Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

Oppdagede nylig oksidert former for 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) kan representere distinkte DNA endringer med unike funksjonsroller. Her beskrives en semi kvantitative arbeidsflyt for visualisering av oxi-mCs' romlige fordelingen, signalet intensitet profilering og colocalization.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I flere tiår, har 5-methylcytosine (5mC) vært antatt å være den eneste DNA modifiseringen med en funksjonell betydning i Metazoer. Oppdagelsen av enzymatisk oksidasjon av 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) samt gjenkjenning av N6-methyladenine (6mA) i DNA av multicellular organismer gitt flere grader av kompleksitet til epigenetic forskning. Ifølge en økende mengde eksperimentelle bevis, kan endringene for romanen DNA spille spesifikke roller i ulike mobilnettet og utviklingsmessige prosesser. Viktigere, som noen av disse merkene (e. g. 5hmC, 5fC og 5caC) utstilling vev- og utviklingsmessige scenen-spesifikk forekomst i virveldyr, representerer immunochemistry et viktig verktøy slik at vurdering av romlige fordelingen av DNA endringer i ulike biologiske sammenhenger. Her er metodene for beregningsorientert analyse av DNA modifikasjoner visualisert ved immunostaining etterfulgt av AC confocal mikroskopi beskrevet. Spesielt generasjonen av 2,5 dimensjon (2.5 D) signal intensitet tomter, signal intensitet profiler, kvantifisering av flekker intensitet i flere celler og fastsetting av signal colocalization koeffisienter vises. Samlet kan disse teknikkene være i vurdere nivåene og lokalisering av endringene DNA i kjernen, bidra til Klargjørende deres biologiske roller i Metazoer.

Introduction

DNA metylering, en godt dokumentert mekanisme knyttet transcriptional regulering innebærer endring av cytosine rester i en 5-cytosine-fosfat-guanine-3 "(CpG) dinucleotide sammenheng via tillegg av en metylgruppe (-CH3) til den 5 - karbonatom cytosine pyrimidine ringen til 5-methylcytosine (5mC)1. I pattedyr, er ca 70% av forbruksvarer denaturert som utgjør bare 1% av deres genomer som de blir utarmet av denne palindromic på grunn av 5mC mutagene tilbøyelighet til å spontant deaminate thymine2. Tilstedeværelsen av methyl grupper på arrangøren gensekvenser viser sterk sammenheng med transcriptional undertrykkelse i virveldyr3,4,5. Tillegg av gruppene metyl er katalysert av høyt konservert DNA methyltransferase (DNMT) enzymer DNMT3a 3b og 3 L og DNMT1 som endre CpG cytosines i de novo og vedlikehold metylering sammenhenger henholdsvis6. DNMT3A/B uttrykk er opphøyet under utvikling i embryonale stamceller og epiblast; men redusert uttrykket er observert etter pluripotent celle avstamning forpliktelse til somatiske skjebne under differensiering8. Mens deler funksjonelle redundans, viser DNMT3a og 3b vev-spesifikke uttrykk mønstre, med 3a oppdaget jevnt i mouse embryoer men 3b hovedsakelig lokalisert til neuroectoderm og Chorion ektoderm vev8.

Metylering signaturer kan arves under mitose og meiose10. Vedlikehold metylering innebærer DNMT1 tilrettelagt endring av CpG cytosine rester finnes i hemi-denaturert palindromes på double-strandet DNA11. DNMT1 binder DNA ved replikering gafler11 og derfor genomisk metylering nivåer topp i S fasen av cellen syklus12. DNMT1 Sam-e methoxide uforandret cytosines dermed skille nylig syntetisert DNA tilnærmingene, fremme X-chromosome inaktivering og opprettholde transcriptional undertrykkelse profiler13. Gjennom anerkjennelse av hemi-denaturert DNA CpG sekvenser opprettholder DNMT1 etablerte bruksmønstre metylering grenser til de novo metylering f.eks undertrykkelse av lang ispedd kjernefysiske Element 1 (linje1) retrotransposon arrangører å hemme den potensielt kreftfremkallende forplantning14. Men besitter hemi-denaturert DNA fortrinnsrett forpliktende tilhørighet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG øya (CGI) sekvenser i DNMT3a/b - / - mutant celler, oppfylle en nødsituasjon de novo metylering rolle15 . Dermed på grunn av DNA replikering16semi-konservativt natur, kan vedlikehold metylering trofast recapitulate metylering signaturer fra overordnet datter celle17.

Men for genet må uttrykk være dynamisk modulert, undertrykkende metylering endring slettes, som kan oppnås ved passive og aktive demethylation mekanismer18. Ti-elleve Translocase (TET) proteiner tilhører en bevart familie dioxygenase proteiner er dugelig av iterativ oksidasjon av methyl grupper på CpG rester19. Disse Tet proteiner, homologe J-Base bindende proteiner (JBP) oppdaget i Trypanosome bruceii, gjenkjenner og binder endret DNA baserer f.eks 5mC og oxygenate disse rester 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) og 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein tilrettelagt oksidasjon av 5mC resulterer i gradvis konformasjon endring fra metyl hydroksyl, karbonyl og carboxylate konfigurasjoner, men 5fC og 5caC modifikasjoner kan syntetiseres direkte fra 5mC oksidasjon21, 22 , 23 , 24.

En informativ indikasjon TET protein aktivitet forstå deres regulering studerer distribusjon og overflod av oxi-metyl-cytosine merker. Betydelig 5mC tilstedeværelse på CpG dårlig arrangører er synlig i motsetning til unmethylated CpG rike regioner, den sistnevnte er karakteristisk for CpG øyene25. Over vev, høyeste vev bestemt metylering er observert i hjernen, testikkel og blod mens oral mucosa utstillingen største hypomethylation, angir du en differensiell metylering mønster på vev bestemte arrangørene26.

Gjennom følsom anti-5mC og anti-5hmC viste antistoffer i selektiv metyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) og påfølgende høy gjennomstrømning sekvensering, Ficz et al. høy 5hmC belegg på arrangører, exons og LINE-1 retrotransposon sekvenser som korrelert med redusert 5mC nivåer på disse stedene i mus embryonale stilk celler27. Omvendt, ble største 5mC berikelse observert på repeterende satellitt sekvenser hvor 5hmC tilstedeværelse var begrenset28. Studier utført på menneskelig frontallappen hjernevev avslører svært betydelig 5hmC berikelse, fire ganger høyere enn i mus embryonale stamceller28. I samsvar med tidligere observasjoner, høy gjennomstrømning sekvensering av frontallappen vev illustrert fleste 55-59% av 5hmC signal lokalisert på lav tetthet CpG promoter regioner, 35-38% innen genet organer og ca 6% bruk på intergenisk regioner. I kontrast, 5mC anriket intergenisk regioner (25-26%) og høyere innen genet organer (52-55%) men redusert (22-24%) på arrangøren sekvenser29. Disse studiene viser overflod av 5hmC i embryonale stamceller og somatiske vev, spesielt hjernen, men undersøkelser på 5fC og 5caC distribusjoner er begrenset.

Interessant, nylig oppdaget i eukaryoter, metylering av adenine rester på posisjon 6 nitrogen (N6) (6mA) vise en genomisk overflod profil inverse som 5mC30. Observasjoner fra flytende kromatografi kombinert tandem massespektrometri avsløre 6mA absolutte nivåer i overskudd i zebra fisk og svin tidlig embryo sammenlignet med sperm med sin nivåer (0.003% av genomic adenines) øker stadig på befruktning, topp på morulastadiet utviklingsstadiet (33 ganger høyere enn sperm) og nå steady state somatiske nivåer av 0.004% av genomic adenines31. Immunoprecipitation av 6mA beriket DNA-sekvenser har vist dominerende belegg (ca 80% berikelse) med dette merket på repeterende element regioner og transcriptional start nettsteder32. Disse observasjonene kontekstualisere og validere oppdagelsen av 6mA demethylase-null embryonic stamceller viser akkumulert 6mA mediert linje-1 retrotransposon stanse sammenlignet med transcriptionally aktive elementer i wildtype celler. Disse data tyder på en transcriptional regulatoriske funksjon for 6mA33.

Mens konjugert biokjemiske tags koblet til etterfølgende DUKKERT analyser indikerer tilstedeværelse eller fravær av oksidert methylcytosine derivater (oxi-mCs), kan ikke de gi romlige fordelingen eller kvantifiserbare informasjon på disse merkene34, 35. en protokoll for sensitive talipes påvisning av 5hmC og 5caC ble nylig utviklet36. Denne fluorophore konjugert sekundære antistoff-baserte immunostai-metoden kombinert med utnytte skanning laser AC confocal mikroskopi har den unike fordelen av å gi visuelle lokalisering av endringene DNA i cellene, dermed understreker personlige farget positivt eller negativt celler tilsvarende med heterogene tilstedeværelsen av disse merkene. 5hmC og 5caC absolutt signal intensiteten aktiverer som forsterkes av konjugert antistoffer semi kvantitative tolkninger vil bli foreslått om størrelsen og plasseringen av merkene i kjernen f.eks heterochromatic og euchromatic 37 , 38. her en teknikk for beregningsorientert analyse av AC confocal mikroskopi bilder er beskrevet. Generering av 2.5D romlige fordelingen tomter for å vise forskjellige 5hmC og 5caC signal topper per piksel og deres steder i kjerner er vist. Histogrammet tomter av 5hmC og 5caC signal intensitet profiler kan illustrere trender i overflod av merkene som topper og trau plottes som separate ikke-overlappende kanaler. Endelig ved å implementere funksjonen colocalization, graden av nærhet til et signal til en annen kan bestemmes og dermed sine respektive genomisk koordinater kan identifiseres.

Protocol

1. generasjon av AC Confocal bilder

  1. i forberedelsene for analyse av endrede former for cytosine, utføre immunohistochemical flekker som beskrevet av Abakir et al. 34.
  2. utføre imaging lysbilder ut ved hjelp av et mikroskop og lagre filer i LSM format.
    Merk: Når sammenligne intensitet profiler mellom prøvene verdiene som brukes for laser makt og vinning for hver kanal må opprettholdes hele bildet tar prosedyre for å tillate direkte sammenligning på bildet analyse scenen.

2. Generasjon 2.5D intensitet tomter

  1. Åpne programvaren (f.eks Zen svart) og velge ' Image Processing '.
  2. Gå til fil-menyen, og velg Åpne. Velg bildet som krever behandling.
  3. Klikk på ' Vis alle ' under bildet å synliggjøre alle grafiske kontroller. I den nedre delen av skjermen er det tre kategorier; ' Dimensjoner ', ' Display ' og ' grafikk ', Velg den ' grafikk ' kategorien
    1. Velg den ' rektangel ' verktøyet å velge kjerner/interesseområde.
    2. Velg ' kuttet regionen ' å beskjære bildet. Dette genererer et nytt bilde for beskjæres regionen i en separat kategorien
    3. Gå til fil-menyen og velg Lagre som gi filen et navn og lagre den som en LSM eller CZI-fil.
  4. Åpne programvare (f.eks Zen blå) og velg den ' Zen Desk '.
  5. Sende det beskårede bildet fra Zen svart til Zen blå ved å merke filen og klikke på Fil-menyen og velg Send til Zen 2012-blå edition. Det beskårede bildet deretter åpnes i det aktuelle programmet.
    Merk: Bildefilen overføres fordi funksjonen 2.5D intensitet tomten i Zen svart 2012 ikke viser flere kanal bilder samtidig.
  6. På venstre side av bildet velger kategorien merket ' 2.5D ', dette kan visualisering av bildet i 2.5 D. Klikk ' Vis alle ' å synliggjøre alle grafiske kontroller.
  7. Alter visualisering innstillinger med fire grå barer til venstre og under bildet.
    Merk: venstre bar, toppen av skjermen = zoom. Venstre bar, bunnen av skjermen = turn bilde på aksen. Bunnen av skjermen, venstre hånd bar = rotasjon av bildet. Bunnen av skjermen, høyre hånd bar = og Utvid skala barer.
  8. Sikre at gjengivelsesmodus valgt er overflate som gir den beste visualiseringen av personlige toppene.
  9. Endre rutenettet avstand ved å endre prosentandelen, lavere prosent mer definert hver personlige topp.
  10. Lagre 2.5D bildet, først skjule listen på høyre side og grafiske verktøy under bildet ved å klikke på grå pilen under 2.5D handlingen (siden ' viser alle '), dette vil skjule kategoriene grafisk slik at bildet å utvide fylle ura n. Trykk for å lagre 2.5D tomten, den ' PrtSc ' tasten på tastaturet. Dette vil ta et skjermbilde av skjermen. Lim inn skjermbildet i Microsoft Paint og beskjære bildet før du lagrer.

3. Intensitet Profiling

  1. Åpne programvaren (f.eks Zen svart) og velge Image Processing.
  2. Gå til fil-menyen, og velg Åpne. Velg bildet som krever behandling.
  3. Som bildet vises på skjermen, på venstre side av bildet Velg kategorien merket ' profil '.
  4. i nedre halvdel av skjermen velge (sjekke av) den ' Vis alle ' kategorien. Dette aktiverer tilgang til alle formateringsalternativene.
  5. i den nederste delen av skjermen er det tre kategorier; ' dimensjoner ', ' Display ' og ' ProfileƆ Velg ' profil ' og velge (sjekke av) det ' tabell ' boksen. Velg den ' pil ' knappen.
  6. På bildet kan du bruke musen til å velge en startpunktet og dra musen over en kontinuerlig rekke celler. Slipp museknappen for å produsere en intensitet tomten for cellene langs linjen. i tillegg tabellen fylles av intensitet måledata for bildepunktene langs linjen for hver bølgelengde.
    Merk: Tabellen vil gi avstanden (µm) på hvilke pixel leses intensitet til den røde, grønne og blå fluorescensen.
  7. For å eksportere dataene, Høyreklikk i tabellen, Velg ' lagre tabellen … ' og lagre på et passende sted som en txt-fil.
  8. Lagre valgte intensiteten profil bildet Velg Fil-menyen og velg ' eksportere … '. I hurtigvinduet velger ' Tagged Image File (Format) ' og ' innholdet av bildevinduet - enkelt rute (Data) ' fulgt ved ' velge navn og lagre … ' Velg et passende sted og klikk ' lagre '.
  9. Gjenta prosessen for hver individuelle intensitet profil avhengig av felt av visjonen og antall profiler analysere.
  10. Import intensitet profiler data lagret (se 3.7) og analysere i et regneark etterfulgt av statistisk analyse.

4. Co lokalisering analyse

  1. Åpne programvaren og velg ' bildebehandling '.
  2. Gå til fil-menyen, og velg Åpne. Velg bildet som krever behandling.
  3. Som bildet vises på skjermen, på venstre side av bildet Velg kategorien merket ' Coloc '.
  4. i nedre halvdel av skjermen velge (sjekke av) den ' Vis alle ' kategorien. Dette aktiverer tilgang til alle formateringsalternativene.
  5. i den nederste delen av skjermen det er fire kategorier; ' dimensjoner ', ' skjermen ', ' grafikk ' og ' ColocalizationƆ Velg ' Colocalization ' og sjekke boksen for ' tabell ' og ' bilde '.
    1. Velg tredje ikonet langs på toppen av denne kategorien (nær Bezier tekst vises når musen holdes over verktøyet) Bruk denne verktøyet for å omringe et enkelt kjerner, verdier for dette kjerner vil deretter vises i tabellen.
      Merk: Et spredningsdiagram produseres For hver omsluttede kjerner for rød versus grønne fluorescens som er visualisert i venstre panelet på skjermen. Aksen er flyttet å gate ut celler avhengig av terskelen. Kjerner av interesse er valgt manuelt i bildene, er justere gating tersklene over null ikke nødvendig. Alle piksel intensitetsverdiene observert i det kjernefysiske perimeters regnes som positivt signal.
  6. Gjenta denne prosessen ved å velge ikonet tredje i kategorien og omringe påfølgende kjerner til datasettet er fullført.
  7. For å eksportere dataene, Høyreklikk i tabellen, Velg lagre tabellen og lagre til en egnet plassering.
  8. Lagre colocalization bildet, Velg Fil-menyen og velg ' eksportere … ' Velg; Merket Image arkiv (Format) og ' innholdet av bildevinduet – enkelt flyet (Data) ' fulgt ved ' velge navn og lagre … ', velge et passende sted og klikker ' lagre '.
  9. Plot colocalization data i et regneark etterfulgt av statistisk analyse.

Representative Results

For å finne den romlige fordelingen av 5hmC og 5caC i skille hepatic progenitors immunostained lysbilder for endringene DNA ble fotografert med et mikroskop.

Første analyse av den romlige fordelingen av disse oxi-mCs ble gjennomført gjennom generasjon 2.5D intensitet tomter (figur 1A, 1B). De røde og grønne toppene var godt definert med begrenset tilstedeværelse av oransje toppunkt som indikerer bare en liten overlapping av 5caC og 5hmC signaler. Med disse resultatene samsvarer profiler for 5hmC og 5caC bakgrunnsintensitetene i den tilsvarende cellen ikke sterkt med hverandre (figur 1 c). Dette illustrerer at 5caC og 5hmC ha ulike mønstre for kjernefysisk distribusjon i hepatic progenitors antyder at Tet-avhengige oksidasjon av 5mC fører til generasjon av ulike oksidert derivater av DNA endringen i bestemte chromatin regioner.

For å sammenligne nivåene av 5caC og 5hmC i Daoy medulloblastoma og BXD-1425EPN ependymoma celler, ble immunostaining for disse oxi-mCs gjennomført på begge prøver under like eksperimentelle. Intensiteter av 5caC og 5hmC signaler ble deretter sammenlignet i 20 profiler generert i 3-5 celler registrert for hver celle linje (figur 2A-2D). Kvantifisering av disse resultatene viste at BXD-1425EPN celler ha betydelig lavere nivåer av både 5hmC og 5caC immunostaining sammenlignet med Daoy celler (figur 2D).

Tatt i betraktning to kanaler rød (5hmC) og grønn (5caC) som kan betegnes som R og G henholdsvis den Pearson korrelasjonskoeffisient (PCC) beskriver graden av romlige overlapping og co segregering av R & G antar begge merkene finnes i en lineær relasjon med hverandre, merket med R flygninger34. Kvadrat PCC verdien angitt av R2 gjør det mulig for måling av grønt signal intensitet variasjoner som er påvirket av røde signalet intensitet34. Dette er overflødig for vår 5caC vs 5hmC co lokalisering analyse.

For å undersøke den romlige fordelingen av 5caC og 5hmC i udifferensierte (Undiff) hiPSCs og hepatic endoderm 24 timer (HE24) etter induksjon, ble colocalization analyse av endringene DNA gjennomført på samme AC confocal bilder, med R-verdiene for 20 kjerner analysert for hver celle linje (figur 3A-3 C).

Kvantifisering av disse resultatene viste at graden av colocalization er betydelig høyere (P < 0,05) i HE24 sammenlignet med Undiff (Figur 3 c). Dette kan skyldes redusert omfanget av 5caC tilstedeværelse og dermed redusert signal intensiteten i Undiff celler.

Figure 1
Figur 1: Immunohistochemical farging av hepatic endoderm progenitors på 72 timer innlegget induksjon av differensiering. (A) co farging av 5hmC (rød), 5caC (grønn) og DAPI kjernefysiske counter beis (blå). Den hvite stiplede pil 'B' angir retningen for profilering samplet gjennom kjernen, illustrert i 1 C. Skala linjen representerer 5 µm. røde kanalen: få 800, laser 1%. Grønne kanalen: få 750, laser 2.4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (B) 2.5 D intensitet handlingen i 5hmC, 5caC og DAPI signaler. Individuelle toppene representerer absolutt signal intensiteter av hver piksel. Flettede visninger og enkeltkanaler vises. (C) intensitet profiler av 5hmC, 5caC og DAPI signaler i hepatic progenitors på 72 timer innlegget induksjon av differensiering. Topp intensiteter ble registrert langs dimensjonene til den hvite stiplede pil 'B' og angis med en svart stiplet pil langs x-aksen profil intensitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: analyse av 5hmC og 5caC signal bakgrunnsintensitetene i Daoy medulloblastoma og BXD-1425EPN ependymoma cellelinjer. (A) Immunofluorescent farging av 5hmC (rød) og 5caC (grønn) i Daoy og BXD-1425EPN celler. Bildene ble tatt med 63 x olje nedsenking linsen, både på de samme innstillingene. Flettede visninger og enkeltkanaler vises. Skala stolper representerer 10 µm. røde kanalen: få 746, laser 1%. Grønne kanalen: få 750, laser 2.4%. (B) Daoy og (C) BXD-1425EPN enkeltceller er utvidet i tilstøtende tall. Skalere barer for (B) og (C) representerer 5 µm. (D) mener fluorescens intensiteten av 5hmC vs 5caC signaler i Daoy og BXD-1425EPN celler (n = 20, SD). Betydning ble vurdert ved hjelp av en F-test og to utvalg t-test stjerner betegne statistisk signifikant p-verdier på ** som p < 0,01 og *** som p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Colocalization analyse av 5hmC og 5caC absolutt signaler i udifferensierte hiPSCs (Undiff) forhold til hepatic endoderm 24 timer etter differensiert progenitor celler (HE24). AC confocal mikroskopi bilder av (A) udifferensierte hiPSCs og (B) HE24 celler farget for 5hmC (rød), 5caC (grønn) og DAPI (blå). Cellene ble fotografert med 63 X olje nedsenking linsen på identiske innstillinger. 20 omsluttede kjerner illustrerer cellene samplet for colocalization analyse. Skala stolper representerer 20 µm. røde kanalen: få 800, laser 1%. Grønne kanalen: få 750, laser 2.4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (C) Colocalization analyse av tilstedeværelsen av 5caC signal innenfor 5hmC nærhet i undiff og HE24 (n = 20, SD). Betydning ble vurdert ved hjelp av en F-test og to utvalg t-test stjerner betegne statistisk signifikant p-verdier på * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver trinnvis prosessen med å generere visuelle representasjoner av DNA endringer i kjerner. Mens følsom og virkningsfulle, disse teknikkene har flere begrensninger.

Det er nødvendig å understreke at dataene som genereres fra 2.5D tomter, signalet intensitet profiler og colocalization analyse er halvt kvantitative i naturen. På grunn av punkt til punkt belysning av prøven under bildeopptak på laserskanning AC confocal mikroskop, registreres absolutt signal intensiteter av hver kanal. Men dette er ikke absolutt magnitudes av 5hmC og 5caC blir oppdaget og bare representerer indikasjoner på tilstedeværelse, fravær eller omfanget av merkene epigenetic.

På grunn av repetitive natur signal amplifications forvirre begrensninger samsvarer med omfanget av maskiner brukt for å styrke signalet uunngåelig tilnærmelser av ekte fysiske genomisk innholdet av disse merkene34. Den sanne genomic lokaliseringen av merkene kan være skjult av disse store proteiner, som fysisk opptar områder uløselig selv ved optimal AC confocal oppløsning grenser på 200-300 nm34. Videre kan ikke signal intensiteter av enkeltkanalene for hvert merke sammenlignes med hverandre skyldes forskjeller i antistoff følsomhet og fluorophore Bøyning34. Men kaster innhentet informasjon med imaging lys over romlige og tidsmessige organiseringen av genomisk merkene.

For nøyaktig kvantifisering av 5hmC og 5caC signaler, er kjerner uthevet og omkranset mot DAPI counterstain, klart demarcating regionen som skal analyseres. Denne prosedyren dispenses med behovet for å kalibrere gating terskler som bakgrunnsstøy ignoreres gjennom den manuelle prosessen med å velge kjerner1. En automatisering av prosessen kan oppnås i den nyeste programvaren som tillater kjernefysiske segmentering skal utføres. Mens gratis alternativ programvare pakker som FIJI er tilgjengelig for colocalization analyse, ulemper som kravet om å konvertere bilder til binære 8 bit formater, maskering bilder og innrykker størrelse utelukkelse dataene for å velge områder av interesse grense det bruker-tilgjengelighet av dette programmet. I tillegg introduserer vurderer totalt begrenset 5hmC og 5caC i genomet kombinert med sine dominerende beliggenhet ved euchromatic regioner og uttømming av genomisk CpG sekvenser generelt, manuell omringe av kjerner bruker-bias. Derfor uthevingen av kjerner automatisk antar alle hendelser i avgrensede regionen å være positive og ignorerer alle pikslene som kan være til stede. Dermed kan analysere bilder basert på pixel intensitet være mer meningsfylt. Disse faktorene er viktig når det gjelder bruk av Mander's colocalization koeffisienten analysere graden av romlige overlapping mellom to signaler, uavhengig av deres signal intensiteter som motsetter til Pearsons korrelasjonskoeffisient som forutsetter en lineær relasjon mellom signaler.

Samlet bære teknikker skissert her temaet for visuell representasjon av biologiske data på en intuitiv format. Mens semi kvantitative bildeanalyser ikke erstatter kraftig teknikker som massespektrometri i følsomhet eller én base oppløsning genomet bredt sekvensering, det gir utfyllende data slik at slutninger og hypoteser skal unnfanget fra analyse av bilder med presisjon.

Disclosures

Noen mulige interessekonflikter ble avslørt.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council [BB/N005759/1 til A.R.]. NRFH ble finansiert av The Rosetrees Trust og The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskopet, behandling datamaskiner og programvare ble finansiert av BBSRC BB/L013827/1 (tverrfaglig Super-oppløsning mikroskopi anlegg på Nottingham University grant)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics