Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

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Summary

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

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Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

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Abstract

Seit mehreren Jahrzehnten hat 5-Methylcytosine (5mC) gedacht worden, um die einzige DNA-Modifikation mit einem funktionalen Bedeutung in Metazoen werden. Die Entdeckung der enzymatischen Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) sowie die Erkennung von N6-Methyladenine (6mA) in der DNA von mehrzelligen Lebewesen zur Verfügung gestellt zusätzliche Freiheitsgrade Komplexität der epigenetischen Forschung. Nach eine wachsende Zahl von experimentellen Beweis können diese neuartige DNA-Modifikationen bestimmte Rollen in verschiedenen zellulären und Entwicklungs-Prozessen spielen. Wichtiger ist, als einige dieser Marken (e. g. 5hmC, 5fC und 5caC) Ausstellung Gewebe- und Entwicklungsstörungen Bühne-spezifische auftreten bei Wirbeltieren, stellt Immunchemie ein wichtiges Instrument, die Beurteilung der räumlichen Verteilung der DNA-Veränderungen in verschiedenen biologischen zusammenhängen. Hier sind die Methoden für computergestützte Analyse von DNA-Veränderungen visualisiert durch Immunostaining gefolgt von konfokalen Mikroskopie beschrieben. Insbesondere die Generation 2.5 Dimension (2,5 D) signal Intensität Grundstücke, signalisieren, dass Intensität Profile, Quantifizierung der Färbung Intensität in mehreren Zellen und Bestimmung des Signal NS1 Koeffizienten angezeigt werden. Gemeinsam können diese Techniken bei der Bewertung der Ebenen und Lokalisierung dieser Modifikationen der DNA im Zellkern, einen Beitrag zur Aufklärung ihre biologische Rolle bei Metazoen einsatzfähig sein.

Introduction

DNA-Methylierung, ein gut dokumentierter Mechanismus verbunden mit transcriptional Regelung bringt Änderung von Cytosin-Rückständen in eine 5'-Cytosin-Phosphat-Guanin-3 "(CpG) Dinucleotide Kontext über die Zugabe einer Methylgruppe (-CH3), 5 - Kohlenstoffatom der Cytosin Pyrimidine Ring 5-Methylcytosine (5mC)1zu bilden. Bei Säugetieren sind etwa 70 % der Verbrauchsgüter methyliert, die nur 1 % von ihrem Genom darstellt, wie sie dieser palindromische Sequenz aufgrund 5mC mutagene Neigung zu deaminate spontan zu Thymin2aufgebraucht sind. Vorhandensein von Methylgruppen auf gen Promotorsequenzen zeigen starke Korrelation mit transcriptional Repression in Wirbeltieren3,4,5. Zugabe von diese Methylgruppen ist katalysiert durch hoch konservierte DNA-Methyltransferase (DNMT) Enzyme DNMT3a, 3 b und 3 L und DNMT1 die CpG Cytosines in de Novo und Wartung Methylierung zusammenhängen bzw. ändern6. DNMT3A/B Ausdruck ist während der Entwicklung in embryonale Stammzellen und Epiblast erhöht; jedoch ist seine verminderte Expression nach pluripotente Zelle Abstammung Engagement für somatische Schicksale während der Differenzierung8beobachtet. Während funktionelle Redundanz zu teilen, display DNMT3a und 3 b gewebespezifischen Expressionsmuster mit 3a einheitlich in Mausembryonen erkannt aber 3 b überwiegend auf Neuroectoderm und Chorion Ektoderm Gewebe8lokalisiert.

Methylierung Signaturen können während der Mitose und Meiose10vererbt werden. Wartung-Methylierung beinhaltet DNMT1 erleichtert Änderung der CpG Cytosin Rückstände im Hemi methyliert Palindrome auf doppelsträngigen DNA-11. DNMT1 bindet DNA bei Replikation Gabeln11 und infolgedessen genomische Methylierung Ebenen Höhepunkt während der S-Phase des Zellzyklus12. DNMT1 methylates unveränderten Cytosines dadurch neu synthetisierten DNA-Stränge zu unterscheiden, X-Chromosom Inaktivierung zu fördern und pflegen transkriptionellen Repression Profile13. Durch Anerkennung der Hemi-methylierte CpG DNA-Sequenzen unterhält DNMT1 etablierte Muster der Methylierung abgegrenzt durch de Novo Methylierung z.B. Unterdrückung von langen durchsetzt Nuclear Element 1 (Linie1) Retrotransposon Promotoren, die potenziell krebserregend Vermehrung14zu hemmen. Obwohl Hemi-methylierte DNA bevorzugte Bindungsaffinität zu besitzen, können DNMT1 unmethylated CpG-Insel (CGI)-Sequenzen in DNMT3a/b - / - Mutantenzellen methylieren ein Notfall de Novo Methylierung Rolle15 . So kann aufgrund der semi-konservative Art der DNA-Replikation16Wartung Methylierung treu Methylierung Unterschriften von übergeordneten Tochterzelle17rekapitulieren.

Allerdings muss für gen Ausdruck dynamisch moduliert, repressiven Methylierung Modifikation ist gelöscht werden, lässt sich von passiven und aktiven Demethylierung Mechanismen18. Die zehn-elf Translocase (TET) Proteine aus einer erhaltenen Familie Dioxygenase Proteine sind in der Lage der iterativen Oxidation von Methylgruppen auf CpG Rückstände19. Diese Tet Proteine, homolog zu J-Base-bindende Proteine (JBP) entdeckt in Trypanosomen Bruceii, erkennen und binden veränderte DNA Basen z.B. 5mC und diese Rückstände, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5 - Sauerstoff Carboxylcytosine (5caC)20. Tet-Protein erleichtert Oxidation von 5mC führt schrittweise Konformation Wechsel von Methyl, Hydroxyl, Carbonyl und Carboxylat Konfigurationen, aber 5fC und 5caC Änderungen direkt aus 5mC Oxidation21, synthetisiert werden können 22 , 23 , 24.

Informative Angabe der TET Proteinaktivität verstehen ihre Regulierung studiert die Verteilung und die Fülle der Oxi-Methyl-Cytosin-Marken. Erhebliche 5mC Präsenz auf CpG Armen Promotoren ist im Gegensatz zu unmethylated CpG reichen Regionen nachweisbar, letztere Merkmal der CpG Inseln25. Über Gewebe, höchste Gewebe, die spezifische Methylierung in Blut, Gehirn und Hoden beobachtet wird, während der Mundschleimhaut zeigen größte Hypomethylierung zeigt eine differenzielle Methylierung Muster an Gewebe spezifische Promotoren26auftretenden.

Durch Nutzung der sensiblen Anti-5mC und Anti-5hmC demonstriert Antikörper im selektiven Methyl/Hydroxymethyl DNA Immunopräzipitation (MeDIP/HmeDIP) und anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung, Ficz Et Al. hohe 5hmC Belegung an Projektträger, Exons und LINE-1 Retrotransposon Sequenzen die korreliert mit reduzierten 5mC Ebenen an diesen Standorten im embryonalen Maus Stammzellen Zellen27. Umgekehrt beobachtet wo war 5hmC Anwesenheit begrenzt28größten 5mC Bereicherung bei sich wiederholenden Sat-Sequenzen. Studien an menschlichen Frontallappen Hirngewebe zeigen hochsignifikante 5hmC Bereicherung, Vierfache höher als bei Maus embryonale Stammzellen28. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen lokalisiert Hochdurchsatz-Sequenzierung der Frontallappen Gewebe illustriert Mehrheit 55-59 % des 5hmC-Signals bei geringer Dichte CpG Förderer Regionen, 35-38 % innerhalb von gen stellen und ca. 6 % Auslastung bei intergenetischer Regionen. Im Gegensatz dazu 5mC war bei intergenetischer Regionen (25-26 %) und höher in gen Gremien (52-55 %) bereichert, sondern reduzierte (22-24 %) beim Projektträger Sequenzen29. Diese Studien zeigen Fülle von 5hmC in embryonalen Stammzellen und somatischen Gewebe, insbesondere das Gehirn, aber Untersuchungen auf 5fC und 5caC Distributionen begrenzt sind.

Interessant ist, vor kurzem entdeckt in den Eukaryotes, Methylierung von Adenin Rückstände auf der Position 6 Stickstoff (N-6) (6mA) Display eine genomische Fülle Profil invers zu derjenigen 5mC30. Beobachtungen von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt-Tandem-Massenspektrometrie zeigen 6mA absoluten Niveaus im Übermaß im Zebrafisch und Schweinen frühen Embryo im Vergleich zu den Samenzellen mit seinen Ebenen (0,003 % der genomischen Adenines) bestehen bei der Befruchtung, stetig Höchststand von Morula Entwicklungsstadium (33 Fach höher als Spermien) und somatische Ausmaße Steady-State von 0,004 % der genomischen Adenines31. Immunopräzipitation 6mA bereichert DNA-Sequenzen hat vorherrschende Belegung (ca. 80 % Anreicherung) von dieser Marke auf sich wiederholende Element Regionen und transkriptionelle Start Seiten32gezeigt. Diese Beobachtungen zu kontextualisieren und validieren die Entdeckung der 6mA Demethylase-Null eMbryonic Stammzellen ausstellenden angesammelten 6mA vermittelt transcriptionally aktiven Elemente in Wildtyp-Zellen gegenüber LINE-1 Retrotransposon zum Schweigen zu bringen. Diese Daten schlagen eine transcriptional regulierende Funktion für 6mA33.

Während konjugierten Biochemische Tags gekoppelt an nachfolgende DIP-Assays Vorhandensein oder Fehlen von oxidierten Methylcytosine Derivate (Oxi-mCs) angeben, können nicht sie räumliche Verteilung oder quantifizierbare Informationen von diesen Marken34, vermitteln. 35. ein Protokoll für sensible immunchemische Nachweis von 5hmC und 5caC wurde vor kurzem entwickelten36. Diese Fluorophor konjugiert sekundäre Antikörper-basierten Immunostaining Methode gepaart mit Verwendung von Scan konfokale Lasermikroskopie besitzt den einzigartigen Vorteil, dass visuelle Lokalisierung dieser DNA-Modifikationen innerhalb der Zellen, so, Betonung einzelner positiv oder negativ gefärbt Zellen entsprechend der heterogenen Präsenz dieser Marken. Die 5hmC und 5caC absolute Signalintensitäten aktivieren, da durch die konjugierten Antikörper verstärkt semi-quantitative Interpretationen über das Ausmaß und die Positionen dieser Marken innerhalb des Zellkerns z.B. heterochromatischen und euchromatisch Regionen vorgeschlagen werden 37 , 38. hier eine Technik für die computergestützte Analyse der konfokalen Mikroskopie-Bildern beschrieben. Die Generation der räumlichen Verteilung 2.5D Grundstücke für die Anzeige von verschiedenen 5hmC und 5caC Signalspitzen pro Pixel und deren Standorte innerhalb Kerne zeigt. Histogramm Grundstücke von 5hmC und 5caC Signal Intensität Profile zeigen Trends in Hülle und Fülle dieser Marken als die Gipfel und Tröge sind als separate nicht überlappende Kanäle dargestellt. Schließlich durch die Implementierung der Kolokalisierung-Funktion, der Grad der Nähe eines Signals ermittelt werden und als Folge davon, ihre jeweiligen genomischen Koordinaten identifiziert werden können.

Protocol

1. Generation der konfokalen Bilder

  1. In Vorbereitung auf die Analyse der modifizierte Formen von Cytosin, immunhistochemische Färbung wie von Abakir Et Al. beschrieben durchführen 34.
  2. durchzuführen Bildgebung von Folien, unter Verwendung eines Mikroskops und Speichern von Dateien in einem Format LSM.
    Hinweis: Beim Vergleich der Intensität zwischen Proben die Werte für Laserleistung und Verstärkung für jeden Kanal Profile beibehalten werden im gesamten Bild Verfahren ermöglicht direkten Vergleich in der Bild-Analyse-Phase nehmen.

2. Generation von 2.5D Intensität Grundstücke

  1. Öffnen Sie die Software (z. B. Zen schwarz) und wählen Sie ' Image Processing '.
  2. Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.
  3. Klicken Sie auf ' zeigen alle ' unter dem Bild um alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen. In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es drei Registerkarten; ' Abmessungen ', ' Anzeige ' und ' Grafik ', wählen Sie die ' Grafik ' tab.
    1. Wählen Sie die ' Rechteck ' Tool Kerne/Interessengebiet auswählen.
    2. Select ' schneiden Region ' um das Bild zu beschneiden. Dies erzeugt ein neues Bild für die abgeschnittenen Region in eine separate Registerkarte
    3. Gehen Sie auf das Menü "Datei" und wählen Sie speichern unter speichern geben Sie die Datei einen Namen und speichern Sie es als LSM oder CZI-Datei.
  4. Software (z. B. Zen blau) zu öffnen, und wählen Sie die ' Zen Schreibtisch '.
  5. Senden Sie das zugeschnittene Bild von Zen schwarz an Zen Blau wählen Sie die Datei und klicken Sie auf das Menü "Datei" und wählen Sie senden, Zen 2012-blaue Ausgabe. Das zugeschnittene Bild öffnet sich dann in das entsprechende Programm.
    Hinweis: Die Image-Datei wird übertragen, weil die 2.5D Intensität Plot-Funktion in Zen Black 2012 nicht mehrere Kanal Bilder gleichzeitig angezeigt werden.
  6. Auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet ' 2,5 D ', dies ermöglicht die Visualisierung des Bildes in 2.5D. Klicken Sie auf ' alle ' alle grafischen Steuerelemente sichtbar zu machen.
  7. Alter Visualisierung Einstellungen mit vier grauen Balken befindet sich auf der linken Seite und unten das Bild.
    Hinweis: linke Hand Bar, oben im Bildschirm = Zoom. Bar der linken, unteren Bildschirmrand = drehen Bild auf Achse. Unteren Bildschirmrand, linke Hand bar = Drehung des Bildes. Unteren Bildschirmrand rechts Hand Bar = ausdehnen und zusammenziehen, Maßstabsleisten.
  8. Gewährleisten die Render-Modus ausgewählt ist Oberfläche, da dadurch die beste Visualisierung der einzelnen Peaks.
  9. Grid-Entfernung zu verändern durch eine Änderung dem Prozentsatz, desto geringer des Prozentsatzes mehr definiert jede einzelne Spitze.
  10. Zum Speichern des Bildes 2.5D verstecken zuerst die Datei-Liste auf der rechten Seite und die grafische Werkzeuge unter dem Bild durch Klicken auf den grauen Pfeil unterhalb der 2,5-D-Plot (neben ' zeigen alle '), dadurch wird ausgeblendet, die grafische Registerkarten ermöglicht das Bild, um zu erweitern, um das Geröll zu füllen n. um die 2,5-D-Plot zu speichern, drücken Sie die ' PrtSc ' Taste auf der Tastatur. Dies wird einen Screenshot des Displays. Fügen Sie den Screenshot in Microsoft Paint und beschneiden Sie das Bild vor dem speichern.

3. Intensität Profiling

  1. Öffnen Sie die Software (z. B. Zen schwarz) und wählen Sie die Image Processing.
  2. Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.
  3. Wie das Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet ' Profil '.
  4. In der unteren Hälfte des Bildschirms auswählen (Häkchen) die ' zeigen alle ' Registerkarte ". Dies ermöglicht Zugriff auf alle Formatierungsoptionen.
  5. In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es drei Registerkarten; ' Abmessungen ', ' Anzeige ' und ' ProfileƆ wählen ' Profil ' und wählen Sie (Häkchen) der ' Tabelle ' Feld. Wählen Sie die ' Pfeil ' Schaltfläche ".
  6. Verwenden Sie die Maus auf das Bild, wählen einen Startpunkt und ziehen die Maus über eine kontinuierliche Reihe von Zellen. Lassen Sie die Maustaste um eine Intensität Handlung für die Zellen entlang der Linie zu produzieren; Zusätzlich wird die Tabelle von Intensität Messdaten für die Pixel entlang der Linie für jede Wellenlänge bevölkert werden.
    Hinweis: Die Tabelle erhalten den Abstand (µm) welches Pixel ist für die roten, grünen und blauen Fluoreszenz Intensität lesen.
  7. Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie rechts auf die Tabelle und wählen Sie ' speichern Tabelle … ' und speichern Sie auf einer geeigneten Stelle als .txt-Datei.
  8. , Der eingestellten Intensität Profilbild zu speichern, wählen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie ' exportieren … '. Wählen Sie im Popup-Fenster ' Tagged Image-Datei (Format) ' und ' Bildfenster Inhalt - einzelne Scheibe (Daten) ' gefolgt von einem Klick ' Dateinamen auswählen und speichern … ' wählen Sie einen geeigneten Speicherort und klicken Sie auf ' speichern '.
  9. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes individuelle Intensität Profil je nach Blickwinkel und Anzahl der Profile zu analysieren.
  10. Import Intensität Profile Daten gespeichert (siehe 3.7) und in einer Tabellenkalkulation, gefolgt von statistischen Analyse analysieren.

4. Co Lokalisierung Analyse

  1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie ' Bildverarbeitung '.
  2. Rufen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie öffnen. Wählen Sie das Bild, die Verarbeitung erfordert.
  3. Wie das Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, auf der linken Seite des Bildes wählen Sie die Registerkarte gekennzeichnet ' Coloc '.
  4. In der unteren Hälfte des Bildschirms auswählen (Häkchen) die ' zeigen alle ' Registerkarte ". Dies ermöglicht Zugriff auf alle Formatierungsoptionen.
  5. In der unteren Hälfte des Bildschirms gibt es vier Registerkarten; ' Abmessungen ', ' Anzeige ', ' Grafiken ' und ' ColocalizationƆ Select ' NS1 ' und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für ' Tabelle ' und ' Bild '. Wählen Sie das dritte Symbol entlang am oberen Rand dieser Registerkarte (Nähe Bezier Text angezeigt wird, wenn die Maus über das Tool) mit diesem Tool können einzelne Kerne einzukreisen, Werte für diese Kerne wird dann erscheinen in der Tabelle
    1. .
      Hinweis: Für jede Eingekreistes Kerne ein Streudiagramm für Rot und grün fluoreszieren entsteht, die im linken Bereich auf dem Bildschirm visualisiert wird. Die Achse wird dann verschoben, um Zellen abhängig von der Schwelle Tor. Wie die Kerne von Interesse in den Bildern manuell ausgewählt, ist die Anpassung der gating Schwellen über Null nicht erforderlich. Alle Pixelwerte Intensität beobachtet innerhalb der nuklearen Perimeter gelten als positives Signal.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang durch das dritte Symbol in der Registerkarte auswählen und rings um nachfolgende Kerne, bis das Dataset abgeschlossen ist.
  7. Um diese Daten zu exportieren, klicken Sie rechts auf den Tisch, wählen Sie speichern Tabelle und speichern Sie auf einem geeigneten Ort.
  8. Das NS1-Bild speichern wählen Sie das Menü "Datei" und wählen Sie ' exportieren … ' wählen; Verschlagwortet mit Image-Datei (Format) und ' Inhalt des Bildfensters – Ebene (Daten) ' gefolgt von einem Klick ' Dateinamen auswählen und speichern … ', wählen Sie einen geeigneten Speicherort und klicken Sie auf ' speichern '.
  9. Plotten NS1 Daten in einer Tabellenkalkulation, gefolgt von statistischen Analyse.

Representative Results

Um festzustellen, die räumliche Verteilung der 5hmC und 5caC bei der Unterscheidung von hepatischen Stammväter Immunostained Folien für diese DNA-Modifikationen wurden abgebildet unter Verwendung eines Mikroskops.

Erste Analyse der räumlichen Verteilung dieser Oxi-MCS erfolgte durch die Generierung von 2.5D Intensität Grundstücke (Abb. 1A, 1 b). Die roten und grünen Gipfel schien gut definiert mit der geringen Präsenz von orange Spitzen Angabe nur eine kleine Überlappung der 5caC und 5hmC Signale. Im Einvernehmen mit diesen Ergebnissen übereinstimmen die Profile für 5hmC und 5caC Intensitäten in der entsprechenden Zelle nicht stark mit einander (Abbildung 1). Dies zeigt, dass 5caC und 5hmC unterschiedliche Muster der nuklearen Verbreitung in hepatischen Stammväter weisen, was darauf hindeutet, dass Tet-abhängige Oxidation von 5mC führt zur Erzeugung von verschiedenen oxidierten Derivate dieser DNA-Modifikation in bestimmten chromatin Regionen.

Um das Maß an 5caC und 5hmC in Daoy Medulloblastom und BXD-1425EPN Ependymoma Zellen zu vergleichen, wurde Immunostaining für diese Oxi-mCs auf beide Proben unter identischen Versuchsbedingungen durchgeführt. Intensitäten von 5caC und 5hmC Signale wurden dann in 20 Profile generiert über 3-5 Zellen aufgezeichnet für jede Zelllinie verglichen (Abbildung 2A-2D). Die Quantifizierung der Ergebnisse ergab, dass BXD-1425EPN Zellen signifikant niedrigere Werte von 5hmC und 5caC Immunostaining im Vergleich zu Daoy Zellen (Abb. 2D) aufweisen.

In Anbetracht der beiden Kanäle rot (5hmC) und grün (5caC), kann bezeichnet werden als f und G bzw. der Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) beschreibt den Grad der räumlichen Überschneidungen und Co Trennung von R & G, vorausgesetzt, beide Marken existieren in einer linearen Beziehung zu einander, durch R Statistik34bezeichnet. Quadratur den PCC-Wert gekennzeichnet durch R2 ermöglicht die Messung von grünes Signal Intensität Variation der durch rotes Signal Intensität34beeinflusst wird. Dies ist für unsere 5caC Vs 5hmC Co Lokalisierung Analyse überflüssig.

Um die räumliche Verteilung der 5caC und 5hmC in undifferenzierten (Undiff) HiPSCs und hepatische Entoderm 24 Stunden (HE24) nach Induktion zu untersuchen, wurde NS1 Analyse dieser DNA-Modifikationen auf die gleichen konfokale Bilder mit R-Werte für 20 durchgeführt Kerne analysiert für jede Zelllinie (Abb. 3A-3 C).

Die Quantifizierung dieser Ergebnisse gezeigt, dass Grad der NS1 deutlich höher ist (P < 0,05) in HE24 im Vergleich zu Undiff (Abb. 3 c). Dies kann auf die reduzierte Größe der 5caC Präsenz und damit seine verringerte Signalintensität in Undiff Zellen zurückzuführen sein.

Figure 1
Abbildung 1: immunhistochemische Färbung der hepatischen Entoderm Stammväter auf 72 Stunden Post Induktion der Differenzierung. (A) Co Färbung des 5hmC (rot), 5caC (grün) und DAPI nuklearen Zähler Fleck (blau). Der weiße gestrichelte Pfeil "B" bezeichnet die Richtung des profiling Stichprobe durch den Zellkern, in 1 Cdargestellt. Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Rot-Kanal: gain-800, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. DAPI-Kanal: gain-750, laser-2,6 %. (B) 2.5D Intensität Grundstück von 5hmC, 5caC und DAPI-Signale. Einzelne Spitzen stellen absolute Signalintensitäten der einzelnen Pixel. Zusammengeführte Ansichten und einzelne Kanäle werden angezeigt. (C) die Intensität Profile von 5hmC, 5caC und DAPI-Signale in hepatischen Stammväter auf 72 Stunden Post Induktion der Differenzierung. Peak-Intensitäten entlang der Dimensionen der weiße gestrichelte Pfeil "B" aufgenommen wurden und werden durch einen schwarzen gestrichelten Pfeil entlang der x-Achse Intensität Profil angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der 5hmC und 5caC signal Intensitäten in Daoy Medulloblastom und Zelllinien BXD-1425EPN Ependymoma. (A) Immunofluorescent Färbung des 5hmC (rot) und 5caC (grün) in Daoy und BXD-1425EPN Zellen. Die Bilder wurden mit 63 x Öl Immersion Objektiv, beide mit den gleichen Einstellungen aufgenommen. Zusammengeführte Ansichten und einzelne Kanäle werden angezeigt. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. Rot-Kanal: gain-746, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. (B) Daoy und (C) BXD-1425EPN Einzelzellen werden in benachbarten Zahlen erweitert. Skalieren Sie Bars für (B) und (C) stellen 5 µm. (D) mittlere Fluoreszenzintensität 5hmC Vs 5caC Signale in Daoy und BXD-1425EPN Zellen (n = 20, SD). Bedeutung wurde anhand eines F-Tests und zwei Stichproben t-Test Sternchen bezeichnen statistisch signifikante p-Werten von ** p < 0,01 und *** p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: NS1 Analyse von 5hmC und 5caC absolute Signalen in undifferenzierten HiPSCs (Undiff) im Vergleich zur hepatischen Entoderm 24 Stunden Post-differenzierte Vorläuferzellen (HE24). Bilder der konfokalen Mikroskopie (A) undifferenzierten HiPSCs und (B) HE24 Zellen für 5hmC (rot), 5caC (grün) und DAPI (blau) gefärbt. Zellen wurden mit 63 X Öl Immersion Objektiv bei identischen Einstellungen abgebildet. 20 Eingekreistes Kerne zeigen die Zellen für die NS1 Analyse abgetastet. Maßstabsleisten repräsentieren 20 µm. Rot-Kanal: gain-800, laser-1 %. Grün-Kanal: gain-750, laser-2,4 %. DAPI-Kanal: gain-750, laser-2,6 %. (C) Kolokalisierung Analyse der Präsenz des 5caC-Signals im Bereich der 5hmC Nähe in Undiff und HE24 (n = 20, SD). Bedeutung wurde anhand eines F-Tests und zwei Stichproben t-Test Sternchen bezeichnen statistisch signifikante p-Werten von * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess der Generierung visueller Darstellungen von DNA-Veränderungen innerhalb der Kerne. Während sensible und wirkungsvolle, besitzen diese Techniken eine Reihe von Einschränkungen.

Es ist notwendig zu betonen, dass Grundstücke von 2.5D generierten Daten, Signal Intensität Profile und NS1 Analyse sind semi-quantitativen in der Natur. Aufgrund der Punkt für Punkt Beleuchtung der Probe während der Bildaufnahme über die Laser-scanning-confocal Mikroskop sind absolute Signalintensitäten der einzelnen Kanäle aufgezeichnet. Jedoch sind keine absoluten Größen der 5hmC und 5caC Wesen erkannt und nur Anzeichen für die Anwesenheit, Abwesenheit oder Skala dieser epigenetischen Markierungen darstellen.

Aufgrund der sich wiederholenden Signal Amplifikationen verwechseln Einschränkungen konsistent mit der Größe der Maschinen angewendet, um das Signal unweigerlich zu verbessern Annäherungen der wahre körperliche genomische Belegung von diesen Marken-34. Die wahre genomische Lokalisation dieser Marken kann durch diese sperrigen Proteine, die physisch Gebieten auch bei optimalen konfokale Auflösung Grenzen von 200-300 nm34unlösbaren besetzen verdeckt werden. Darüber hinaus können nicht die Signalintensitäten der einzelnen Kanäle für jede Marke aufgrund der unterschiedlichen Antikörper Empfindlichkeit und Fluorophor Konjugation34miteinander verglichen werden. Aber wirft die Informationen mittels Bildgebung Licht auf die räumliche und zeitliche Organisation der genomischen Marken.

Für genaue Quantifizierung von 5hmC und 5caC Signalen sind Kerne hervorgehoben und umkreist gegen das DAPI Gegenfärbung, klare Abgrenzung der Region analysiert werden. Dieses Verfahren verzichtet auf die Anforderung für die Kalibrierung gating Schwellenwerte wie Hintergrundgeräusche durch den manuellen Prozess der Auswahl von Kernen1außer acht gelassen wird. Eine Automatisierung dieses Prozesses kann in der neuesten Software erfolgen, die für nukleare Segmentierung durchgeführt werden können. Während kostenlose alternative Software-Pakete wie Fidschi sind verfügbar für die NS1 Analyse, Nachteile wie die Anforderung, Bilder in 8 Bit binäre Formate zu konvertieren Interesse Maskierung Bilder und Eingabe Größe Ausschluss Daten wählen Sie Regionen der Begrenzung der Zugänglichkeit für Benutzer dieses Programms. Darüber hinaus stellt in Anbetracht der allgemeinen Ebenen von 5hmC und 5caC in das Genom, zusammen mit ihre vorherrschende Position in euchromatisch Regionen und Erschöpfung der CpG Genomsequenzen im Allgemeinen begrenzt, manuelle rings um Kerne Benutzer-Bias. Daher die Hervorhebung der Kerne automatisch übernimmt alle Ereignisse, die innerhalb der abgegrenzten Region positiv und ignoriert alle Hintergrundpixel, die vorhanden sein können. Analyse von Bildern anhand Pixel Intensität kann daher sinnvoller sein. Diese Faktoren sind wichtig, wenn man die Verwendung von Mander des NS1 Koeffizient, analysieren den Grad der räumlichen Überschneidungen zwischen beiden Signalen, unabhängig von ihrer Signalintensitäten wie Pearson Korrelationskoeffizient gegen die übernimmt eine lineare Beziehung zwischen Signalen.

Insgesamt tragen die hier beschriebenen Techniken das Thema der visuellen Darstellung von biologischen Daten in einem intuitiven Format. Während semi-quantitativen Bildanalyse leistungsstarke Techniken wie Massenspektrometrie im Hinblick auf die Empfindlichkeit oder einheitliche Basis Abwicklung Genom ablösen kann nicht breit Rüst-, es liefert ergänzende Daten erlauben Rückschlüsse und Hypothesen zu aus der Analyse von Bildern mit Präzision konzipiert.

Disclosures

Potenzielle Interessenkonflikte wurden bekannt gegeben.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde von Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council [BB/N005759/1, A.R] unterstützt. NRFH wurde von der Rosetrees Vertrauen und The Stoneygate finanziert [A1130 / M546]. Das Zeiss Elyra PS.1 Mikroskop, die Verarbeitung Computer und Software wurden durch BBSRC BB/L013827/1 (multidisziplinäre Super Auflösung Mikroskopie Facility in Nottingham University Grant) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

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References

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