האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

החלבון integrase (ב) של רטרווירוס אב טיפוס קצפית וירוס (PFV) הוא אנזים מודל לימוד המנגנון של retroviral אינטגרציה. בהשוואה ל- IN של רטרווירוסים אחרים, PFV IN הוא מסיס יותר נוטה יותר מניפולציה ניסויית. בנוסף, הוא רגיש מעכבי IN הרלוונטית קלינית וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), רומז כי מנגנון PFV IN קטליטי דומה כי של HIV-1 ב- IN IN מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי DNA משלימים (cDNA) למטרה DNA בתהליך שנקרא העברה strand. כזאתי העברה סטרנד מציג ניקס יעד ה-DNA. ניתוח של אינטגרציה התגובה מוצרים יכול להיות מבולבל על ידי הנוכחות של nucleases שניק באופן דומה ה-DNA. נוקלאז חיידקי הוכח לטהר במשותף עם רקומביננטי IN PFV לידי ביטוי Escherichia coli (e. coli). כאן אנו מתארים שיטה לבודד PFV ב מ נוקלאז משחיתה מאת הפארין כרומטוגרפיית זיקה. שברים מוקרנים בקלות עבור נוקלאז זיהום עם פלסמיד supercoiled, agarose בג'ל. ב PFV ו נוקלאז משחיתה את להציג הזיקות חלופי עבור sepharose הפארין ומאפשר נוקלאז ללא הכנת IN PFV רקומביננטי מתאים לניתוח ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר של אינטגרציה.

Introduction

מחקרים ביוכימיים, רווק מולקולה של אינטראקציות חלבון עם ה-DNA דורשים חומרים טהור במיוחד. מזהם nucleases מחיידקים, ניתן להסתיר את התוצאות של מבחני אלה. נוקלאז מזהמים נמצא בתוך ההכנות של חומרים חמצן נבלות protocatechuate-3,4-dioxygenase (יהלומים), אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV) integrase (ב) מבודד Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.

שילוב retroviral מבחני להסתמך על ההמרה של ה-DNA supercoiled עצור או ליניארי מוצרים כאמצעי של פעילות4. במהלך זיהום הסלולר ב מצטרף בשני קצותיו של cDNA ויראלי כרומטין מארח5. בכל קצה מצטרף התגובה נקרא העברה strand. מבחני של recombinant ב פעילות יכול להצטרף oligomers דנ א שני מחקה את cDNA ויראלי נגמר אל יעד ה-DNA אינטגרציה מתואמת תגובה4,5,6,7,8. לחלופין IN רקומביננטי עשוי להצטרף קצה דנ א אחד רק9,10תגובה אינטגרציה שאינה פיזיולוגית הרלוונטיים באתר חצי. כאשר הדנ א פלסמיד supercoiled היעד של אינטגרציה, אינטגרציה מתואמת המוצרים הם לליניארית דנ א, חצי אתר שילוב מוצרים עיגולים רגועה. מוצרים אלה התגובה מזוהים על ידי ניידות היחסי שלהם במהלך agarose ג'ל אלקטרופורזה1. אם IN רקומביננטי של נוקלאז מזהמים, יהיה כדין עיגולים רגועה או על פלסמיד ליניארית יכול להיות מבלבל את תוצאות הניסוי. נגיפי DNA oligomers עשוי להיות מסומן fluorescently באופן סופי לזהות מוצרים אינטגרציה, בניגוד נוקלאז מוצרים. עם זאת, ב מאוד טובות מטרות DNA supercoiled; אובדן של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או DNA ליניארי על ידי מזהמים נוקלאז יכול להטות תוצאות ופרשנות של נתונים11. לכן יש הכרח להסיר את nucleases חיידקי retroviral בהכנות.

ב PFV יש זיקה שונה עבור sepharose הפארין בהשוואה של נוקלאז חיידקי1. ב PFV, את נוקלאז עשוי להיות מופרדים של • תנאי מעבר צבע ליניארי של הפארין sepharose. נוקלאז אינה מזוהה בקלות על-ידי של ספיגת אולטרה סגול (UV) בשיא 280 ננומטר או נתרן אנליטית dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). במקום זאת, נוקלאז מאותרים על ידי assay פעילות נוקלאז העסקת את ההמרה של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או מוצרים. כל שבר בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה נבדק נוקלאז פעילות. ב PFV את הזיהום נוקלאז יש הבדל אהדה עבור מונו-Q אניון שרף. יש הבדל קטן אהדה עבור מונו-S הקטיון שרף. עם זאת, הרזולוציה מונו-S של נוקלאז חיידקי ו PFV לא תאפשר הפרדה יעילה בין החלבונים. בסופו של דבר, הפארין sepharose זיקה טיהור מציע ההפרדה הטוב ביותר של נוקלאז חיידקי מ PFV IN ויש לו היתרון של נפח בלתי מוגבל.

בדיקה של מזהם נוקלאז פעילות עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. החלבון עניין סביר להניח יש זיקה חלופי מאפיינים מאשר ב PFV; ההבדל מחייבים המאפיינים של החלבון של עניין את הזיהום נוקלאז להיקבע מדעית. מתודולוגיה זו לזיהוי נוקלאז הזיהום עשוי להיות מותאם כדי אחרים שרפים כולל הקטיון מונו-S או מונו-Q אניון exchange שרפים. זיקה, יונים שרפים עשויים להציע שיטה אמינה כדי לבודד חלבון רקומביננטי עניין ובלחות nucleases ללא מגבלות באמצעי האחסון של חלבון במהלך כרומטוגרפיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לגרום PFV בביטוי e. coli

  1. להוסיף 1 μL של PFV של הביטוי פלסמיד (10 ng/μL) 20 μL של e. coli BL21(DE3) pLysS (aliquot μL 20 תאים זמינים מסחרית יש > עונה 2 פרק 106 CFU/μg פלסמיד) צינור 1.5 מ ל. מערבבים בעדינות על ידי האצבע הקשה או להרים את השפופרת. דגירה על קרח 5 דקות.
    1. מחממים הלם עבור בדיוק 30 s בהלעפה תרוטרפמט 42 רשמים, מיד ולחזור קרח למשך 2 דקות.
    2. מוסיפים 80 μL מרק סופר מיטבית בטמפרטורת החדר עם מדיה הדיכוי (SOC) catabolite. תקופת דגירה של h 1 הלעפה תרוטרפמט 37 עם 225 סיבובים לדקה (סל ד) רועדת.
    3. צלחת μL 25 של התערובת על 100 מ"מ x 15 מ"מ פטרי המכיל 25 מ של אגר מרק (LB) לוריא (אגר LB 1 ליטר: 10 גרם מה נשארתי-טריפטון, 10 גרם NaCl, תמצית שמרים 5 g, 15 גרם אגר) ו μg/mL 100 אמפיצילין (פתרון מניות 100 מ"ג/מ"ל).
    4. צלחת של μL 75 הנותרים של התאים טרנספורמציה על צלחת זהים השני. דגירה הצלחות עם עפעפיו למטה לילה ב 37 º C.
  2. אחזר את הצלחות של טרנספורמציה e. coli. השתמש שמושבה בודדת כדי לחסן 3 מ"ל של ליברות (1 ליטר LB: 10 גרם של מה נשארתי-טריפטון, 10 גרם של NaCl, 5 גר' שמרים לחלץ) בתוספת אמפיצילין μg/mL 100 צינור פוליפרופילן תרבות התחתון עגול 14-mL. תקופת דגירה של ~ 8 h הלעפה תרוטרפמט 37 עם סל"ד 225 רועדת.
    1. הוסף את 3 מ"ל של תרבות 50 מ ל LB בתוספת 100 אמפיצילין μg/mL ו 34 μg/mL כלורמפניקול (פתרון המניה 34 מ"ג/מ"ל) ב- 250 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק. דגירה התרבות בין לילה ב 37 ° C עם סל"ד 225 רועדת.
    2. העברת mL 53 של תרבות ליברות, אמפיצילין μg/mL 100 כלורמפניקול μg/mL 34 בבקבוקון Erlenmeyer 4 L של 1 ליטר. דגירה ב 37 ° C עם סל"ד 225 רועדת.
    3. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של תרבות מעת לעת. בתחילה, בדוק התרבות יתר600 כל h. כפי התרבות מגיע ה OD הרצוי600, בדוק בכל 15 דקות והדבר לא. לגדול התרבות יתר600 בין 0.9 1.0. להעביר את הבקבוקון אמבטיית קרח ו מערבולת כדי להפחית את הטמפרטורה של התרבות.
  3. העבר 1 מ"ל של התרבות צינור 1.5 mL לניתוח בשלב מאוחר יותר על-ידי denaturing מרחביות-דף ניתוח.
    1. גלולה התאים בצינור 1.5 mL על ידי צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- microfuge ב g x 14,000 בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר בתוך 150 μL פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) על ידי pipetting. טוב, מגניב יכול להיות עם או בלי CaCl2 ו- MgCl2.
    2. להוסיף 150 μL של 2 x מרחביות-דף לדוגמה מאגר (150 מ מ טריס-HCl, pH 6.8, 1.2% מרחביות, גליצרול 30%, 15% β-mercaptoethanol (βME), bromophenol 0.0018% כחול) ומערבבים היטב על ידי pipet או מערבולת. מרתיחים 3 מינימלית החנות ב-20 ° C.
  4. להוסיף התרבות חיידקי: ריכוז סופי של 0.25 mM איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, פתרון מניות 0.25 מ') ו- 50 μM ZnCl2 (פתרון מניות 50 מ מ). IPTG גורם ביטוי של הגן PFV IN של האמרגן T7 ונוספת ZnCl2 כתוספת עבור קיפול נכונה של תחום אצבע אבץ מסוף אמינו ב PFV IN. Incubate התרבות 25 ° c ברעידות-225 rpm עבור 4 h מיד להעביר את הבקבוקון אמבטיית קרח. שמור 1 מ"ל של תרבות לניתוח מרחביות-דף בעקבות באותו פרוטוקול לעיל ב- 1.3.
  5. להעביר את התרבות חיידקי בקבוקים צנטריפוגה בגודל מתאים. לדוגמה, תרבות 1 ליטר עשוי להיות מועבר התחתון חרוט סטרילי חד פעמי 250 מ ל ארבעה בקבוקים פוליפרופילן. לסובב את הבקבוקים ומפרידה שולחן קירור ב 3000 x g עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. להתעלם supernatants על ידי מזיגת.
    1. . Resuspend את כל כדורי מתרבות חיידקי 1 ליטר בהנפח הכולל של 25 מ ל (6.25 מ"ל לכל בקבוק) PBS קר (עם או בלי CaCl2 ו- MgCl2) על ידי pipetting לשלב ולהעביר את המתלים חיידקי שפופרת חרוט אחת של 50 מ. ספין ומפרידה בקירור ב 3000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע על ידי מזיגת או pipetting.
  6. Resuspend בגדר חיידקי במאגר resuspension 10 מ"ל (50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, ו- 500 מעכב פרוטאז של phenylmethylsulfanoxide (PMSF) μM) על ידי pipetting. הצמד להקפיא בגדר על ידי הנחת הצינור בבקבוקון דיואר עם חנקן נוזלי מספיק. להציף את הצינור 50 מ. בזהירות להסיר את הצינורית של חנקן נוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדורי חיידקי ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב-80 מעלות צלזיוס. ראינו אין איבוד חלבון פעילים בעקבות אחסון-80 מעלות צלזיוס במשך שנתיים.
  7. לנתח הדגימות אינדוקציה קדם ומעגל שלאחר ידי 8.3 ס מ רוחב, 7.3 ס מ, 0.75 מ מ עבה מרחביות-דף ג ' לים עם 1.5 מ ל 6% לזיהוי לערום שכבה (125 מ מ טריס-HCl, pH 6.8, 6% אקרילאמיד, 0.1% מרחביות, 0.1% קירור, 0.001% TEMED) ו 3.5 מ ל 10% לזיהוי לפתרון השכבה (375 מ"מ טריס-HCl, pH 8.8, 10% אקרילאמיד, 0.1% מרחביות, 0.1% קירור, 0.001% TEMED)12.
    1. לאחר יציקת הג'ל הערמה, הכנס מסרק טוב 10. כאשר הג'ל יש polymerized, להרכיב את המנגנון דף, וכן להוסיף עמודים מרחביות מספיק פועל מאגר (25 מ"מ טריס, גליצין 192 מ מ, 0.1% מרחביות).
    2. לטעון μL 10 של כל דגימה ו- 4 μL של חלבון prestained תקנים. הפעל ב 16.5 V/ס מ עד לחזית צבע מגיע לתחתית של הג'ל, כ- 60 דקות.
    3. לפרק את הצלחות ג'ל ולהעביר את הג'ל לאמבט פלסטיק. הוסף Coomassie מבריק כחול מכתים פתרון (0.1% R-250 כחול מבריק Coomassie, 40% מתנול, 10% חומצה אצטית) בנדיבות לכסות את הג'ל, כתם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להסיר את הפתרון מכתימים על ידי מזיגת, החלף destain פתרון (40% מתנול, 10% חומצה אצטית) עד להקות גלויים בקלות. להסיר את הפתרון destaining על ידי מזיגת ולהחליף מים יונים. PFV IN צריך ניתן לזהות בקלות במדגם שלאחר אינדוקציה. ב PFV עם תג hexahistidine יש משקל מולקולרי של 47374 Da.
    5. אם PFV IN אינה גלויה, חזור על אינדוקציה החל מושבה שונה מאחד הצלחות טרנספורמציה.

2. ניקל כרומטוגרפיית זיקה

  1. הפשרת צניפה חיידקי אחד על קרח.
    הערה: זה ייקח זמן ניכר (כ 2-3 h). בגדר יש הקרת slurry תא, מוסיפים נוספים 500 μM PMSF (פתרון מניות 100 מ מ).
  2. שמור הצינור 50 מ של חיידקים slurry על קרח. Sonicate החיידק ב 30% משרעת ב-30 s (1 s ב, 1 s הנחה) לכל גלולה נגזר מתרבות 1 L באמצעות sonicator עם קרן ביו בקוטר 0.5 ס מ בקוטר סנטימטר 0.125 צמצום microtip, תדירות של 20 kHz, כוח מרבי של 400 W.
  3. להעביר את הדגימה תא צינור ultracentrifuge קר. השתמש פוליקרבונט הבקבוק הרכבות (בקוטר 25 מ מ, גובה 89 מ מ) תואמת ל- Ti 60 סוג זווית קבועה רוטור. צינורות חלופי ורוטרים עשוי לשמש אם באותו כוח הכבידה מושגת. ספין g 120,000 x עבור 60 דקות ב 4 º C. צריך להיות גלולה ברור. תגובת שיקוע ייתכן צבע צהוב.
  4. להעביר את תגובת שיקוע על ידי מזיגת או pipetting אל צינור חרוטי קר 50 מ. הערה האחסון; אמצעי אחסון זה צריך להיות כ הנפח של מאגר resuspension בשימוש לפני snap קפוא. אם תגובת שיקוע צמיגה, זה עשוי להיות מזוהמים על ידי חיידקי ה-DNA אשר יכול לסתום את העמודה כרומטוגרפיה. במקרה זה, חזור על ultracentrifugation כדי הצניפה ה-DNA חיידקי.
  5. הכנת 500 מ"ל מאגר של (50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 500 μM PMSF) ו- 500 מ"ל B מאגר (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 500 μM PMSF, imidazole 200 מ"מ).
    הערה: ב פרוטוקול זה, לשמור את המערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) של חלבון מהיר, מאגרי כל המדגם ב 4 ° C בחדר קר.
    1. מאגרי מסנן סטרילי A ו- B 0.2 יחידות סינון חד פעמיות μm. בהתאם למערכת FPLC, לשטוף משאבת, משאבת B עם מאגר A ו- B מאגר, בהתאמה. זרימה 90% מאגר A ו-10% B מאגר דרך מערכת עד מוליכות ועל קריאות UV לייצב. קצב זרימת המקסימום יהיה תלוי על הכלי; השתמש קצב זרימה של 5 mL/min עם מגבלה מרב הלחץ של 1.0 מגפ ס.
  6. להכין 110 מ מ ארוך, 5 מ מ בקוטר FPLC עמודה עם שרף טעונה ניקל 1.5 mL (קיבולת מקסימלית איגוד 50 מ"ג/מ"ל, מקסימום לחץ 1 מגפ ס). העמודה עשויה להיות מוכן יום לפני טיהור ומאוחסנים ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
  7. לחבר את העמודה הכלי FPLC. Equilibrate את העמודה עם 20 מ של 90% מאגר A ו-10% B מאגר (20 מ מ imidazole) בספיקה של 0.5 mL/min עם מגבלה מרב הלחץ של 0.5 מגפ ס. המכשיר צריך להיות איסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ו- UV ספיגת ב 280 ננומטר (280). מוליכות ועל קריאות UV אמור לייצב. אם הקריאות האלה לא התייצבו, המשך זרימה מאגרים דרך העמודה עד הם יציבים.
  8. לטעון את הדגימה חלבון (~ 10 מ"ל לכל גלולה) אל העמודה בקצב הזרימה של 0.15 mL/min עם מגבלה מרב הלחץ של 0.5 מגפ ס. הלחץ עמודה וקצב זרימת נשארת זהה במהלך הטיהור. לאסוף את הזרם דרך צינור 50 מ.
    1. לשטוף את העמודה עם 20 מ ל 90% מאגר A ו-10% לאסוף מאגר B. לשטוף את צינור 50 מ ל. Elute את החלבונים עם מעבר צבע ליניארי 20 מ"ל של 10% עד 100% B מאגר (20 מ ל-200 מ מ imidazole).
    2. לבסוף, יש לשטוף את העמודה עם 5 מ ל 100% B מאגר (imidazole 200 מ"מ). לאסוף לשטוף את הדרגה והאחרון ב שברים 0.27 mL-
  9. לשלב 15 μL 2 x מרחביות-דף לדוגמה מאגר עם 15 μL של הזרם דרך, לשטוף, ושברים פיק א280 . מרתיחים את הדגימות למשך 3 דקות.
    1. להכין שני 10% מרחביות-דף ג ' לים כפי שתואר לעיל בשלב 1.6 פרט עם 15 מסרקים היטב. לטעון 10 μL של כל דגימה ל ג'לים ו- 4 μL של חלבון prestained תקנים. לרוץ, כתם, ולנתח את ג'ל כפי שמתואר בשלב 1.6.
    2. לשלב שברים שמופיעים כדי להכיל IN PFV טהור המבוסס על בדיקה ויזואלית. למדוד את עוצמת הקול על-ידי pipetting, בדרך כלל 8-10 מ"ל.
    3. שימוש ספקטרופוטומטרים, למדוד את A280 של שברים משולבים, לחשב את הסכום הכולל של חלבון PFV; התשואה טיפוסי שלנו הוא ~ 10 מ ג לליטר תרבות המושרה. המקדם הכחדה של PFV IN עם התגית hexahistidine הוא 59360 ס מ-1 מ'-1.
  10. כדי להסיר את התג hexahistidine, תוספת IN PFV עם dithiothreitol 10 מ מ (DTT, פתרון מניות 1 מ') ו- 0.1 מ מ EDTA, pH 8.0 (פתרון מניות 0.5 M). להוסיף μg 15 של ריינו-וירוס אנושי (HRV) ג 3 פרוטאז לכל מ"ג PFV IN. Incubate הלעפה תרוטרפמט 4 בן לילה. פצילות מפחיתה את המשקל המולקולרי PFV IN 47374 Da כדי דה 44394, ניתן לבירור על ידי ניתוח מרחביות-דף 10%.

3. הפארין כרומטוגרפיית זיקה

  1. להכין 250 מ ל C מאגר (50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ DTT, 0.1 מ מ EDTA, 500 μM PMSF) ו- 250 מ ל מאגר D (50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ"מ DTT, 0.1 מ"מ EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    הערה: ב פרוטוקול זה, FPLC מערכת מאגרי, דוגמת שמורים בתוך חדר קר ב- 4 הלעפה תרוטרפמט.
    1. מסנן סטרילי מאגרי C ו- D עם 0.2 יחידות סינון חד פעמיות μm. בהתאם למערכת FPLC, לשטוף משאבת, משאבת B עם מאגר C ו- D מאגר, בהתאמה. זרימה 80% מאגר C ו-20% D מאגר דרך המערכת עד המוליכות, UV שהקריאות יתייצבו. קצב זרימת המקסימום יהיה תלוי על הכלי; אנו משתמשים באופן שגרתי קצב זרימה של 5 mL/min עם מגבלה מרב הלחץ של 1.0 מגפ ס.
  2. להכין 80 מ מ ארוך, 5 מ מ בקוטר FPLC עמודת עם 1 מ"ל של הפארין sepharose שרף (מקסימום מחייב יכולת 2.0 מ ג של שור שרף השלישי antithrombin לכל mL; מקסימום לחץ 1.4 MPa). העמודה עשויה להיות להכין יום לפני טיהור ומאוחסנים ב 4 º C. לחבר את העמודה הכלי FPLC.
    1. Equilibrate את העמודה עם 20 מ ל 80% מאגר C ו-20% D מאגר (200 מ מ NaCl) בספיקה של 0.5 mL/min עם מגבלה מרב הלחץ של 1 מגפ ס. המכשיר צריך להיות איסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ו- UV ספיגת ב 280 ננומטר (280). מוליכות ועל קריאות UV אמור לייצב. אם הקריאות האלה לא התייצבו, המשך זרימה מאגרים דרך העמודה עד הם יציבים.
  3. להפחית את ריכוז NaCl הדגימה PFV IN עד 200 מ"מ על-ידי הוספת אמצעי אחסון 1.5 מאגר ג לדוגמה, להוסיף 15 מ"ל של מאגר C IN PFV 10 מ"ל. הנפח הכולל שלנו היא בדרך כלל ~ 25 מ.
  4. טעינה הדגימה PFV IN מדולל על העמודה sepharose הפארין בקצב זרימת 0.5 mL/min בלחץ המרבי להגביל 1.0 מגפ ס. הלחץ עמודה וקצב זרימת נשארת זהה במהלך הטיהור. לאסוף את הזרם דרך צינור חרוטי 50 מ.
    1. לשטוף העמודה עם 20 מ ל 80% מאגר C ו-20% D מאגר (200 מ מ NaCl), איסוף לשטוף את צינור חרוטי 50 מ. Elute את העמודה עם מעבר צבע ליניארי 30 מ של 20% עד 100% D מאגר (200 מ"מ עד 1 M NaCl).
    2. לשטוף העמודה עם 5 מ ל 100% מאגר ד לאסוף לשטוף את הדרגה והאחרון בחלקים מ 0.37.
  5. לנתח עומס, לזרום, לשטוף, שברים ידי 8% מרחביות-דף כמתואר ב- 2.9. ב PFV בעקבות המחשוף של התג hexahistidine יש משקל מולקולרי של 44394 Da ונשאר המקדם הכחדה 59360 ס מ-1 מ'-1 ללא תג hexahistidine. לאחסן כל שברים-הלעפה תרוטרפמט 4 עד להשלמת וזמינותו נוקלאז.

4. נוקלאז assay

  1. זיהוי שברים sepharose הפארין שמופיעים כדי להכיל כמעט טהור μL PFV IN. לשלב 3 של שבר הפרין ו- 50 ng של 3 kb מאגר דנ א פלסמיד supercoiled בתגובה (10 מ מ HEPES, pH 7.5, 110 מ מ NaCl, 5 מ מ MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 מ מ DTT) עם נפח סופי של 15 μL. דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט במשך 90 דקות כלול פקד שלילי עם PFV אין ב- IN.
    1. לעצור את התגובה עם 1 מ"ג/מ"ל proteinase K (פתרון מניות 20 מ"ג/מ"ל) מרחביות 0.5% (10% הפתרון מניות). דגירה ב 37 ° C עבור דגימות ה 1 ניתן לאחסן ב-20 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.
  2. הכנת ג'ל 125 מ של 1% משקל לכל אמצעי אחסון (w/v) agarose במאגר x TAE 1 (40 מ"מ טריס-אצטט, 1 מ מ EDTA) עם 0.1 µg/mL אתידיום ברומיד (פתרון מניות 10 מ"ג/מ"ל)13. להמיס את הפתרון agarose ויוצקים למגש הליהוק ג'ל 15 ס"מ, 10 ס"מ. הכנס מסרק טוב 15 עם 5 מ מ רחב, 0.75 מ מ עבה וולס. וולס דק תשואות רזולוציה להקה טובה יותר בהשוואה ולס בעובי 1.5 מ מ. לאפשר את הג'ל שבמהלכו בטמפרטורת החדר.
    1. לטבול את הג'ל 1 x TAE עם µg/mL 0.1 אתידיום ברומיד. מוסיפים 3.5 μL של 6 x טוען צבען (50% גליצרול, צבע כתום G 0.15%) נוקלאז assay לתגובות. לטעון את אמצעי האחסון כולו לג'ל. הפעל את הג'ל עם מתח קבוע, 10 וולט. לכל ס מ (100 וולט) בטמפרטורת החדר למשך 1 h או עד לחזית צבע כתום G מגיע לסוף הג'ל.
  3. תמונה מיד את הג'ל agarose עם סורק פלורסנט מוגדר לזהות אתידיום ברומיד. DNA ליניארי צריך לרוץ נכון גודל ב- 3 kb supercoiled DNA צריך לרוץ מהר יותר (~ 2 kb), מעגל רגועה דנ א צריך לרוץ לאט יותר (~3.5 kb).
    1. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, לחשב את עוצמת פיקסל פלסמיד מעגל supercoiled, לינארי, ונינוחה כל ליין. קוראים את הסכום של הפיקסל אמצעי אחסון עבור אלה DNA שלוש צורות "הדי מוחלטת" ערך ולהשתמש בו כדי לחשב את האחוזים של מעגלים ליניאריים ורגועה. לדוגמה, עוצמת פיקסל עיגולים רגועה מחולק לפי הערך הכולל של פיקסל DNA בנתיב הזה, להכפיל את המספר הזה ב- 100 כדי לקבוע אחוז. שברים המכילים מזהמים נוקלאז להציג אחוז גבוה יותר של מעגלים ליניאריים ורגועה לעומת הפקד שלילי.
  4. לשלב הפארין sepharose שברים שאינם מציגים פעילות נוקלאז משחיתה. Dialyze ב- 10 מ מ 6-8 kDa משקל מולקולרי הקיצוץ (MWCO) דיאליזה אבובים ב 4 ° C בלילה נגד 1 ליטר של 50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 מ מ. DTT, 20% גליצרול.
  5. להתאושש הדגימה PFV IN נוקלאז ללא דיאליזה אבובים. למדוד את A280 ולחשב את ריכוז החלבון הסופי. Aliquot (snap) להקפיא בחנקן נוזלי. חנות aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ב PFV רקומביננטי נגוע לעיתים קרובות עם חיידקי נוקלאז1. שילוב הביוכימי מבחני תלויים כימות תשובתו של פלסמיד supercoiled DNA עיגולים רגועה ומוצרים ליניארי. הנוכחות של נוקלאז מזהמים עלול להוביל כדין כימות של מבחני אלה. הביטוי של PFV IN עם תג hexahistidine המושרה ב e. coli (איור 1), תחילה מטוהרת על-ידי ניקל כרומטוגרפיית זיקה (איור 2). השברים עם טהור ב PFV משולבים, התג hexahistidine הוא ביקע על ידי פרוטאז. אנחנו קבעו כי PFV IN נוקלאז משחיתה את יש הזיקות שונים עבור הפארין sepharose כרומטוגרפיה (איור 3)1. שברים PFV IN בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה מודגרת של פלסמיד supercoiled כדי assay עבור עיגולים רגועה, פלסמיד ליניארית, המוצרים של פעילות נוקלאז (איור 4). Assay זו מאפשרת זיהוי חלבונים שברים ללא נוקלאז (איור 5). שברים אלה עשויים להיות משולב, דיאליזה, קפוא לניסויים עתידיים.

Figure 1
איור 1: אינדוקציה של PFV ב e. coli . תאים מתרבויות לפני (ליין 2), לאחר אינדוקציה (ליין 3) הם ניתחו לנוכחות של דגימות המחוזי PFV ב, 47374 היו מופרדים על ידי 10% מרחביות-דף מוכתם כחול מבריק Coomassie. ליין 1, סמני משקל מולקולרי (kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניקל זיקה כרומטוגרפיה שברים. Lysates חיידקי מסיסים הופרדו באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ניקל. ב PFV עם תג hexahistidine היה eluted עם מעבר צבע ליניארי של 20 מ ל-200 מ מ imidazole. שברים הוערכו ב- 10% מרחביות-דף מוכתם כחול מבריק Coomassie. PFV ב, 47374 דא, בולט לעין במדגם טעון על העמודה (עומס), אבל הוא פחות ניכרת הזרימה או כביסה. בשברים עם elute בשלב מוקדם של המילוי ההדרגתי imidazole בדרך כלל להציג מזהם ניידות איטי יותר בקרבת 75 kDa, כמו גם כמה מזהמים ניידות מהירה יותר או תחתיו 25 kDa. בריכוזים גבוהים של imidazole יש חומציות בולט לעין, PFV IN שנראה יחסית טהור. בדוגמה זו, שברים #33 דרך #84 היו משולבות וטיהרו עוד יותר. סמני משקל מולקולרי (kDa) נמצאים בצד השמאל של כל ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הפארין כרומטוגרפיה sepharose של PFV של 1 . בעקבות ניקל זיקה פרוטאז והסרת של התג hexahistidine, PFV ב (44394 Da) היה fractionated על ידי sepharose הפארין. חלבונים היו eluted עם מעבר צבע ליניארי מ-200 מ מ ל 1 M NaCl. אפילו שברים #12 כדי #44 הוערכו על ידי 8% מרחביות-דף מוכתם Coomassie כחול. סמני משקל מולקולרי (kDa) נמצאים בצד השמאל של כל ג'ל. שברים אלו נבדקו נוקלאז פעילות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נוקלאז וזמינותו של הפארין sepharose שברים 1 . כל שבר sepharose הפארין נוספה supercoiled פלסמיד ה-DNA. שבר מספרים לתאם לאלו המוצגות באיור3. בעקבות דגירה, התגובות נוקלאז deproteinated, מופרדים על-ידי 1% agarose עם אתידיום ברומיד. פקדים השליליים כוללים הדנ א פלסמיד עם אין חלבונים (היעד בלבד) ולטיהור פראי סוג ב PFV שידוע כי של נוקלאז (PFV ב WT) הקודמת. פקד חיובי עבור מזהמות נוקלאז פעילות הוא הוא לטיהור הקודם של catalytically לא פעיל IN PFV מוכרת יש מזהמים נוקלאז (PFV IN D128N). סמני גודל ה-DNA מוצגים ב- kb. פלסמיד supercoiled (SC), פלסמיד ליניארי (L), רגועה עיגולים (RC) מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : כימות של מבחני נוקלאז 1. Agarose ג'לים נסרקו וערכי פיקסלים היו לכמת supercoiled (SC), ליניארי (L) של מעגל רגועה (RC) להקות בנתיב בכל. שבר מספרים תשבחות אלה באיור דמויות 3 ו- 4. האחוזים של מעגלים ליניאריים ורגועה חושבו באמצעות ערכי הפיקסלים המשוואה המוצג. לדוגמה, הפיקסל הערכים עבור הלהקות של שבר #12: פלסמיד supercoiled 817636 50467 פלסמיד ליניארי, עיגולים רגועה 112052. הערך הכולל של פיקסל הדנ א של שבר #12 הוא הסכום של ערכים אלה, 980155. האחוז של DNA ליניארי הוא 50467 מוכפלים ב- 100 עבור האחוז ומופרדים הערך DNA הכולל שווה ב- 5.1%. האחוז של עיגולים רגוע הוא 112052 מוכפלים ב- 100, מחולק לפי הערך DNA הכולל שווה 11.4%. הסכום של מעגל ליניארי ורגועה אחוזי הוא 16.5%. בקרה שלילית פלסמיד DNA עם אין חלבונים (לא IN, הגרף התחתון) מציין כי זו הכנה של פלסמיד כולל 4.4% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי או רגועה. פקד שלילי השני היה טיהור קודמות מסוג הפרוע PFV IN (WT) מוצגים 8.6% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי או רגועה. מנתיבי שליטה שני מצביעים על רמת רקע של עצור או ליניארית פלסמיד הנוכחי עם המצע לבד ועם PFV IN... פקד חיובי הוא הוא לטיהור הקודם של catalytically לא פעיל IN PFV (D128N) אשר היה 23% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי ורגועה. ה-DNA נחשפים הפארין sepharose שברים #12 באמצעות #22, גרמו > 10% של ה-DNA כעיגולים ליניארי ורגועה. בדוגמה זו, שברים #24 #42 מוצגים < 10% המרה מעגלים ליניאריים ורגועה. שברים אלה היו משולבות, דיאליזה. Aliquots היו קפואים, מאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חומרים המקיימים אינטראקציה עם ה-DNA, כגון ה-DNA לתקן חלבונים, אוכלי נבלות חמצן עבור יישומים מיקרוסקופ מולקולה בודדת, או retroviral integrases, צריך להיות חופשי של זיהום חיידקי nucleases2,3. מזהמים אלה עשוי לבלבל את הפרשנות של תוצאות במהלך מבחני ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר.

מצאנו כי נוקלאז חיידקי לעתים קרובות שותף מטהרת עם PFV IN... אולם, ב PFV יציג זיקה sepharose הפארין זה בקלות ניתן להבחנה בין מזהם חיידקי נוקלאז1. המפתח הכנת נטולת נוקלאז PFV IN הוא כימות זהיר של נוקלאז פעילות כל שבר בעקבות • תנאי מעבר צבע מן sepharose הפארין. מעבר הצבע חייב להיות רדוד במידה מספקת כדי לאפשר ההפרדה של PFV ב מ הזיהום נוקלאז; מדרג תלול לא יהיה תואם עם הפרדה יעילה. בנוסף, המצע דנ א פלסמיד צריך להיות אחוז נמוך של עיגולים רגוע כדי להפחית את הרקע של נוקלאז וזמינותו. אם המצע דנ א פלסמיד יש רקע גבוה של מעגלים רגוע, הוא לטיהור החדש של פלסמיד ה-DNA יש לבצעו. נוקלאז פעילות וזמינותו מגלה הנוכחות של מזהמים נוקלאז ושברים זה צריכים להיות מושלך.

במקרים מסוימים, ייתכן גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות) שיטה יעילה להסרת נוקלאז מזהמים2. קבוצות קודמות השתמשו שניה במהלך טיהור של PFV ב4. שניה יש חלל אחסון בנפח מוגבל, נוטה להפחית את ריכוז החלבון הסופי. היתרון העיקרי זיקה, כרומטוגרפיה יונים הוא ביכולת טעינה של אמצעי אחסון גדול יותר באופן משמעותי מאשר לניירות

בדיקות לפעילות נוקלאז עשוי להיות מותאם כדי חלבונים שונים לטהר במשותף עם נוקלאז חיידקי. כאן אנו מזהים את IN PFV, נוקלאז מזהמים עשוי להיות מופרדת באמצעות כרומטוגרפיה sepharose הפארין. אנחנו הראו בעבר כי ב PFV יש פרופיל דומה נוקלאז עם מונו-S הקטיון, מונו-Q אניון חילופי גזים שהופך שרפים אלו מתאים חלבון זה. בהתאם מאפייני זיקה של החלבון הרצוי ביחס נוקלאז, פרוטוקול זה עשוי לשמש עם מעבר צבע • תנאי ושרפים זיקה או יונים. המפתח סילוק יעיל של נוקלאז זיהום של חלבון עניין הבדל אהדה עבור שרף. כל שבר חייב להיות לבדיקה נוקלאז פעילות. שרפים כרומטוגרפיה של פרוטוקול זה עשוי לא להיות ישירות מוחל על כל החלבונים זה לטהר במשותף עם חיידקי nucleases. עם זאת, התפיסה הכוללת של משתמש זיקה או שרף חילוף יונים להפריד את נוקלאז חלבון של עניין assaying שברים לפעילות נוקלאז עשויים לחול באופן כללי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics