Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

Immunology and Infection

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Summary

Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

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Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

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Abstract

A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.

Introduction

Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.

Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos entalhadas ou lineares como uma medida da atividade4. Durante a infecção celular IN junta-se as duas extremidades do cDNA viral para o anfitrião cromatina5. Cada participante se juntar a reação é denominado transferência de vertente. Ensaios de recombinação na atividade posso juntar dois oligómeros de DNA imitar o cDNA viral termina para um destino de DNA em uma integração concertada reação4,5,6,7,8. Alternativamente IN recombinante pode aderir apenas um final de DNA em um site não-fisiologicamente relevante metade integração reação9,10. Quando supercoiled Plasmídeo é alvo de integração, integração concertada produtos são linearizadas DNA e produtos de integração local metade são círculos relaxados. Estes produtos de reação são identificados por sua mobilidade relativa durante de eletroforese de gel de agarose1. Se o recombinante em tem uma contaminante nuclease, haverá círculos relaxados espúrios ou um plasmídeo linear possivelmente confundir os resultados experimentais. Oligómeros de DNA virais podem ser rotulados fluorescente para identificar conclusivamente produtos de integração, ao contrário de produtos da nuclease. No entanto, em muito favorece supercoiled alvos do DNA; qualquer perda do plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou DNA linear por nucleases contaminantes poderia distorcer os resultados e interpretação de dados11. Assim, é imperativo para remover bacterianas nucleases de retroviral em preparações.

PFV em tem uma diferente afinidade para heparina sepharose comparado ao de nuclease bacteriana1. PFV IN e a nuclease podem estar separadas por uma eluição gradiente linear de heparina-sepharose. A nuclease não é facilmente detectado por uma absorvância (UV) ultravioleta no pico de nm 280 ou por eletroforese em gel de poliacrilamida analítica de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Em vez disso, a nuclease é detectado por um ensaio de atividade nuclease empregando a conversão de um plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou produtos lineares. Cada fração após cromatografia de sepharose heparina é testada para a atividade de nuclease. PFV IN e a contaminação de nuclease não tem nenhuma diferença na afinidade para resina de ânion Mono-Q. Há uma pequena diferença na afinidade para resina de cátion Mono-S. No entanto, a resolução de Mono-S de nuclease bacteriana e em PFV não permitiria eficiente separação das proteínas. Em última análise, purificação da afinidade de sepharose heparina oferece a melhor separação de nuclease bacteriana de PFV IN... e tem a vantagem do volume de carga ilimitada.

Teste para contaminar a atividade de nuclease pode ser adaptada a outras proteínas. A proteína de interesse provavelmente terá características de afinidade alternativos que PFV IN; a diferença de vinculação características da proteína de interesse e a contaminação de nuclease deve ser determinada empiricamente. Esta metodologia para identificar contaminação nuclease pode ser adaptada para outras resinas incluindo cátion Mono-S ou resinas de troca de ânion Mono-Q. Afinidade e troca iônica resinas podem oferecer um método confiável para isolar uma proteína recombinante do interesse de contaminar nucleases sem limites no volume de proteína durante a cromatografia.

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Protocol

1. induzir PFV em expressão em e. coli

  1. Adicionar 1 μL do plasmídeo de expressão IN PFV (10 ng/μL) de 20 μL de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (20 alíquota μL de células disponíveis comercialmente tem > 2 x 106 UFC/μg plasmídeo) em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente pelo dedo tocar ou passar rapidamente o tubo. Incubar em gelo 5 min.
    1. Aqueça o choque por exatamente 30 s em um 42 ˚ c banho de água e em seguida, retornar imediatamente para gelo por 2 min.
    2. Adicione 80 µ l de caldo super ideal de temperatura com meios de repressão (SOC) catabolite. Incube durante 1 h a 37 ˚ c com 225 rotações por minuto (rpm) a tremer.
    3. Placa 25 μL da mistura em uma 100 x 15 mm placa de Petri contendo 25 mL de ágar de caldo (LB) de Luria (ágar-ágar LB 1L: 10 g NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g bacto-triptona, ágar 15 g) e 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solução).
    4. Os restantes 75 μL das células transformadas em uma segunda placa idêntica da placa. Incubar as placas com as tampas para baixo durante a noite a 37 ° C.
  2. Recuperar as placas de transformada Escherichia coli. Usar uma única colônia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de fermento extrato) suplementado com 100 ampicilina μg/mL em um tubo de polipropileno cultura 14 mL de fundo redondo. Encube por ~ 8 h em 37 ˚ c com 225 rpm a tremer.
    1. Adicione a 3 mL de cultura a 50 mL LB suplementado com 100 μg/mL ampicilina e cloranfenicol 34 μg/mL (34 mg/mL de solução) em um Erlenmeyer de 250 mL. Incube a cultura durante a noite a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.
    2. Transferi o 53 mL da cultura para L 1 LB, 100 μg/mL ampicilina e 34 cloranfenicol μg/mL em um frasco de Erlenmeyer de 4 L. Incube a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.
    3. Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura periodicamente. Inicialmente, verifica a cultura OD600 cada h. Como a cultura atinge o desejado OD600, verificar a cada 15 min para não overgrow. Cresce a cultura para uma OD600 entre 0,9 e 1,0. Transferir o balão para um banho de gelo e agite para reduzir a temperatura da cultura.
  3. Transferi 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL para análise posterior por desnaturação análise de SDS-PAGE.
    1. Granule as células no tubo de 1,5 mL por centrifugação por 1 min em uma microcentrífuga a 14.000 x g, à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 150 μL tampão fosfato soro fisiológico (PBS), pipetando. O PBS pode ser com ou sem CaCl2 e MgCl2.
    2. Adicionar 150 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS de 1,2%, 30% de glicerol, 15% de β-mercaptoetanol (βME), 0,0018% bromofenol) e misture bem por pipeta ou vórtice. Ferva por 3 min. loja a-20 ° C.
  4. Adicionar a cultura bacteriana: uma concentração final de 0,25 mM isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, solução estoque de 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (solução de 50 milímetros). IPTG induz a expressão do gene PFV IN o promotor T7 e ZnCl2 é adicionado como um suplemento para o dobramento correto de um domínio do dedo de zinco terminal amino em PFV IN. Incubate a cultura, a 25 ° C com agitação imediatamente a 225 rpm para 4 h. transferi o balão para um banho de gelo. Salve 1 mL da cultura para análise de SDS-PAGE, seguindo o mesmo protocolo como acima no ponto 1.3.
  5. Transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga de tamanho apropriado. Por exemplo, uma cultura de 1L pode ser transferida para quatro garrafas de polipropileno parte inferior cónica estéril descartável 250 mL. Gire as garrafas em uma centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g durante 20 minutos a 4 ˚ c. Descarte os sobrenadantes derramando.
    1. Todas as pelotas de uma cultura bacteriana de 1 L, em um volume total de 25 mL (6,25 mL / frasco) PBS frio (com ou sem CaCl2 e MgCl2) Ressuspender pipetando. Combinar e transferir as suspensões bacterianas para um tubo cónico de 50 mL. Girar numa centrifugadora refrigerada a 3.000 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por derramar ou pipetagem.
  6. Resuspenda o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl e 500 inibidor da protease phenylmethylsulfanoxide (PMSF) μM) por pipetagem. Snap congelar a pelota, colocando o tubo em um frasco de Dewar com nitrogênio líquido suficiente para submergir o tubo de 50 mL. Cuidadosamente Retire o tubo do nitrogênio líquido e armazene a-80 ° C.
    Nota: Pelotas bacterianas podem ser armazenadas por vários meses a-80 ° C. Temos visto sem perda de proteína ativa após armazenamento-80 ° C durante dois anos.
  7. Análise das amostras de pré- indução e pós-indução por 8,3 cm de largura, 7,3 cm de altura, 0,75 mm espessura SDS-PAGE géis com poliacrilamida 6% de 1,5 mL camada de empilhamento (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, persulfato de amónio do acrilamido 6%, 0,1% SDS, 0,1%, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilamida resolvendo camada (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10% do acrilamido, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amónio, 0,001% TEMED)12.
    1. Depois de derramar o gel de empilhamento, inserir um pente bem 10. Quando o gel tem polimerizado, montar o aparato da página e adicionar suficiente buffer corrente de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192mm, 0,1% SDS).
    2. Carrega 10 μL de cada amostra e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Execute a 16.5 V/cm até a frente do corante atinge a parte inferior do gel, aproximadamente 60 min.
    3. Desmontar as placas de gel e gel de transferência para uma banheira de plástico. Adicione Coomassie brilhante azul coloração solução (0,1% R-250 azul brilhante de Coomassie, 40% de metanol, ácido acético a 10%) generosamente cobrir o gel e mancha por 20 min à temperatura ambiente.
    4. Remover a solução de coloração derramando e substituir com destain solução (40% de metanol, ácido acético a 10%) até bandas são facilmente visíveis. Remover a solução de descoloração derramando e substituir com água desionizada. PFV IN devem ser facilmente identificado na amostra pós-indução. PFV em com um tag de hexahistidine tem um peso molecular de 47374 Da.
    5. Se em PFV não estiver visível, repita a indução, começando com uma colônia diferente de uma das placas de transformação.

2. níquel cromatografia de afinidade

  1. Descongele uma pelota bacteriana no gelo.
    Nota: Isso levará um tempo significativo (aproximadamente 2-3h). Quando a pelota descongelou para uma suspensão de células, adicione um adicional de 500 μM PMSF (solução estoque de 100 mM).
  2. Mantenha o tubo de 50 mL de bactérias chorume no gelo. Proceda à sonicação as bactérias em amplitude de 30% para 30 s (1 s na, 1 s fora) por pelota derivada da cultura de 1 L, usando um sonicador com um chifre de bio 0,5 polegada de diâmetro com um diâmetro de 0,125 polegada afilado microtip, uma frequência de 20 kHz e potência máxima de 400 w.
  3. Transferi a amostra de células para um tubo frio se. Use o policarbonato garrafa assemblies (25 mm de diâmetro, altura de 89 mm) compatíveis com um rotor de ângulo fixo tipo 60 de Ti. Rotores e tubos alternativos podem ser utilizados se a mesma força de gravitação é alcançada. Girar a 120.000 x g, durante 60 min a 4 ° C. Deve haver um pellet óbvio. O sobrenadante pode ter uma cor amarela.
  4. Transferi o sobrenadante por derramar ou Pipetar para um tubo cônico de frio 50 mL. Nota o volume; Este volume deve ser aproximadamente o volume de ressuspensão buffer usado antes da congelação de snap. Se o sobrenadante é viscoso, podem estar contaminado por ADN bacteriano que pode obstruir a coluna de cromatografia. Neste caso, repita a ultracentrifugação para o DNA bacteriano de Pelotas.
  5. Preparar 500 mL Buffer uma (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF, imidazol 200 mM).
    Nota: No presente protocolo, manter o sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida, todos os buffers e a amostra a 4 ° C, em uma sala fria.
    1. Buffers de filtro estéril A e B com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com tampão A e B do Buffer, respectivamente. B de Buffer de fluxo 90% A de Buffer e 10% através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; Use uma taxa de fluxo de 5 mL/min com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.
  6. Preparar uma 110 mm, 5 mm diâmetro FPLC coluna com resina de níquel-cobrado 1,5 mL (capacidade de ligação máxima 50 mg/mL, máximo 1 MPa de pressão). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ˚ c.
  7. A coluna Conecte o instrumento FPLC. Equilibrar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% B Buffer (imidazol 20mm) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.
  8. Carrega a amostra de proteínas (~ 10 mL por pelota) para a coluna em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo de 50 mL.
    1. Lavar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% Buffer B. coletar a lavagem em um tubo de 50 mL. Eluir as proteínas com um gradiente linear de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM para imidazole 200 mM).
    2. Finalmente, lave a coluna com 5 mL 100% B Buffer (imidazol 200 mM). Recolher a lavagem final e gradiente em frações de 0,27 mL.
  9. Aliam 15 μL de tampão de amostra SDS-PAGE 2 x 15 μL do fluxo através de lavagem e pico A280 fracções. Ferva as amostras por 3 min.
    1. Prepare dois 10% gel de SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente na etapa 1.6 exceto com 15 pentes bem. Carrega 10 μL de cada amostra para os géis e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Executar, manchar e analisar os geles, conforme descrito na etapa 1.6.
    2. Fracções de combinar que parecem conter quase puro PFV IN baseiam na inspeção visual. Medir o volume de pipetagem, normalmente de 8 a 10 mL.
    3. Usando um spectrophotometer, medir a um280 das frações combinadas e calcular a quantidade total de proteínas em PFV; nosso rendimento típico é ~ 10 mg / L de cultura induzida. O coeficiente de extinção da PFV IN com a tag hexahistidine é 59360 cm-1 M-1.
  10. Para remover a marca de hexahistidine, suplemento PFV IN com 10 mM ditiotreitol (DTT, solução estoque de 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (solução 0,5 M). Adicione 15 μg de protease de 3C rinovírus humano (VFC) por mg PFV IN. Incubate no 4 ˚ c durante a noite. Clivagem reduz o peso molecular PFV IN de 47374 para Da 44394 e pode ser verificada pela análise de SDS-PAGE 10%.

3. cromatografia de afinidade heparina

  1. Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM de EDTA e 500 μM PMSF) e 250 mL de tampão D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Nota: Este protocolo, o sistema FPLC, buffers e amostra são mantidos em uma sala fria no 4 ˚ c.
    1. Filtro estéril Buffers C e D com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com Buffer C e D do Buffer, respectivamente. Fluxo de Buffer C 80% e 20% D reserva através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; rotineiramente usamos uma taxa de fluxo de 5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.
  2. Prepare uma 80 mm, 5 mm diâmetro FPLC de coluna com 1 mL de resina sepharose de heparina (máxima capacidade de ligação 2,0 mg de bovinos antitrombina III / mL da resina; 1,4 MPa de pressão máxima). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ° C. A coluna Conecte o instrumento FPLC.
    1. Equilibrar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.
  3. Reduzir a concentração de NaCl de amostra PFV em 200mm adicionando 1,5 volumes Buffer C. Por exemplo, adicionar 15 mL de tampão C para 10 mL PFV IN. Nosso volume total é tipicamente ~ 25 mL.
  4. A amostra em PFV diluída à coluna de sepharose heparina em taxa de fluxo de 0,5 mL/min com pressão máxima de carga limite 1,0 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo cónico de 50 mL.
    1. Lavar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), coletando a lavagem em um tubo cónico de 50 mL. Eluir a coluna com um gradiente linear de 30 mL de 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).
    2. Lave a coluna com 5 mL de 100% Buffer D. coletar o gradiente e lavagem final em frações de 0,37 mL.
  5. Analisar o fluxo através de carga, lavagem e frações em 8% SDS-PAGE, conforme descrito em 2.9. PFV em clivagem da hexahistidine marca a seguir tem um peso molecular de 44394 Da e o coeficiente de extinção permanece 59360 cm-1 M-1 sem a marca de hexahistidine. Armazene todas as frações no 4 ˚ c até a conclusão de um ensaio de nuclease.

4. ensaio de nuclease

  1. Identificar frações de sepharose heparina que parecem conter quase puro PFV pol. combinar 3 μL de fração de heparina e 50 ng de 3KB supercoiled Plasmídeo em reação buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) com um volume final de 15 µ l. Incubar a 37 ˚ c por 90 min. incluir um controle negativo com nenhum PFV IN.
    1. Parar a reação com 1 mg/mL da protease K (20 mg/mL de solução) e 0,5% SDS (solução a 10% das ações). Incube a 37 ° C por 1 h. amostras podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.
  2. Prepare um gel de 125 mL de 1% peso por volume (p/v) de agarose em 1 x TAE buffer (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 µ g/mL ethidium bromide (10 mg/mL de solução)13. Derreter a solução de agarose e despeje para uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente bem 15 com ampla, poços de espessura 0,75 mm 5 mm. Poços finos rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espessura de 1,5 mm. Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
    1. Imergir o gel em 1 x TAE com brometo de etídio 0,1 µ g/mL. Adicione 3,5 μL de 6 x Tintura (50% de glicerol, tintura de laranja G 0,15%) de carregamento para as reações de ensaio de nuclease. Carrega todo o volume para o gel. Funcione o gel em constante tensão, 10 volts por centímetro (100 V) à temperatura ambiente durante 1 h ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.
  3. O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar o brometo de etídio. DNA linear deve ser executado fiel tamanho em kb 3, DNA supercoiled deve correr mais rápido (~ 2 kb) e círculo relaxado DNA deve executar mais lento (~3.5 kb).
    1. Usando o software de análise de imagem, calcule o volume de pixel do plasmídeo círculo supercoiled, linear e relaxado em cada raia. Chame a soma do pixel volumes para estas três formas de DNA, o DNA"total" de valor e usá-lo para calcular a percentagem de círculos lineares e relaxados. Por exemplo, o volume de pixel de círculos relaxados é dividido pelo valor de pixel de DNA total na lane, multiplique esse número por 100, para determinar uma porcentagem. Frações que contêm contaminante nuclease exibem um percentual maior de círculos lineares e descontraídos, em comparação com o controle negativo.
  4. Combine a frações de sepharose heparina que não exibem atividade de nuclease contaminante. Urinar em 10 mm, 6-8 kDa peso molecular corte (MWCO) tubulação da diálise em 4 ° C durante a noite contra 1 L de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.
  5. Recupere a amostra PFV IN livre de nuclease da tubulação da diálise. Medir a um280 e calcular a concentração de proteína final. Alíquota e snap freeze em nitrogênio líquido. Alíquotas de loja a-80 ° C.

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Representative Results

Recombinante PFV em muitas vezes está contaminado com uma nuclease bacteriana1. Ensaios bioquímicos integração dependem a quantificação da conversão do plasmídeo supercoiled DNA para círculos relaxados e produtos lineares. A presença de uma contaminante nuclease poderia levar a quantificação espúria destes ensaios. Expressão da PFV IN com um tag de hexahistidine é induzida em e. coli (Figura 1) e primeiro purificado por cromatografia de afinidade de níquel (Figura 2). As frações com quase puro PFV IN são combinadas e a tag hexahistidine é clivada por uma protease. Nós determinamos que PFV IN e as nucleases contaminantes têm afinidades diferentes para heparina sepharose cromatografia (Figura 3)1. Frações em PFV após cromatografia de sepharose heparina são incubadas com um plasmídeo supercoiled a ensaiar para círculos relaxados e plasmídeo linear, os produtos da atividade da nuclease (Figura 4). Este ensaio permite a identificação de frações de proteína sem a nuclease (Figura 5). Estas frações podem ser combinadas, diálise e congeladas para experiências futuras.

Figure 1
Figura 1: Indução de PFV em e. coli . Células de culturas antes (pista 2) e depois de indução (faixa 3) são analisadas para a presença de PFV IN, 47374 promotor. amostras foram separados por 10% SDS-PAGE e corados com azul de Coomassie brilhante. Pista 1, marcadores de peso molecular (kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Níquel fracções de cromatografia de afinidade. Lisado bacteriano solúvel foram separado por cromatografia de afinidade de níquel. PFV IN com um tag de hexahistidine foi eluída com um gradiente linear de 20 mM para imidazole de 200 mM. Frações foram avaliadas em 10% SDS-PAGE e corados com azul de Coomassie brilhante. PFV IN, 47374 Da, é facilmente perceptível na amostra carregada para a coluna (carga), mas é menos aparente no fluxo através de ou lavar. Frações que eluir cedo no gradiente de imidazol comumente exibem um contaminante de mobilidade mais lento perto de 75 kDa, bem como alguns contaminantes de mobilidade mais rápidos em ou abaixo de 25 kDa. Em altas concentrações de imidazol existem contaminantes não aparentes e PFV IN parece ser relativamente puro. Neste exemplo, frações #33 através de #84 foram combinadas e mais purificadas. Marcadores de peso molecular (kDa) são à esquerda de cada gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Cromatografia de sepharose heparina de PFV em 1 . Após a remoção de afinidade e protease níquel da marca hexahistidine, PFV em (Da 44394) foi fracionado por heparina-sepharose. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 200 mM a 1 M de NaCl. Mesmo frações #12 #44 foram avaliadas em 8% SDS-PAGE corado com Coomassie azul. Marcadores de peso molecular (kDa) são à esquerda de cada gel. Estas frações foram testadas para a atividade de nuclease. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensaio de nuclease de frações de heparina sepharose 1 . Cada fração de sepharose heparina foi adicionada ao plasmídeo supercoiled DNA. Números de fração correlacionam àqueles mostrados na Figura 3. Após incubação, as reações de nuclease foram desproteínado e separaram por 1% de agarose com brometo de etídio. Controles negativos incluem Plasmídeo com nenhuma proteína (alvo somente) e uma purificação anterior do tipo selvagem em PFV conhecido para ser livre de nuclease (PFV em WT). Um controle positivo para contaminar a atividade de nuclease é uma purificação anterior de cataliticamente inactiva PFV em que é conhecida por ter contaminante nuclease (PFV em D128N). Marcadores de tamanho de DNA são mostrados em kb. Supercoiled plasmídeo (SC), plasmídeo linear (L) e círculos relaxados (RC) são indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Quantificação dos ensaios de nuclease 1. Agarose géis foram escaneados e valores de pixel foram quantificados para supercoiled (SC), linear (L) e bandas de círculo relaxado (RC) em cada raia. Números de fração correlacionam àqueles mostrados nas figuras 3 e 4. As percentagens de lineares e descontraídos círculos foram calculadas usando os valores de pixel e a equação mostrada. Por exemplo, o pixel valores para as bandas da fração #12 são: 817636 do plasmídeo supercoiled, 50467 plasmídeo linear e 112052 círculos relaxados. O valor de pixel de DNA total para fração #12 é a soma desses valores, 980155. A porcentagem de DNA linear é 50467 multiplicado por 100 para a porcentagem e dividido pelo valor de DNA total igual a 5,1%. A percentagem de círculos relaxados é 112052 multiplicado por 100 e dividido pelo valor de DNA total igualando 11,4%. A soma das percentagens de círculo linear e relaxado é 16,5%. Controlo negativo plasmídeo com nenhuma proteína (não IN, gráfico inferior) indica que esta preparação do plasmídeo incluído 4,4% do DNA total como círculos lineares ou relaxados. Um segundo controle negativo era uma purificação anterior do tipo selvagem PFV IN (WT) exibido 8,6% do DNA total como círculos lineares ou relaxados. Estas faixas de controle de dois indicam o nível de fundo do plasmídeo entalhado ou linear presente com o substrato sozinho e com PFV pol. Um controle positivo é uma purificação anterior de cataliticamente inactiva em PFV (D128N), que tinha 23% do DNA total como círculos lineares e relaxados. O DNA exposto a frações de sepharose heparina #12 a 22 # resultou em > 10% do DNA linear e relaxado em círculos. Neste exemplo, frações #24 a #42 exibidas < conversão de 10% aos círculos lineares e relaxados. Estas frações foram combinadas e diálise. Alíquotas foram congeladas e armazenadas a-80 ° C para uso futuro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.

Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co purifica com PFV pol. No entanto, PFV IN exibe uma afinidade para sepharose heparina que é facilmente distinguível do contaminante nuclease bacteriana1. A chave para a preparação da nuclease livre PFV IN é a quantificação cuidadosa de actividade nuclease em cada fração após eluição gradiente de heparina-sepharose. O gradiente deve ser suficientemente raso para permitir a separação do PFV IN do contaminante nuclease; um gradiente íngreme não seria compatível com uma separação eficiente. Além disso, o substrato de DNA de plasmídeo deve ter uma baixa percentagem de círculos descontraídos para reduzir o plano de fundo do ensaio da nuclease. Se o substrato de DNA de plasmídeo tem um fundo elevado de círculos relaxados, deve ser realizada uma nova purificação de plasmídeo. O ensaio da atividade nuclease revela a presença do contaminante nuclease e fracções que devem ser descartadas.

Em alguns casos, a cromatografia de exclusão (SEC) pode ser um método eficaz para a remoção de um contaminante nuclease2. Grupos anteriores usaram SEC durante a purificação de PFV em4. SEC tem um volume de carga limitada e tende a reduzir a concentração de proteína final. A grande vantagem de afinidade e cromatografia de troca iónica é a capacidade de carregar um volume significativamente maior do que a SEC.

Testes para a atividade de nuclease podem ser adaptada para diferentes proteínas que purificam co com uma nuclease bacteriana. Aqui podemos identificar ao PFV e uma nuclease contaminante pode ser separado por cromatografia de sepharose heparina. Anteriormente mostramos que PFV em tem um perfil semelhante a nuclease com Mono-S cação e cromatografia de troca de ânion Mono-Q tornando Estas resinas inadequada para esta proteína. Dependendo das características de afinidade da proteína desejada em relação a nuclease, este protocolo pode ser usado com afinidade ou troca iônica resinas e eluição gradiente. A chave para uma eficaz remoção de contaminação de nuclease de uma proteína de interesse é uma diferença na afinidade por uma resina. Cada fração deve ser analisada para a atividade de nuclease. As resinas de cromatografia do presente protocolo não podem ser aplicadas diretamente para todas as proteínas que purificam co com nucleases bacterianas. No entanto, o conceito global do uso de uma afinidade ou resina de troca iônica para separar a nuclease de uma proteína de interesse e frações analisar para a atividade de nuclease pode ser amplamente aplicável.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

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References

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