii에서 발견 된 동종 인식 및 수정된 DNA 바인딩 예 5mC 기초 및 산소 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-이러한 잔류물 carboxylcytosine (5caC)20. 그러나 5 fC와 5caC 수정 5mC 산화21, 에서 직접 합성 수 있습니다 Tet 단백질 5mC 결과 수 산 기, 생성, 카복실산 구성, 메 틸에서 단계적 구조 변경에서의 산화 촉진 22 , 23 , 24.

그들의 규칙을 이해 TET 단백질 활동의 유익한 표시 유통 및 oxi-메 틸-시 토 신 마크의 공부입니다. CpG 가난한 발기인에서 중요 한 5mC 존재 unmethylated CpG 풍부한 지역 달리 감지, 후자 되 고 포장 소비재의 제도25. 조직, 구강 점 막 최고의 hypomethylation 전시 하는 동안 특정 메 틸 화는 뇌, 고환 및 혈액에서 관찰 하는 가장 높은 조직에 걸쳐 조직 특정 발기인26에서 발생 하는 차동 메 틸 화 패턴을 나타냅니다.

중요 한 안티-5mC 및 안티 5hmC 통해 선택적 메 틸/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), 그리고 이후의 높은 처리량 시퀀싱, Ficz 항 체 증명 발기인에 높은 5hmC 인 exons 및 마우스 배아에서이 위치에서 감소 5mC 수준 연관-1 retrotransposon 시퀀스 줄기 세포27. 반대로, 가장 큰 5mC 농축 5hmC 존재가 제한 된28반복적인 위성 시퀀스에서 관찰 되었다. 인간의 전 두 엽 뇌 조직에서 수행 하는 연구는 매우 중요 한 5hmC 농축, 마우스 배아 줄기 세포28보다 4 배 공개. 이전 관찰과 일치에서 5hmC 신호의 전 두 엽 조직 그림 대부분 55-59%의 높은 처리량 연속에 지역화 저밀도 포장 소비재 발기인 지구 유전자 시체와 intergenic에서 약 6% 인 35-38% 영역입니다. 반면, 5mC intergenic 지역 (25-26%)와 높은 유전자 시체 (52-55%) 내에서 농축 했다 하지만 감소 (22-24%)에 발기인 순서29. 그러나이 연구 조사 5 fC와 5caC 배포판에 제한 된다 배아 줄기 세포와 체세포 조직, 특히 뇌, 5hmC의 풍부한을 나타냅니다.

흥미롭게도, 진핵생물, 위치 6 질소 (N6)에서 아데닌 잔류물의 메 틸 화에에서 최근 발견 (6mA) 디스플레이 게놈 풍부한 프로필 5mC30에의 역. 결합 하는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석에서 관찰 얼룩말 물고기와 돼지 초기 배아의 수준 (genomic adenines의 0.003%)와 정자에 비해 초과에서 존재 6mA 절대 수준을 공개 시 수정, 꾸준히 증가 morula 발달 단계 (정자 보다 높은 33 배)에서 정점 그리고 게놈 adenines31의 0.004%의 정상 상태 체세포 수준에 도달. Immunoprecipitation 농축 6mA DNA 시퀀스의 반복적인 요소 지역과 transcriptional 시작 사이트32에이 마크의 우세 인 (약 80% 농축)을 시연 하고있다. 이 관측의 컨텍스트와 6mA demethylase null 전자의 발견을 확인mbryonic 줄기 세포 축적된 6mA 전시 wildtype 셀에 transcriptionally 활성 요소에 비해 선-1 retrotransposon 입을 중재. 이러한 데이터는 6mA33transcriptional 규제 기능을 제안합니다.

그들은 공간 배급 또는 이러한 마크34, 의 정량 정보를 얻으며 수 없습니다 후속 딥 분석을 결합 하는 활용된 생화학 태그 표시 산화 methylcytosine 파생 상품 (oxi mCs)의 유무, 하는 동안 35. 5hmC 및 5caC의 중요 한 토론 검색 프로토콜은 최근에 개발 된36. 스캐닝 레이저 confocal 현미경 검사 법을 이용 하 여 함께이 fluorophore 활용 된 이차 항 체 기반 immunostaining 방법 따라서, 제공 하는 세포 내에서 DNA 수정이의 시각적 지역화의 독특한 장점을 개별 강조 긍정적으로 또는 부정적으로이 마크의 다른 유형의 존재와 함께 해당 셀 스테인드. 5hmC 및 5caC 절대 신호 강렬으로 활용 된 항 체에 의해 증폭 활성화 heterochromatic euchromatic 지역 예: 크기 및 핵 내에서 이러한 표시의 위치에 대 한 제안에 반 정량적 해석 37 , 38. confocal 현미경 이미지의 전산 분석을 위한 기법을 설명 하는 여기. 2.5 D 공간 배급의 명백한 5hmC 표시에 대 한 플롯 그리고 픽셀 및 핵 내의 그들의 위치 당 5caC 신호 봉우리 시연. 5hmC의 히스토그램 플롯 및 5caC 신호 강도 프로필 봉우리로 이러한 표시의 풍부에 트렌드를 설명 수 골짜기 별도 비중첩 채널으로 그려집니다. 마지막으로, colocalization 함수를 구현 하 여 다른 하나의 신호의 근접의 정도 확인할 수 있습니다 그리고 이것 결과로, 그들의 각각 게놈 좌표를 확인할 수 있습니다.

Protocol

1. 공초점 이미지의 세대

  1. immunohistochemical 얼룩 Abakir 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 수행 시 토 신 수정 된 형태의 분석에 대 한 준비, 34.
  2. 밖으로 슬라이드의 영상 현미경을 사용 하 여 수행 하 고는 LSM 형식에 파일을 저장.
    참고: 이미지 분석 단계에서 직접적인 비교를 허용 하는 절차를 복용 하는 이미지 전체에서 유지 되어야 때 강도 비교 프로필 샘플 사이 레이저 파워 및 각 채널에 대 한 이득에 대 한 사용 되는 값.

2. 2.5 D 강도 플롯의 세대

  1. 소프트웨어 (예를 들어, 선 블랙)를 열고 선택 ' 이미지 처리 '.
  2. 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
  3. 클릭 ' 모두 표시 ' 모든 그래픽 컨트롤을 볼 수 있도록 이미지 아래. 화면의 아래쪽 절반에는 세 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ' 및 ' 그래픽 ', 선택은 ' 그래픽 ' 탭
    1. 선택은 ' 사각형 ' 핵/관심 영역을 선택 하려면 도구.
    2. 선택 ' 영역을 잘라 ' 이미지를 자르려면. 자른된 영역에 대 한 새로운 이미지를 별도 탭에 생성 됩니다
    3. 파일 메뉴에서 저장 다른 이름으로 주고 파일 이름을 선택 하 고 LSM 또는 CZI 파일로 저장.
  4. 소프트웨어 (예를 들어, 선 블루)을 열고 선택 합니다 ' 젠 데스크 '.
  5. 자른된 이미지에서에서 전송 선 검은 선 블루 파일을 선택 하 고 파일 메뉴에서 클릭 하 여 고 선 2012-블루 버전으로 보내기를 선택 합니다. 자른된 이미지 다음 해당 프로그램에서 열립니다.
    참고: 이미지 파일은 전송 선 블랙 2012 년에서 2.5 D 강도 플롯 기능 동시에 여러 채널 이미지를 표시 하지 않습니다.
  6. 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭을 선택 ' 2.5 D ', 2.5 d에서 이미지의 시각화 수 있습니다. 클릭 ' 모두 표시 ' 모든 그래픽 컨트롤을 볼 수 있도록.
  7. 이미지 아래 왼쪽에 위치한 4 개의 회색 막대를 사용 하 여 Alter 시각화 설정.
    참고: 왼쪽 손 바, 화면 상단의 확대/축소 =. 왼쪽 손 바, 화면의 하단 축에 회전 이미지를 =. 손으로 왼쪽 화면의 하단 바 = 이미지의 회전. 화면, 오른쪽 손 바 = 확장 하 고 계약 규모 바.
  8. 한지는 렌더링 모드를 선택 표면이 제공 하는 개별 봉우리의 최고의 시각화.
  9. 그리드 거리 변경 비율, 더 낮은 비율을 변경 하 여 더 정의 각 개별 피크.
  10. 2.5 D 이미지를 저장 하려면 먼저 2.5 D 음모 아래 회색 화살표를 클릭 하 여 파일 목록 오른쪽에는 이미지 아래의 그래픽 도구를 숨기기 (옆에 ' 모두 보기 '),이 스크린을 채우기 위해 확장 하는 이미지에 대 한 허용 그래픽 탭을 숨길 것 이다 명. 2.5 D 음모를 저장 하려면 눌러는 ' PrtSc '는 키보드의 키. 이 디스플레이의 화면을 캡처합니다. Microsoft 그림판에 화면 캡처를 붙여 하 고 저장 하기 전에 이미지 자르기.

3. 강도 프로 파일링

  1. 소프트웨어 (예를 들어, 선 블랙)를 열고 이미지 처리를 선택 합니다.
  2. 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
  3. 로 이미지는 화면에 표시 됩니다, 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭 선택 ' 프로필 '.
  4. 에에서 화면의 선택 (틱)는 ' 모두 표시 ' 탭. 이 모든 서식 옵션에 액세스할 수 있도록 합니다.
  5. 스크린의 아래쪽에는 세 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ' 및 ' ProfileƆ 선택 ' 프로필 ' (진드기)를 선택 하 고는 ' 테이블 ' 상자. 선택은 ' 화살표 ' 버튼.
  6. 이미지를 사용 하 여 마우스 시작 포인트를 선택 하 고 셀의 연속 수 위로 마우스를 끕니다. 릴리스 마우스 생산 라인; 셀에 대 한 강도 음모를 또한 테이블 각 파장에 대 한 라인을 따라 픽셀에 대 한 강도 측정 데이터에 의해 채워질 것 이다.
    참고: 테이블 거리 (µ m)는 픽셀에서 빨강, 녹색 및 파란색 형광에 대 한 읽기 강도 제공 합니다.
  7. 이 데이터를 내보낼이, 마우스 오른쪽 단추로 선택 테이블 ' 테이블 저장 … '.txt 파일로 적절 한 위치에 저장 하 고.
  8. 선택한 강도 프로 파일 이미지를 저장 하려면 파일 메뉴를 선택 하 고 선택 ' 수출 … '. 팝업 창에서 선택 ' 태그 이미지 파일 (형식) ' 및 ' 이미지 창-단일 창 (데이터)의 내용을 ' 클릭 하 여 다음 ' 파일 이름을 선택 하 고 저장 … ' 적절 한 위치를 선택 하 고 클릭 ' 저장 '.
  9. 분야의 비전 및 분석 하는 프로필의 수에 따라 각 개별 강도 프로필에 대 한 과정을 반복.
  10. 가져오기 프로필 (3.7 참조) 저장 하는 데이터와 통계 분석 하 여 다음 스프레드시트에서 분석.

4. 공동 지역화 분석

  1. 소프트웨어를 열고 선택 ' 이미지 처리 '.
  2. 파일 메뉴로 이동 하 고 열기를 선택 합니다. 처리가 필요한 이미지를 선택 합니다.
  3. 로 이미지는 화면에 표시 됩니다, 이미지의 왼쪽에 표시 하는 탭 선택 ' Coloc '.
  4. 에에서 화면의 선택 (틱)는 ' 모두 표시 ' 탭. 이 모든 서식 옵션에 액세스할 수 있도록 합니다.
  5. 스크린의 아래쪽에는 4 개의 탭; ' 차원 ', ' 디스플레이 ', ' 그래픽 ' 및 ' ColocalizationƆ 선택 ' Colocalization '에 대 한 상자를 체크 하 고 ' 테이블 '와 ' 이미지 '.
    1. 선택이이 탭 (가까운 베 지 어 텍스트 마우스 도구를 가리키면 나타납니다)의 상단에 따라 세 번째 아이콘 다음이 도구를 사용 하 여 단일 핵을 둘러싸 자,이 핵은 대 한 값을 다음 테이블에 나타납니다.
      참고: 각 원된 핵에 대 한 점도 대 화면의 왼쪽 패널에서 시각 이다 녹색 형광 레드에 대 한 생산 됩니다. 축 다음 임계값에 따라 세포 게이트 위해 이동 합니다. 관심의 핵은 이미지에서 수동으로 선택 되어, 0 보다 제어 임계값 조정 필요 하지 않습니다. 모든 픽셀의 강도 값 핵 경계 내에서 관찰 긍정적인 신호로 간주 됩니다.
  6. 탭에서 세 번째 아이콘을 선택 하 고 데이터 집합 완료 될 때까지 후속 핵 포위 망 하 여이 과정을 반복.
  7. 이 데이터를 내보낼 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 테이블 저장을 선택 하 고 적절 한 위치에 저장.
  8. Colocalization 이미지를 저장 하려면 파일 메뉴를 선택 하 고 선택 ' 수출 … ' 다음 선택; 태그 이미지 파일 (형식)와 ' 이미지 창의 내용을 – 단일 평면 (데이터) ' 클릭 하 여 다음 ' 파일 이름을 선택 하 고 저장 … ' 적절 한 위치를 선택 하 고 클릭 ' 저장 '.
  9. 통계 분석 하 여 다음 스프레드시트에 colocalization 데이터.

Representative Results

5hmC와 5caC 간 창시자 immunostained 슬라이드 이러한 DNA 수정에 대 한 차별화의 공간 배급 결정 했다 현미경을 사용 하 여 몇 군데.

이러한 oxi mCs의 공간 배급의 초기 분석 2.5 D 강도 플롯 (그림 1A, 1B)의 세대를 통해 수행 되었다. 빨간색과 녹색 봉우리만 작은 오버랩 5caC 및 5hmC 신호를 나타내는 주황색 봉우리의 제한 된 존재와 잘 정의 된 것 처럼 보였다. 이러한 결과와 해당 셀에 5hmC 및 5caC 농도 대 한 프로필 강하게 서로 (그림 1C)와 일치 하지 않습니다. 이것은 5caC와 5hmC 간 창시자 그 Tet 종속 산화 특정 chromatin DNA 수정이의 다른 산화 유도체의 세대 5mC 리드의 제안에 핵 배포의 명백한 본 전시 설명 영역입니다.

5caC 및 Daoy medulloblastoma BXD 1425EPN ependymoma 세포에서 5hmC의 수준을 비교, 이러한 oxi mCs에 대 한 immunostaining 동일 실험 조건 하에서 두 샘플에 수행 되었다. 5caC 및 5hmC 신호 강도 다음 각 셀 라인에 대 한 기록 3-5 셀에 걸쳐 생성 된 20 프로필에 비교 했다 (그림 2A-2D). 이러한 결과의 정량화 BXD 1425EPN 셀 5hmC와 5caC immunostaining Daoy 셀 (그림 2D)에 비해 상당히 낮은 수준의 전시 밝혔다.

두 채널 레드 (5hmC) 및 녹색 (5caC)을 고려 하면 있는 수 수 표시 R과 G으로 각각, Pearson의 상관 계수 (PCC) 공간 중복 및 R의 공동 분리의 정도 설명 합니다 & G 모두 표시 가정 선형 존재 서로, R 통계34로 표시 관계입니다. PCC 값, R2 로 표시 squaring 빨간 신호 강도34영향 인 녹색 신호 강도 변화 측정을 수 있습니다. 이것은 우리의 5caC 대 5hmC 공동 지역화 분석에 대 한 불필요 한입니다.

5caC 및 5hmC undifferentiated (Undiff) hiPSCs 및 간장 endoderm에서의 공간 배급 유도 후 24 시간 (HE24) 검사, 이러한 DNA 개조의 colocalization 분석 실시 됐다 20 R 값과 동일한 confocal 이미지에 핵 각 셀 라인 (그림 3A-3 C)에 대 한 분석.

이러한 결과의 정량화 시연 colocalization의 정도 상당히 높은 (P < 0.05) HE24 Undiff (그림 3c)에 비해 서에서. 5caC 존재의 감소 된 크기 및 따라서 Undiff 세포에 그것의 감소 된 신호 강도에 기인 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 차별화의 72 시간 게시물 유도에서 간장 endoderm 창시자의 Immunohistochemical 얼룩. (A) 5hmC (적색), 5caC (녹색), DAPI 핵 카운터 얼룩 (파란색)의 공동 얼룩. 흰색 파선된 화살표 'B' 1 C에 핵을 통해 샘플링 프로 파일링의 방향을 나타냅니다. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 빨강 채널: 800 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. DAPI 채널: 750 이득, 2.6% 레이저. (B) 2.5 D 5hmC, 5caC 및 DAPI 신호 강도 플롯. 개별 봉우리는 각 픽셀의 절대 신호 강도를 나타냅니다. 병합 된 보기와 개별 채널 표시 됩니다. (C) 5hmC, 5caC 및 DAPI 강도 프로필 차별화의 72 시간 게시물 유도에서 간장 창시자에 신호. 피크 농도 흰색 파선된 화살표 'B'의 크기에 따라 기록 된 고 강도 프로필 x 축을 따라 검은색 파선 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 5hmC와 5caC의 분석 신호 Daoy medulloblastoma BXD 1425EPN ependymoma 셀 라인에서 농도. (A) Immunofluorescent 얼룩 (빨강) 5hmC 및 5caC (녹색) Daoy 및 1425EPN BXD 셀에. 이미지 모두 동일한 설정에서 기름 침수 렌즈, x 63으로 점령 했다. 병합 된 보기와 개별 채널 표시 됩니다. 스케일 바 대표 10 µ m. 빨강 채널: 746 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. 개별 Daoy (B)와 (C) BXD 1425EPN 셀 인접 한 인물에 확장 됩니다. (B)에 대 한 막대 및 (C) 대표 5 µ m. (D) 비 형광의 강도 Daoy BXD 1425EPN 세포에서 5hmC 대 5caC 신호 확장 (n = 20, SD). 의미는 F-검정을 사용 하 여 평가 했다 그리고 두 표본 t-테스트 별표 표시의 통계적으로 유의 한 p-값 * * p로 < 0.01와 * * * p로 < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 5hmC 5caC 절대 신호 undifferentiated hiPSCs (Undiff)에 Colocalization 분석에 비해 간 endoderm 24 시간 후 차별화 된 조상 세포 (HE24). (A)의 confocal 현미경 이미지 undifferentiated hiPSCs 및 (B) HE24 5hmC (적색), 5caC (녹색), DAPI (블루)에 대 한 스테인드. 셀 동일한 설정에서 63 X 기름 침수 렌즈는 몇 군데 있었다. 20 원된 핵 세포를 colocalization 분석을 위한 샘플링을 보여 줍니다. 스케일 바 대표 20 µ m. 빨강 채널: 800 이득, 레이저 1%. 녹색 채널: 750 이득, 레이저 2.4%. DAPI 채널: 750 이득, 2.6% 레이저. (C) undiff 및 HE24 5hmC 근접의 범위 내에서 5caC 신호의 존재의 Colocalization 분석 (n = 20, SD). 의미는 F-검정을 사용 하 여 평가 했다 그리고 두 표본 t-테스트 별표 표시의 통계적으로 유의 한 p-값 * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜의 핵 내 DNA 수정 시각적 표현 생성의 단계적 프로세스를 설명 합니다. 과민 하 고 강렬한, 하는 동안 이러한 기술을 제한의 수를가지고 할.

그것은 2.5 D에서 생성 된 데이터 플롯, 신호 강도 프로필 및 colocalization 분석은 자연에서 반 정량적 강조 해야 합니다. 때문에 레이저 confocal 현미경 검사에 이미지 중 샘플의 지점에 의해 포인트 조명, 각 채널의 절대 신호 강렬 기록 됩니다. 그러나, 이들은 5hmC의 절대 크기 그리고 5caC 되 고 감지 하 고 유일한 존재, 부재 또는이 후 성적인 표의 규모의 대표.

신호 확대의 반복적인 특성상 필연적으로 신호를 향상에 적용 하는 기계의 크기와 제한 이러한 마크34의 진정한 물리적 게놈 점령의 근사 혼동. 이 마크의 진정한 게놈 지역화 물리적으로 200-300 nm34의 최적의 confocal 해상도 한계 에서도 해결할 수 없는 영역을 차지 하는이 부피가 큰 단백질에 의해 왜곡 될 수 있습니다. 또한, 각 마크에 대 한 개별 채널의 신호 강도 항 체 감도 및 fluorophore 활용34차이로 인해 서로에 비해 수 없습니다. 그러나 정보 영상으로 얻은 게놈 부호의 공간과 일시적인 조직에 빛이 나.

5hmC 및 5caC 신호의 정확한 정량에 대 한 핵 강조 표시 하 고 분석 영역을 명확 하 게 정해 DAPI counterstain에 둘러 쌓여. 이 절차는 배경 잡음은 핵1을 선택 하는 수동 과정 무시로 제어 임계값을 보정에 대 한 요구와 함께 dispenses. 이 프로세스의 자동화는 수행 되어야 할 핵 세분화 수 있는 최신 소프트웨어에 구현할 수 있습니다. 이미지 마스킹 및 크기 제외 데이터의 영역을 선택 하려면 입력 제한 관심 무료 대안 소프트웨어 패키지와 같은 피지 colocalization 분석, 이진 8 비트 형식으로 이미지를 변환할 필요가 같은 단점에 사용할 수 있는 하는 동안은 이 프로그램 사용자 접근 또한, 고려 전체 5hmC 및 5caC euchromatic 지구 고, 게놈 CpG 시퀀스의 고갈에 그들의 지배적인 위치를 가진 일반적으로 결합 하는 게놈에서의 레벨 제한, 사용자 바이어스 소개 핵의 수동 포위 망 합니다. 따라서, 자동으로 핵의 강조 긍정적인 demarcated 지역 내에서 발생 하는 모든 이벤트를 가정 하 고 있을 수 있는 모든 배경 픽셀을 무시 합니다. 따라서, 픽셀의 강도에 따라 이미지 분석은 더 의미 있을 수 있습니다. Mander의 colocalization 계수 피어슨의 상관 관계 계수 추측 하에 반대 그들의 신호 강도 관계 없이 2 개의 신호 사이 공간 오버랩의 정도 분석 하 고의 사용을 고려할 때 이러한 요소는 중요 한 신호 사이 선형 관계입니다.

전반적으로, 여기에 설명 된 기술을 직관적인 형태로 생물학 데이터의 시각적 표현의 테마를가지고. 반 양적 이미지 분석 감도 또는 단일 기본 해상도 게놈 질량 분석 등 강력한 기술을 대체할 수 없습니다 하는 동안 추론 및 가설 될 수 있도록 하는 무료 데이터 제공 넓은 시퀀싱 정밀도와 이미지의 분석에서 잉태.

Disclosures

관심의 잠재적인 충돌 공개 됐다.

Acknowledgments

작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 [BB/N005759/1 아칸소]에 의해 지원 되었다. NRFH Rosetrees 신뢰와 Stoneygate 신탁에 의해 투자 되었다 [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 현미경, 처리 컴퓨터와 소프트웨어에 의해 BBSRC BB/L013827/1 (종합 슈퍼 해상도 현미경에 시설 노팅엄 대학 그랜트)을 투자 했다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics