Быстрое обнаружение фенотипов исходам в клетках человека нейронных прекурсоров (НПС)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Психомоторного развития процессы, такие, как распространение, миграции и neurite нарост часто возмущенных в психоневрологических заболеваний. Таким образом мы представляем протоколы можно воспроизвести и быстро оценить эти процессы нервной в человека iPSC производные РНУ. Эти протоколы позволяют также оценки воздействия соответствующих факторов роста и терапии по развитию NPC.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Развитие человеческого мозга проходит через ряд четко спланированных процессов, с ранних этапов распространения, миграции и neurite нарост; и более поздних стадиях характеризуются аксона/дендритов нарост и синапса формирования. В нервной расстройств часто один или несколько из этих процессов разрушаются, ведущих к аномалии в мозге формирования и функции. С появлением человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) технологии исследователи теперь имеют в избытке человеческих клеток, которые могут быть дифференцированы в практически любой тип клеток, включая нейронов. Эти клетки могут использоваться для изучения развития нормального мозга и патогенез болезни. Ряд протоколов, с помощью hiPSCs для моделирования использования психоневрологические заболевания неизлечимо продифференцировано нейронов или использование 3D культуры систем называется organoids. Хотя эти методы доказали неоценимое значение в изучении патогенеза заболеваний человека, есть некоторые недостатки. Дифференциация hiPSCs в нейроны и поколения organoids, длительных и дорогостоящих процессов, которые могут повлиять на количество экспериментов и переменных, которые могут быть оценены. Кроме того в то время как после митотическая нейронов и organoids позволяют исследования процессов, связанных с болезнями, включая дендритов нарост и synaptogenesis, они исключают изучения предыдущих процессов как миграции и распространения. В нервной расстройств, таких как аутизм обильные доказательства генетических и посмертные указывает дефекты в начале процессов развития. Клетки-предшественники нейронных (НПС), высокой пролиферативной клеток населения, может быть подходящую модель, в которой задавать вопросы о онтогенетические процессы и начало болезни. Теперь мы расширяем методологий, извлеченные из изучения развития в мышь и крыса корковых культур для человека РНУ. Использование НИПы позволяет нам исследовать связанные с болезнью фенотипы и определить как различные переменные (например, факторы роста, наркотики) воздействия процессов развития включая распространения, миграции и дифференциация лишь через несколько дней. В конечном итоге этот набор может использоваться в духе воспроизводимость и высок объём для выявления механизмов конкретных заболеваний и фенотипы в нервной расстройств.

Introduction

Использование мыши модели и проще организмов выяснены механизмы развития основных мозга, а также патогенеза болезни. Несмотря на эти достижения этиологию многих психоневрологических расстройств ускользает, потому что не все результаты в более простые организмы имеют непосредственное отношение к сложные аспекты заболеваний человека. Кроме того большую сложность человеческого мозга часто делает его трудным для модели человеческого развития и расстройства в животных. С Эволюция и прогресс человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) технологии соматические клетки можно перепрограммировать в стволовые клетки и затем дифференцированной в нейрональные клетки для изучения болезней человека. Достижения в технологии hiPSCs и «omic» (геномика, transcriptomics, протеомики и метаболомики) обещает революционизировать понимание развития человеческого мозга. Эти технологии теперь сделать возможным «точность медицина» подход к характеристике психоневрологических заболеваний на основе case-by-case.

Текущий штапель в поле hiPSC заболевание моделирование является дифференцироваться в определенных нейронов подтипы в монослое клеток или использовать систему 3D культуры под названием органоид резюмировать аспекты мозга развития1,2, 3. Эти системы были невероятно ценным в изучении и расчехлять уникальные аспекты развития человеческого потенциала и болезни4,5,6,7. Однако нейронов культур и organoids часто требуют везде от недель до месяцев в культуре прежде чем они готовы учиться. Трудоемкий характер этих протоколов и количество ресурсов, необходимых для поддержания этих систем культуры часто ограничивают количество экспериментов, которые могут быть выполнены и количество переменных (как факторы роста или наркотиков), которые могут быть проверены. Кроме того многие исследования с использованием пост митотическая нейронов и organoids были сосредоточены на процессы такие как нарост или синапса образования дендритов, которые происходят позже в процессе развития. Хотя эти процессы были причастны к патологии развития расстройств, таких как аутизма и шизофрении, ранее развития события, которые происходят до окончательного нейрональных дифференциация также важны для патогенеза заболеваний8 ,9,10,11,12,13. Действительно недавние геномные исследования показывают, что периода середины плода, который состоит из распространения, процесс нарост и миграции, особенно важное значение в патогенезе аутизм11,14. Таким образом важно изучить нервных стволовых и прародитель клеточных популяций, чтобы лучше понять эти ранее процессов. Органоид систем, которые считаются лучше итог развития человеческого мозга из-за их 3D природа и организованную структуру, содержать прародителя бассейн, который был использован для изучения некоторых из этих более ранних событий. Однако прародитель населения organoids часто является редким и больше как радиальные глиальные клетки чем нервных стволовых и прогениторных клеток5,15. Таким образом было бы полезно иметь высокую пропускную способность метода для изучения ранних стадиях нейроразвития в популяции активно пролиферативной клеток.

В лаборатории, мы создали протокол, использующий hiPSC производные нейронных прекурсоров клетки (НПС), смешанного населения нервных стволовых и прогениторных клеток, что весьма пролиферативная, изучение неврологического процессов, таких как распространение, миграции клеток, и расширение начального процесса (neurite). Эти анализы были разработаны от методов, используемых в нашей лаборатории на протяжении десятилетий успешно учиться нейроразвития крысы и мыши корковых культур16,,1718,19,20, 21,,22-23. Важно отметить, что также было показано, что фенотипы и регулирования сигналов, определенных в системах культуры крысы и мыши очень интеллектуальный механизмов, которые активно в естественных условиях, указывающее значение этих методов16, 17,18,19,24. После первоначального дифференциации hiPSCs с НПС эти методы позволяют нам для изучения жизненно важных процессов развития в считанные дни. Эти методы имеют много преимуществ: (1) они требуют мало сложного оборудования и легко осуществить, (2) многочисленные экспериментальные реплицирует может проводиться в течение короткого времени, позволяя быстрое подтверждение воспроизводимости результатов, и (3) Культура переменных, таких как покрытие матрицы, эффекты факторов роста и активности препаратов могут быть проверены, быстро и экономично. Кроме того мы воспользоваться хорошо созданы роль внеклеточных факторов роста как критические регуляторы различных процессов развития. НПС были подвержены выбрать развития сигналы, которые непосредственно стимулировать такие события, как распространение, neurite нарост и миграции клеток и обнаружили, что они повышают способность выявлять дефекты, которые не проявляются в условиях управления19 , 25 , 26 , 27 , 28. Аналогичным образом, облегчения оценки наркотиков обеспечивает мощный авеню принять точности методов медицины для проверки эффективности различных терапевтических вмешательств. Таким образом этот протокол способствует высокой пропускной способности, воспроизводимость и простой методологии для изучения раннего развития мозга, патогенеза заболевания и потенциальных благотворно факторов роста и наркотиков на фенотипы психомоторного развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. безопасность процедуры и обслуживание кабинета по биобезопасности

  1. Процедуры безопасности уровня биобезопасности-2 (BSL-2)
    1. Следуйте рекомендациям, учреждения по работе с материалами BSL-2. Утилизация материалов BSL-2 по данным Института практики. Укажите номера и оборудование, которые используются для материалов BSL-2. Носите все средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат и перчатки.
  2. Техническое обслуживание кабинета по биобезопасности
    1. Используйте биобезопасности кабинета, сертифицированные для использования BSL-2 уровня материалов.
    2. Включите УФ света в области биобезопасности, кабинет для по крайней мере 15 минут, а затем спрей поверхностей раствором отбеливателя 10%. Разрешить отбеливатель решение сидеть за 15 мин, протрите кабинета и включите воздуха перед использованием.
  3. Радиоактивные третируют [3H]-тимидина (тритий) процедуры и безопасности
    Примечание: Трития является радиоактивный источник категории 5, «наиболее вряд ли может быть опасно» Категория. Руководящим учреждением для работы с радиоактивностью. Некоторые учреждения могут требовать сертификаты или позволяет обрабатывать трития.
    1. Обучение от учреждения о том, как правильно обрабатывать и распоряжаться трития. Утилизация радиоактивных отходов в сосудов, по данным Института политики. Носите СИЗ при работе с тритием.

2. нейронной индукции от iPSCs

Примечание: Чтобы НИПы, затем слегка модифицированную версию протокола, который сопровождает коммерчески доступных нейронной индукции комплект. Комплект состоит из Neurobasal (NB) средства массовой информации и 50 x нейронной индукции дополнение (НИС), который используется для изготовления 1 x нейронной индукции среднего (NIM). Чтобы сделать 100% также используется NIS расширения среды (см. раздел 3.1). Ссылка на протокол находится в материалы и оборудование и ссылки на раздел43.

  1. Прохождение iPSCs, когда они становятся 70-80% притока.
  2. Плита 300 000 iPSCs в 1 хорошо квалифицированных Госкомсанэпиднадзором внеклеточная матрица имитируют гель (гель ECM-мнемосхемы) с покрытием 6-ну пластины, содержащий 2 мл с 5 мкм ингибитора рок фидер бесплатно iPSC среды. Инструкции по скважинам покрытие гелем ECM-имитировать смотрите раздел 3.2.
  3. Один день позже, удалите iPSC средний + ингибитор и мыть iPSCs рок с ПБС. Добавьте 2 мл NIM в iPSCs.
    Примечание: 50 мл NIM производится путем добавления 1 мл 50 x ННГ и 250 мкл (50 единиц/мл, 5 мкл/мл), пенициллин/стрептомицина (P/S) 49 мл NB средств массовой информации.
  4. Средства массовой информации изменения нейронной индукции каждые 2 дня, аспирационных провел средних и замене с 2 мл NIM до клетки становятся вырожденная (около 4-5 дней). Изменения средства массовой информации ежедневно, после того, как клетки вырожденная.
  5. Проход клетки после 7 дней в ним и пластины в ECM-имитировать гель с покрытием 6-ну пластины, содержащий 2 мл 100% расширения средств массовой информации и АБС битор рок 5 мкм. Клетки, считаются прохода 0 (P0) NPC на данный момент. Смотрите раздел 3.1 ниже инструкции сделать 100% расширения средств массовой информации.
  6. Проход клеток с использованием методов, описанных в разделе 3.4. Подождите, пока клетки достигли P2 и вырожденная до отделения пятно для маркеров NPC и покрытие для экспериментов (рис. 1).

3. Культура СМИ, покрытие и обслуживание РНУ

  1. Подготовка средств массовой информации для поддержания РНУ (100% расширения СМИ):
    1. Сделать 50 мл 100% расширения средств массовой информации путем объединения 24.5 мл DMEM/F12 с 24,5 мл NB.
    2. Добавьте 1 мл 50 x NIS в среде DMEM/F12 + NB решение. Добавьте 250 мкл раствора P/S в средствах массовой информации.
      Примечание: Средства массовой информации может быть охлажденных (4 ° C) и используется для до 2 недель. Меньшие объемы средств массовой информации могут быть сделаны корректировки объемов DMEM / F12 + NB + NIS с помощью же показатели, как объем 50 мл.
  2. Подготовка геля ECM-имитировать покрытием культуры пластин для обслуживания NPC
    1. Аликвота ECM-имитировать гель на тома, необходимо сделать 6 мл рабочего раствора. Вычислить аликвота тома, глядя на сертификат анализа листа, поскольку ECM-имитировать гель коэффициент разбавления меняется от партии к партии и много-много.
    2. Оттепель гель Алиготе ECM-имитировать на льду и растворяются в 6 мл холодной среде DMEM/F12 средств массовой информации.
    3. Добавьте 1 mL ECM-имитировать решения гелем/DMEM/F12 для каждой скважины 6 пластины хорошо. Инкубировать пластину 6-колодец с ECM-имитировать гель решение для 30 минут при 37 ° C.
    4. Аспирационная ECM-имитировать решения гелем после 30 минут инкубации и заменить 100% расширения СМИ или охладите пластины (4 ° C, до 1 недели) без аспирационных ECM-имитировать гель решение.
  3. Техническое обслуживание РНУ
    1. НИПы пластины на плотности 1,5 миллиона клеток в ECM-имитировать гель покрытием хорошо содержащие 2 мл 100% расширения средств массовой информации.
    2. Инкубируйте NPC при 37 ° C во влажной среде с 5% CO2.
    3. Добавьте 5 мкм ингибитора рок в СМИ для НПС на P3 или ниже, или талой NPC, чтобы предотвратить чрезмерное клеточной смерти. Изменить СМИ после 24 ч для удаления рок ингибитора.
    4. Клетки проход каждые 4-9 дней, в зависимости от когда они становятся вырожденная. Клетки, считаются вырожденная, когда они становятся плотно упакованных монослоя, охватывающих весь нижней поверхности блюдо.
    5. Пластина NPC на плотности 1 до 1,5 миллионов клеток на одной скважиной 6-ну плиты (см. раздел 3.4). Удаление отработанного СМИ каждые 48 ч и заменить 2 мл 100% расширения средств массовой информации.
  4. Поднять, разъединять и Пелле НПС для поддержания и/или покрытие для экспериментальных условий
    1. Аспирационная средний, вымыть клетки один раз с ПБС. Аспирационная PBS и добавьте 500 мкл раствора 1 x мобильный отряд в 1 хорошо вырожденная РНУ. инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
    2. Добавьте 500 мкл комнатной температуры (RT) PBS и мыть хорошо с помощью пипетки P-1000 обеспечить удаление клеток. Соберите клетки + решение PBS в 15 мл Конические трубки. Вымойте тарелку снова с 1 мл раствора PBS и добавить жидкость в трубе.
    3. Вращать клетки вниз на 300 g x 5 мин в гранулах.
    4. Удалить супернатант из клеток гранул и вновь приостановить клеток в 1-5 мл подогретым DMEM/F12 средств массовой информации. Разбавьте клетки к плотности 1 до 4 миллионов клеток/мл средств массовой информации. Подсчитать ячейки с помощью Горяева.
    5. Пластина необходимое количество клеток, специфические для обслуживания NPC (раздел 3.3) или отдельные проба проводится (см. Последующие разделы для получения более подробной информации).
    6. Отрегулируйте громкость подвеска клеток со средствами массовой информации так, что между 15 до 100 мкл ячеек используются для каждой скважины/блюдо. Этот небольшой обшивка объем гарантирует, что существует даже клеток распределения и не разбавленный факторы роста, наркотиков или подложек в среде.
    7. Инкубировать клетки при 37 ° C. Изменить СМИ каждые 48 ч, для поддержания NPC или увидеть конкретные детали для отдельных анализов.
  5. Средства массовой информации подготовка экспериментальных условий (30% расширения СМИ)
    1. Разбавить СМИ расширение 100% на 70% (называется 30% расширение), добавив 1:1 DMEM/F12 + NB решение сделать СМИ для экспериментальных условиях.
    2. Сделайте 20 мл 30% расширения СМИ, добавив 6 мл 100% расширения средств массовой информации и разбавления с 7 мл NB и 7 мл в среде DMEM/F12 средств массовой информации. Добавьте 5 мкл/мл раствора P/S.
      Примечание: Если 100% СМИ уже содержит P/S, затем добавить 5 мкл/мл на сочетании DMEM / F12 + NB = (14 мл) x (5 мкл/мл) = 70 мкл P/s вместо 100µL.
    3. В желаемой концентрации в 30% расширения СМИ добавьте покрытие подложек и факторы роста.

4. Оценка синтеза ДНК, S-фаза вход и число клеток РНУ

  1. Подготовка для синтеза ДНК, S-фаза вход и число Assay клетки
    1. Стоковый раствор 1 мг/мл поли D-лизина (PDL) в dH2O и стерилизовать фильтра. Разбавьте 1:10 в dH2O сделать 0,1 мг/мл раствора PDL и добавить 300 мкл в каждой скважине 24 хорошо плиты или 1 мл раствора для 35-мм блюдо. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
    2. Вымойте PDL Уэллс 3 раза за 5 мин с dH2O. аспирата dH2O и добавить 300 мкл/колодец или 1 мл/блюдо Ламинин (5 мкг/мл) разводят в 1 x PBS. Накладки с парафина и держать в стерильные, биобезопасности кабинета на ночь на RT (12-24 ч).
    3. Подготовка 30% расширения средств массовой информации (см. раздел 3.5) после 12 до 24 ч. добавить транспортные средства, факторы роста или наркотиков интерес в нужной концентрации в объемах, которые являются менее 10% всего решения, чтобы избежать разбавления NIS в 30% расширения среды.
    4. Мыть каждый хорошо из 24-ну пластины дважды с ПБС (5 мин). Аспирационная ПБС и добавьте 450 мкл СМИ (без или с наркотиками/роста факторов). Инкубируйте пластины при 37 ° C по меньшей мере 15 мин до гальванических клеток.
    5. Для каждого эксперимента установите вверх 2-3 скважины или блюд в условием.
    6. Пластина NPC (см. раздел 3.4):
    7. Assay синтеза ДНК NPC: 100000 клеток/колодец в 24 хорошо пластины
    8. S-фаза вход: 500000 клеток/35 мм блюдо
    9. Номер Assay клетки: 50,000 клетки/колодец в пластине 24-а
  2. Assay синтеза ДНК клетки нервной прекурсоров
    1. Пластина 100000 клеток/колодец в пластине 24-Ну и оценить в трех экземплярах/состояние.
    2. Добавить радиоактивных, третируют [3H]-тимидина к питательной среды (1,5 мкКи/мл) в каждый хорошо после 46 h в культуре. Инкубируйте клетки при 37 ° C на 2 ч.
      Примечание: При использовании радиоактивных материалов, проходят подготовку от учреждения, протоколы безопасности следуйте радиоактивности и утилизации радиоактивных материалов в отходах сосудов надлежащим образом назначенного.
    3. Удалите и надлежащим образом распоряжаться радиоактивных средств массовой информации после 2 ч. добавить 300 мкл предварительно разогретую 0,25% трипсина ЭДТА (0.5 мм) для каждой скважины и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
    4. Включите комбайн клеток (см. материалы и оборудование раздел) и насос и убедитесь, что давление насоса ниже 200 PSI. Фильтр бумага через пространство в ячейку комбайн и оторвать правом углу, чтобы отметить ориентацию бумаги.
    5. Место сбора трубок сотовый харвестерная в пустой «пустой» лоток и нажмите программ смачивать фильтровальной бумаги. Место сбора трубок в образце скважины и запустить (старт).
    6. По завершении сбора образцов клеток комбайн Поднимите зажим и предварительный фильтр бумага повторить для всех наборов образцов. Всегда prewash в пустой, «пустой» пластины.
    7. Высушить фильтровальную бумагу под источником света и настроить соответствующие флаконов в лоток. Выбивать Чадс бумаги в флаконах и добавить 2 мл ЖС коктейль для каждого флакона. Колпачок и label флаконов.
    8. Инкубируйте флаконов в ЖС коктейль для по крайней мере 1 час перед чтением отсчеты в минуту (СУВП) на машине сцинтилляции.
  3. NPC S-фаза вход Assay
    1. Смотрите раздел 3.4 шаги чтобы поднять, разъединять, окатышей и вновь приостановить клетки.
    2. Пластина 500 000 ячеек на блюдо в 35 мм блюд, приготовленных в разделе 4.1, только 1 блюдо/условие для этого шага.
    3. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 46 h.
    4. Подготовьте три тарелки 35 мм, покрытые PDL/Ламинин за состояние после 24 ч. Например, если существует одно блюдо 35 мм 30% расширения средств массовой информации и одно блюдо 35 мм 30% расширения СМИ + ФБП (10 нг/мл) затем пальто 6 PDL/Ламинин пластин для использования на следующий день.
    5. Добавьте 2 мкл/мл по 5 мм EdU культур после 46 h. инкубировать на 2 ч.
    6. Разъединять и Пелле клетки (см. раздел 3.4). Вновь приостановите Пелле клеток в 3 мл 30% расширения средств массовой информации или 3 мл 30% расширения СМИ + желаемого роста факторы/наркотиков.
    7. Плита 1 мл на блюдо на предварительно покрытых PDL/Ламинин блюда. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте при 37 ° C за 2 ч до позволяют клеткам придерживаться блюдо. Смотрите Рисунок 2 для упрощенной шкалы.
  4. Вход S-фаза анализа
    1. Исправить блюда с ледяной 4% параформальдегида (ПФА в однократном ПБС) за 20 мин. Затем мыть посуду 3 раза за 5 мин с ПБС.
    2. Добавьте 1 mL 1 x PBS с 0,05% азид натрия для предотвращения роста бактерий и грибков. Клетки могут храниться при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев, если блюда (запечатанный с парафина) хранятся в PBS + натрия азид решение, хотя не все иммунологические антигены являются хорошо сохранившиеся после длительных задержек в анализе.
    3. Assay клетки, с помощью коммерческих реакции EdU комплекта (см. Протокол изготовителя). Пятно клеток с использованием DAPI или другой ядерной маркер и изображения с помощью микроскопии флуоресцирования.
    4. Определить долю EdU позитивных клеток более всего живой клетки (всего мобильный номер) слепых в 10 систематически случайных полей (10 x). Не включать в анализ мертвые клетки.
    5. Используйте этап контраст изображения и флуоресцентных изображений для определения положительный пятнать EdU и выяснить, какие клетки мертвы или жив (рис. 3).
    6. Граф все ячейки, которые имеют оба гладкой и даже клеточной мембраны в этап настройки контрастности и большое нефрагментированный ядро, флуоресцентный DAPI ядерной пятно, как эти клетки являются жить (Рисунок 3А-B).
    7. Исключить все ячейки, которые являются фазы яркий, сломанной неравномерным клеточной мембраны и маленький, конденсированной ядро как визуализированное DAPI флуоресцентных изображений, как эти клетки являются мертвых (Рисунок 3А-B). Оцените живой клетки для выражения EdU путем выявления клеток, которые имеют яркие флуоресцентные EdU пятно охватывающих весь ядро или пятнистым флуоресцентные пятнать в ядре (рис. 3 c).
  5. Номер Assay клетки NPC
    1. После 2 дней в культуре этикетки и подготовить 0,5 мл и 1,5 мл microcentrifuge труб microcentrifuge трубы. В каждом 0,5 мл трубки добавьте 5 мкл Трипановый синий.
    2. В каждую лунку 24 хорошо плиты удалите среднего и добавьте 200 мкл 1 x мобильный отряд решение и место в инкубаторе для 10-15 мин.
    3. После отведенное время после того, как клетки сняли, добавьте нужное количество ПБС в каждой скважине.
      Примечание: Как правило, на 2 день, добавьте 300 мкл ПБС хорошо содержащие клетки плюс 200 мкл раствора отряда, для общего объема 500 мкл. С дополнительной культуры время инкубации как клетки становятся более вырожденная, увеличьте объем разрежения в случае необходимости. К примеру на 4 день, добавить 500 мкл 1 x PBS и на 6 день, добавить 800 мкл ПБС. Всего тома будет 700 мкл и 1 мл, соответственно.
    4. С помощью пипетки P-1000, Пипетка вверх и вниз в каждом хорошо 4-5 раз для удаления клеток. Изучите пластину под микроскопом, чтобы обеспечить, что все клетки отдельный. Клетки перехода для 1.5 мл пробирок.
    5. Инвертируйте 1.5 мл пробирок с разбавленным клетки 2-3 раза. Затем возьмите 50 мкл аликвота клеток от середины трубы и добавить 0,5 мл пробирок с Трипановый синий (см. 4.5.1).
    6. Пипеткой раствор клеток вверх и вниз 2-3 раза. Добавление ячеек в Горяева и анализировать сразу. Ждать больше 10 мин может увеличить клеточной гибели или наличие клеток, которые заняли Трипановый синий.
    7. Тщательно мкл 10 клеток + Трипановый синий смеси для каждой стороны Горяева для выполнения репликации графов. Подсчет количества ячеек с помощью контраста микроскоп этапа. Не рассчитывать отмершие клетки или темно синие клетки, которые заняли Трипановый синий.
    8. Для получения общей ячейки номер, использовать средний мобильный номер отсчитывается от 4 углов Горяева и применить следующее уравнение:
      Означают номер ячейки x СМИ объем (мл) x 10,000 = ячейке номер/а
    9. Аспирационная и повторите процедуру на оставшихся скважинах. Измените СМИ на клетки, которые не засчитываются, пробирного повторять каждые 48 ч. на 4 дней и 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Подготовка блюда и СМИ для Neurite Assay
    1. Стоковый раствор 1 мг/мл поли d-лизина (PDL) в dH2O и стерилизовать фильтра. Разбавьте 1:10 в dH2O сделать 0,1 мг/мл раствора PDL и добавьте 1 mL к каждому блюду 35-мм. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
    2. В то же время готовить 30% расширения средств массовой информации (см. раздел 3.5) и добавить 5 мкг/мл (5 мкл/мл) раствора фибронектина (1 мг/мл бульона) в средствах массовой информации.
    3. После того, как средства массовой информации готовится, добавьте транспортные средства, факторы роста или наркотиков интереса в желаемой концентрации.
      Примечание: Это лучше добавить транспортное средство, факторы роста или наркотиков, в тома < 10% всего решения, чтобы избежать разбавления фибронектина и других компонентов в средстве расширения 30%.
    4. После 20 минут мыть посуду PDL 3 раза за 5 мин с dH2O для удаления избыточных PDL. Убедитесь, что блюда сухой перед добавлением средств массовой информации.
    5. Место 1 мл СМИ (с или без лекарств/роста факторов) + фибронектин решение в каждом PDL покрытием блюдо.
    6. Инкубируйте блюд при 37 ° C для по крайней мере 30 минут до гальванических клеток для обеспечения надлежащего крепления фибронектин к PDL.
    7. Для каждого эксперимента установите вверх 2-3 блюда за состояния (например, 3 автомобиля содержащих, блюда 3 наркотиков содержащих).
  2. Покрытие для Neurite Assay РНУ
    1. Смотрите раздел 3.4 для шагов поднять, разъединять, окатышей и Ресуспензируйте клетки.
    2. Пластина 50 000 ячеек на блюдо в блюда, приготовленные в разделе 5.1. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
    3. Инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 48 часов.
  3. Анализ плекситы
    1. После инкубации клеток для 48 ч, аспирационная среднего и исправить блюда с лед холодной 4% PFA для 20 мин.
    2. После 20 минут мыть посуду 3 раза за 5 мин с ПБС. После окончательной стирки, добавьте 1 mL 1 x PBS с 0,05% азид натрия.
    3. Анализируйте блюда слепо на этап микроскопа контраст на 32 X. Подсчет общей клетки и клетки с невритов 3, рядами 1 см, наугад, но воспроизводимые позиции. Граф минимум 150 ячеек на блюдо для обеспечения адекватного выборки.
      Примечание: Neurite определяется как расширение (процесс) из тела клетки, что является > 2 диаметров клетки тела в длину. Для ячеек с несколькими процессами длинный процесс считается для критерия. Клетки с процессами, которые являются < 2 клетки тела диаметром в длину, не включены (рис. 4).
    4. Сложите общее количество клеток и общее количество клеток с невритов в каждое блюдо. Вычислите % клеток с невритов. Средний процент клеток с невритов через репликацию блюда. Уверенность в экспериментальной воспроизводимость устанавливается, когда все строки в каждое блюдо похожи, и средние среди блюд очень похожи, с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) < 10%.
    5. Кроме того, анализ невритов, проводя immunocytochemistry для маркеров, такие как бета III-тубулина (TUJ1) или MAP2. После окрашивания для маркера интерес, принять 10 систематически случайных изображений на флуоресцентный микроскоп 10 X. Изображения по крайней мере 200 клеток. В этом случае приобретать изображения не слишком близко к краю блюдо. Анализируйте процент клеток с TUJ1 или MAP2 + невритов (см. рис. 10 в качестве примера).

6. NPC нейросферы миграции Assay

  1. Формирование нейросфера
    1. Добавьте 1 mL 100% расширения средств массовой информации в 35-мм блюдо с не покрытие субстрата. Инкубируйте блюда по крайней мере 15 минут при 37 ° C, прежде чем покрытие РНУ. Подготовка 2-3 блюда для обеспечения будет достаточно neurospheres для миграции assay клетки.
      Примечание: Отсутствие покрытие субстрата гарантирует, что НПС по-прежнему приостановлено в средствах массовой информации, которая необходима для формирования нейросферы. Покрытие блюда будет предотвратить образование нейросферы.
    2. Смотрите раздел 3.4 на шаги, чтобы поднять, разъединять и Пелле клетки. Ресуспензируйте Пелле клетки в 2-5 мл подогретым 100% расширения средств массовой информации. Пластина 1 миллион НИПы в каждом 35-мм блюдо, приготовленное в разделе 6.1.1.
    3. Инкубируйте NPC при 37 ° C для 48-96 h позволять NPC агрегатных и формы neurospheres. Оцените размер сферы, с использованием живой правителя на микроскопе фазово контрастной. Ждать для большинства сфер для достижения приблизительный диаметр 100 мкм (± 20 мкм) (Рисунок 5). Меньших сфер будет полностью дисперсных и разбить во время миграции assay.
  2. Подготовка пластин для Assay переноса нейросфера
    1. Наплыв ECM-имитировать гель аликвоты (см. раздел 3.2) 6 мл 30% расширения средств массовой информации. После подготовки ECM-имитировать gel/30% расширения СМИ решения добавьте транспортных средств, факторы роста или наркотиков интересов в желаемой концентрации.
      Примечание: Транспортное средство, наркотиков и фактор роста концентрации необходимо увеличить до учетной записи для добавления 200 мкл neurospheres в разделе 6.3.
    2. Пластина 1 мл ECM-мнемосхемы гель решение расширения Media /30% (± транспортных средств, факторы роста или наркотики) в одну скважину 6-ну плиты. Сделайте 2-3 скважины в экспериментальной условие. Кроме того 35-мм блюда могут быть использованы. Инкубировать пластины для по крайней мере 30 минут при 37 ° C.
      Примечание: Не аспирационная ECM-имитировать gel/30% расширение медиа решения для этого анализа. Покрытие сферах на атмосферный ECM-имитировать гель приведет к быстрому и избыточной миграции.
  3. Покрытие Neurospheres
    1. Сбор neurospheres, образованная в разделе 6.1 и поместите их в коническую пробирку. Вымойте 35 мм, собранные блюда с 1 мл раствора 1 x PBS для обеспечения всех neurospheres. Спин вниз собранных neurospheres на 100 g x 5 мин.
    2. Вновь приостановить neurospheres в 1-3 мл подогретым 30% расширения средств массовой информации. Если собирается 1 блюдо neurospheres, 1 мл средства массовой информации используется для Ресуспензируйте сферах. Если собираются 2 блюда, 2 мл средства массовой информации добавляются Ресуспензируйте сферах, и т.д. Пипетка мягко и использовать только P-1000 чтобы убедиться, что сферы не сломаны.
    3. Плита 200 мкл ресуспензированы neurospheres в ECM-имитировать gel/30% решение расширения в разделе 6.2. Пластины рок во всех направлениях, чтобы равномерно распределить neurospheres. Инкубировать пластины для 48 ч при 37° C.
    4. Удалите расширение медиа-решение ECM-имитировать gel/30% и исправить клетки в 4% PFA, мыть и хранить клетки в 1 x PBS + 0,05% азид натрия.
  4. Анализ Neurospheres
    1. Получение изображений всей neurospheres с использованием фазы настройки контрастности 10 X. Убедитесь, что сферы не соприкасаются друг с другом. Измерить средний миграции с помощью программного обеспечения ImageJ.
    2. Отслеживать внешний контур нейросферы, используя средство произвольной линии. Произвольной линии можно, щелкнув правой кнопкой на значке «прямой». Вручную трассировку с помощью мыши.
    3. Используйте функцию измерения для вычисления области трассировки. Убедитесь, что «район» выбран как считывание в окне «Набор измерений», найти на вкладке анализировать. Рисунок 6 см для трассировки внешнего контура синим цветом.
    4. Трассировка внутренней клеточной массы области сферы и меры. Рисунок 6 см для трассировки внутреннего контура в красном. Подсчитать среднее миграции путем вычитания внутренней клеточной массы из области общей нейросферы.
    5. Neurospheres мера, который exhibit плотно упакованных внутренней клеточной массы с клетками, миграция как непрерывный ковер (рис. 6).
    6. Не включать клетки вне ковра или отделяться от нейросферы для измерения. Смотрите Рисунок 6 примеры (кружил в белом) клеток, которые исключены из измерения внешней ковер. Анализируйте как минимум 20 neurospheres для каждого условия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одна из целей этих исследований является определение пролиферативной активности НПС, то есть, увеличение числа клеток. Это достигается путем оценки синтеза ДНК клеток всего населения, высок объём подход, который измеряет включение радиоактивных трассирующими третируют тимидин в клеточных экстрактов и отражает все клетки в S-фазе, являются ли они синтезирующий для 5 минут или всего два часа. Кроме того эти анализы позволяют Определение удельного ячеек введите S-фазе и числа общей клеток, более трудоемкий пробирного одиночных клеток. Клетки синтезировать ДНК в S-фазе, шаг, который предшествует митоз и деление клеток, которые должны произойти в целях увеличения числа клеток. Поскольку эти процессы занять некоторое время, изменения в синтезе ДНК, на 48 часов не могут быть связаны с изменениями в число клеток в этот момент времени. Тем не менее было установлено, что изменения в синтезе ДНК, на 48 часов надежно предсказать увеличение числа клеток в 4 и 6 дней.

При оценке синтез ДНК, клетки покрыты на плотности 100000 клеток (~ 50% притока) в 24-ну пластине и могут расти за 48 часов до проведения измерений. С помощью этого плотность гарантирует, что клетки напоминают их монослоя окружающей среды, но также не растут так быстро, в течение 48 ч, что средства массовой информации становится слишком кислой. Средства массовой информации, что является слишком кислой может существенно повлиять на метаболизм клеток и таким образом, изменить результаты распространения. Если конкретных клеточных линий высокой пролиферативной, исследователь следует рассмотреть возможность изменения клеток плотность, объем средств массовой информации, или средства массовой информации обмен частоты для предотвращения очень кислой условий. Если условия изменяются, важно быть последовательным, при сравнении различных клеточных линий, потому что контакт зависимые изменения в ячейке безусловно влияет на темпы роста. Простой дизайн этих анализов позволяет нам проверить различные факторы роста. Как показано на рисунке 7, добавления фактор роста фибробластов (ФБП, 10 нг/мл) для 48 часов увеличивает синтез ДНК на ~ 40%. Кроме того пробирного синтеза ДНК воспроизводимость как все клоны и люди показывают увеличение синтеза ДНК после стимуляции ФБП. Потенциал для базовых и ФБП и стимулируется синтез ДНК среди различных затрагивает лиц, а также потенциал клоновых изменчивости в тот же человек это показано в таблице 1. Благодаря этой изменчивости важно проверить несколько iPSC клонов на единицу, а также оценить как минимум 3 до 5 строк NPC производным от каждого клона различных iPSC. Минимум 3 экспериментов для каждой линии NPC была выполнена.

Assay синтеза ДНК позволяет нам быстро оценить многочисленные экспериментальные группы в духе высокой пропускной способностью и мера отражает сумму синтеза ДНК, независимо от продолжительности S-фаза (5 минут до 2 часов). Для определения доли клеток в S-фазе, работал пробирного вход S-фазе. Для этот assay клетки выращивают на такой же плотности, как упоминалось ранее разрешить монослоя как динамики происходят, но затем они отделить после 2 дней и возможность кратко придерживаться пластин для проведения анализа одной ячейки. Подсчет клеток в монослое может быть затруднено из-за высокой ячейке в контакт и региональной изменчивости в пластине. Эта парадигма позволяет нам модели клетки как монослоя и затем проанализировать их как отдельные клетки. Он также действует как методологически независимого подтверждения данных, полученных в assay синтеза ДНК. Как видно на рисунке 8, 48 часов ФБП (10 нг/мл) стимуляции увеличивается доля клеток, фазу S ~ 25%.

При оценке числа клеток, более низкую плотность ячеек используется, чем в вышеупомянутых анализов, с 50 000 ячеек покрытием за хорошо 24 хорошо пластины. Опять же это плотность был выбран для обеспечения что быстрее клеточных линий не растут так быстро, в течение 6-дневный рН среды становится слишком кислой и желтеет. На рисунке 9в то время как число клеток не могут быть значительно отличаются между элементом управления и группами ФБП (10 нг/мл) в 2 дня, изменения в синтезе ДНК, на 48 ч (рис. 7) прогнозирования изменений в число клеток в 4 и 6 дней.

В то время как NPC обычно выращиваются при высокой плотности, neurite assay проводится на плотности 50 000 клеток покрытием в 35-мм блюдо для того чтобы оценить отдельные клетки. Даже на этой низкой плотности, ВСНП культур Экспресс цитоскелетных протеинов и транскрипционные факторы, характерные для NPC NESTIN, SOX2 и PAX6 (Рисунок 10 A-D). Это означает, что low-density культивирования значительно не изменяет судьбу клеток в этот период времени. Кроме того аналогичные low-density условия были использованы в системах культуры крысы и мыши для обнаружения фенотипов, которые были в конечном итоге воспроизводимые в естественных условиях16,,1718,19, 20,21,22,23. После 48 часов инкубации небольшая часть НИПы начинают расширять невритов, как показано на рисунке 11А и B и количественно в график на рисунке 11C. Доля клеток, которые расширяют невритов, длина невритов и количество невритов/ячейки могут быть измерены для оценки развития параметров. Для того, чтобы точно оценить процент клеток с neurite нарост, важно, что клетки покрыты как отдельные ячейки или кластеры < 5 клеток и не столь большой агрегатов. Как видно на рисунке 10 E-F, клеток, несущих невритов (белая стрелка) также выразить незрелых нейрональных маркер тубулин бета III (TUJ1). Как уже упоминалось в методах, флуоресцентного изображения могут быть приобретены из TUJ1, окрашенных НПС и затем эти изображения могут быть подсчитаны для доли TUJ1 + невритов обеспечить нейрональных происхождения процессов. В нашей лаборатории анализы методом, либо дали статистически аналогичные результаты.

Простой дизайн и быстрый характер neurite assay также позволяют нам проверить последствия вследствие порока развития соответствующих факторов роста и цитокинов пептиды. Например, Рисунок 11 показывает, что нейропептида гипофиза аденилатциклаза, активация полипептид (PACAP, 3 Нм) увеличивает neurite нарост в РНУ. PACAP является важным фактором развития, имеет широкое выражение в ЦНС и было показано, что иметь важное значение для развития мозга. Грызун исследования в нашей лаборатории и другие лаборатории показали, что PACAP имеет широкое зависит от стадии развития эффекты, такие как регулирование neurite нарост, миграции и пролиферации в обоих задний мозг и переднего16,22, 29,30,31. Недавние исследования, проведенные атаман и др. (2016) с использованием искусственного человека корковых клеток фетальной указывают, что активность нейронов индуцирует 9 раз увеличение экспрессии генов PACAP, указывая значение пептидов в нейрональных развития человека32. Действительно, Таблица 2 показывает процент невритов управления и PACAP (3 Нм) условий между многочисленными линиями производным от не влияет лиц. Как показано в таблице 2, есть некоторые изменчивость в процентах невритов, выраженная в клеточных линий, полученных от различных клонов из того же и от NPC, полученных от разных людей. Однако эти не влияет лица имеют увеличение в neurite нарост в ответ на PACAP, указав воспроизводимость анализов.

Как neurite нарост клетки миграция является важным процессом развития необходимы для правильного подключения, Организации и проводки мозга. Neurospheres позволяют нам учиться NPC миграции в типичной высокой плотности условие, которое поддерживает контакт ячеек среди NPC (Рисунок 12). Развивающих соответствующие факторы также могут быть проверены на neurospheres для оценки их воздействия на миграцию. Например, на рисунке 12 показано, что PACAP (10 Нм) увеличивает миграции РНУ.

Figure 1
Рисунок 1: NPC на проход 3. NPC на P3 Экспресс несколько этап специфических маркеров, включая (A) плюрипотентных транскрипционный фактор, SOX2 транскрипционный фактор (B) для переднего НИПы, PAX6, и НЕСТИН NPC белков цитоскелета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема S-фаза вход пробирного. Хронология Assay вход S-фазе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: количественная вход S-фазе. (A) фазы изображения показаны фазы темный живой клетки (белые стрелки), фаза яркий мертвых клеток (белая звезда) и этап яркие живые клетки (зеленая стрелка). (B) флуоресцентных DAPI пятно, показывая конденсированных ядро в мертвых клеток (белая звезда) и крупными ядрами в живой клетке (белые и зеленые стрелки). (C) флуоресцентных EdU изображения показаны яркие EdU позитивные ядер (красная стрелка) и крапинами EdU позитивные ядер (Красная звезда). (D) фазы и флуоресцентные слияние изображений 3А - 3 C.

Figure 4
Рисунок 4: определение невритов. Этап контраст изображения РНУ. (A) A ячейки с процессом > 2 клетки тела в длину, тем самым встреча критерием для neurite. (B) ячейки с процессом < 2 клетки тела в длину и поэтому не считается neurite подшипник. (C) представляет ячейку с 2 процессов-длительный процесс оценивается по критерию neurite. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: выбор neurospheres для миграции assay. (A) фаза контраст изображения представителя поля neurospheres на 24 ч. сферах являются все менее 100 мкм и таким образом, не собираются для assay переноса. (B) этап контраст изображения представителя поля neurospheres на 72 ч. Все сферы находятся в пределах 100 мкм ± 20 мкм, о том, что они готовы быть собраны для assay переноса.

Figure 6
Рисунок 6: количественная оценка миграции. (A) фаза контраст изображение представитель нейросферы. (B) синий контур отображает трассировку для измерения общей нейросферы области. Красный показывает контуре используются для измерения области внутренние ячейки массы. Миграция определяется как общая нейросферы области внутренняя ячейка массы. Обратите внимание, что белые круги показывают клетки, которые не находятся в смежных ковер, как эти клетки исключаются из контуров миграции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Оценка синтеза ДНК. Представитель результаты контроля по сравнению с ФБП лечение РНУ. ФБП (10 нг/мл) увеличивает синтез ДНК на 48 ч (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 скважин/группы/эксперимент; 3 экспериментов). Планки погрешностей представляют SEM.

Figure 8
Рисунок 8: доля клеток, S-фазу. (A) фаза контрастность изображения NPC клетки инкубировали в управления по сравнению с ФБП (10 нг/мл) обработанной СМИ 48 ч. вставки представляют выше увеличение изображения клеток, витражи для флуоресцентных EdU маркер управления и 10 нг/мл ФБП СМИ. Красные стрелки показывают, что клетки, которые являются EdU позитивные и белые стрелки указывают на клетки, которые являются EdU отрицательные. (B) граф представительных результатов контроля против ФБП (10 нг/мл) лечение РНУ. FGF увеличивает S-фаза вход на 48 ч (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 блюда/группы/эксперимент; 3 экспериментов). Планки погрешностей представляют SEM.

Figure 9
Рисунок 9: перечисление клетки на 2, 4 и 6 дней. (A) фаза контрастность изображения клеток в управления и ФБП (10 нг/мл) обработанной СМИ на 2, 4 и 6 дней. (B) граф представительных результатов; Обратите внимание что ФБП (10 нг/мл) всегда не увеличение числа клеток на 2 дня, но на 4 и 6 дней увеличивается являются очевидными (р ≤0.05). (n = 2-4 скважин/группы/эксперимент; 3 экспериментов). Планки погрешностей представляют SEM.

Figure 10
Рисунок 10: характеристика НИПы в условиях низкой плотности. (A, C, E) Фаза контрастность изображения РНУ в условиях низкой плотности. (B) НИПы Экспресс стволовых/прогениторных клеток маркеры НЕСТИН (зеленый), SOX2 (красный) и ядерных маркеров DAPI (синий). (D) PAX6 (красный), DAPI (синий). (F) плотностью, клетки, расширяя невритов (белая стрелка) также выразить незрелых нейронах маркер TUJ1 (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11: Neurite нарост. (A) фазы контраст изображения РНУ. Черные стрелки указывают на клетки с невритов. (B) Добавление нейропептида PACAP (3 Нм) увеличивает процент клеток с невритов (p ≤1 x 10-2). (C) количественная оценка нарост neurite управления и 3 Нм PACAP содержащих средств массовой информации. (n = 2-4 блюда/группы/эксперимент; 3 экспериментов). Планки погрешностей представляют SEM.

Figure 12
Рисунок 12: нейросферы миграции. (A) фаза контрастность изображения neurospheres. (B) помимо PACAP (10 Нм) увеличивает нейросферы миграции клеток (p крупностью до 10-2) (C) количественная оценка миграции клеток. (n = 20 сферах/группы/эксперимент, 3 экспериментов). Планки погрешностей представляют SEM.

Средства массовой информации
Пациент Клонировать # CTRL ФБП
(10 нг/мл)
Пациент 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Пациент 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

Таблица 1: Синтез ДНК. Краткое изложение ценностей синтеза ДНК (в СУВП) РНУ производным от двух клонов iPSC за неизменным двое.

Средства массовой информации
Пациент Клонировать # CTRL PACAP
(3 Нм)
Пациент 1 1 13,60% 18.10%
2 16.50% 21,10%
Пациент 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21,10%

Таблица 2: Процент клеток с невритов. Краткое изложение процент клеток, несущих невритов в NPC производным от двух клонов iPSC за неизменным двое.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь представлены протоколы свидетельствуют быстрые и простые методы для изучения фундаментальных неврологического процессов и тестирования факторы роста и наркотиков с использованием клеток hiPSC производные нейронных прекурсоров. hiPSC технология революционизировал изучение патогенеза заболеваний нервной, предоставив нам беспрецедентный доступ к жить нейрональные клетки человека от пострадавших лиц. Действительно, имели место многочисленные исследования hiPSC нервной расстройств, включая синдром Ретта, Тимоти синдром, синдром Fragile-X, и шизофрении, которые обнаружены аберрации конкретных заболеваний в дендриты, синапсы и нейронов Функция4,33,34,35,36. Большинство из этих исследований были главным образом сосредоточены на неизлечимо продифференцировано, пост митотическая нейронов, которые, хотя считается относительно функционально незрелых, исключает изучение ранее неврологического процессов, таких как распространение и миграции. Эти последние процессы были сильно вовлечены в патогенез нервной расстройств и ордер дальнейшего изучения8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. Использование НИПы позволяет нам изучать эти важные события ранее обеспечивая при этом возможность исследовать более зрелой процессы как способность клеток для расширения незрелых аксоны в дендритов (невритов). Кроме того некоторые из этих анализов может также распространяться для изучения других параметров, таких как длина neurite, номер и ветвление или расстояние поехало ячейки.

Некоторые более новые исследования использовали органоид модель системы для изучения ранее развития событий в 3-D «Мини-мозг системы»1,,3940. Тем не менее даже в этих системах органоид, популяции клеток пролиферативной прекурсоров является ограниченным и раннего созревания и миграции трудно изучать15,39. Помимо ограничения изучение ранее развития явлений, использование неизлечимо продифференцировано нейронов или organoids часто является длительным, дорогостоящим и ограничивает количество переменных, которые могут быть оценены в системе. Это потому, что делает нейронов и organoids может потребовать вирусный индукции протоколы, Специальные инкубаторы и оборудование, несколько недель времени и большое количество средств массовой информации. В противоположность этому за исключением анализа синтеза ДНК (которая позднее рассматривается ниже), этот протокол может быть легко применен к исследованию нервной расстройств и не требует обширную подготовку, дорогостоящих инструментов и ресурсов или программного обеспечения. Легкость и относительно низкая стоимость добавления наркотиков и факторы роста в этих анализов, делают этот протокол полезным высок объём технологию для тестирования различных потенциальных методов лечения нервной и психоневрологических заболеваний. Кроме того поскольку факторы роста закон через определенный сотовой сигнальных путей, они могут также использоваться как инструменты для проверки потенциальных сигнализации дефектов в разработке систем. Наконец поскольку НИПы пролиферативной самостоятельного обновления населения, большое количество клеток могут быть произведены и замораживают позволяя экспериментов, чтобы эффективно проводиться без сделать НПС с iPSCs каждый раз.

Чтобы успешно использовать эти анализы, важно отметить следующие критические шаги. Этот Протокол устанавливает НИПы в различных условиях для поддержания и расширения против экспериментов. Конкретно хотя НПС наведены, вырос и пассированной в среде, содержащей нейронной индукции дополнение (НИС), наши экспериментальные условия уменьшить дополнения на 70%, что места клетки в условиях ограничения, позволяя нам возможность добавить обратно и тестирование важных факторов роста. Во-вторых важно, чтобы отслеживать прохождение НПС. В наших исследований мы обычно ограничили проход количество клеточных линий от P3 - P8. В проходах раньше, чем P3, некоторые строки не Экспресс энергично характерные маркеров. В выше отрывков в то время как некоторые линии клетки имеют очень стабильный рост ставок или ответы на факторы роста, другие клеточные линии могут иметь драматические изменения в рост клеток или ответ. Хотя Агентство не регулярно, мы и многие другие испытали это драматические изменения в пролиферативной ценам выше отрывков. Причина это неизвестно, но это изменение может отражать ограниченный потенциал самообновлению РНУ. определения, почему и как показатели распространения изменения над расширенной проходы могут обеспечить понимание развития и патогенез болезни, но дальнейшие исследования будет нужно быть сделанным. Наконец, протокол коммерческих нейронной индукции, который мы используем иногда может принести низкого качества нервных стволовых клеток, особенно если начальный iPSCs не высокого качества (т.е., у дифференциации клеток на границах колоний клеток, аномалии кариотипа). В некоторых случаях морфологию клеток искажается и выражение маркеров не присутствует. Не следует использовать эти культуры. В других случаях НИПы растут с плоскими «загрязнения» клетки, которые могут быть удалены с помощью дифференциальной клеток лечение отряд решение обеспечить практически чистый NPC населения перед использованием в экспериментах. Имея высокое качество NPC имеет решающее значение для надлежащего результаты: см. раздел материалы и оборудование для ссылки на нейронной индукции протокол, где можно найти образы высокого и низкого качества РНУ.

Для каждого из представленных анализов важно отметить следующие важные шаги, потенциальные ошибки и советы по устранению неполадок. Для количества клеток, синтез ДНК и neurite анализов важно для плиты клетки, отделить отдельные ячейки и не как кусты, как это может исказить мер синтез ДНК, клеток и neurite поведение. Чтобы убедиться, что не покрыты скопления клеток, образец небольшого количества клеток с P1000, пластины на слайде и проверить, если скопления клеток присутствуют. Если отмечены сгустки, Пипетка клетки вверх и вниз сломать вручную врозь кусты перед обшивкой. Для синтеза ДНК и номер assay клетки клетки поднимаются с энзимами для подсчета и анализа. Это имеет решающее значение для визуально подтвердить клетки полностью сняли с судна культуру для получения точных цифр и при необходимости может использоваться длительный инкубационный фермента. В случае низкой клеток или низкой СРМ для assay синтез ДНК, клетки может быть покрытием на более высокой начальной плотности, радиоактивных третируют [3H] - тимидина могут быть добавлены для двойной время (4 часа вместо 2), или третируют [3H] - тимидина концентрация может быть удвоен. Для neurite assay плотность первоначального покрытия может быть удвоен без риска расширять контакты к ячейке. Обратите внимание на распределение клеток через блюдо и подсчета количества строк 1 см, таким образом, что пробы каждой частью блюдо. Если neurite процент слишком мал на 48 ч, assay может быть продлен до 6 дней или тип подложки покрытия или концентрации могут быть изменены для содействия большей доли невритов. Однако важно отметить, что покрытие раз и методы, которые мы представили в протоколе были выбраны для оптимальной neurite нарост и клетки здравоохранения после тестирования многочисленных различных субстратов, концентрации субстрата и покрытие раз. Для assay нейросферы использование меньших дозаторов (P20, Р200) может привести к стрижка и поломки крупных сфер. Таким образом важно, что дозирование делается аккуратно и с P1000 или Серологические Пипетки. Для гранулирования neurospheres, низкой скорости (100 x g вместо 300 x g) также рекомендуется для предотвращения нейросферы диссоциации. Во время покрытия области, убедитесь, что сферы надлежащим образом расположены друг от друга как сферы сферу контакт может оказывать влияние миграции. В тех случаях, когда миграция слишком быстро или слишком медленно время инкубации можно уменьшилось или увеличилось соответственно. Покрытие поверхностей также могут быть изменены для изменения показателей миграции.

Хотя методы, используемые быстрый, простой и применимых к исследованию нервной расстройств, есть определенные ограничения. С одной стороны, многие из представил анализ (номер assay клетки, neurite assay, миграции пробирного) требуют следователи сделать субъективных решений (например, является ли это neurite? Мертв эта ячейка?) потенциально приводит к следователю предвзятости и Нижняя воспроизводимость. Однако проведение анализов слепых и строгие стандарты настройки для каждого принятого в assay, как показано в методах, можно улучшить эти предубеждения. Аналогичным образом эти анализы требуют ручного измерения и счетчики, которые могут быть много времени и труда интенсивной. Однако в лабораториях, которые имеют оборудование и технические ресурсы, эти анализы можно ускорить, с использованием автоматизированных клеток счетчиков и программ, которые могут проводить автоматизированные измерения41,42. В случае анализа синтеза ДНК, эти методы являются специфическими для наших клеток комбайн и сцинтилляционных машины (см. материалы и оборудование); Однако существуют другие доступные модели и методы, которые могут быть использованы для получения той же информации, таких как клетки комбайн Omnifilter-95. Для некоторых учреждений использования радиоактивных источников не возможно. В этом случае альтернативный метод, с помощью флуоресцентные тимидина аналоговый, например Эду, анализируется на флуоресцентные Гонав читатель, позволит для получения той же информации на массовый анализ ДНК синтеза44.

Наша система low-density культуре отделяет НИПы в отдельные клетки или небольшие сгустки, условие, которое отличается от плотно упакованных характер НИПы в развивающихся нервной трубки. Тем не менее НПС являются здоровыми и выразить соответствующие маркеры (рис. 1, Рисунок 10). Кроме того наши предыдущие исследования крыс и мышей корковых культур показаны параллельные выводы в культурах в пробирке , и в естественных условиях модели показывают, что полезность и целесообразность использования этого подхода16,17,18 , 19 , 24. Кроме того, эта система обеспечивает эффективный подход к понимать созревание клеток и изучения суб популяции клеток. К примеру иммуногистохимия может проводиться на neurite пробу для определения, какие конкретные нейрональных клеток расширение neurite. В конечном итоге несмотря на некоторые ограничения, этот уникальный протокол обеспечивает простой, мощный и быстрый методы для изучения нервной расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана губернатор Нью-Джерси Совета медицинских исследований и лечения аутизм (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Нэнси Lurie знаменует Фонд семьи, Mindworks благотворительный фонд свинца и еврейская община фонд более Метроуэст NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics