組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

Immunology and Infection

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Summary

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。

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Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

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Abstract

レトロ ウイルス プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) のインテグラーゼ (IN) タンパク質は、レトロ ウイルスの統合のメカニズムを研究するためのモデル酵素です。他のレトロ ウイルスからのに比べて、PFV ではより水溶性と実験操作に向いています。さらに、臨床的に関連するひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の阻害剤、PFV での触媒機構がウイルス相補的 DNA (cDNA) ターゲットの共有結合に参加する HIV 1 インチのすることに似ていることを示唆しているに敏感です。プロセスの DNA では、ストランドの転送と呼ばれます。この鎖転移反応は、ターゲット DNA にニックを紹介します。統合反応生成物の分析は、同様にニック DNA 核酸の存在によって混同することができます。細菌ヌクレアーゼは、組換え PFV のエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 単位で共同浄化するために示されています。ここでヘパリン親和性クロマトグラフィーによる汚染のヌクレアーゼから PFV を分離する手法について述べる。分数は、スーパーのプラスミドと agarose のゲルの電気泳動のヌクレアーゼの混入のため簡単に上映されます。PFV および汚染のヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズ統合の一括生化学的または単一分子解析に適した遺伝子組換え PFV のヌクレアーゼ フリーの準備を許可するため代替の親和性を表示します。

Introduction

蛋白質 DNA 相互作用の生化学的および単一分子の研究は、非常に純粋な組換えタンパク質を必要とします。これらのアッセイの結果を隠すことが汚染細菌の核酸分解酵素。汚染ヌクレアーゼは、組換えタンパク質酸素スカベン ジャー プロトカテク酸--3, 4-ジオキシゲナーゼ (PCD) とエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌)1から分離したプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) インテグラーゼ (IN) の準備で発見されています。,2,3

レトロ ウイルスの統合の試金は、活動4の対策としてスーパー コイル DNA の刃こぼれしたりリニア製品への変換に依存します。細胞の感染ではウイルスの cDNA の 2 つの端をホスト クロマチン5に結合します。反応に参加する各端は、ストランドの転送と呼ばれます。アッセイの組換えの活動参加 2 つの DNA オリゴマー協調統合反応4,5,6,7,8でターゲット DNA に終了ウイルスの cDNA を模倣しました。また遺伝子組換えでは、非生理関連の半分サイト統合反応9,10で一端のみの DNA を結合するかもしれない。スーパー プラスミッド DNA のターゲットである統合、共同統合製品は、線形 DNA と半分のサイト統合製品は、リラックスしたサークル。これら反応生成物は agarose のゲルの電気泳動の1中の相対移動によって識別されます。遺伝子組換え汚染ヌクレアーゼ持ち、スプリアスのリラックスしたサークルや実験結果を混乱可能性線形プラスミッドがあるでしょう。ウイルスの DNA オリゴマーは、決定的ヌクレアーゼ製品ではなく、統合製品を識別するために蛍光に分類することがあります。ただしで大きくスーパー DNA ターゲットを支持します。スーパー プラスミドをリラックスしたサークルや汚染ヌクレアーゼによる線形 DNA の損失は結果とデータ11の解釈を歪めます。こうして準備でレトロ ウイルスから細菌の核酸を削除することが不可欠です。

PFV では、ヘパリン セファローズ細菌ヌクレアーゼ1と比較して、異なる親和性を持ってください。PFV とヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズから線形勾配溶出によって切り離されるかもしれない。ヌクレアーゼは、280 nm のピーク時に紫外線 (UV) 吸収すること分析ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって容易には検出されません。代わりに、ヌクレアーゼ スーパー プラスミドのリラックスしたサークルやリニア製品への変換を用いたヌクレアーゼ活性検出します。各分画ヘパリン セファローズ クロマトグラフィーを次のヌクレアーゼ活性テストされます。PFV とヌクレアーゼ汚染モノ Q 陰イオン樹脂の親和性には違いがあります。モノ S 陽イオン樹脂の親和性の差があります。しかし、細菌のヌクレアーゼと PFV のモノ S 解像度はタンパク質の効率的な分離を許さなかった。最終的には、ヘパリン セファローズ親和性の浄化は PFV IN から細菌ヌクレアーゼの最高の分離を提供して無制限の量の利点をいます。

ヌクレアーゼ活性の汚染のためのテストは、他の蛋白質に適応させること。興味の蛋白質は PFV の; より代替親和性特性に可能性が結合の関心とヌクレアーゼ汚染タンパク質の特性の違いは経験的に決まります。ヌクレアーゼの混入を識別するためのこの方法はモノ S 陽イオンまたはモノラル Q 陰イオン交換樹脂を含むその他の樹脂に適応させること。親和性とイオン交換樹脂クロマトグラフィー中タンパク質の量に制限のない核酸の汚染からの興味の組換えタンパク質を分離するための信頼できる方法があります。

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Protocol

1. 誘導 PFVエシェリヒア属大腸菌に表現で

  1. 大腸菌BL21(DE3) pLysS の 20 μ L に PFV の発現プラスミド (10 ng/μ L) の 1 μ L を追加 (市販の細胞の 20 μ 因数が > 2 × 106 CFU/μ g のプラスミド) 1.5 mL チューブに。指タップまたはフリック チューブでそっと混ぜます。孵化で氷の 5 分。
    1. まさに 30 衝撃を熱 42 ° C の水のお風呂と 2 分間氷にすぐに戻ります。
    2. カタボライト抑制 (SOC) メディアで室温超最適スープの 80 μ L を追加します。225 回転/分 (rpm) 揺れと 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
    3. 100 mm × 15 mm シャーレ ルリア スープ (LB) 寒天の 25 mL を含む混合物の 25 μ L をプレート (1 L LB 寒天: 15 g 寒天 10 g 食塩 5 g 酵母エキス、バクト トリプトン 10 g) と 100 μ g/mL アンピシリン (100 mg/mL 原液)。
    4. 第 2 同一プレート上の変換セルの残りの 75 μ L をプレートします。37 ° C で一晩を蓋板を孵化させなさい
  2. プレートを取得変換大腸菌。LB の 3 mL を接種する単一コロニーを使用 (1 L LB: 10 g, 塩化ナトリウム 10 g、イースト 5 g、バクト トリプトンの抽出) ポリプロピレン文化 14 mL 丸底チューブの 100 μ g/mL アンピシリンと補われます。225 rpm の揺れで 37 ° C で 8 ~ 時間孵化させなさい。
    1. 文化の 3 mL を 50 mL LB 100 μ g/mL アンピシリンと 250 mL の三角フラスコに 34 μ g/mL クロラムフェニ コール (34 mg/mL 原液) 補足に追加します。225 rpm の揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。
    2. 1 L LB、100 μ g/mL アンピシリン、クロラムフェニ コール μ g/mL 34 4 L 三角フラスコに文化の 53 mL に転送します。225 rpm の揺れで 37 ° C で孵化させなさい。
    3. 600 の光学濃度を測定定期的に文化の nm (外径600)。最初に、すべての h 文化外径600を確認します。文化目的 OD600に達すると、ないにはびこるに 15 分毎に確認してください。0.9 と 1.0 の間の OD600に文化を育てなさい。文化の温度を下げ、旋回し、フラスコを氷浴に転送します。
  3. SDS-PAGE 分析の変化によって文化の 1 mL を 1.5 mL チューブを後で分析に転送します。
    1. 室温で 14,000 x g でおよび microfuge で 1 分間遠心分離によって 1.5 mL チューブに細胞をペレットします。上清を捨てます。ピペッティングで 150 μ L リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でペレットを再懸濁します。PBS は、CaCl2と MgCl2なしまたは可能性があります。
    2. SDS-PAGE サンプルバッファー x 2 の 150 μ L を追加 (150 mM トリス-HCl、pH 6.8, 1.2% SDS 0.0018% ブロモフェノール ブルー、15% β-メルカプトエタノール (βME) 30% グリセロール) とピペットまたは渦流によって徹底的にミックスします。3 分で店-20 ° C の沸騰
  4. 細菌培養に追加: 最終濃度 0.25 mM イソプロピル-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG、0.25 M 原液) と 50 μ M ZnCl2 (50 mM 原液)。IPTG は T7 プロモーターから PFV遺伝子の発現を誘導して PFV インチ加温直後 4 h 225 rpm で振とうしながら 25 ° C で文化のアミノ ターミナル亜鉛フィンガー ドメインの正しい折りたたみのための補足として ZnCl2を追加フラスコを氷浴に転送します。1.3 で上記のように同じプロトコルの SDS-PAGE 解析の文化の 1 mL を保存します。
  5. 適切に大きさで分類された遠心ボトルに細菌培養を転送します。たとえば、1 L 文化は 4 滅菌使い捨て 250 mL コニカル底ポリプロピレン ボトルに転送する可能性があります。3000 × g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵卓上遠心でボトルをスピンします。注ぐことによって培養上清を捨てます。
    1. ピペッティングで 25 mL (ボトルあたり 6.25 mL) 冷 PBS (CaCl2と MgCl2有無にかかわらず) の容量 1 L 培養からペレットのすべてを再懸濁します。結合し、細菌懸濁液を 50 mL の円錐管に転送します。3,000 x g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵遠心でスピンします。注ぐまたはピペットで上澄みを廃棄します。
  6. ピペットで 10 mL 再懸濁バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) プロテアーゼ阻害剤) の細菌のペレットを再懸濁します。スナップは、50 mL のチューブを水没する十分な液体窒素デュワー フラスコにチューブを配置することによって、ペレットを凍結します。慎重に液体窒素からチューブを削除し、-80 ° C で保存
    注意: 細菌のペレットは、-80 ° C で数ヶ月間保存します。我々 は次の 2 年間-80 ° C のストレージのアクティブなタンパク質のロスを見なかった。
  7. サンプルの分析前誘導期およびポスト誘導 8.3 cm、幅 7.3 cm、高さ 0.75 mm 厚 SDS-PAGE ゲル層を積層 1.5 mL 6% ポリアクリルアミドゲルで (125 mM トリス-HCl、pH 6.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 6% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed) と 3.5 mL の 10%ポリアクリルアミド層の解決 (375 mM トリス-HCl、pH 8.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 10% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed)12
    1. スタッキングのゲルを注入後 10 よく櫛を挿入します。ゲルが重合したときページ装置を組み立てるし、十分な SDS-PAGE 実行バッファー (25 mM トリス、グリシン 192 mM、0.1 %sds) を追加します。
    2. 各サンプルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。16.5 V/cm 染料フロント約 60 分のゲルの底に到達するまで実行します。
    3. ゲル板を分解し、ゲルをプラスチック製の浴槽に転送します。Coomassie ブリリアント ブルー染色液 (0.1 %coomassie 鮮やかな青い R-250、40% メタノール、10% 酢酸) 惜しみなくゲルをカバーし、室温で 20 分間染色を追加します。
    4. 染色液を注ぐことによって削除し、置換後の文字列は、ソリューション (40% メタノール、酢酸 10%) をすすぐバンドがすぐに表示されるまで。注ぐことによって脱染め色液を削除し、脱イオン水で置き換えます。PFV の後誘導サンプルで簡単に識別されます。PFV hexahistidine タグと持ち 47374 Da の分子量。
    5. PFV でが表示されない場合は、変換プレートの 1 つから別のコロニーから始まる誘導を繰り返します。

2. ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー

  1. 氷の上の 1 つの細菌ペレットを解凍します。
    注: これは重要な時間 (約 2-3 時間) かかります。ペレットは、セル スラリーを解凍して、追加の 500 μ M PMSF (100 mM 原液) を追加します。
  2. 氷のスラリー菌 50 mL のチューブをしてください。30 の 30% 振幅で細菌を超音波 s (1 s、1 オフ s)、超音波発生装置を用いた 0.125 インチ直径 0.5 インチ直径バイオ ホーン 1 L 文化から派生したペレットあたりテーパ陰極、周波数 20 kHz、最大電力 400 W
  3. 冷たい遠心チューブに細胞サンプルを転送します。ポリカーボネート ボトル アセンブリ (直径 25 mm、高さ 89 mm) タイプ 60 Ti 固定角ロータと互換性があるを使用します。同じ引力力が達成された場合は、代替管とローターを使用できます。4 ° C で 60 分スピン 120,000 x g明白なペレットがあります。上清は黄色の色にあります。
  4. 注ぐまたは冷たい 50 mL の円錐管にピペットで上澄みを転送します。ボリュームに注意してください。このボリュームは、約凍結スナップ前に使用される再懸濁バッファーのボリュームをする必要があります。粘性上清の場合は、クロマトグラフィー コラムを詰らせることができる細菌の DNA によって汚染される可能性があります。この場合は、バクテリアの DNA をペレットに遠心を繰り返します。
  5. 500 ml (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M PMSF) をバッファーと 500 mL バッファー B (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M 200 ミリメートル イミダゾール, PMSF)。
    このプロトコルの注意: タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム、すべてのバッファー、サンプルで寒い部屋 4 ° C。
    1. 滅菌フィルター バッファー A と B 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニット。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と A のバッファーとバッファー B ポンプ B を洗います。導電率、UV 測定値が安定するまでシステムをフローと 10% 90% バッファー A バッファー B。最大流量、道具に依存します。5 mL/min の流量、最大圧力 1.0 MPa まで使用です。
  6. 110 mm 長く、5 mm 径 FPLC 列 1.5 mL ニッケル充電樹脂の準備 (最大結合容量 50 mg/mL、最大圧力 1 MPa)。列は、精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。
  7. FPLC 計測器にカラムを接続します。0.5 MPa の最大圧力リミットを 10% バッファー B (20 mM イミダゾール) 0.5 mL/min の流速で 90% バッファー A の 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。
  8. 0.5 MPa の最大圧力制限で 0.15 mL/min の流量で列に蛋白質のサンプル (ペレットあたり 〜 10 mL) をロードします。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL のチューブの流れを収集します。
    1. コラムを洗浄 20 ml の 10% と 90% のバッファーはバッファー B. 収集 50 mL のチューブで、洗浄。20 mL 線形グラデーション 10 ~ 100% のバッファー B (20 mM 200 mM のイミダゾールから) とタンパク質を溶出します。
    2. 5 mL 100% のバッファー B (イミダゾール 200 mM) を最後に、洗い流します。グラデーションと最終的な洗浄を収集0.27 mL 分数
  9. 流れ、洗浄、およびピーク A280分数の 15 μ L と 2 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 15 μ L を組み合わせます。3 分のサンプルを沸騰させます。
    1. SDS ページのゲル 1.6 ステップを除く 15 よく櫛で前述 2 つの 10% を準備します。各サンプルをゲルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。実行、汚れ、および 1.6 の手順で説明するように、ゲルを分析します。
    2. ほぼ純粋な PFV の目視検査に基づくを含む表示分数を組み合わせます。通常 8-10 mL のピペットで、量を測定します。
    3. 分光光度計を使用すると、結合された分数の A280を測定し、PFV のタンパク質の総量を計算私たちの典型的な収量は、誘導文化の L あたり 〜 10 mg です。Hexahistidine タグと PFV での消散係数は 59360 cm-1 M-1です。
  10. Hexahistidine タグを削除するには、PFV の 10 mM ジチオトレイトール (DTT、1 M 原液) と 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 (0.5 M 原液) を補足します。4 ° C で一晩 mg PFV インチ加温当たりライノ (HRV) 3 C プロテアーゼの 15 μ g を追加します。胸の谷間と 44394 Da 47374 Da から PFV の分子量が低減され 10 %sds-page 解析による検証可能性があります。

3. ヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー

  1. 250 ml バッファー C (50 mM トリス-HCl, pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M PMSF) と 250 mL のバッファー D (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M, PMSF 1 M NaCl)。
    注意: このプロトコルで FPLC システム、バッファー、およびサンプルが保管 4 ° C で寒い部屋。
    1. 滅菌フィルター バッファー C と 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニットと D。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と C バッファーとバッファー D ポンプ B を洗います。導電性、紫外線測定値が安定するまでバッファー C 80% と 20% のバッファー D システムを介してを流れ。最大流量、道具に依存します。我々 は、最高圧力 1.0 MPa までと 5 mL/min の流速を日常的に使用します。
  2. 80 mm 長く、5 mm 直径 FPLC 列 1 ml のヘパリン セファローズ樹脂 (最大吸着容量 2.0 mg ウシのアンチトロンビン III の 1 mL あたりの樹脂; 最大圧力 1.4 MPa) を準備します。列を精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。FPLC 計測器にカラムを接続します。
    1. 1 mpa 最大圧力制限付きバッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl) 0.5 mL/min の流速で 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。
  3. 1.5 ボリューム c. バッファーを追加することによって PFV のサンプルで 200 mM の NaCl 濃度を減らすたとえば、バッファー C の 15 mL を 10 mL PFV インチ追加します。合計ボリュームは通常 ~ 25 mL です。
  4. 負荷最大圧力 0.5 mL/分の流量でヘパリン セファローズ列に希薄 PFV のサンプルは、1.0 MPa を制限します。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL の円錐管に流れを収集します。
    1. 洗浄バッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl)、20 mL の列は 50 mL の円錐管に洗浄を収集します。(1 M の NaCl を 200 mM)、30 mL の線形グラデーション 20 ~ 100% のバッファー D 列を溶出します。
    2. 0.37 mL の一部分で 100% 収集バッファー D. グラデーションと最終的な洗浄の 5 ml カラムを洗浄します。
  5. 8 割負荷、流れ、洗浄、および分数を分析 SDS-PAGE 2.9 に記載。PFV の次の hexahistidine タグの胸の谷間が 44394 Da の分子量と消散係数 59360 cm-1 M-1 hexahistidine タグなしのまま。ヌクレアーゼの分析が完了するまで 4 ° C ですべての分数を格納します。

4. ヌクレアーゼ アッセイ

  1. 分画ヘパリンと 50 のほぼ純粋な PFV インチを組み合わせる 3 μ L が含まれるヘパリン セファローズ分数を識別する 3 kb の ng スーパー プラスミド DNA 反応バッファー (10 mM HEPES、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4、4 μ M ZnCl2、10 mM DTT) 15 μ L の最終巻で。ない PFV インチで 90 分含む陰性対照の 37 ° C で孵化させなさい
    1. 1 mg/mL, プロテイナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) と 0.5 %sds を停止 (10% 原液)。1 h. サンプルは、後で分析のための-20 ° C で保存されるかもしれないのは、37 ° C で孵化させなさい。
  2. 0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイド (10 mg/mL 原液)13で 1 x TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose あたり 1% の重量のジェル 125 mL を準備します。アガロース溶液を溶融し、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイに注ぐ。5 mm、幅 0.75 mm 厚井戸と 15 も櫛を挿入します。細い井戸には、1.5 mm 厚井戸と比較してより良いバンド解像度が得られます。常温で固化するゲルを許可します。
    1. 1 のゲルを浸す 0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイドで x TAE。ヌクレアーゼ アッセイ反応にローディングの染料 (50% のグリセロール、0.15% オレンジ G 染料) x 6 の 3.5 μ L を追加します。ゲルに全体のボリュームをロードします。常温 1 時間またはオレンジ G 染料前ゲルの端に達するまで cm (100 V)/10 v 定電圧でゲルを実行します。
  3. すぐにエチジウム ブロマイドを検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。3 kb で線形 DNA サイズに該当する実行、スーパー コイル DNA を高速 (~ 2 kb) を実行し、リラックスした環状 DNA が遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。
    1. 画像解析ソフトを使用して、各レーンのスーパー、線形、およびリラックスした円のプラスミッドのピクセル量を計算します。これらの 3 つの DNA フォーム"総 DNA"ボリューム値し、線形とリラックスしたサークルの割合を計算を使用してピクセルの合計を呼び出します。たとえば、リラックスしたサークルのピクセル量は車線の合計 DNA ピクセル値で分割、この数を 100 パーセントを決定するために掛けます。汚染ヌクレアーゼを含む分数は、陰性対照と比較して線形とリラックスの円のより高いパーセントを表示します。
  4. 汚染のヌクレアーゼ活性を表示しないヘパリン セファローズ分数を組み合わせます。6-8 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 透析チューブ 50 mM トリス-HCl、pH 7.5、200 mM の NaCl、50 μ M ZnCl2、10 mM DTT、20% のグリセロールの 1 L に対して一晩 4 ° C で 10 mm の dialyze します。
  5. ヌクレアーゼ フリー PFV のサンプルを透析チューブから回復します。A280を測定し、最終的なタンパク質濃度を計算します。因数とスナップは、液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。

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Representative Results

組換え PFV でしばしば細菌ヌクレアーゼ1で汚染されています。生化学的統合の試金はスーパー プラスミド DNA のリラックスした円とリニア製品への変換の量子化によって異なります。これらのアッセイのスプリアス定量汚染ヌクレアーゼの存在可能性があります。Hexahistidine タグを持つ PFV での式はエシェリヒア属大腸菌(図 1) に誘導される、まずニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2) で精製します。ほぼ純粋な PFV の分数を組み合わせるし、hexahistidine タグがプロテアーゼにより切断されます。PFV のと汚染のヌクレアーゼにヘパリン セファローズ クロマトグラフィー (図 3)1の異なる親和性があることを定めています。次のヘパリン セファローズ クロマトグラフィー PFV の分数はリラックスしたサークルのために試金するスーパー プラスミッドおよび線形プラスミッドのヌクレアーゼ活性 (図 4) の製品と孵化させます。この試金はヌクレアーゼ (図 5) なし蛋白の同定を可能します。これらの画分が結合し、透析、今後の実験計画の凍結の可能性があります。

Figure 1
図 1:大腸菌内で PFV の誘導。(2 車線) の前に文化からの細胞し、の 47374 PFV の da サンプルの有無を分析 (3 車線) 誘導後 10% によって分かれていた SDS ページし、鮮やかなブルーのステンド グラスします。レーン 1、分子量マーカー (kDa)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー分数。水溶性細菌 lysates はニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって分かれていた。PFV の hexahistidine タグでは、20 mM 200 mM のイミダゾールからの線形グラデーションで溶出しました。分数は 10% によって評価された SDS ページし、鮮やかなブルーのステンド グラスします。PFV の 47374 Da (負荷) の列に読み込まれるサンプルで容易に感じ取ることができますが以下の流れを感じ取るまたは洗浄。イミダゾール グラデーションの早い段階でよく溶出画分 25 kDa 以下でいくつかの高速のモビリティの汚染物質と同様、75 kDa 付近より遅い移動汚染物質を表示します。イミダゾールの高濃度ではないすぐに明白な汚染物質、PFV の比較的純粋なようであります。この例では分数 #33 #84 を組み合わせて、更に精製します。分子量マーカー (kDa) は各ゲルの左側にいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: PFV でのヘパリン セファローズ クロマトグラフィー1 。Hexahistidine タグのニッケルの親和性とプロテアーゼの除去、次 (44394 Da) で PFV ヘパリン セファローズに分画しました。タンパク質は、200 mM から 1 M の NaCl への線形グラデーションで溶出させた。分数 #12 に #44 は、SDS-PAGE 染色 Coomassie 青い 8% によって評価されました。分子量マーカー (kDa) は各ゲルの左側にいます。これらの画分は、ヌクレアーゼ活性を調べた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:ヘパリン セファローズ分数のヌクレアーゼ アッセイ1 。各ヘパリン セファローズ画分は、スーパー プラスミド DNA に追加されました。分数を図 3に示すようにそれらを関連付けます。次の孵化、ヌクレアーゼ反応 deproteinated、エチジウム ブロマイドで 1% アガロースゲルで区切られました。否定的なコントロールにはないタンパク質 (ターゲットのみ) と野生型 PFV のヌクレアーゼ (PFV の WT) の自由に知られているの以前の精製プラスミド DNA が含まれます。ヌクレアーゼ活性を汚染する肯定的な制御は以前浄化触媒不活性 PFV の汚染ヌクレアーゼ (PFV の D128N) を持っている知られています。DNA サイズ マーカーが kb 単位で表示されます。スーパー プラスミド (SC)、線形プラスミッド (L)、およびリラックスした円 (RC) が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ヌクレアーゼ アッセイの定量1。 Agarose のゲルがスキャンされたとピクセル値のスーパー (SC)、線形 (L) は、各レーンのリラックスしたサークル (RC) バンドの定量を行った。分数は図 3 および図 4 に示すようにそれらを関連付けます。線形およびリラックスしたサークルの割合を算出したピクセル値と方程式を表示。たとえば、ピクセル値分数 #12 のバンド: 817636 スーパー プラスミド、50467 線形プラスミッド、112052 リラックス円。分数 #12 の DNA ピクセル値の合計は、980155、これらの値の合計です。線形 DNA の割合は 50467 割合を乗じたし、5.1% と等しい総 DNA の値で割った値です。リラックスしたサークルの割合は、112052 100 を掛けて、11.4% と等しい総 DNA の値で割った値です。線形とリラックスしたサークルの割合の合計は 16.5% です。ネガティブ コントロール プラスミッド DNA ないタンパク質 (で、下のグラフ) では、プラスミドのこの準備に線形またはリラックス円として合計 DNA の 4.4% が含まれていることを示します。2 番目の否定的なコントロールは、野生型 PFV の (WT) 線形またはリラックス円として合計 DNA の 8.6% を表示の以前の精製でした。これら 2 つのコントロールの車線が傷ついたり、線形プラスミッド PFV インチと基板だけで現在のバック グラウンド レベルを示す肯定的な制御は、以前の精製触媒不活性 PFV の (D128N) 線形落ち着いたサークルとして総 DNA の 23% を持っていたのです。ヘパリン セファローズ分数 # 22 #12 にさらされる DNA の結果 > 線形落ち着いたサークルとして DNA の 10%。この例では、分数 #24 に #42 表示 < 10% 変換線形およびリラックスしたサークルに。これらの画分を組み合わせ、透析。因数は凍結され、将来使用するため-80 ° C で保存します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

DNA 修復タンパク質 1 分子顕微鏡アプリケーション、またはレトロ ウイルス integrases の酸素スカベン ジャーなど DNA と相互作用する組換えタンパク質は汚染細菌核酸2,3の無料する必要があります。これらの汚染物質は、一括生化学的または単一分子アッセイ中に結果の解釈を混乱させるかもしれません。

我々 は、細菌のヌクレアーゼ頻繁共同浄化 PFV インチで発見しました。ただし、PFV のヌクレアーゼの細菌汚染物質1と容易に区別がヘパリン セファローズに親和性が表示されます。ヌクレアーゼ フリー PFV の調製に重要な各分画ヘパリン セファローズから次のグラジエントのヌクレアーゼ活性の注意深い定量です。グラデーションはヌクレアーゼ汚染; から PFV の分離を許可するように十分に浅いである必要があります。急な勾配は、効率的な分離と互換性がないでしょう。さらに、プラスミド DNA 基板ヌクレアーゼ アッセイの背景を減らすためにリラックスしたサークルの割合が低いこと。プラスミド DNA の基板にリラックスした円の高い背景がある場合新しい精製プラスミド DNA が行わなければなりません。ヌクレアーゼ活性測定法では、汚染のヌクレアーゼと破棄する必要があります分数の存在を明らかにします。

場合によっては、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) 汚染ヌクレアーゼ2の除去のための効果的な方法があります。前のグループは、PFV の4の浄化中に秒を使用しています。秒限られた負荷量があり最終的なタンパク質濃度を低減する傾向があります。親和性およびイオン交換クロマトグラフィーの主な利点は、秒よりも大きくボリュームをロードする能力

ヌクレアーゼ活性のテスト細菌ヌクレアーゼと共同浄化の異なった蛋白質に適応させること。ここで、我々 はその PFV を識別して汚染ヌクレアーゼはヘパリン セファローズ クロマトで分離することがあります。我々 は以前 PFV のいるモノ S 陽イオンとこのタンパク質に適さないこれらの樹脂を作るモノ Q 陰イオン交換クロマトグラフィ ヌクレアーゼと同様のプロファイルにします。ヌクレアーゼに関連して目的タンパク質のアフィニ ティーの特性に応じてアフィニティまたはイオン交換樹脂とグラジエントこのプロトコルを使用することがあります。興味の蛋白質からヌクレアーゼの混入の効果的な除去にキーは、樹脂に対して親和性の違いです。各画分は、ヌクレアーゼ活性の試金する必要があります。このプロトコルのクロマトグラフィー樹脂は可能性があります細菌の核酸の浄化共同すべての蛋白質に直接適用されません。ただし、関心のヌクレアーゼ活性の試金すること画分タンパク質から、ヌクレアーゼを分離するアフィニティまたはイオン交換樹脂を使用しての全体のコンセプトは広く適用できる可能性があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

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References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

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