Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

Nyupptäckt oxiderat former av 5-metylcytosin (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) kan representera olika DNA ändringar med unika funktionella roller. Här beskrivs ett semikvantitativt arbetsflöde för visualisering av oxi-mCs' rumsliga fördelning, signal intensiteten profilering och colocalization.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under flera decennier, har 5-metylcytosin (5mC) varit tänkt att vara den enda DNA-modifieringen med en funktionell betydelse i metazoans. Upptäckten av enzymatisk oxidation av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) samt detektion av N6-methyladenine (6mA) i DNA hos flercelliga organismer som tillhandahålls ytterligare frihetsgrader komplexitet att epigenetiska forskningen. Enligt en växande mängd experimentella bevis, kan dessa nya DNA-förändringar spelar specifika roller i olika cellulära och utvecklingsmässiga processer. Ännu viktigare, som vissa av dessa märken (e. g. 5hmC, 5fC och 5caC) uppvisar vävnad- och utvecklingstoxicitet scenen-specifika förekomsten hos ryggradsdjur, representerar immunkemi ett viktigt verktyg som möjliggör bedömning av rumslig distribution av DNA ändringar i olika biologiska sammanhang. Här beskrivs metoder för computational analys av DNA modifieringar visualiseras genom immunfärgning följt av konfokalmikroskopi. Specifikt generationen av 2,5 dimension (2.5 D) signal intensiteten tomter, signal intensiteten profiler, kvantifiering av färgning intensitet i flera celler och bestämning av signal colocalization koefficienter visas. Sammantaget kan dessa tekniker vara operativa i utvärdering av nivåer och lokalisering av ändringarna DNA i cellkärnan, bidrar till att belysa deras biologiska roller i metazoans.

Introduction

DNA-metylering, en väldokumenterad mekanism som är associerad med inriktning mot transkriptionell reglering innebär ändring av cytosin rester i en 5'-cytosin-fosfat-guanin-3' (CpG) dinukleotid sammanhang via tillägg av en metylgrupp (-CH3) 5- kolatomen av cytosin pyrimidin ringen att bilda 5-metylcytosin (5mC)1. Hos däggdjur, är cirka 70% av CpGs metylerat som utgör endast 1% av deras genom som de är uttömda av denna palindromic sekvens på grund av 5mC mutagena benägenhet att spontant deaminate till tymin2. Förekomsten av metylgrupper på arrangören gensekvenser visar stark korrelation med transkriptionell förtryck i ryggradsdjur3,4,5. Tillägg av dessa metylgrupper är katalyseras av mycket DNA metyltransferas (DNMT) enzymer DNMT3a, 3b och 3 L, och DNMT1 som ändra CpG cytosin i de novo och underhåll metylering sammanhang respektive6. DNMT3A/B uttryck är förhöjd under utveckling i embryonala stamceller och epiblast; men dess minskat uttryck observeras efter pluripotenta celler härstamning engagemang för somatiska öden under differentiering8. Samtidigt som jag delar funktionella redundans, visar DNMT3a och 3b vävnadsspecifika uttrycksmönster, med 3a upptäckt jämnt i musembryon men 3b huvudsakligen lokaliserad till neuroectoderm och chorionic ektoderm vävnader8.

Metylering signaturer kan ärvas under Mitos och meios10. Underhåll-metylering involverar DNMT1 underlättas modifiering av CpG cytosin rester befintliga i hemi-metylerat palindrom på dubbelsträngat DNA11. DNMT1 binder DNA på replikering gafflar11 och följaktligen genomisk metylering nivåer topp under S-fasen i cellcykeln12. DNMT1 methylates oförändrad cytosin därmed skilja nyligen syntetiskt DNA-strängar, främjande av x-kromosomen inaktivering och upprätthålla transkriptionell förtryck profiler13. Genom erkännande av hemi-metylerat DNA CpG sekvenser upprätthåller DNMT1 etablerade mönster av metylation som avgränsas av de novo metylering t.ex. förtryck av lång Interspersed nukleära Element 1 (LINE1) retrotransposon initiativtagare att hämma dess potentiellt cancerframkallande förökning14. Även om som har hemi-metylerat DNA förmånliga affinitet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG ön (CGI) sekvenser i DNMT3a/b - / - mutanta celler, uppfyller en akut de novo metylering roll15 . Således på grund delvis konservativ DNA replication16, kan underhåll metylering troget recapitulate metylering signaturer från förälder till dotter cell17.

Dock för gen måste uttryck vara dynamiskt modulerade, repressiv metylering ändring raderas, vilket kan uppnås genom passiva och aktiva demetylering mekanismer18. De tio-elva Translocase (TET) proteiner tillhör en bevarade familj av dioxygenas proteiner klarar av iterativa oxidation av metylgrupper på CpG rester19. Dessa Tet proteiner, homolog till J-bas-bindande proteiner (JBP) upptäcktes i Trypanosome bruceii, känna igen och binda modifierad DNA baser t.ex. 5mC och syresätta dessa rester till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) och 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein underlättas oxidation av 5mC resultat i stegvis konformation förändring från metyl till hydroxyl, karbonyl och bildas konfigurationer, men 5fC och 5caC ändringar kan syntetiseras direkt från 5mC oxidation21, 22 , 23 , 24.

En informativ indikation av TET protein aktivitet förstå deras reglering studerar distribution och överflöd av oxi-metyl-cytosin märken. Betydande 5mC närvaro på CpG fattiga initiativtagare är detekterbara i motsats till unmethylated CpG rika regioner, den senare var kännetecken av CpG öar25. Som anger en differentiell metylering mönster förekommer vid vävnad specifika initiativtagare26över vävnader, högsta vävnad specifika metylering observeras i hjärnan, testiklarna och blod medan munslemhinnan uppvisar största hypometylering.

Genom att utnyttja känsliga anti-5mC och anti-5hmC visat antikroppar i selektiv metyl/hydroxymetyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) och efterföljande hög genomströmning sekvensering, Ficz et al. hög 5hmC beläggning på projektansökare, exoner och LINE-1 retrotransposon sekvenser som korrelerade med reducerad 5mC nivåer på dessa platser i mus embryonala stamceller celler27. Omvänt, observerades största 5mC anrikning vid repetitiva satellit sekvenser där 5hmC närvaro var begränsad28. Studier på mänskliga frontalloben hjärnvävnad avslöja mycket betydande 5hmC anrikning, fyra gånger högre än i mus embryonala stamceller28. I överensstämmelse med tidigare iakttagelser lokaliserade hög genomströmning sekvensering av frontalloben vävnad illustrerad majoriteten 55-59% av 5hmC signal vid låg densitet CpG arrangören regioner, 35-38% inom gen organ och cirka 6% beläggning på intergenic regioner. Däremot 5mC var berikad på intergenic regioner (25-26%) och högre inom gen organ (52-55%), men minskade (22-24%) på arrangören sekvenser29. Dessa studier visar överflöd av 5hmC i embryonala stamceller och somatisk vävnad, särskilt hjärnan, men utredningar på 5fC och 5caC distributioner är begränsade.

Intressant, nyligen upptäckt i Eukaryoter, metylering av adenin rester på 6 plats kvävet (N-6) (6mA) display en genomisk överflöd profil inversen med 5mC30. Observationer från vätskekromatografi kopplad tandem mass spectrometry avslöja 6mA absoluta nivåer finns i överskott i zebrafisk och svin tidiga embryon jämfört med spermier med dess nivåer (0,003% av genomisk adenines) ökar stadigt vid befruktning, topp på utvecklingsstadiet morula (33 gånger högre än spermier) och når steady-state somatiska nivåer 0,004% av genomisk adenines31. Immunoprecipitation 6mA berikad DNA-sekvenser har visat dominerande beläggning (cirka 80% anrikning) av detta märke på repetitiva inslag regioner och transkriptionell start platser32. Dessa observationer kontextualisera och validera upptäckten av 6mA demethylase-null embryonic stamceller uppvisar ackumulerade 6mA medierad linje-1 retrotransposon ljuddämpning jämfört med transcriptionally aktiva element i vildtyp celler. Dessa data tyder på en transkriptionell reglerande funktion för 6mA33.

Samtidigt konjugerade biokemiska Taggar kopplas till efterföljande dopp analyser indikerar närvaro eller frånvaro av oxiderat metylcytosin derivat (oxi-mCs), kan inte de förmedla rumslig distribution eller kvantifierbara information av dessa märken34, 35. ett protokoll för känslig immunokemisk detektion av 5hmC och 5caC var nyligen utvecklade36. Denna fluorophore konjugerat sekundära antikroppsbaserade immunfärgning metod tillsammans med utnyttja scanning laser konfokalmikroskopi besitter den unika fördelen av att ge visuell lokalisering av ändringarna DNA i cellerna, alltså betonar individuella färgade positivt eller negativt celler motsvarande med heterogena förekomsten av dessa märken. 5hmC och 5caC absoluta signal stödnivåerna aktivera som förstärks av de konjugerade antikropparna semikvantitativt tolkningar som föreslås om omfattningen och positioner av dessa märken inom kärnan e.g. heterochromatic och euchromatic regioner 37 , 38. här en teknik för computational analys av konfokalmikroskopi bilder beskrivs. Generering av 2.5D rumsliga fördelningen tomter för att visa olika 5hmC och 5caC signaltoppar per pixel och deras platser inom atomkärnor framgår. Histogrammet tomter av 5hmC och 5caC signal intensiteten profiler kan illustrera trender i överflöd av dessa märken som toppar och dalar är ritade som separata icke överlappande kanaler. Slutligen genom att implementera funktionen colocalization, graden av närhet av en signal till en annan kan bestämmas och till följd av detta, deras respektive genomisk koordinater kan identifieras.

Protocol

1. generation av Confocal bilder

  1. förberedelse för analys av modifierade former av cytosin, utföra immunhistokemisk färgning som beskrivs av Abakir et al. 34.
  2. utföra bildbehandling av bilderna ut med Mikroskop och spara filer i formatet LSM.
    Obs: När jämföra intensiteten profiler mellan prover de värden som används för laser makt och vinning för varje kanal måste upprätthållas i hela bilden tar förfarande som möjliggör direkt jämförelse på bild analys scenen.

2. Generation av 2.5D intensitet tomter

  1. Öppna programvaran (t.ex., Zen svart) och välj ' Image Processing '.
  2. Gå till menyn Arkiv och välj Öppna. Välj den bild som kräver bearbetning.
  3. Klicka på ' Visa alla ' under bilden för att synliggöra alla grafiska kontroller. I den nedre halvan av skärmen finns det tre flikar; ' Dimensioner ', ' Display ' och ' grafik ' väljer du den ' grafik ' tab.
    1. Välj den ' rektangeln ' verktyg att välja kärnor/intresseområde.
    2. Välj ' skär regionen ' att beskära bilden. Detta kommer att generera en ny bild för regionen beskurna i en separat tab.
    3. Gå till menyn Arkiv och välj Spara As. ge filen ett namn och spara den som en LSM eller CZI fil.
  4. Öppna programvaran (t.ex., Zen blå) och välj den ' Zen skrivbord '.
  5. Skicka den beskurna bilden från Zen svart till blå Zen genom att markera filen och klicka på Arkiv-menyn och välj Skicka till Zen 2012-blå upplagan. Den beskurna bilden öppnas då i relevant program.
    Obs: Bildfilen överförs eftersom funktionen 2.5D intensitet tomt i Zen svart 2012 inte visar flera bilder kanal samtidigt.
  6. På vänster sida av bilden väljer du fliken märkt ' 2.5D ', detta möjliggör visualisering av bilden i 2.5 D. Klicka på ' Visa alla ' att synliggöra alla grafiska kontroller.
  7. Alter visualisering inställningar med hjälp av fyra grå barerna som ligger till vänster och under bilden.
    Obs: vänster hand bar, toppen av skärmen = zooma. Vänster hand bar, botten av skärmen = tur bild på axeln. Längst ned på skärmen, vänster bar = rotation av bilden. Längst ned på skärmen, höger hand bar = expandera och kontrakt skala barer.
  8. Se till att göra läget valts är yta som ger den bästa visualiseringen av de enskilda topparna.
  9. Ändra grid avstånd genom att ändra procentsatsen, lägst procentsatsen mer definieras varje enskild topp.
  10. Spara 2.5D bilden, först dölja listan på höger sida och de grafiska verktygen under bilden genom att klicka på den grå pilen under 2.5D tomten (bredvid ' Visa alla '), detta kommer att dölja flikarna grafiska vilket möjliggör bilden att expandera för att fylla rasbranter n. för att spara 2.5D tomten, tryck på den ' PrtSc ' nyckel på tangentbordet. Här kommer en skärmdump av skärmen. Klistra in skärmdumpen i Microsoft Paint och beskära bilden innan du sparar.

3. Intensitet profilering

  1. Öppna programvaran (t.ex., Zen svart) och välj Image Processing.
  2. Gå till menyn Arkiv och välj Öppna. Välj den bild som kräver bearbetning.
  3. Som bilden kommer att visas på skärmen, på vänster sida av bilden väljer du fliken märkt ' profil '.
  4. i nedre halvan av skärmen välja (tickande) den ' Visa alla ' fliken. Detta kommer att aktivera åtkomst till alla formateringsalternativ.
  5. i den nedre halvan av skärmen finns det tre flikar; ' dimensioner ', ' Display ' och ' ProfileƆ Välj ' profil ' och välja (tickande) den ' tabell ' rutan. Välj den ' pil ' knappen.
  6. På bilden Använd musen för att välja en startpunkt och dra med musen över en kontinuerlig antalet celler. Släpp musknappen för att producera en intensitet tomt för cellerna längs linjen; Dessutom tabellen fylls av intensitet mätdata för pixlarna längs linjen för varje våglängd.
    Anmärkning: Tabellen ger avståndet (µm) i vilken pixel intensitet är läsa för de röda, gröna och blå fluorescensen.
  7. För att exportera dessa data, högerklicka på tabellen, Välj ' Spara tabellen … ' och spara till en lämplig plats som en .txt-fil.
  8. Spara den valda intensiteten profilbilden Välj Arkiv-menyn och välj ' exportera … '. I popup-fönstret väljer du ' Tagged Image File (Format) ' och ' innehåll av bildfönstret - enda glasruta (Data) ' följt genom att klicka på ' Välj filnamn och spara … ' Välj en lämplig plats och klicka ' Spara '.
  9. Upprepa processen för varje individuell intensitet profil beroende på synfält och antal profiler analysera.
  10. Import intensitet profiler data Sparad (se 3.7) och analysera i ett kalkylblad som följt av statistisk analys.

4. Samtidig lokalisering analys

  1. Öppna programvaran och välj ' bildbehandling '.
  2. Gå till menyn Arkiv och välj Öppna. Välj den bild som kräver bearbetning.
  3. Som bilden kommer att visas på skärmen, på vänster sida av bilden väljer du fliken märkt ' Coloc '.
  4. i nedre halvan av skärmen välja (tickande) den ' Visa alla ' fliken. Detta kommer att aktivera åtkomst till alla formateringsalternativ.
  5. i den nedre halvan av skärmen finns det fyra flikar; ' dimensioner ', ' Display ', ' grafik ' och ' ColocalizationƆ Välj ' Colocalization ' och kryssa i rutan för ' tabell ' och ' bild '.
    1. Välj den tredje ikonen längs överst på den här fliken (nära Bezier text visas när muspekaren över verktyget) sedan använda detta verktyg för att omringa en enda atomkärnor, värden för detta kärnor kommer sedan visas i tabellen.
      Obs: För varje inringade atomkärnor produceras ett spridningsdiagram för röda kontra grön fluorescens som visualiseras i panelen till vänster på skärmen. Axeln är sedan flyttade för att gate ut celler beroende på tröskeln. Som atomkärnor av intresse väljs manuellt i bilderna, krävs justera de portande tröskelvärdena över noll inte. Alla pixelvärden intensitet observerats inom de nukleära betraktas som positiv signal.
  6. Upprepa den här processen genom att markera ikonen tredje fliken och omringa efterföljande kärnor tills datamängden är klar.
  7. För att exportera dessa data, högerklicka på tabellen, Välj Spara tabellen och spara till en lämplig plats.
  8. Spara den colocalization bilden, Välj Arkiv-menyn och välj ' exportera … ' Välj sedan; Tagged Image File (Format) och ' innehåll av bildfönstret – enda plan (Data) ' följt genom att klicka på ' Välj filnamn och spara … ' Välj en lämplig plats och klicka ' Spara '.
  9. Rita colocalization data i ett kalkylblad som följt av statistisk analys.

Representative Results

För att bestämma den geografiska fördelningen av 5hmC och 5caC i differentiera nedsatt föräldraparets immunostained bilder för dessa DNA modifieringar var avbildade med Mikroskop.

Första analys av rumslig distribution av dessa oxi-mCs genomfördes genom generering av 2.5D intensitet tomter (figur 1A, 1B). De röda och gröna topparna föreföll vara väl definierade med begränsad närvaro av orange toppar som visar endast en liten överlappning av signalerna som 5caC och 5hmC. Med dessa resultat sammanfaller profiler för 5hmC och 5caC stödnivåer i motsvarande cell inte starkt med varandra (figur 1 c). Detta illustrerar att 5caC och 5hmC uppvisar distinkta mönster av nukleära fördelning i nedsatt föräldraparets tyder på att Tet-beroende oxidation av 5mC leder till generation av olika oxiderade derivat av denna DNA ändring i specifika kromatin regioner.

För att jämföra halterna av 5caC och 5hmC i Daoy medulloblastom och BXD-1425EPN ependymoma celler, genomfördes immunfärgning för dessa oxi-mCs på båda prover under identiska experimentella förhållanden. Intensitet av 5caC och 5hmC signaler jämfördes sedan i 20 profiler genereras över 3-5 celler registreras för varje cellinje (figur 2A-2D). Kvantifiering av dessa resultat visade att BXD-1425EPN celler uppvisar betydligt lägre nivåer av både 5hmC och 5caC immunfärgning jämfört med Daoy celler (figur 2D).

Med tanke på de två kanaler röd (5hmC) och grön (5caC) som kan vara betecknas som R och G respektive den Pearsons korrelationskoefficient (PCC) beskriver graden av spatial överlappning och samtidig segregering av R & G förutsatt att båda varumärkena finns i en linjär förhållande till varandra, betecknas med R statistik34. Kvadratur värdet PCC, betecknas med R2 möjliggör mätning av grön signal intensiteten variation som påverkas av röd signal intensiteten34. Detta är överflödigt för vår 5caC vs 5hmC samtidig lokalisering analys.

För att undersöka den rumsliga fördelningen av 5caC och 5hmC i odifferentierade (Undiff) hiPSCs och nedsatt endoderm 24 timmar (HE24) efter induktion, genomfördes colocalization analys av dessa DNA ändringar på samma confocal bilder, med R-värden för 20 atomkärnor analyseras för varje cellinje (figur 3A-3 C).

Kvantifiering av dessa resultat visade att graden av colocalization är signifikant högre (P < 0,05) i HE24 jämfört med Undiff (figur 3 c). Detta kan tillskrivas den minskade omfattningen av 5caC närvaro och därmed dess lägre signalintensitet i Undiff celler.

Figure 1
Figur 1: immunhistokemisk färgning av nedsatt endoderm stamfäder på 72 timmar efter induktion av differentiering. (A) Co färgning av 5hmC (röd), 5caC (grön) och DAPI nukleära counter fläcken (blå). Den vit streckad pil 'B' betecknar riktning mot profilering provtas genom kärnan, illustreras i 1 C. Skalstapeln representerar 5 µm. röda kanalen: få 800, laser 1%. Grön kanal: få 750, laser 2,4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (B), 2.5 D intensitet tomt 5hmC, 5caC och DAPI signaler. Enskilda toppar utgör absoluta signal stödnivåer för varje pixel. Sammanslagna visningar och enskilda kanaler visas. (C), intensiteten profiler av 5hmC, 5caC och DAPI signaler i nedsatt stamfäder på 72 timmar efter induktion av differentiering. Maximala stödnivåer spelades längs dimensionerna för den vit streckad pil 'B' och anges längs x-axeln intensiteten profil med en svart streckad pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: analys av 5hmC och 5caC signal stödnivåer i Daoy medulloblastom och BXD-1425EPN ependymoma cellinjer. (A) Immunofluorescerande färgning av 5hmC (röd) och 5caC (grön) i Daoy och BXD-1425EPN celler. Bilder fångades med 63 x olja nedsänkning objektiv, båda på samma inställningar. Sammanslagna visningar och enskilda kanaler visas. Skala staplarna representerar 10 µm. röda kanalen: få 746, laser 1%. Grön kanal: få 750, laser 2,4%. Enskilda (B) Daoy och (C) BXD-1425EPN celler byggs ut i intilliggande siffror. Skala barer för (B) och (C) representerar 5 µm. (D) Genomsnittlig fluorescensintensiteten hos 5hmC vs 5caC signaler i Daoy och BXD-1425EPN celler (n = 20, SD). Betydelse bedömdes med hjälp av ett F-test och två-sampel t-Test. asterisker beteckna statistiskt signifikant p-värden för ** som p < 0,01 och *** som p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Colocalization analys av 5hmC och 5caC absoluta signaler i odifferentierade hiPSCs (Undiff) jämfört med nedsatt endoderm 24 timmar efter differentierade stamceller (HE24). Konfokalmikroskopi bilder av (A) odifferentierade hiPSCs och (B) HE24 celler färgas för 5hmC (röd), 5caC (grön) och DAPI (blå). Cellerna var avbildade med 63 X olja nedsänkning linsen på identiska inställningar. 20 inringade atomkärnor illustrera de celler som provtas för colocalization analys. Skala staplarna representerar 20 µm. röda kanalen: få 800, laser 1%. Grön kanal: få 750, laser 2,4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (C) Colocalization analys av förekomsten av 5caC signal inom spänna av 5hmC närhet i undiff och HE24 (n = 20, SD). Betydelse bedömdes med hjälp av ett F-test och två-sampel t-Test. asterisker beteckna statistiskt signifikant p-värden för * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det här protokollet beskriver stegvis processen att skapa visuella representationer av DNA ändringar inom atomkärnor. Samtidigt känsliga och effektfulla, äger dessa tekniker ett antal begränsningar.

Det är nödvändigt att betona att de data som genereras från 2.5D tomter, signal intensiteten profiler och colocalization analys är semikvantitativt i naturen. På grund av punkt för punkt belysning av provet under bild förvärv på laser skanning confocal Mikroskop, registreras absoluta signal stödnivåer för varje kanal. Men dessa är inte absoluta magnituder av 5hmC och 5caC vara upptäckta och endast representera indikeringar av förekomsten, avsaknaden eller omfattningen av dessa epigenetiska märken.

Repetitiva pågrund av signal kompletteringar förvirra begränsningar överensstämmer med omfattningen av maskiner som tillämpas för att förbättra signalen oundvikligen approximationer av sann fysisk genomisk beläggning av dessa märken34. Sanna genomisk lokaliseringen av dessa märken kan skymmas av dessa skrymmande proteiner, som fysiskt upptar områden inte kan matchas även vid optimal confocal upplösning gränserna för 200-300 nm34. Dessutom kan signal stödnivåerna de enskilda kanalerna för varje märke inte jämföras med varandra på grund av skillnader i antikropp känslighet och fluorophore konjugation34. Men belyser informationen som erhållits med imaging den rumsliga och tidsmässiga organisationen av genomisk märken.

För noggrann kvantitering av 5hmC och 5caC signaler, är kärnor belyst och omringade mot den DAPI motfärg, tydligt avgränsar regionen ska analyseras. Detta förfarande avstår kravet på att kalibrera Usenets tröskelvärden som bakgrundsljud ignoreras genom den manuella processen av att välja kärnor1. En automatisering av denna process kan uppnås i den senaste programvaran som möjliggör nukleära segmentering som ska utföras. Samtidigt gratis alternativ programvara paket såsom FIJI finns för colocalization analys, nackdelar såsom kravet att konvertera bilder till binärt 8-bitars format, maskera bilder och inmatning storlek utslagning data för att välja områden av intresse gräns den användaren-tillgänglighet av detta program. Dessutom, introducerar med tanke på övergripande begränsade nivåer av 5hmC och 5caC i genomet tillsammans med deras dominerande placering vid euchromatic regioner och, utarmning av CpG genomsekvenser i allmänhet, manuell inringa atomkärnor användaren-bias. Därför markeringen av atomkärnor automatiskt förutsätter alla händelser som inträffar inom avgränsade regionen att vara positiv och bortser från eventuella bakgrundspixlar som kan förekomma. Analysera bilder baserat på pixel intensitet kan således vara mer meningsfull. Dessa faktorer är viktiga när man överväger användning av Mander's colocalization koefficient att analysera graden av spatial överlappning mellan två signaler, oavsett deras signal stödnivåer som motsätter sig att Pearsons korrelationskoefficient som förutsätter en linjärt samband mellan signaler.

Övergripande, de tekniker som beskrivs här bär temat för visuell representation av biologiska data i en intuitiv format. Samtidigt semikvantitativt bildanalys inte kan ersätta kraftfulla tekniker såsom masspektrometri i form av känslighet eller enda bas resolution genome bred ordningsföljd, den ger kompletterande data vilket gör att slutsatser och hypoteser för att vara tänkt från analys av bilder med precision.

Disclosures

Inga potentiella intressekonflikter lämnades ut.

Acknowledgments

Arbetet stöds av bioteknik och biologiska Sciences Research Council [BB/N005759/1 till A.R.]. NRFH finansierades av The Rosetrees förtroende och The Stoneygate förtroende [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskopet, bearbetning datorer och mjukvara finansierades av BBSRC BB/L013827/1 (tvärvetenskapliga Super Resolution mikroskopi Facility på Nottingham University grant)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics