Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Recombinante prototype schuimend virus integrase eiwit is het vaak besmet met een bacteriële nuclease tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Deze methode nuclease besmetting identificeert en verwijdert het uit de definitieve opstelling van het enzym.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het eiwit integrase (IN) van het retrovirus prototype schuimend virus (PFV) is een enzym model voor het bestuderen van het mechanisme van retrovirale integratie. In vergelijking met IN van andere retrovirussen, is PFV IN meer oplosbaar en meer vatbaar voor experimentele manipulatie. Bovendien is de gevoelig voor klinisch relevante humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) IN remmers, suggereren dat het katalytische mechanisme van PFV IN vergelijkbaar met is dat van HIV-1 IN. IN katalyseert de covalente verbinding van virale cDNA (cDNA) naar doel DNA in een proces genaamd strand overdracht. Deze reactie van de overdracht deel introduceert nicks aan het DNA van het doel. Analyse van integratie reactieproducten kan worden verward door de aanwezigheid van nucleasen die ook nick DNA. Een bacteriële nuclease heeft aangetoond dat mede zuiveren met recombinant PFV IN uitgedrukt in Escherichia coli (E. coli). Hier beschrijven we een methode om te isoleren PFV IN van de besmettende nuclease door de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Breuken zijn gemakkelijk gescreend nuclease besmetting met een supercoiled plasmide en agarose gel electroforese. PFV IN en de besmettende nuclease weergegeven alternatieve affiniteiten voor heparine sepharose waardoor een nuclease-vrije opstelling van recombinante PFV IN geschikt voor bulk biochemische of één molecuul analyse van integratie.

Introduction

Biochemische en één molecuul studies eiwitinteractie met DNA vereisen uitzonderlijk zuivere recombinante eiwitten. Contaminerende nucleasen van bacteriën kan onzichtbaar maakt de resultaten van deze tests. Een contaminerende nuclease heeft gevonden in de voorbereidingen van recombinante eiwitten zuurstof scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) en prototype schuimend virus (PFV) integrase (IN) geïsoleerde van Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.

Retrovirale integratie testen is afhankelijk van de conversie van supercoiled DNA naar gejat of lineaire producten als een maatregel van IN activiteit4. Tijdens de cellulaire infectie IN sluit zich aan bij de twee uiteinden van een virale cDNA naar de host chromatine5. Elk uiteinde toetreding tot reactie heet strand overdracht. Testen van recombinante IN activiteit kan toetreden twee DNA oligomeren nabootsen van virale cDNA eindigt aan een doelDNA in een onderling afgestemde feitelijke integratie reactie4,5,6,7,8. Als alternatief kunt recombinante IN slechts één DNA einde deelnemen in een niet-fysiologisch relevante halve site integratie reactie9,10. Wanneer supercoiled plasmide DNA de doelstelling van is integratie, gecoördineerde integratie producten zijn gelineariseerde DNA en halve site integratie producten zijn ontspannen cirkels. Deze reactieproducten worden geïdentificeerd door hun relatieve mobiliteit tijdens agarose gel elektroforese1. Als de recombinante IN een contaminerende nuclease heeft, zal er valse ontspannen cirkels of een eventueel gelineariseerde plasmide verwarrend de experimentele resultaten. Virale DNA oligomeren kunnen fluorescently worden aangeduid om overtuigend integratie producten, in tegenstelling tot de nuclease producten vast te stellen. Echter, gunsten sterk IN supercoiled DNA doelstellingen; enig verlies van supercoiled plasmide te ontspannen cirkels of lineaire DNA door contaminerende nuclease kan scheeftrekken resultaten en interpretatie van gegevens11. Het is dus absoluut noodzakelijk om bacteriële nucleasen van retrovirale IN preparaten.

PFV IN heeft een verschillende affiniteit voor heparine sepharose ten opzichte van de bacteriële nuclease1. PFV IN en de nuclease mogen worden gescheiden door een lineaire gradiënt elutie van heparine sepharose. De nuclease is niet gemakkelijk gedetecteerd door een ultraviolet (UV)-absorptie bij 280 nm piek of polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor analytische natrium dodecyl sulfaat. In plaats daarvan wordt de nuclease gedetecteerd door een nuclease activiteit assay met de conversie van een supercoiled plasmide naar ontspannen cirkels of lineaire producten. Elke breuk na heparine sepharose chromatografie is getest voor nuclease activiteit. PFV IN en de nuclease verontreiniging hebben geen verschil in affiniteit voor Mono-Q anion hars. Er is een klein verschil in affiniteit voor Mono-S catie hars. De resolutie van de Mono-S van bacteriële nuclease en PFV IN zou echter niet toestaan dat efficiënte scheiding van de eiwitten. Uiteindelijk, heparine sepharose affiniteit zuivering biedt de beste scheiding van bacteriële nuclease van PFV IN en heeft het voordeel van onbeperkte belasting volume.

Testen voor besmetting van de nuclease activiteit kan worden aangepast aan andere eiwitten. De proteïne van belang zal waarschijnlijk hebben alternatieve affiniteit kenmerken dan PFV IN; het verschil in de kenmerken van de proteïne van belang en de verontreiniging van de nuclease bindend moet empirisch worden bepaald. Deze methodologie voor het identificeren van de nuclease verontreiniging kan worden aangepast aan andere harsen met inbegrip van Mono-S catie of Mono-Q anion uitwisseling harsen. Affiniteit en ionenwisseling harsen kunnen bieden een betrouwbare methode om te isoleren een recombinant proteïne van belang van contaminerende nucleasen met geen limiet op de hoeveelheid eiwit tijdens chromatografie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. het induceren van PFV IN expressie in E. coli

  1. Voeg 1 μL van PFV IN expressie plasmide (10 ng/μl) toe aan 20 μL van E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μL hoeveelheid in de handel verkrijgbare cellen heeft > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in een 1,5 mL-buis. Meng voorzichtig door de vinger te onttrekken of flicking de buis. Incubeer op ijs 5 min.
    1. Verwarm schok voor precies 30 s in een 42 ˚C water bad en dan onmiddellijk terug naar het ijs gedurende 2 minuten.
    2. Voeg 80 l kamertemperatuur super optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (SOC) media. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ˚C met 225 omwentelingen per minuut (rpm) schudden.
    3. Plaat van 25 μl van het mengsel op een 100 x 15 mm petrischaal met 25 mL Luria Bouillon (LB) agar (1 L LB agar: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gistextract, 15 g agar) en 100 μg/mL ampicilline (100 mg/mL stockoplossing).
    4. De resterende 75 μL van de getransformeerde cellen op een tweede identieke plaat plaat. Incubeer de platen met de deksels af overnachting bij 37 ° C.
  2. Ophalen van de platen van getransformeerde E. coli. Gebruik een enkele kolonie om te enten van 3 mL LB (1 L LB: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gist extract) aangevuld met 100 μg/mL ampicilline in een ronde bodem van 14 mL polypropyleen cultuur buis. Incubeer gedurende ~ 8 h bij 37 ˚C met 225 rpm schudden.
    1. Voeg de 3 mL van de cultuur tot 50 mL LB aangevuld met 100 μg/mL ampicilline en 34 μg/mL chlooramfenicol (34 mg/mL stockoplossing) in een conische kolf van 250 mL. Incubeer de cultuur 's nachts bij 37 ° C met 225 rpm schudden.
    2. Breng de 53 mL van cultuur 1 L LB, 100 μg/mL ampicilline en 34 μg/mL chlooramfenicol in een conische kolf van 4 L. Incubeer bij 37 ° C met 225 rpm schudden.
    3. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) van de cultuur periodiek. Aanvankelijk, Controleer de cultuur OD600 elke h. Als de cultuur de gewenste OD600 bereikt, controleren elke 15 min naar niet zijn overwoekeren. De cultuur uitgroeien tot een OD600 tussen 0,9 en 1,0. De kolf overbrengen in een ijsbad en swirl ter vermindering van de temperatuur van de cultuur.
  3. 1 mL van de cultuur overbrengen in een tube 1,5 mL voor latere analyse door denaturering van SDS-pagina-analyse.
    1. De cellen in de buis 1,5 mL pellet door centrifugeren voor 1 min in een microfuge bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 150 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door pipetteren. De PBS kan worden met of zonder CaCl2 en MgCl2.
    2. Voeg 150 l 2 x SDS-pagina monster buffer (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1,2% SDS, 30% glycerol, 15% β-mercaptoethanol (βME), 0,0018% bromophenol blauw) en meng door Pipetteer of vortex. Kook voor 3 min. winkel bij-20 ° C.
  4. Toevoegen aan de bacteriecultuur: een eindconcentratie van 0,25 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M stockoplossing) en 50 μM ZnCl2 (50 mM stockoplossing). IPTG induceert expressie van het PFV IN gen van de T7 promotor en ZnCl2 is toegevoegd als een aanvulling voor de juiste vouwen van een amino terminal zink vinger domein in PFV IN. Incubate de cultuur bij 25 ° C met schudden bij 225 t/min voor 4 h. onmiddellijk de kolf overbrengen in een ijsbad. Sla 1 mL van de cultuur voor SDS-pagina-analyse na hetzelfde protocol zoals hierboven in punt 1.3.
  5. De bacteriecultuur overbrengen in gepaste afmetingen centrifuge flessen. Bijvoorbeeld, kan een 1 L-cultuur worden overgedragen aan vier steriele wegwerp 250 mL conische bodem polypropyleen flessen. Draaien de flessen in een gekoelde tafelblad centrifuge op 3000 x g gedurende 20 minuten op 4 ˚C. Gooi supernatant door gieten.
    1. Resuspendeer alle van de pellets uit een 1 L-bacteriecultuur in een totaal volume van 25 mL (6,25 mL per fles) koude PBS (met of zonder CaCl2 en MgCl2) door pipetteren. Combineer en de bacteriële schorsingen overbrengen in een conische tube van 50 mL. Spin in een gekoelde centrifuge op 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door gieten of pipetteren.
  6. Resuspendeer de bacteriële pellet in 10 mL resuspensie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, en 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteaseinhibitor) door pipetteren. De pellet module bevriezen door het plaatsen van de buis in een maatkolf van Dewar met vloeibare stikstof voldoende te dompelen de tube van 50 mL. Verwijder voorzichtig de buis van vloeibare stikstof en het opslaan van-80 ° C.
    Opmerking: Bacteriële pellets kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden bij-80 ° C. Hebben we geen verlies van actieve eiwit-80 ° C-opslag te volgen voor twee jaar.
  7. Analyseer de pre inductie en na inductie monsters door 8,3 cm breed, 7,3 cm hoog, 0,75 mm dik SDS-pagina gels met 1,5 mL 6% polyacrylamide stapelen laag (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% acrylamide, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumnitraat persulfate, 0,001% TEMED) en 3,5 mL 10% Polyacrylamide oplossen van laag (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% acrylamide, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumnitraat persulfate, 0,001% TEMED)12.
    1. Invoegen na het gieten van de stapelvolgorde gel, een 10 goed kam. De gel heeft polymeervorm, assembleren de pagina apparaat als voldoende SDS-pagina lopende buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS) toevoegen.
    2. 10 μL van elk monster en 4 μL van prestained eiwit normen laden. Uitvoeren vanaf 16,5 V/cm totdat de kleurstof voorkant de onderkant van de gel, ongeveer 60 min bereikt.
    3. Demonteren van de gel-platen en de gel overbrengen in een kunststof kuip. Voeg Coomassie briljant blauw kleurstofoplossing (0.1% Coomassie briljant blauw R-250, 40% methanol, 10% azijnzuur) te royaal dekken de gel en vlek gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder de kleurstofoplossing door het gieten en vervangen met destain oplossing (40% methanol, 10% azijnzuur) totdat bands waarneembaar zijn. Verwijder de destaining oplossing door gieten en vervang met gedeïoniseerd water. PFV IN moet gemakkelijk worden geïdentificeerd in het monster na inductie. PFV IN met een hexahistidine-tag heeft een molecuulgewicht van 47374 Da.
    5. Als PFV IN niet zichtbaar is, herhaal de inductie begint met een andere kolonie van één van de platen van de transformatie.

2. de chromatografie van de affiniteit van de nikkel

  1. Ontdooi een bacteriële pellet op ijs.
    Opmerking: Dit zal heel wat tijd (ongeveer 2-3 uur) duren. Wanneer de pellet heeft ontdooid aan een cel drijfmest, voeg een extra 500 μM (100 mM stockoplossing) PMSF.
  2. Houd de tube 50 mL van bacteriën drijfmest op ijs. Bewerk de bacteriën bij 30% amplitude voor 30 ultrasone trillingen ten s (1 s op 1 s af) per pellet afgeleid van 1 L cultuur met behulp van een ultrasoonapparaat met een 0,5 inch diameter bio hoorn met een diameter van 0,125 inch kegelvormige microtip, een frequentie van 20 kHz en maximaal vermogen van 400 W.
  3. Het monster van de cel overbrengen in een koude ultracentrifuge buis. Het gebruik van polycarbonaat fles assemblages (diameter 25 mm, 89 mm hoogte) compatibel is met een Type 60 Ti vaste hoek rotor. Alternatieve buizen en rotoren mogen worden gebruikt indien dezelfde gravitatie kracht is bereikt. Spin 120.000 x g voor 60 min bij 4 ° C. Er moet een duidelijk pellet. Het supernatant kan een gele kleur hebben.
  4. Breng het supernatant door gieten of pipetteren aan een conische buis van koude 50 mL. Opmerking het volume; Dit volume moet ongeveer de hoeveelheid resuspensie buffer gebruikt voorafgaand aan module bevriezing. Als het supernatant viskeuze is, kan het worden besmet door bacteriële DNA die de chromatografie-kolom verstoppen kan. In dit geval, herhaal de ultracentrifugatie om de bacteriële DNA pellet.
  5. Bereiden van 500 mL Buffer een (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) en 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol).
    Opmerking: In dit protocol, houd het systeem snel eiwit vloeistofchromatografie (FPLC), alle buffers en het monster bij 4 ° C in een koude kamer.
    1. Steriel filter Buffers A en B met 0,2 micrometer wegwerp filter units. Afhankelijk van het FPLC systeem, wassen pomp A en B pomp met A Buffer en Buffer B, respectievelijk. Doorstroming van 90% Buffer A en 10% Buffer B via het systeem totdat de geleidbaarheid en UV lezingen stabiliseren. Het maximale debiet zal afhangen van het instrument; Gebruik een debiet van 5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1.0 MPa.
  6. Bereiden van een 110 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolom met 1,5 mL nikkel-charged hars (maximale bindingscapaciteit 50 mg/mL, maximale druk van 1 MPa). De kolom kan worden voorbereid op de dag vóór de zuivering en opgeslagen op 4 ˚C.
  7. De kolom verbinden met het FPLC-instrument. De kolom met 20 mL 10% Buffer B (20 mM imidazol) bij een snelheid van 0,5 mL/min of 90% Buffer A met een maximale druk limiet van 0,5 MPa equilibreer. Het instrument moet het verzamelen van real-time gegevens van geleidbaarheid en UV-absorptie bij 280 nm (een280). De geleidbaarheid en UV lezingen moeten stabiliseren. Als deze lezingen niet hebben gestabiliseerd, blijven buffers van de stroom door de kolom totdat ze stabiel zijn.
  8. Laad de eiwitSteekproef (~ 10 mL per pellet) naar de kolom op een debiet van 0,15 mL/min met een limiet van de maximale druk van 0,5 MPa. De waterdruk tarief en kolom ongewijzigd gedurende de zuivering. Het verzamelen van de stroom door in een tube van 50 mL.
    1. Was de kolom met 20 mL 90% Buffer A en 10% Buffer B. verzamelen het wassen in een tube van 50 mL. Elueer de eiwitten met een lineair verloop van 20 mL van 10% tot 100% Buffer B (20 mM tot 200 mM imidazol).
    2. Tot slot was de kolom met 5 mL 100% Buffer B (200 mM imidazol). Verzamelen van de kleurovergang en definitieve wassen in breuken van 0,27 mL.
  9. 15 μL van 2 x SDS-pagina monster buffer combineren met 15 μL van de stroom door, wassen en piek A280 breuken. Kook de monsters gedurende 3 minuten.
    1. Twee 10% SDS-pagina gels zoals eerder is beschreven in stap 1.6 behalve met 15 goed kammen voor te bereiden. 10 μL van elk monster naar de gels en 4 μL van prestained eiwit normen laden. Uitvoeren, vlekken en analyseren van de gels, zoals beschreven in stap 1.6.
    2. Combineren van breuken die worden weergegeven bevat bijna pure PFV IN gebaseerd op visuele inspectie. Meet het volume door pipetteren, meestal 8-10 mL.
    3. Met een spectrofotometer, de A-280 van de gecombineerde breuken meten en berekenen van de totale hoeveelheid PFV IN eiwit; onze typische opbrengst is ~ 10 mg per liter van geïnduceerde cultuur. Het uitsterven prestatiecoëfficiënt PFV IN met de hexahistidine-tag is 59360 cm-1 M-1.
  10. Schakel de hexahistidine-tag, een aanvulling op de PFV IN met 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M stockoplossing) en 0.1 mM EDTA, pH 8,0 (0.5 M stockoplossing). Voeg 15 μg van menselijke rhinovirus (HRV) 3C protease per mg PFV IN. Incubate 4 ˚C's nachts. Decolleté vermindert het PFV IN moleculaire gewicht van 47374 Da 44394 da en door 10% SDS-pagina-analyse kan worden geverifieerd.

3. de chromatografie van de affiniteit van de heparine

  1. Bereiden van 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF) en 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Opmerking: In dit protocol, het FPLC systeem, buffers, en steekproef worden bewaard in een koude kamer op 4 ˚C.
    1. Steriel filter Buffers C en D met 0,2 micrometer wegwerp filter units. Afhankelijk van het FPLC systeem, wassen pomp A en B pomp met Buffer C en D van de Buffer, respectievelijk. Stroom 80% Buffer C en 20% Buffer D t/m het systeem totdat de geleidbaarheid en UV lezingen stabiliseren. Het maximale debiet zal afhangen van het instrument; regelmatig gebruiken we een debiet van 5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1.0 MPa.
  2. Bereiden een 80 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolom met 1 mL van heparine sepharose hars (maximale bindingscapaciteit 2,0 mg van runderen antithrombin III per mL resin; maximale druk 1.4 MPa). De kolom kan worden voorbereid op de dag vóór de zuivering en opgeslagen bij 4 ° C. De kolom verbinden met het FPLC-instrument.
    1. De kolom met 20 mL 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl) op een debiet van 0,5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1 MPa equilibreer. Het instrument moet het verzamelen van real-time gegevens van geleidbaarheid en UV-absorptie bij 280 nm (een280). De geleidbaarheid en UV lezingen moeten stabiliseren. Als deze lezingen niet hebben gestabiliseerd, blijven buffers van de stroom door de kolom totdat ze stabiel zijn.
  3. De concentratie van NaCl van het PFV IN monster tot 200 mM verminderen door toevoeging van 1,5 volumes Buffer C. Bijvoorbeeld, voeg toe 15 mL Buffer C op 10 mL PFV IN. Onze totale volume is meestal ~ 25 mL.
  4. Belasting aan de heparine sepharose kolom 0,5 mL/min debiet met maximumdruk verdunde PFV IN monster beperken 1.0 MPa. De waterdruk tarief en kolom ongewijzigd gedurende de zuivering. Het verzamelen van de stroom door in een conische tube van 50 mL.
    1. Was de kolom met 20 mL 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl), het verzamelen van het wassen in een conische tube van 50 mL. Elueer de kolom met een lineair verloop van 30 mL van 20% tot 100% Buffer D (200 mM tot 1 M NaCl).
    2. Was de kolom met 5 mL 100% Buffer D. verzamelen het verloop en definitieve wassen in 0,37 mL breuken.
  5. Analyseren van lading, stroom door, wassen en breuken met 8% SDS-pagina zoals beschreven in 2.9. PFV IN na de splitsing van de hexahistidine-tag heeft een molecuulgewicht van 44394 Da en de coëfficiënt uitsterven blijft 59360 cm-1 M-1 zonder de hexahistidine tag. Bewaren alle breuken op 4 ˚C tot de voltooiing van een test van de nuclease.

4. nuclease assay

  1. Identificeren van heparine sepharose breuken die worden weergegeven bevat bijna pure PFV IN. combineren 3 μL van heparine breuk en 50 ng van 3 kb supercoiled plasmide DNA in reactie buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) met een eindvolume van 15 μL. Incubeer bij 37 ˚C voor 90 min. opnemen een negatieve controle met geen PFV IN.
    1. Stop de reactie met 1 mg/mL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing) en 0,5% SDS (stockoplossing 10%). Incubeer bij 37 ° C voor 1 h. monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor een latere anayse.
  2. Bereiden een 125 mL gel 1% gewicht per volume (w/v) agarose in 1 x TAE buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) met 0,1 µg/mL ethidium bromide (10 mg/mL stockoplossing)13. Smelt de agarose oplossing en giet aan een dienblad van de casting van het gel van 15 x 10 cm. Invoegen van een 15 goed kam met 5 mm breed, 0,75 mm dik wells. Dunne putten levert betere band resolutie ten opzichte van 1,5 mm dikke wells. Laat de gel te stollen bij kamertemperatuur.
    1. Dompel de gel in 1 x TAE met 0,1 µg/mL ethidiumbromide. 3.5 μL van 6 x laden kleurstof (50% glycerol, 0,15% oranje G kleurstof) aan de nuclease assay Reacties toevoegen. Het laden van het gehele volume aan de gel. Stel de gel bij constante spanning, 10 volt per cm (100 V) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of totdat de voorkant van de kleurstof oranje G het einde van de gel bereikt.
  3. Direct het imago van de agarose gel met een fluorescerende scanner ingesteld op het detecteren van ethidiumbromide. Lineaire DNA trouw grootte wordt uitgevoerd bij 3 kb, supercoiled DNA moet sneller (~ 2 kb) worden uitgevoerd en ontspannen cirkel DNA moet langzamer (~3.5 kb) worden uitgevoerd.
    1. Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, het berekenen van het volume van de pixel van de plasmide supercoiled, lineaire en ontspannen cirkel in elke baan. Bel de som van de pixel volumes voor deze drie DNA vormen de "totale DNA" waarde en gebruiken voor het berekenen van het percentage van de lineaire en ontspannen cirkels. Bijvoorbeeld, het volume van de pixel van ontspannen kringen wordt gedeeld door de totale waarde van de pixel van de DNA in dat lane, dit getal te vermenigvuldigen met 100 om te bepalen van een percentage. Breuken die contaminerende nuclease bevatten geeft een hoger percentage van lineaire en ontspannen cirkels in vergelijking met de negatieve controle.
  4. Combineren van heparine sepharose breuken die besmettende nuclease activiteit niet weergeven. Dialyze in 10 mm 6-8 kDa molecuulgewicht cutoff (MWCO) dialyse buis bij 4 ° C's nachts tegen 1 L voor 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glycerol.
  5. Herstellen de PFV IN nuclease-vrije steekproef van dialyse buizen. De A-280 meten en berekenen van de definitieve eiwitconcentratie. Aliquot en module bevriezen in vloeibare stikstof. Winkel aliquots bij-80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Recombinante PFV IN is vaak besmet met een bacteriële nuclease1. Biochemische integratie testen is afhankelijk van de kwantificatie van de omzetting van supercoiled plasmide DNA naar ontspannen cirkels en lineaire producten. De aanwezigheid van een contaminerende nuclease kan leiden tot valse kwantificatie van deze tests. Uitdrukking van PFV IN met een hexahistidine-tag is geïnduceerd in E. coli (Figuur 1) en eerst gezuiverd door chromatografie van de affiniteit van nikkel (Figuur 2). De breuken met bijna pure PFV IN worden gecombineerd en de hexahistidine-tag is gekloofd door een protease. We hebben vastgesteld dat PFV IN en de besmettende nuclease verschillende affiniteiten voor heparine sepharose chromatografie (Figuur 3)1. PFV IN breuken na heparine sepharose chromatografie worden geïncubeerd met een supercoiled plasmide te assay voor ontspannen cirkels en gelineariseerde plasmide, de producten van de nuclease activiteit (Figuur 4). Deze bepaling laat de identificatie van eiwitfracties zonder de nuclease (Figuur 5). Deze fracties kunnen worden gecombineerd, dialyzed en bevroren voor toekomstige experimenten.

Figure 1
Figuur 1: Inductie van PFV IN bij E. coli . Cellen uit culturen vóór lane (2) en na (lane 3) inductie voor de aanwezigheid van PFV IN, 47374 Da. monsters worden geanalyseerd werden gescheiden door 10% SDS-pagina en gekleurd met briljante Coomassie blue. Lane 1, moleculair gewicht markeringen (kDa). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Nikkel affinity chromatografie breuken. Oplosbare bacteriële lysates werden gescheiden door de chromatografie van de affiniteit van de nikkel. PFV IN met een tag hexahistidine was met een lineair verloop van 20 mM tot 200 mM imidazool geëlueerd. Breuken werden beoordeeld door 10% SDS-pagina en gekleurd met briljante Coomassie blue. PFV IN, 47374 Da, is gemakkelijk herkenbaar in het monster geladen naar de kolom ("load"), maar is minder herkenbaar in de stroom door of wassen. Breuken die gewoonlijk vroeg in het verloop van de imidazool Elueer weer een langzamere verontreinigingen van de mobiliteit in de buurt van 75 kDa evenals sommige sneller mobiliteit verontreinigingen op of onder 25 kDa. Bij hogere concentraties van imidazool er zijn geen overduidelijk contaminanten en PFV IN lijkt te zijn relatief zuiver. In dit voorbeeld werden de breuken #33 via #84 gecombineerd en verder gezuiverd. Moleculair gewicht markers (kDa) zijn aan de linkerkant van elke gel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Heparine sepharose chromatografie van PFV IN 1 . Naar aanleiding van nikkel affiniteit en protease verwijdering van de hexahistidine-tag, PFV IN (44394 Da) was gefractioneerde door heparine sepharose. Eiwitten zijn met een lineaire gradiënt van 200 mM naar 1 M NaCl geëlueerd. Zelfs fracties #12 tot en met #44 werden beoordeeld door 8% SDS-pagina gekleurd met Coomassie blue. Moleculair gewicht markers (kDa) zijn aan de linkerkant van elke gel. Deze fracties werden getest voor nuclease activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Nuclease assay van heparine sepharose breuken 1 . Elke fractie heparine sepharose toevoegde aan supercoiled plasmide DNA. Fractie nummers correleren aan die wordt weergegeven in Figuur 3. Na incubatie, de nuclease reacties waren deproteinated en gescheiden door 1% agarose met ethidiumbromide. Negatieve controles omvatten plasmide DNA met geen eiwit (Target Only) en een voorgaande zuivering van wild type PFV IN waarvan bekend is dat gratis nuclease (PFV IN WT). Een positieve controle voor besmetting van de nuclease activiteit is een voorgaande zuivering van catalytically inactief PFV IN die erom bekend te hebben van contaminerende nuclease (PFV IN D128N). DNA-merkers voor grootte worden in kb weergegeven. Supercoiled plasmide (SC), lineaire plasmide (L) en ontspannen cirkels (RC) zijn aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Kwantificatie van nuclease tests 1. Agarose gels zijn gescand en pixelwaarden werden gekwantificeerd voor supercoiled (SC), lineaire (L) en ontspannen cirkel (RC) banden in elke baan. Fractie nummers correleren aan die wordt weergegeven in de figuren 3 en 4. De percentages van lineaire en ontspannen kringen werden berekend aan de hand van de pixelwaarden en de vergelijking komt te staan. Bijvoorbeeld, de pixel waarden voor de bands van breuk #12 zijn: 817636 supercoiled plasmide, 50467 lineaire plasmide en 112052 ontspannen cirkels. De totale waarde van de pixel van de DNA voor fractie #12 is de som van deze waarden, 980155. Het percentage van de lineaire DNA is 50467 vermenigvuldigd met 100 voor het percentage en gedeeld door de totale waarde van de DNA evenaren 5,1%. Het percentage van ontspannen cirkels is 112052 vermenigvuldigd met 100 en gedeeld door de totale waarde van de DNA evenaren 11,4%. De som van de percentages van de lineaire en ontspannen cirkel is 16,5%. Negatieve controle plasmide DNA met geen eiwit (geen IN, onder grafiek) geeft aan dat deze voorbereiding van plasmide 4,4% van het totale DNA als lineair of ontspannen cirkels. Een tweede negatieve controle was een voorgaande zuivering van wild type PFV IN (WT) die 8,6% van het totale DNA als lineair of ontspannen cirkels weergegeven. Deze controle twee rijstroken aangeven het achtergrondniveau van gejat of gelineariseerde plasmide aanwezig met het substraat alleen en PFV IN. Een positieve controle is een voorgaande zuivering van catalytically inactief PFV IN (D128N) die had 23% van het totale DNA als lineaire en ontspannen cirkels. Het DNA blootgesteld aan heparine sepharose breuken #12 tot en met #22 resulteerde in > 10% van het DNA als lineaire en ontspannen cirkels. In dit voorbeeld, breuken #24 tot en met #42 weergegeven < 10% conversie naar lineaire en ontspannen cirkels. Deze fracties werden gecombineerd en dialyzed. Aliquots waren bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Recombinante eiwitten die interactie met DNA, zoals DNA repair eiwitten, zuurstof aaseters voor enkel molecuul microscopie toepassingen of retrovirale integrases, moeten vrij zijn van contaminerende bacteriële nucleasen2,3. Deze verontreinigingen kunnen verwarren de interpretatie van resultaten tijdens bulk biochemische of één molecuul testen.

We hebben gevonden dat een bacteriële nuclease vaak mede met PFV IN. zuivert PFV IN wordt echter een affiniteit voor heparine sepharose die gemakkelijk te onderscheiden van de nuclease bacteriële verontreiniging1is weergegeven. De sleutel tot de voorbereiding van de nuclease-vrije PFV IN is de zorgvuldige kwantificatie van nuclease activiteit in elke fractie na verloop elutie van heparine sepharose. Het verloop moet voldoende ondiep zodat de scheiding van PFV IN van de nuclease verontreiniging; een steile helling zou niet verenigbaar zijn met efficiënte scheiding. Het plasmide DNA substraat moet bovendien een laag percentage van ontspannen cirkels om de achtergrond van de bepaling van de nuclease. Als het substraat plasmide DNA een hoge achtergrond van ontspannen cirkels heeft, moet een nieuwe zuivering van plasmide DNA worden uitgevoerd. De bepaling van de activiteit nuclease blijkt de aanwezigheid van de besmettende nuclease en breuken die moeten worden weggegooid.

In sommige gevallen wellicht grootte uitsluiting chromatography (SEC) een effectieve methode voor het verwijderen van een contaminerende nuclease2. Eerdere groepen hebben SEC gebruikt tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van PFV IN4. SEC heeft een beperkte werklast volume en neigt om de definitieve eiwitconcentratie. Het grote voordeel van affiniteit en ionenwisselingschromatografie is de mogelijkheid om een aanzienlijk groter volume dan de SEC.

Testen voor nuclease activiteit kan worden aangepast aan verschillende eiwitten die samen met een bacteriële nuclease zuiveren. Hier we identificeren die PFV IN en een contaminerende nuclease kan worden gescheiden door heparine sepharose chromatografie. Wij hebben eerder aangetoond dat PFV IN een vergelijkbaar profiel naar de nuclease met Mono-S catie en Mono-Q anion uitwisseling chromatografie deze harsen ongeschikt voor dit eiwit te maken. Afhankelijk van de kenmerken van de affiniteit van het gewenste eiwit ten opzichte van de nuclease, kan dit protocol worden gebruikt met affiniteit of ionenwisseling harsen en kleurovergang elutie. De sleutel tot effectieve verwijdering van verontreiniging van de nuclease uit een proteïne van belang is een verschil in affiniteit voor een hars. Elke fractie moet nuclease activiteit vehiculumcontrolegroep worden. De chromatografie harsen van dit protocol kunnen niet rechtstreeks worden toegepast op alle eiwitten die samen met bacteriële nucleasen zuiveren. Het totale concept van het gebruik van een affiniteit of ionenwisseling hars te scheiden van de nuclease van een proteïne van belang en keuring breuken voor nuclease activiteit kan evenwel breed toepasbare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH AI099854 en de AI126742 sleutel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics