En In Vivo Duo-färg metod för Imaging vaskulär Dynamics efter Contusive ryggmärgsskada

Neuroscience
 

Summary

Vi introducerar en i vivo imaging metod med två olika fluorescerande färger för att spåra dynamiska spinal vaskulära förändringar efter en contusive ryggmärgsskada i vuxen Sprague-Dawley-råttor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ryggmärgsskada (SCI) orsakar betydande vaskulära störningar på platsen av skada. Vaskulär patologi inträffar omedelbart efter SCI och fortsätter under hela fasen akut skada. I själva verket verkar endotelceller vara först att dö efter en contusive SCI. De tidiga vaskulära händelser, inklusive ökad permeabilitet av blod-ryggmärgen barriär (BSCB), framkalla vasogenic ödem och bidra till skadliga sekundära skada händelser orsakas av komplexa skada mekanismer. Inriktning de vaskulära störningar, därför kunna vara en viktig strategi att minska sekundär skada kaskader som bidrar till histologiska och funktionella försämringar efter SCI. Tidigare studier utfördes mestadels på efter döden prover och kunnat inte fånga de dynamiska förändringarna av vaskulära nätverket. I denna studie har vi utvecklat en in-vivo duo-färg två-photon bildgivande metod för att övervaka akut vaskulär dynamiska ändringar efter contusive SCI. Detta tillvägagångssätt gör att upptäcka blodflödet, fartyget diameter och andra vaskulära sjukdomar på olika platser i samma råtta före och efter skada. Sammantaget ger denna metod en utmärkt plats för att utreda vaskulär dynamics.

Introduction

Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är en vanlig skada som leder till försämring av motoriska, sensoriska och autonoma fungera. Enligt den nationella ryggmärgen skadan statistiska Center (NSCISC) under 2016, cirka 282,000 personer drabbades medan 69% av dem var främst på grund av trafikolyckor eller faller1. Dessa patienter kräver ofta intensivvård; dock finns för närvarande ingen effektiv behandling. Därför behövs omgående nya effektiva strategier för SCI.

SCI är huvudsakligen indelad i två faser: primär skada och sekundära skador. Den primära skadan består av den fysiska förolämpning som orsakar hemorragisk nekros på platsen för impact2, följt av en serie av sekundär skada händelser, såsom inflammation, cell apoptos och demyelinisering av återstående axoner, som successivt leder till en utvidgning av morfologiska och funktionella underskott3,4,5,6. Blödning är det första synliga tecknen på skadan, som anger en omedelbar vaskulära störningar i den akuta fasen av SCI7,8. En nervskyddande strategi syftar till att minska den tidiga kärlskador kan förbättra patienternas återhämtning, men detta kräver en bättre förståelse av patofysiologiska mekanismen för tidig efter skada vaskulära händelser.

Trots att tidigare studier med olika metoder för att studera ryggmärgen kärlsystemet, fortfarande betydande begränsningar. Mest delade nackdelen studerar endast efter döden prover, till exempel väte clearance9, autoradiografi10, microangiogram8, vaskulär korrosion kastar11och immunohistokemi12 ,13. Även Laser Doppler Flowmetry ger noninvasiv realtidsövervakning av ryggmärgen blod flöde14, är det att skilja mellan vaskulära system och upptäcka vaskulär morfologiska förändringar. Dynamisk kontrastförstärkt MRT (DCE-MRI) är också icke-invasiv, men det genererar lågupplösta bilder och kräver en dyr infrastruktur15.

Även om i vivo imaging använder 2-photon laser scanning mikroskopi (2 P-LSM) har utvecklats för att studera vasodynamics i cortex16,17,18, ett begränsat antal studier har påvisade vaskulära förändringar efter en SCI. Tang et al. har visat förändringar i blodflödet vid kanten av webbplatsen lesion i en hemisection modell19, men imaging efter en contusive skada är mer utmanande av två skäl. Först skulle en traditionell optisk glasfönster över skadan webbplats inte upprätthålla den mekaniska stötar och förbli funktionella för avbildning. Andra, läckage av tracer i parenkymet beror på blödning skapar svårigheter med efter skada imaging.

Här presenterar vi en roman duo-color imaging metod, som tillåter imaging de samma enskilda fartyg före och efter skada tidpunkter. Dessutom, ger det en temporal-spatial profil av vaskulär dynamiska förändringar efter en contusive SCI. Det har också potential för imaging på flera efter skada tidpunkter. Detta protokoll kan tillämpas direkt på transgena djur att studera neurovaskulära interaktion.

Protocol

Alla kirurgiska och djurens hantering utfördes som godkänts enligt guiden för vård och användning av försöksdjur (National Research Council) och riktlinjerna av Indiana University skola av medicin institutionella djur vård och användning Kommittén.

1. kirurgisk beredning

  1. Sterilisera alla kirurgiska verktyg inklusive ryggraden stabilisatorn. Ren operationsbord och alla det omgivande området med 70% etanol. För beredning av icke-survival kirurgiska ingrepp, placera en ren kirurgiska pad ovanpå en 37 ° C värmedyna.
  2. Använd sex veckor gamla Sprague Dawley (SD) råtta för denna studie. Väger och söva råtta med en intraperitoneal injektion av ketamin (87,7 mg/kg) och xylazin (12,3 mg/kg) blandning. Bekräfta rätt skede av anestesi när djuret upphör att svara på en tå nypa stimulans. Subkutant injicerar 0,01-0,05 mg/kg buprenorfin och 5mg/kg karprofen före operation.
  3. Raka råtta i 2 områden: regionen halsryggen på ryggen och halsen regionen på bröstet sida. Svabba huden områden med betadine kirurgiska buskmarker och 70% alkohol torkar. Tillämpa ögonsalva för att förhindra torra ögon under kirurgi. Placera djuret i ryggläge på rent kirurgiska pad.

2. yttre halsvenen kateterisering

  1. Leta upp den yttre halsvenen genom att hitta puls punkt nära nyckelbenet och skär med en liten fjäder sax göra ett vertikalt snitt på plats, som är den cross-punkten 3 anatomiska Poäng: kaudala ramus av höger underkäke, större knöl av humerus och manubrium (figur 1A). Isolera fartyget använder våren sax och fin pincett. Knyt den distala änden med 1 sterila kirurgiska suturer linje (figur 1 c)20.
  2. Förbereda en 1 mL spruta fylld med koksaltlösning och ansluten med en specialiserad kateter tillverkad av en 21-gauge nål (figur 1B). Gör ett litet snitt med ett par mikro sax på fartyget och skjut katetern i fartyget.
    1. Fäst nålen genom att knyta både den proximala och distala änden (figur 1 c). Specialiserade katetern är tillverkad av en 21-gauge nål. Slipa spetsen platt och svetsa med en 2 mm bit spets avskurna från en annan 21-gauge nål. Detta kan hindra katetern från att glida utanför.
      Obs: En liten mängd blod flyter in nålen anger nålen har angett ett blodkärl framgångsrikt.

3. ryggraden stabilisering och C5-C7 laminektomi

  1. Placera djuret i en liggande ställning. Skära huden längs mittlinjen med nr 15 skalpell blad på önskad spinal nivå. Dissekera muskeln skikten från den 5: e till 7th halskotor (C5-C7) bilateralt för att exponera den laterala fasetter (figur 2A)21.
    Obs: Leta upp andra bröstkorg kotan (T2) genom att hitta markanta mellan scapulae. Räkna uppåt från T2 kotan att hitta C7 kotan21,22,23,24.
  2. Stabilisera ryggraden råttans använder en modifierad stabiliserande apparatur. Gör en skåra på båda sidor av laterala vertebrala ben. Skjut rostfritt stål armarna under exponerade tvärgående process fasetter och skruvarna för att säkra stabilitet (figur 2B).
  3. Ta försiktigt bort de C5-C7 bladskivan (laminektomi, figur 2 c).
  4. Placera en liten bit av saltlösning-indränkt gelfoam ovanpå den exponerade dura mater att hålla den återfuktad (figur 2D).

4. installation av två-foton (2P) Imaging fönster

  1. Saker små bitar av gelfoam i gapet mellan muskler och vertebrala ben, även grejer en tunn linje av gelfoam mellan ryggmärgen och vertebrala ben och sedan använda vävnad självhäftande lim för att försegla området kring muskel-ben. Vänta 5 min till fullständig torrhet (figur 2E).
    Obs: Detta steg förhindrar effektivt framtida blödning in i fönstret och leakiness av nedsänkning lösningar.
  2. Förbered 4% agar med ddH2O i mikrovågsugn. Efter agar är helt upplöst, vänta tills den återvänder till en beröringsbara temperatur. Fyll en 1 mL steril spruta med agar lösningen och spritsa den på kanten av fönstret för att bygga en mur (figur 2E). Lösningen stelnar snabbt och förblir flexibel att objektivet eller målet att röra sig fritt.
  3. När du är redo för avbildning, ta bort gelfoam och plats nedsänkning vätskan inuti fönstret för 2P imaging (figur 2F). Överföra stabiliserad djuret inne i 2-photon Mikroskop mörka kammaren och placera fönstret 2P imaging direkt under linsen. Sänka linsen noga i fönstret imaging.

5. injektion av första fluorescerande färgämne och baslinjen Imaging

  1. Förbereda 0,5 mL rodamin B fluoresceinisothiocyanat-Dextran (4 mg/mL medelmolekylvikt ~ 70kDa) i saltlösning. Fyll en 1 mL steril spruta med lösningen och Anslut sprutan till tidigare installerade katetern.
    Obs: Beredning av fluorescerande färg innan användning rekommenderas.
  2. Injicera den första färgen genom deprimerande sprutan mycket långsamt (figur 3B). Använd först okularet för att identifiera området av intresse. Använd en kostnad kopplade enhet (CCD) kamera för att förvärva en ljus-fältet bild av ytan blodkärl mönster vid lägre förstoring som landmärke bild. Växla till laser skanningsläge och sedan öppna den 2P bildhanteringsprogram för insamling av både bilder och linje-scan data.
  3. Välj rätt 2P laser excitation våglängd, strömförsörjning och fluorescerande kanal (röd kanal för första färgämne) för att matcha med den fluorophores som används i avbildad vävnaden och sedan utföra i vivo imaging (figur 3E). Hålla djur på en värmedyna under hela processen.

6. C7 Contusive skada med LISA enhet

  1. Utföra en C7 mittlinjen kontusion skada använder en Louisville skada systemet apparater (LISA) enhet enligt en tidigare etablerat protokoll25,26.
    1. I korthet, placera djuret på LISA scenen efter kalibrering.
Efter att välja en noll-punkt inställning och justera vävnad förskjutning (0.800 mm i detta fall), klicka på knappen ”Kör Experiment” av programvaran till frisätter Slaganordningen och skapa skadan.
  • Efter skadan, placera en liten bit av saltlösning-indränkt gelfoam ovanpå den exponerade dura mater att hålla den återfuktad.
  • Upprepa steg 4,3 och åter utföra i vivo imaging på samma område synligt med den tidigare injicerade rött färgämnen (figur 3 c & F).
  • Överföra animaliska baksidan till tabellen kirurgiska och hålla djuret drogad med lämplig anestesi efter IACUC-IUSM protokollet.
  • 7. injektion av andra fluorescerande färgämne och efter skada Imaging

    1. Förbereda 0,5 mL av Fluorescein isotiocyanat-dextran (4 mg/mL, genomsnittlig molekylvikt ~ 70 kDa) i saltlösning samma som 5.1. Fyll lösningen i en 1 mL steril spruta och kontakt med tidigare installerade katetern.
    2. Överföra stabiliserad animaliska baksidan släpper 2P Mikroskop mörka kammaren och re-bild samma område med den röda kanalen för den första färgen och den gröna kanalen för andra färgämnet (siffror 3D & G).
    3. I slutet av imaging, släppa råttan från spinal stabilisering enheten och rengör agar wall.

    8. djuroffer

    1. Efter imaging, offra råtta efter de transcardial perfusion protokoll27. Samla in ryggmärgen proverna och fixa dem i 4% PFA.

    9. offlinedata analys: Kvantifiering av fartyget diametrar

    1. Överföra bildfiler till en arbetsstation för offline analys.
    2. Öppna ImageJ och välj ”fil” och sedan välja tidigare sparade rådata och öppna den associerade enda bildfilen (figur 4B).
    3. Kalibrera bilden genom att välja ”analysera” följt av ”ange skala” (figur 4 c). Värdet placeras i ”avståndet i bildpunkter” beräknas med hjälp av den ekvation som visas i figur 4A. Kalibrering av 2-foton optisk lins bestämmer standardvärdet i ekvationen. Värdet av ”opticalZoom” finns i Excel Extensible Markup Languagefile (XML-fil) är associerad med den enda bildfilen (figur 4B).
    4. Rita en linje som är vinkelrät mot den långa axeln av fartyget (figur 4 d1 & E1) och välj ”analysera” följt av ”åtgärd”. Mätning av fartyg diameter visas i resultatfönstret (figur 4 d2 & E2). Upprepa 3 gånger över fartyget att förvärva det genomsnittliga värdet.

    10. offline dataanalys: Kvantifiering av röd blod cell (RBC) hastighet

    1. Överföra linjeavsökning filer till arbetsstationen för analys.
    2. Starta programmet ImageJ och välj ”fil” och sedan välja tidigare sparade rådata och öppna alla associerade linje-Genomsök filer med det tillägget namn ”.ome”.
    3. Öppna ”bild” och välj ”Stacks” följt av ”bilder att stapla”. Konvertera alla OME filer till en enda bild stack TIFF-fil.
    4. Starta Matlab-programvaran och klicka på ”öppna”, Välj ”LSPIV_parallel.m” kodfil. Obs: Matlab-kod för LS-PIV kan hämtas på https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
    5. Välj följande order: ”kör” > ”ändra mapp” > ”artär”. Välj den bild stack TIFF-fil som genereras i 10.3.
    6. Typ ”Y” och tryck på RETUR.
    7. Placera en markör till vänster och höger sida av bilden respektive, och programmet startar att bearbeta data.
    8. I slutet av programmet, ange 2 värden för att beräkna den slutliga Läs: ”pixel_meter konverteringsvärde”, och ”scan-tid konverteringsvärde”. Båda kan hittas i den XML-associerade med linjeavsökning data. Det slutliga värdet uttrycks som medelvärde och standardavvikelse för velocity i enheter av millimeter per sekund (mm/s).

    Representative Results

    Metoden är kunna övervaka i vivo dynamiska spinal vaskulära förändringar i enskilda fartyg pre- och post-traumatisk SCI. Först installeras en kateter via den yttre halsvenen klientåtkomst för efterföljande fluorescerande färgämne injektioner (figur 1A-C, figur 3). I det andra steget används en specialiserad apparatur för att stabilisera den exponerade C5-C7 (figur 1 d-F, figur 2A-B). Denna stabilisering steg kan eliminera andning artefakter och ger stadig imaging. Efter laminektomi (figur 2 c) är nästa steg installationen av 2 P imaging fönster över C5-C7 (figur 2D-F). Minimera perifer vävnad blödning runt fönstret spinal imaging är avgörande för framgångsrik vaskulär imaging. Följande steg är att injicera rodamin-dextran fluorescerande färgämne (röd) via ovan nämnda katetern till landmärke och karta vaskulära nätverket som baslinje (figur 3A-B, E). Efter C7 mittlinjen contusive skada med måttlig svårighetsgrad, FITC-dextran (grön) introduceras vid önskade tidpunkter efter skada (figur 3A & D). Skönheten i metoden duo-färg är att man kan fortfarande upptäcka vaskulär struktur med den andra färgen när den första färgen har redan läckt ut i parenkymet på grund av skada (figur 3 g).

    Under bildsession är det lämpligt att hålla djuret på en värmedyna att upprätthålla förkroppsliga kärnar ur temperatur efter anestesi induktion.

    Med vår duo-färg metod, kan diameter och röda blodkroppar hastigheten (RBC hastighet) av enskilda fartyg mätas och beräknas. För diameter, kan man använda ImageJ för att mäta fartyget på dess största diameter för 3 repetitioner efter kalibrering (figur 4). För hastighet mäts linjeavsökning bilder använder Matlab program (MATLAB R2013a) för att beräkna den RBC velocity (figur 5)18. Baserat på morfologi, blod strömningshastighet och fartyget diameter, fartygen kan delas in i 2 Kategorier: artär och ven (se tabell1).

    Figure 1
    Figur 1 . Halsvenen kateterisering och ryggrad stabilisering.
    (A)
    en schematisk ritning för att lokalisera den yttre halsvenen. (B) specialiserade katetern gjort från en 21-gauge nål. Spetsen var marken platt och svetsade med en bit av 2 millimeter tip avskurna från en annan 21-gauge nål. (C) en schematisk bild av kateterisering. Den distala änden är sammanskrivna först, följt av proximala katetern stabilisering, slutar med fästande nålen tillsammans med fartyget (fartyget ligatur, blå pilspetsar). (D) en bild av den modifierade ryggraden stabilisatorn. En C5-C7 fönster före laminektomi (E) och efter laminektomi och contusive SCI (F) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2 . Schematisk bild av fiberoptiska fönster installation steg för steg.
    (A)
    steg 1: exponera kotan av styckning hud och muskel längs mittlinjen. (B) steg 2: ryggraden stabilisering. (C) steg 3: laminektomi. (D) Steg4: bibehålla fukten i ryggmärgen genom att placera en bit av saltlösning-indränkt gelfoam. (E) steg 5: försegla luckorna med steril gelfoam och vetbond. Efter torkning, är ett lager av agar väggen byggd på kanten av fönstret. (F) steg 6: när du är redo för avbildning, ta bort gelfoam och plats nedsänkning vätskan inuti 2 P imaging fönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3 . Den i vivo duo-färg metod förfarande stegvisa.
    Hela förfarandet består av 5 steg (A). Efter steg 1 och steg 2, ett par av dextran spårämnen med en storleksanpassa av ungefärligt 70 KDa är injiceras i sekvens för att märka den ryggmärgen vaskulatur innan ()B och C) och efter contusive SCI (D). (E)-(G) representativa 2P bilder visas i ryggmärgen vaskulatur på steg 3 till steg 5. Vita pilarna pekar på första omgången rött färgämne läckande områden (F och G), turkos pilspetsar visas andra-wave grön dye läckage (G). Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4 . Förvärv och kvantifiering av spinal fartyget diametrar.
    Efter beredningen, enstaka bildfiler förvärvas under 2 P mikroskopi, tillsammans med XML-filer med kalibrerade värden (B). (A) ekvationen visar beräkningen av ”pixel per micron” baserat på optisk zoom värden. Efter kalibrering i ImageJ (C), fartyget diametrar värderas till 3 Poäng över den längsgående axeln innan (D1) och efter (E1) skada. (D2) och (E2) visar uppmätta värden. (F) kvantifiering av fartyget diametrar vid studiestart och 30 min efter skada. Skalstapeln = 50 µm. Data visas som genomsnitt ± SD, *** p < 0,0001, tvåsidiga parade t-test.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5 . Förvärv och kvantifiering av spinal fartygets hastighet.
    Linjeavsökning bildfiler förvärvas under 2 P mikroskopi att beräkna enda fartyg hastigheter. (A) ett exempel på en valda fartyg och metod för att bedöma blodkärl RBC hastighet. (B) en arteriell exempel linjeavsökning bild och motsvarande plot fil för beräkning av hastighet, samt ett exempel på en ven (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Artär Ven
    Morfologi Rak, slät, tjock kärlväggen Grenar, ojämna kanter
    Blodet flödeshastighet Snabb Långsam men varierar
    Diameter 30-80 µm 100-250 µm

    Tabell 1: Kriterier för att identifiera fartygstyper

    Discussion

    En utmaning för vaskulär studier efter SCI är en teknisk begränsning eftersom traditionella tekniker är till stor del begränsade till vaskulär struktur förändringar i efter döden prover. Denna roman i vivo imaging ovan beskrivna metoden möjliggör dynamisk mätning av blodflöde och relaterade parametrar (hastighet och fartyget diameter) med 2 P-LSM i levande råttor. Det gör också upprepad undersökning i samma uppsättningar av fartyg vid olika tidpunkter efter contusive SCI. Föregående 2-foton mikroskopi avbildningstekniker kunde inte fånga posttraumatisk vaskulära strukturer på grund av läckage av ett enda spårämne. Vår duo-färg design möjliggör dynamisk vaskulär imaging för traumatisk modeller. Dessutom ger flexibiliteten i denna metod en möjlighet att generera en temporal-spatial profil av akut vaskulära förändringar efter SCI.

    Det finns flera kritiska steg i vår i vivo duo-color imaging metod. Det första är det grundläggande att säkerställa fysiska stabiliteten av ryggmärgen före time-lapse imaging, särskilt minska andning motion artefakt. Vi designat formen av spinal klämmor att höja höjden av spinal kotan något under stabilisering. Förflyttning av ryggmärgen korrelera till andas djuret kan således vara kraftigt minskat (figur 1 d-F, 2B). Det är rekommenderat att kontrollera stabiliteten i ryggmärgen före början av varje bildsession. Om ryggmärgen misslyckas att uppnå stabilitet bör justeringen göras till justering och täthet av ryggmärgen klämmor. Andra, perifer vävnad (ben, muskel lager och hud) blödning i fönstret imaging riskerar förorening av vyn. För en smidig bildsession, bör gelfoam och vävnad självhäftande lim tillämpas på den omgivande vävnaden för effektivt förebyggande. Tredje, de fluorescerande färgerna vi väljer har en liknande storlek som albumin (66 kDa), som är det huvudsakliga hög molekylvikt blod plasma proteinet. Homeostatiska villkor behölls till stor del färgämnena inuti fartyget liknande som albumin28. Efter skadan, färgämnena passerade störd endotelfunktion struktur och läckte ut i parenkymet, orsakar en betydande ökad fluorescerande intensitet i området perifer vaskulatur (figur 3F-G). Dessutom finns det två skäl till varför vi väljer yttre halsvenen kateterisering. Det kan först ge en konsekvent tillgänglig rutt för leverans när som helst på experimentet. För det andra kan det användas som en rutt för framtida behandling injektion.

    Även om våra i vivo duo-färg metod är att skapa en ny mötesplats för traumatisk vaskulär imaging studier, måste några varningar angående denna teknik åtgärdas. För närvarande, denna teknik är utformad för att bedöma vaskulära förändringar vid 2 tidpunkter (baseline och 1 efter skada tidpunkt), men det är möjligt att växla till flera tidpunkter om ytterligare fluorescerande färger och kanaler är tillgängliga. Det finns flera studier med inopererade glasfönster för kronisk intravital imaging, kan ingen av dem ge originalplansinformation på samma fartyg efter traumatisk skada19,29,30, 31,32. Till skillnad från dessa studier är våra fönster ett no-glas fönster. Detta är bekvämt för före och efter skada imaging, men det kan vara utmanande för att återupprätta fönstret för långsiktig observation. Vår framtida forskning arbetar på den tekniska förbättringen för kronisk avbildning. Det vaskulära systemet består av flera fartygstyper (artär, ven och kapillär) och alla är olika aspekter av morfologi och funktion. Differentiering mellan fartygstyper under imaging kan bidra till att locka fram ett tydligt mönster av vaskulära förändringar. Protokollet ovan beror på observatören att identifiera fartyg baserat på Morfologi och hastighet; dock kan en artär-specifika färgämne enkelt läggas för att ge en mer definitiv klassificering mellan fartyget typer33.

    Denna teknik är inte bara begränsat till bedömningar på contusive och andra traumatiska modeller, såsom crush skada och strålning skada, men också på studier med fokus på störningar av BSCB, samt som vaskulär permeabilitet förändringar. Förutom SCI, kunde det användas för att studera de vaskulära förändringar efter andra neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateralskleros (ALS) och multipel skleros (MS). Dessutom kan det vara överförbar till en transgena djurmodeller studera dynamiska neurovaskulära interaktionen. Som ett kraftfullt screeningverktyg, kunde framtida studier utnyttja den imaging teknik som beskrivs här för att bedöma effekten av behandling av ryggmärgsskador.

    Avslutningsvis är i vivo duo-färg metod en pålitlig, realtid, in-vivo strategi verktyg för att bedöma dynamisk vaskulära förändringar, vilket är idealiskt för karakterisering av temporal-spatial vaskulär profil och screening för behandlingar för att minska sekundära skador efter SCI.

    Disclosures

    Författarna har något att avslöja.

    Acknowledgments

    Detta arbete var stöds delvis av NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit granskning Award I01 BX002356 från US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ryggmärgen och hjärnan skada Research Foundation ( ISCBIRF) av Indiana State Department of Health (019919) och Mari Hulman George kapitalfonder.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. (2016).
    2. Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24, (5), 254-264 (2001).
    3. Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17, (10), 915-925 (2000).
    4. Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59, (4), 606-619 (2006).
    5. Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (1), 23-27 (2016).
    6. Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11, (10), 1678-1684 (2016).
    7. Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164, (3), 837-843 (1987).
    8. Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86, (3), 483-492 (1997).
    9. Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2, (3), 197-200 (1974).
    10. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49, (6), 844-853 (1978).
    11. Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32, (2), 260-268 (1993).
    12. Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103, (1), 34-40 (1989).
    13. Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24, (3), 492-507 (2007).
    14. Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27, (4), 403-408 (2005).
    15. Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22, (3), 332-341 (2009).
    16. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (20), 8473-8478 (2011).
    17. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4, (2), e22 (2006).
    18. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7, (6), e38590 (2012).
    19. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
    20. Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10, (2), 84-94 (2002).
    21. Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
    22. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220, (1), 9-22 (2009).
    23. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
    24. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
    25. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25, (10), 1227-1240 (2008).
    26. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
    27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
    28. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
    29. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
    30. Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
    31. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
    32. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, (1), 1-7 (2008).
    33. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9, (3), 273-276 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics