Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Rekombinant prototype skummende virus integrase protein er ofte forurenset med en bakteriell nuclease under renselsen. Denne metoden identifiserer nuclease forurensning og fjerner den fra den siste forberedelsen av enzymet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lopez Jr., M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (130), e56605, doi:10.3791/56605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Integrase (IN) protein av retrovirus prototype skummende viruset (PFV) er en modell enzymet for å studere mekanisme retroviral integrering. PFV i forhold til IN fra andre retroviruses, og er mer løselig og mer mottakelig for eksperimentell manipulasjon. I tillegg er det følsom for klinisk relevante humant immunsviktvirus (HIV-1) IN hemmere, antyder at PFV i katalytisk mekanisme er lik at av HIV-1 IN. IN katalyserer kovalente sammenføyning av viral komplementære DNA (cDNA) mot DNA i en prosess kalt strand overføring. Denne strand overføring reaksjonen introduserer kutt til målet DNA. Analyse av integrasjon reaksjon produkter kan bli forvirret av tilstedeværelsen av nucleases som tilsvarende nick DNA. En bakteriell nuclease har vist å co rense med rekombinant PFV IN uttrykt i Escherichia coli (E. coli). Her beskriver vi en metode for å isolere PFV i fra forurensende nuclease av heparin affinitet kromatografi. Fraksjoner er lett vist for nuclease kontaminering med supercoiled plasmider og agarose gel geleelektroforese. PFV i og forurensende nuclease viser alternative slektskap for heparin sepharose slik at en nuclease uten forberedelse av rekombinant PFV i egnet for bulk biokjemiske eller ett molekyl analyse av integrering.

Introduction

Biokjemiske og ett molekyl studier av protein interaksjoner med DNA krever eksepsjonelt ren rekombinante proteinene. Forurensende nucleases fra bakterier kan skjule resultatene av disse analyser. En forurensende nuclease har blitt funnet i forberedelsene rekombinante proteinene oksygen scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) og prototype skummende virus (PFV) integrase (IN) isolert fra Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.

Retroviral integrering analyser stole på konvertering av supercoiled DNA nicked eller lineær produkter som et mål i aktivitet4. Under cellular infeksjon blir IN de to endene av en viral cDNA til verten chromatin5. Hver ende med reaksjon kalles strand overføring. Analyser av rekombinant IN aktivitet kan delta to DNA oligomers etterligne viral cDNA ender til et mål DNA i et felles integrering reaksjon4,5,6,7,8. Alternativt kan rekombinant IN bli en DNA ende i en ikke-fysiologisk relevant halv område integrering reaksjon9,10. Når supercoiled plasmider DNA er målet for integrering, felles integrering produkter er linearized DNA og halv området integrering produkter avslappet sirkler. Produktene reaksjon identifiseres av deres relative mobilitet under agarose gel geleelektroforese1. Hvis rekombinant inn har en forurensende nuclease, vil det være falske avslappet sirkler eller en muligens linearisert plasmider forvirrende eksperimentelle resultatene. Viral DNA oligomers kan være fluorescently merket som entydig identifiserer integrering produkter, i motsetning til nuclease produkter. Imidlertid favoriserer i stor grad supercoiled DNA mål; tap av supercoiled plasmider avslappet sirkler eller lineær DNA av forurensende nuclease kan forskyve resultatene og tolkning av data11. Derfor er det viktig å fjerne bakteriell nucleases fra retroviral i forberedelsene.

PFV i har en annen affinitet for heparin sepharose sammenlignet med bakteriell nuclease1. PFV på og av nuclease kan skilles med en lineær gradient elueringsrør fra heparin sepharose. Nuclease er ikke lett oppdaget av en ultrafiolett (UV) absorbans ved 280 nm topp eller analytisk natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). I stedet oppdages nuclease av en nuclease aktivitet analysen ansette konvertering av en supercoiled plasmider avslappet sirkler eller lineær produkter. Hver fraksjon etter heparin sepharose kromatografi er testet for nuclease aktivitet. PFV i og miljøgifter til nuclease har ingen forskjell i affinitet for Mono-Q anion harpiks. Det er en liten forskjell i affinitet for Mono-S kasjon harpiks. Mono-S oppløsningen av bakteriell nuclease og PFV i tillater imidlertid ikke effektiv separasjon av proteiner. Til slutt, heparin sepharose affinitet rensing tilbyr beste separasjon av bakteriell nuclease fra PFV i og har fordelen av ubegrenset Last volum.

Testing av forurensende nuclease aktivitet kan tilpasses andre proteiner. Protein av interesse vil sannsynligvis ha alternative affinitet egenskaper enn PFV i; forskjellen i bindende egenskaper av protein av interesse og nuclease miljøgifter må bestemmes empirisk. Denne metoden for å identifisere nuclease forurensning kan tilpasses andre harpikser inkludert Mono-S kasjon eller Mono-Q anion exchange harpiks. Tilhørighet og ionebytte harpiks kan tilby en pålitelig metode for å isolere et rekombinant protein av interesse fra forurensende nucleases uten grenser for mengden protein under kromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indusere PFV i uttrykk E. coli

  1. Tilsett 1 μL av PFV i uttrykket plasmider (10 ng/μL) 20 μL av E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μL aliquot kommersielt tilgjengelig celler har > 2 x 106 CFU/μg plasmider) i en 1,5 mL tube. Bland forsiktig ved finger å peke eller flicking røret. Ruge på is 5 min.
    1. Varme støt for nøyaktig 30 s i en 42 grader vann bad og deretter umiddelbart tilbake til is i 2 minutter.
    2. Legge til 80 μL romtemperatur super optimal buljong med catabolite undertrykkelse (SOC) media. Inkuber 1t på 37 grader med 225 omdreininger per minutt (rpm) risting.
    3. Plate 25 μL blandingen på en 100 mm x 15 mm Petriskål inneholder 25 mL av Luria kjøttkraft (LB) agar (1 L LB agar: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt, 15 g agar) og 100 μg/mL ampicillin (100 mg/mL lager løsning).
    4. Plate de resterende 75 μL transformert cellene i en identisk platen. Inkuber platene med lokkene ned over natten på 37 ° C.
  2. Hente plater forvandlet E. coli. Bruke en enkelt koloni for å vaksinere 3 mL LB (1 L LB: 10 g av bacto-tryptone, 10 g av NaCl, 5 g av gjær pakke) med 100 μg/mL ampicillin i et 14-mL runde bunnen polypropylen kultur rør. Inkuber ~ 8 h på 37 grader med 225 rpm risting.
    1. Legg til de 3 mL kultur 50 mL LB supplert med 100 μg/mL ampicillin og 34 μg/mL chloramphenicol (34 mg/mL lagerløsning) i en 250 mL Erlenmeyer kolbe. Inkuber kulturen overnatting på 37 ° C med 225 rpm risting.
    2. Overføre den 53 mL kultur 1 L LB, 100 μg/mL ampicillin og 34 μg/mL chloramphenicol i en 4 L Erlenmeyer kolbe. Ruge på 37 ° C med 225 rpm risting.
    3. Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) av kulturen med jevne mellomrom. Først sjekk kulturen OD600 hver h. Som kultur når ønsket OD600, sjekke hvert 15 min til ikke overgrow. Vokse kulturen en OD600 mellom 0,9 og 1.0. Overføre kolbe til en isbadet og virvel for å redusere temperaturen på kulturen.
  3. Overføre 1 mL av kulturen til en 1,5 mL tube for senere analyse av denaturing SDS-side analyse.
    1. Pellets cellene i 1,5 mL tube med sentrifugering i 1 min i en microfuge på 14.000 x g ved romtemperatur. Kast nedbryting. Resuspend pellet i 150 μL fosfat bufret saltvann (PBS) av pipettering. PBS kan være med eller uten CaCl2 og MgCl2.
    2. Tilsett 150 μL av 2 x SDS side eksempel buffer (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1,2% SDS, 30% glyserol, 15% β-mercaptoethanol (βME), 0.0018% bromophenol blå) og bland godt med Pipetter eller vortex. Kok i 3 min. butikken på 20 ° C.
  4. Legger til bakteriell kultur: en siste konsentrasjon av 0,25 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M lagerløsning) og 50 μM ZnCl2 (50 mM lager løsning). IPTG induserer uttrykk for PFV IN genet fra arrangøren av T7 og ZnCl2 legges til som et supplement for riktig folding av et amino terminal sink finger domene i PFV IN. Incubate kulturen ved 25 ° C med skjelvende på 225 rpm for 4 h. umiddelbart overføre kolbe til en isbadet. Lagre 1 mL av kultur for SDS side analyse etter den samme protokollen som ovenfor i 1.3.
  5. Overføre bakteriell kultur til riktig størrelse sentrifuge flasker. For eksempel overføres en 1 L kultur til fire sterilt disponibel 250 mL konisk bunnen polypropylen flasker. Spinne flasker i en nedkjølt tabletop centrifuge 3000 x g for 20 min på 4 grader. Kast supernatants ved å helle.
    1. Resuspend alle pellets fra en 1 L bakteriell kultur i et totalt volum på 25 mL (6,25 mL per flaske) kaldt PBS (med eller uten CaCl2 og MgCl2) av pipettering. Kombiner og overføre de bakterielle suspensjoner til en 50 mL konisk tube. Spinne i en nedkjølt centrifuge 3000 x g for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting av helle eller pipettering.
  6. Resuspend bakteriell pellet 10 mL rørets buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, og 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF) protease hemmer) av pipettering. Fest fryse pellet ved å plassere røret i en Dewar kolbe med flytende nitrogen tilstrekkelig å dykke 50 mL tube. Nøye fjerne røret fra flytende nitrogen og lagre på-80 ° C.
    Merk: Bakteriell pellets kan lagres i flere måneder på-80 ° C. Vi har sett uten tap av aktiv protein etter-80 ° C lagring for to år.
  7. Analysere pre induksjon og etter induksjon prøvene av 8.3 cm bred, 7.3 cm høy, 0,75 mm tykk SDS side gels med 1,5 mL 6% polyakrylamid stabling lag (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% akrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED) og 3,5 mL 10% polyakrylamid løse lag (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% akrylamid, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED)12.
    1. Etter pouring stabling gel, setter du inn en 10 godt kam. Når gel har polymerized, montere siden apparatet, og Legg tilstrekkelig SDS side kjører buffer (25 mM Tris, 192 mM glysin, 0,1% SDS).
    2. Last 10 μL hvert utvalg og 4 μL prestained protein standarder. Kjøre på 16,5 V/cm til fargestoff foran når bunnen av gel, ca 60 min.
    3. Demonter gel plater og overføre gel til plast badekar. Legg Coomassie briljant blå flekk løsning (0,1% Coomassie briljant blå R-250, 40% metanol, 10% eddiksyre) sjenerøst dekke gel og flekker for 20 min ved omgivelsestemperatur.
    4. Fjerne flekker løsningen ved å helle og Erstatt med destain løsning (40% metanol, 10% eddiksyre) til band er synlig. Fjerne destaining løsningen ved å helle og erstatte med deionisert vann. PFV i bør lett identifiseres i post induksjon utvalget. PFV i en hexahistidine kode har en molekylvekt av 47374 Da.
    5. Hvis PFV i ikke er synlig, kan du gjenta induksjon starter med en annen koloni fra en av transformasjon platene.

2. nikkel affinitet kromatografi

  1. Tine en bakteriell pellet på is.
    Merk: Dette vil ta betydelig tid (ca 2-3 h). Når pellet har tint til en celle slurry, legge en ytterligere 500 μM PMSF (100 mM lager løsning).
  2. Holde 50 mL tube av bakterier slurry på is. Sonicate bakterier på 30% amplitude for 30 s (1 s på, 1 s av) per pellet avledet fra 1 L kultur med en sonicator med en 0,5 tommer diameter bio horn 0.125 tommers diameter konisk microtip, en frekvens på 20 kHz og maksimal effekt på 400 W.
  3. Overføre celle prøven til en kald ultracentrifuge tube. Bruk polykarbonat flaske samlinger (25 mm diameter, 89 mm høyde) kompatibel med en Type 60 Ti fast vinkel rotor. Alternative rør og rotorer kan brukes hvis samme gravitasjon kraft er oppnådd. Spin 120.000 x g for 60 min på 4 ° C. Det bør være en tydelig pellets. Nedbryting kan ha en gul farge.
  4. Overføre nedbryting av helle eller pipettering slik kalde 50 mL konisk. Merk volumet; Dette volumet skal ca volumet av rørets bufferen før snapin frysing. Hvis nedbryting tyktflytende, kan dette være forurenset av bakteriell DNA som kan tette kolonnen kromatografi. I dette tilfellet gjenta ultracentrifugation å pellets bakteriell DNA.
  5. Forberede 500 mL Buffer en (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) og 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole).
    Merk: I denne protokollen, holde rask protein flytende kromatografi (FPLC) system, alle buffere og prøven på 4 ° C i et kaldt rom.
    1. Sterilt filter buffere A og B med 0,2 μm disponibel filter enheter. Avhengig av FPLC systemet, vask pumpe A og pumpe B Buffer A og Buffer B, henholdsvis. Flyt 90% Buffer A og 10% Buffer B gjennom systemet til ledningsevne og UV opplesninger stabilisere. Maksimal infusjonshastigheten avhenger på instrumentet; bruke en flow rate på 5 mL/min med en maksimal trykkgrensen 1,0 MPA.
  6. Forberede en 110 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolonne med 1,5 mL nikkel-ladet harpiks (maksimal innbindingen behandlingskapasitet 50 mg/mL, maksimalt Trykk 1 MPa). Kolonnen kan være forberedt dagen før rensing og lagret på 4 grader.
  7. Koble kolonnen på FPLC-apparatet. Equilibrate kolonnen med 20 mL 90% Buffer A og 10% Buffer B (20 mM imidazole) på en strømningshastighet på 0,5 mL/min med maksimalt trykk limit 0,5 MPA. Apparatet bør være å samle sanntidsdata ledningsevne og UV absorbans ved 280 nm (en280). Ledningsevne og UV målinger skal stabilisere. Hvis disse målinger ikke har stabilisert, fortsatt flyt buffere gjennom kolonnen til de er stabile.
  8. Laste protein prøven (~ 10 mL per pellet) til kolonnen på en strømningshastighet på 0,15 mL/min med maksimalt trykk limit 0,5 MPA. Flow rate og kolonnen trykket forblir den samme gjennom rensingen. Samle flyten gjennom i en 50 mL tube.
    1. Vask kolonnen med 20 mL 90% Buffer A og 10% Buffer B. samle vask i en 50 mL tube. Elute proteiner med en 20 mL lineær gradient på 10% til 100% Buffer B (20 mM til 200 mM imidazole).
    2. Til slutt, vask kolonnen med 5 mL 100% Buffer B (200 mM imidazole). Samle gradient og siste vask i 0,27 mL brøker.
  9. Kombiner 15 μL 2 x SDS side eksempel buffer med 15 μL flyten gjennom, vask og topp A280 fraksjoner. Kok prøvene i 3 minutter.
    1. Forberede to 10% SDS side gels som beskrevet tidligere i trinn 1.6 unntatt med 15 godt kammer. Last 10 μL av hver prøve å geléer og 4 μL prestained protein standarder. Kjøre flekken og analysere geléer som beskrevet i trinn 1.6.
    2. Kombinere brøker som inneholde nesten ren PFV i basert på visuell inspeksjon. Måle volumet av pipettering, vanligvis 8-10 mL.
    3. Bruker et spektrofotometer, måle A280 av kombinerte fraksjoner og beregne den totale PFV i protein; våre typisk avkastning er ~ 10 mg per L indusert kultur. Utryddelse koeffisient PFV i med hexahistidine koden er 59360 cm-1 M-1.
  10. Hvis du vil fjerne hexahistidine koden, supplement PFV inn med 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M lagerløsning) og 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M lager løsning). Legge til 15 μg av menneskelig rhinovirus (HRV) 3C protease per mg PFV IN. Incubate på 4 grader over natten. Kløv reduserer PFV i molekylvekt fra 47374 Da til 44394 Da og kan verifiseres ved 10% SDS-side analyse.

3. heparin affinitet kromatografi

  1. Forberede 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) og 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
    Merk: I denne protokollen, det FPLC system, buffere, og prøve er holdt i en kald rom på 4 grader.
    1. Sterilt filteret buffere C og D med 0,2 μm disponibel filter enheter. Avhengig av FPLC systemet, vask pumpe A og pumpe B Buffer C og Buffer D, henholdsvis. Flyt 80% Buffer C og 20% Buffer D gjennom systemet til ledningsevne og UV opplesninger stabilisere. Maksimal infusjonshastigheten avhenger på instrumentet; Vi bruker rutinemessig en flow rate på 5 mL/min med en maksimal trykkgrensen 1,0 MPA.
  2. Forberede en 80 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolonne med 1 mL av heparin sepharose harpiks (maks innbindingen behandlingskapasitet 2,0 mg av storfe antithrombin III per mL harpiks, maksimalt Trykk 1,4 MPa). Kolonnen kan være forberedt dagen før rensing og lagret på 4 ° C. Koble kolonnen på FPLC-apparatet.
    1. Equilibrate kolonnen med 20 mL 80% Buffer C og 20% Buffer D (200 mM NaCl) på en strømningshastighet på 0,5 mL/min med maksimalt trykk limit 1 MPA. Apparatet bør være å samle sanntidsdata ledningsevne og UV absorbans ved 280 nm (en280). Ledningsevne og UV målinger skal stabilisere. Hvis disse målinger ikke har stabilisert, fortsatt flyt buffere gjennom kolonnen til de er stabile.
  3. Redusere NaCl konsentrasjonen av PFV i prøven til 200 mM ved å legge til 1,5 volumer Buffer C. For eksempel legge 15 mL Buffer C til 10 mL PFV IN. Vår totale volumet er vanligvis ~ 25 mL.
  4. Last utvannet PFV i prøven kolonnen heparin sepharose på 0,5 mL/min gjennomstrømningshastighet maksimalt trykk begrense 1,0 MPa. Flow rate og kolonnen trykket forblir den samme gjennom rensingen. Samle flyten gjennom i et 50 mL konisk rør.
    1. Vask kolonnen med 20 mL 80% Buffer C og 20% Buffer D (200 mM NaCl), samle vask i et 50 mL konisk rør. Elute kolonnen med 30 mL lineære graderinger på 20% til 100% Buffer D (200 mM til 1 M NaCl).
    2. Vask kolonnen med 5 mL av 100% Buffer D. samle gradient og siste vask i 0.37 mL fraksjoner.
  5. Analysere belastning, strømme gjennom, vask og brøker med 8% SDS side som beskrevet i 2.9. PFV i følgende spalting av hexahistidine-koden har en molekylvekt av 44394 Da og utryddelse koeffisient forblir 59360 cm-1 M-1 uten hexahistidine koden. Lagre alle fraksjoner på 4 grader til ferdigstillelse av en nuclease analysen.

4. nuclease analysen

  1. Identifisere heparin sepharose brøker som inneholde nesten ren PFV i. kombinere 3 μL heparin brøk og 50 ng 3 KB supercoiled plasmider DNA reaksjon buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) med et siste volum på 15 μL. Ruge på 37 grader til 90 min. inkluderer en negativ kontroll med ingen PFV IN.
    1. Stoppe reaksjon med 1 mg/mL proteinasen K (20 mg/mL lagerløsning) og 0,5% SDS (10% lager løsning). Ruge på 37 ° C for 1 h. prøver kan lagres på 20 ° C for senere analyse.
  2. Forberede en 125 mL gel 1% vekt per volum (w/v) agarose i 1 x TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) med 0,1 µg/mL ethidium bromide (10 mg/mL lagerløsning)13. Smelt agarose løsningen og hell til en 15 cm x 10 cm gel avstøpning skuff. Sett inn en 15 godt kam med 5 mm bred 0,75 mm tykk brønner. Tynn brønner gi bedre bandet oppløsning sammenlignet med 1.5 mm tykk brønner. Tillate gel å stivne ved omgivelsestemperatur.
    1. Fordype gel i 1 x TAE med 0,1 µg/mL ethidium bromide. Legge til 3,5 μL 6 x lasting fargestoff (50% glyserol, 0,15% Orange G fargestoff) nuclease analysen reaksjonene. Legg til hele volumet gel. Kjør gel ved konstant spenning, 10 volt pr. cm (100 V) ved omgivelsestemperatur 1t eller til Orange G fargestoff foran når slutten av gel.
  3. Umiddelbart bilde agarose gel med et fluorescerende skanner sette å oppdage ethidium bromide. Lineær DNA skal kjøre riktig størrelse på 3 kb supercoiled DNA bør kjøre raskere (~ 2 kb) og avslappet sirkel DNA bør kjøre tregere (~3.5 kb).
    1. Bruker analyseprogramvare, beregne pixel volumet av supercoiled, lineær og avslappet sirkel plasmider i hver fil. Kall summen av pikselen volumer for disse tre DNA former "Totale DNA" verdi og bruke den til å beregne den lineære og avslappet sirkler. For eksempel pixel volumet av avslappet sirkler er delt av den totale DNA pikselverdien i denne kjørefelt, multiplisere dette tallet med 100 for å bestemme en prosentandel. Brøker som inneholder skadelige nuclease viser en høyere andel av lineære og avslappet sirkler sammenlignet med kontrollen negative.
  4. Kombinere heparin sepharose brøker som ikke viser forurensende nuclease aktivitet. Dialyze i 10 mm 6-8 kDa molekylvekt cutoff (MWCO) dialyse rør på 4 ° C over natten mot 1 L 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glyserol.
  5. Gjenopprette nuclease uten PFV i prøven fra dialyse rør. Måle A280 og beregne den endelige protein konsentrasjonen. Aliquot og fest fryse i flytende nitrogen. Lagre dele på-80 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant PFV i er ofte forurenset med en bakteriell nuclease1. Biokjemiske integrering analyser avhenger kvantifisering av konvertering av supercoiled plasmider DNA til avslappet sirkler og lineær produkter. Tilstedeværelsen av en forurensende nuclease kan føre til falsk kvantifisering av disse analyser. Uttrykk for PFV i en hexahistidine kode er indusert i E. coli (figur 1) og første renset ved nikkel affinitet kromatografi (figur 2). Fraksjoner med nesten ren PFV IN kombineres og hexahistidine koden er kløyvde av en protease. Vi har funnet ut at PFV i og forurensende nuclease har forskjellige interesseområder for heparin sepharose kromatografi (Figur 3)1. PFV i fraksjoner etter heparin sepharose kromatografi er ruges med en supercoiled plasmider til analysen for avslappet sirkler og lineær plasmider, produkter av nuclease aktivitet (Figur 4). Denne analysen kan identifikasjon av protein fraksjoner uten nuclease (figur 5). Disse fraksjoner kan kombinert, dialyzed og frosset for senere eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Induksjon av PFV i i E. coli . Celler fra kulturer før (lane 2) og etter (lane 3) induksjon analyseres etter PFV i, 47374 Da. prøver ble skilt med 10% SDS side og farget med Coomassie briljant blå. Lane 1, molekylvekt markører (kDa). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Nikkel affinitet kromatografi brøker. Løselig bakteriell lysates var atskilt med nikkel affinitet kromatografi. PFV i med en hexahistidine-kode ble elut med en lineær gradient 20 mM til 200 mM imidazole. Brøker ble evaluert med 10% SDS side og farget med Coomassie briljant blå. PFV i, 47374 Da, er åpenbart i utvalget lastet til kolonnen (load), men er mindre i flyten gjennom eller vask. Brøker som elute tidlig i imidazole forløpningen vanligvis vise en tregere mobilitet miljøgifter nær 75 kDa samt noen raskere mobilitet forurensninger på eller under 25 kDa. PFV i synes å være ren på høyere konsentrasjoner av imidazole det er ikke åpenbart forurensninger. I dette eksemplet fraksjoner #33 gjennom #84 kombinert og ytterligere renset. Molekylvekt markører (kDa) er til venstre for hver gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Heparin sepharose kromatografi av PFV i 1 . Etter nikkel tilhørighet og protease fjerning av hexahistidine koden, var PFV i (44394 Da) fraksjonert av heparin sepharose. Proteiner ble elut med en lineær gradient fra 200 mM til 1 M NaCl. Selv fraksjoner #12 #44 ble evaluert av 8% SDS side farget med Coomassie blå. Molekylvekt markører (kDa) er til venstre for hver gel. Disse fraksjoner ble testet for nuclease aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Nuclease analysen av heparin sepharose fraksjoner 1 . Hver heparin sepharose fraksjon ble lagt til supercoiled plasmider DNA. Brøkdel tall relateres til de som vist på Figur 3. Etter inkubasjon nuclease reaksjoner var deproteinated og atskilt med 1% agarose med ethidium bromide. Negativ omfatter plasmider DNA med ingen protein (mål bare) og en tidligere renselse av vill-type PFV i kjent for å være fri for nuclease (PFV i WT). En positiv kontroll for forurensende nuclease aktivitet er en tidligere renselse av katalytisk inaktive PFV i som er kjent for forurensende nuclease (PFV i D128N). DNA størrelse indikatorer vises i kb. Supercoiled plasmider (SC), lineær plasmider (L) og avslappet sirkler (RC) angis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Kvantifisering av nuclease analyser 1. Agarose gels ble skannet og bildepunktverdier kvantifisert for supercoiled (SC), lineær (L) og avslappet sirkel (RC) band i hver fil. Brøkdel tall relateres til de i tallene 3 og 4. Prosentandelene av lineære og avslappet sirkler ble beregnet ved hjelp av bildepunktverdiene og ligningen vises. For eksempel bildepunktet verdier for brøkdel #12 er: 817636 supercoiled plasmider, 50467 lineær plasmider og 112052 avslappet sirkler. DNA pixel totalverdien for brøkdel #12 er summen av disse verdiene, 980155. Prosentandelen av lineær DNA er 50467 multipliseres med 100 for prosenten og delt på totalt DNA verdien tilsvarer 5,1%. Prosentandelen av avslappet sirkler er 112052 multiplisert med 100, og divideres med DNA totalverdien tilsvarer 11,4%. Summen av lineær og avslappet sirkel prosenter er 16,5%. Negativ kontroll plasmider DNA med ingen protein (ingen IN, nederste diagram) angir at denne utarbeidelse av plasmider med 4,4% av totale DNA som lineær eller avslappet sirkler. En andre negativ kontroll var en tidligere renselse av vill-type PFV i (WT) som vises 8,6% av totale DNA som lineær eller avslappet sirkler. Disse to control baner angi bakgrunn nicked eller lineær plasmider underlaget alene og med PFV modulen En positiv kontroll er en tidligere renselse av katalytisk inaktive PFV i (D128N) som hadde 23% av totale DNA som lineære og avslappet sirkler. DNA utsatt for heparin sepharose fraksjoner #12 gjennom #22 resulterte i > 10% av DNA som lineære og avslappet sirkler. I dette eksemplet fraksjoner #24 til #42 vises < 10% konvertering til lineær og avslappet sirkler. Disse fraksjoner ble kombinert og dialyzed. Dele var frosset og lagret på-80 ° C for fremtidig bruk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinante proteinene som samhandler med DNA, DNA-reparasjon proteiner, oksygen renovasjonsarbeider for ett molekyl mikroskopi programmer eller retroviral integrases, som bør være fri for forurensende bakteriell nucleases2,3. Disse forurensningene kan forvirre tolkningen av resultater i bulk biokjemiske eller ett molekyl analyser.

Vi har funnet at en bakteriell nuclease ofte co renser med PFV modulen PFV i viser imidlertid en affinitet for heparin sepharose som er lett skilles fra bakteriell nuclease miljøgifter1. Nøkkelen til utarbeidelse av nuclease uten PFV i er forsiktig kvantifisering av nuclease aktivitet i hver fraksjon etter gradient elueringsrør fra heparin sepharose. Graderingen må være tilstrekkelig grunt å tillate separasjon av PFV i fra nuclease miljøgifter; en bratt stigning ville ikke være kompatibel med effektiv separasjon. I tillegg bør plasmider DNA underlaget ha en lav prosentandel av avslappet sirkler å redusere bakgrunnen til nuclease analysen. Hvis plasmider DNA underlaget har en høy bakgrunn avslappet sirkler, skal en ny renselse av plasmider DNA utføres. Nuclease aktivitet analysen avdekker forurensende nuclease og brøker som skal kastes.

I noen tilfeller kan størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) være en effektiv metode for fjerning av forurensende nuclease2. Tidligere grupper har brukt SEC under rensing av PFV i4. SEC har en begrenset belastning volum og tendens til å redusere den endelige protein konsentrasjonen. Den store fordelen til tilhørighet og ionebytte kromatografi er muligheten til å laste et betydelig større volum enn SEC.

Testing for nuclease aktivitet kan bli tilpasset ulike proteiner som co renser med en bakteriell nuclease. Vi identifisere her at PFV i og en forurensende nuclease kan skilles med heparin sepharose kromatografi. Vi har tidligere vist at PFV i har en lignende profil for å nuclease med Mono-S kasjon og Mono-Q anion exchange kromatografi gjør disse harpikser uegnet for dette proteinet. Avhengig av affinitet egenskaper av ønsket protein i forhold til nuclease, kan denne protokollen brukes med affinity eller ionebytte harpiks og gradient elueringsrør. Nøkkelen til effektiv fjerning av nuclease forurensning fra et protein av interesse er en aldersforskjell affinitet for en harpiks. Hver fraksjon må være assayed for nuclease aktivitet. Kromatografi harpiks i denne protokollen kan ikke brukes direkte alle proteiner som co renser med bakteriell nucleases. Generelle begrepet bruke affinitet eller ionebytte harpiks skille nuclease fra et protein av interesse og assaying brøker nuclease aktivitet kan imidlertid være bredt aktuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH AI099854 og AI126742 til nøkkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21/DE3 Rosetta E. coli EMD Millipore 70956-4
LB broth EMD biosciences 1.10285.0500
Ampicillin Amresco 0339
Chloramphenicol  Amresco 0230
PBS Sigma-Aldrich D8537
IPTG  Denville Scientific CI8280
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
PMSF  Amresco 0754
Imidazole  Sigma-Aldrich I0250
DTT  P212121 SV-DTT
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
MgSO4 Amresco 0662
Agarose  Denville Scientific CA3510
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430
Heparin Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences 17-0998-01
HRV14 3C protease  EMD Chemicals 71493-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24, (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37, (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280, (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79, (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69, (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69, (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics