मानव तंत्रिका प्रणेता कोशिकाओं में Neurodevelopmental Phenotypes का तेजी से पता लगाने (NPCs)

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Developmental Biology

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Summary

Neurodevelopmental प्रक्रियाओं जैसे प्रसार, प्रवासन, और neurite की वृद्धि अक्सर neuropsychiatric रोगों में परेशान हैं । इस प्रकार, हम तेजी से प्रोटोकॉल वर्तमान और reproducibly मानव iPSC-व्युत्पंन NPCs में इन neurodevelopmental प्रक्रियाओं का आकलन । इन प्रोटोकॉल भी प्रासंगिक विकास कारकों और चिकित्सकीय एनपीसी विकास पर प्रभाव के आकलन की अनुमति ।

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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Abstract

मानव मस्तिष्क विकास ठीक आर्केस्ट्रा प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से आय, पहले प्रसार, प्रवासन, और neurite वृद्धि से प्रतिष्ठित चरणों के साथ; और बाद के चरणों axon/dendrite वृद्धि और synapse गठन की विशेषता । neurodevelopmental विकारों में, अक्सर एक या इन प्रक्रियाओं के अधिक बाधित कर रहे हैं, मस्तिष्क के गठन और समारोह में विषमताओं के लिए अग्रणी. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, शोधकर्ताओं ने अब मानव कोशिकाओं है कि वस्तुतः किसी भी कोशिका प्रकार, ंयूरॉंस सहित में विभेदित किया जा सकता है की एक प्रचुर मात्रा में आपूर्ति की है । इन कोशिकाओं को सामान्य मस्तिष्क विकास और रोग रोगजनन दोनों का अध्ययन किया जा सकता है. hiPSCs मॉडल neuropsychiatric रोग का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का एक नंबर टर्मिनल विभेदित ंयूरॉंस का प्रयोग करें या 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग organoids । जबकि ये विधियां मानव रोग रोगजनन के अध्ययन में अमूल्य सिद्ध हुई हैं, इसमें कुछ कमियां हैं । न्यूरॉन्स और organoids की पीढ़ी में hiPSCs का भेदभाव लंबा और महंगा प्रक्रियाओं है कि प्रयोगों और चर का आकलन किया जा सकता है की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, जबकि पोस्ट-mitotic न्यूरॉन्स और organoids dendrite की वृद्धि और synaptogenesis सहित रोग-संबंधी प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं, वे प्रसार और प्रवास जैसे पहले प्रक्रियाओं का अध्ययन बाधा । ऐसे आत्मकेंद्रित के रूप में neurodevelopmental विकारों में, प्रचुर मात्रा में आनुवंशिक और पोस्टमार्टम सबूत जल्दी विकास प्रक्रियाओं में दोषों का संकेत है । तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (NPCs), एक उच्च प्रफलन कोशिका आबादी, एक उपयुक्त मॉडल है जिसमें ontogenetic प्रक्रियाओं और रोग दीक्षा के बारे में सवाल पूछने के लिए हो सकता है । अब हम मानव NPCs के लिए माउस और चूहे cortical संस्कृतियों में विकास का अध्ययन करने से सीखा के तरीके का विस्तार । NPCs का उपयोग हमें रोग से संबंधित phenotypes की जांच करने और परिभाषित कैसे विभिंन चर (जैसे, विकास कारकों, दवाओं) प्रभाव प्रसार, प्रवास सहित विकास प्रक्रियाओं, और केवल कुछ ही दिनों में भेदभाव की अनुमति देता है । अंततः, इस toolset एक reproducible और उच्च प्रवाह तरीके में इस्तेमाल किया जा सकता है neurodevelopmental विकारों में रोग विशेष तंत्र और phenotypes की पहचान ।

Introduction

सरल जीवों और माउस मॉडलों के प्रयोग ने आधारभूत मस्तिष्क विकास के साथ-साथ रोग रोगजनन के तंत्र का आविर्भाव किया है. इन अग्रिमों के बावजूद, कई neuropsychiatric विकारों के एटियलजि मायावी रहता है क्योंकि सरल जीवों में नहीं सभी निष्कर्षों सीधे मानव रोग के जटिल पहलुओं के लिए प्रासंगिक हैं । इसके अलावा, मानव मस्तिष्क की अधिक से अधिक जटिलता अक्सर यह मुश्किल मानव विकास और पशुओं में विकारों के मॉडल के लिए बनाता है । विकास और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) प्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, दैहिक कोशिकाओं स्टेम कोशिकाओं में reऔर फिर मानव रोग का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है । hiPSCs में अग्रिम और "omic" प्रौद्योगिकियों (जीनोमिक्स, transcriptomics, प्रोटियोमिक्, metabolomics) मानव मस्तिष्क के विकास की समझ में क्रांतिकारी बदलाव के लिए वादा करता हूं । इन प्रौद्योगिकियों अब संभव एक "सटीक चिकित्सा" neuropsychiatric रोग के लक्षण वर्णन करने के लिए एक मामले पर दृष्टिकोण के आधार पर बनाते हैं ।

hiPSC रोग-मॉडलिंग क्षेत्र में वर्तमान प्रधान एक monolayer में विशिष्ट न्यूरॉन उपप्रकार में कोशिकाओं को अंतर करने के लिए या एक 3 डी संस्कृति प्रणाली मस्तिष्क विकास के दोहराऊंगा पहलुओं के लिए एक organoid बुलाया का उपयोग करने के लिए है1,2, 3. इन प्रणालियों का अध्ययन और मानव विकास और रोग4,5,6,7के अद्वितीय पहलुओं को उजागर करने में अविश्वसनीय रूप से मूल्यवान है । हालांकि, दोनों ंयूरॉंस संस्कृतियों और organoids अक्सर कहीं भी हफ्तों से संस्कृति में महीनों के लिए आवश्यकता से पहले वे अध्ययन के लिए तैयार हैं । इन प्रोटोकॉल की समय लेने वाली प्रकृति और इन संस्कृति प्रणालियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक संसाधनों की मात्रा अक्सर किया जा सकता है कि प्रयोगों की संख्या सीमित और चर की संख्या (जैसे विकास कारकों या दवाओं) है कि परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, कई अध्ययनों के बाद उपयोग mitotic न्यूरॉन्स और organoids ऐसी dendrite वृद्धि या synapse गठन, जो बाद में विकास में होने के रूप में प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि इन प्रक्रियाओं को ऐसे आत्मकेंद्रित और एक प्रकार का पागलपन के रूप में विकासात्मक विकारों की विकृति में फंसाया गया है, पहले विकास की घटनाओं है कि निश्चित ंयूरॉन भेदभाव से पहले होते है रोग रोगजनन के लिए भी महत्वपूर्ण है8 ,9,10,11,12,13. दरअसल, हाल के जीनोमिक अध्ययनों से पता चलता है कि मध्य भ्रूण अवधि, जो प्रसार के शामिल है, प्रक्रिया में वृद्धि, और प्रवास, autism रोगजनन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है11,14। इस प्रकार, यह तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए बेहतर इन पहले प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । Organoid प्रणालियों, जो अपने 3 डी प्रकृति और संगठित संरचना की वजह से बेहतर दोहराऊंगा मानव मस्तिष्क विकास के लिए विचार कर रहे हैं, एक जनक पूल है कि इन पहले की घटनाओं में से कुछ का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है शामिल । हालांकि, organoids में जनक जनसंख्या अक्सर विरल और अधिक तंत्रिका स्टेम या जनक कोशिकाओं से रेडियल glial कोशिकाओं की तरह है5,15. इस प्रकार, यह एक उच्च प्रवाह विधि के लिए एक सक्रिय रूप से प्रफलन कोशिका आबादी में neurodevelopment के प्रारंभिक दौर के अध्ययन के लिए फायदेमंद होगा ।

प्रयोगशाला में, हम एक प्रोटोकॉल है कि hiPSC-व्युत्पंन तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (NPCs), तंत्रिका स्टेम और जनक कोशिकाओं है कि अत्यधिक प्रफलन है की एक मिश्रित जनसंख्या का उपयोग करता है बनाया है, प्रसार के रूप में neurodevelopmental प्रक्रियाओं का अध्ययन, सेल प्रवासन, और प्रारंभिक प्रक्रिया (neurite) एक्सटेंशन । इन परख हमारी प्रयोगशाला में दशकों के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों से विकसित करने के लिए सफलतापूर्वक चूहे और माउस cortical संस्कृतियों में neurodevelopment अध्ययन16,17,18,19,20, 21,22,23. महत्वपूर्ण रूप से, यह भी दिखाया गया है कि चूहे और माउस संस्कृति प्रणालियों में परिभाषित phenotypes और विनियामक संकेत तंत्र है कि vivo मेंसक्रिय है की अत्यधिक भविष्यवाणी कर रहे हैं, इन तकनीकों के मूल्य का संकेत16, १७,१८,१९,२४. NPCs के लिए hiPSCs के प्रारंभिक भेदभाव के बाद, इन तरीकों हमें दिनों के एक मामले में महत्वपूर्ण विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति । इन तरीकों कई फायदे हैं: (1) वे थोड़ा परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है और लागू करने के लिए आसान कर रहे हैं, (2) कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां समय की एक छोटी अवधि में आयोजित किया जा सकता है, परिणामों के reproducibility की तेजी से पुष्टि के लिए अनुमति, और (3) ऐसे कोटिंग मैट्रिक्स, विकास कारकों के प्रभाव के रूप में संस्कृति चर, और दवाओं की गतिविधि जल्दी और लागत प्रभावी ढंग से परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, हम विविध विकासात्मक प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में extracellular विकास कारकों की अच्छी तरह से स्थापित भूमिका का लाभ उठाते हैं । NPCs विकास संकेतों का चयन करें कि सीधे प्रसार, neurite वृद्धि, और सेल प्रवास की तरह घटनाओं को उत्तेजित कर रहे थे, और पाया है कि वे दोष है कि नियंत्रण की स्थिति में स्पष्ट नहीं है की पहचान करने की क्षमता में वृद्धि19 , 25 , 26 , 27 , 28. इसी तरह, दवाओं का आकलन करने की आसानी के लिए एक शक्तिशाली अवसर प्रदान करता है परिशुद्धता दवा तकनीक को अपनाने के लिए विभिंन चिकित्सीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता का परीक्षण । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल एक उच्च प्रवाह की सुविधा, reproducible, और सीधी पद्धति का अध्ययन करने के लिए जल्दी मस्तिष्क विकास, रोग रोगजनन, और neurodevelopmental phenotypes पर विकास कारकों और दवाओं के संभावित लाभकारी प्रभाव ।

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Protocol

1. सुरक्षा प्रक्रियाओं और सुरक्षा के मंत्रिमंडल रखरखाव

  1. सुरक्षा स्तर-2 (बीएसएल-2) सुरक्षा प्रक्रियाओं
    1. बीएसएल-2 सामग्रियों के साथ कार्य करने पर संस्था के दिशानिर्देशों का पालन करें । संस्था के अभ् यास के अनुसार बीएसएल-2 सामग्रियों का निपटान । बीएसएल-2 सामग्रियों के लिए उपयोग किए जाने वाले कमरे और उपकरण दर्शाएं । सभी व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), लैब कोट और दस्ताने सहित पहनें ।
  2. सुरक्षा मंत्रिमंडल रखरखाव
    1. बीएसएल-2 स्तर की सामग्रियों के उपयोग के लिए प्रमाणित एक सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करें ।
    2. इस पर बारी के लिए अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश, और फिर स्प्रे सतहों के साथ 10% ब्लीच समाधान. ब्लीच समाधान 15 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें, नीचे कैबिनेट पोंछ, और उपयोग करने से पहले airflow पर बारी ।
  3. रेडियोधर्मी Tritiated [3एच]-thymidine (Tritium) सुरक्षा प्रक्रियाओं
    नोट: Tritium एक श्रेणी 5 रेडियोधर्मी स्रोत है, ' खतरनाक होने की सबसे अधिक संभावना नहीं ' श्रेणी । रेडियोधर्मिता के साथ कार्य करने के लिए संस्था के दिशानिर्देशों का पालन करें । कुछ संस्थानों tritium को संभालने के लिए प्रमाणपत्र या परमिट की आवश्यकता हो सकती है ।
    1. कैसे ठीक से संभाल और tritium के निपटान के लिए पर संस्था से प्रशिक्षण प्राप्त करें । उचित संदूकों में रेडियोधर्मी कचरे के निपटान, संस्था की नीतियों के अनुसार । tritium के साथ काम करते समय पीपीई पहनें ।

2. iPSCs से तंत्रिका प्रेरण

नोट: NPCs बनाने के लिए, एक प्रोटोकॉल है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तंत्रिका प्रेरण किट के साथ एक थोड़ा संशोधित संस्करण का पालन किया गया था । किट Neurobasal (एनबी) मीडिया और एक 50x तंत्रिका प्रेरण अनुपूरक (NIS), जो एक 1x तंत्रिका प्रेरण माध्यम (एनआईएम) बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है के होते हैं । NIS भी १००% विस्तार मध्यम (३.१ अनुभाग देखें) बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल के लिए एक लिंक सामग्री और उपकरण और संदर्भ खंड४३में पाया जाता है ।

  1. गद्यांश iPSCs जब वे ७०-८०% धाराप्रवाह हो जाते हैं ।
  2. प्लेट ३००,००० iPSCs 1 में एक अच्छी तरह से एक hESC-योग्य extracellular मैट्रिक्स की नकल जेल (ECM-जेल नकल) लेपित 6-खैर प्लेट फीडर के 2 मिलीलीटर से युक्त-रॉक अवरोधक के 5 माइक्रोन के साथ मुक्त iPSC माध्यम । ECM-नकल जेल के साथ कोटिंग कुओं पर निर्देशों के लिए धारा ३.२ देखें ।
  3. एक दिन बाद, iPSC मध्यम + रॉक अवरोधक और धो iPSCs 1x पंजाबियों के साथ एक बार हटा दें । iPSCs के लिए एनआईएम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: ५० मिलीलीटर एनआईएम की 50x NIS और २५० µ l (५० इकाइयों/एमएल, 5 μL/एमएल) के 1 मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा किया जाता है/Streptomycin (पी/एस) के ४९ एमएल के लिए एनबी मीडिया ।
  4. aspirating द्वारा हर 2 दिनों में तंत्रिका प्रेरण के परिवर्तन मीडिया मध्यम खर्च और एनआईएम के 2 मिलीलीटर के साथ की जगह जब तक कोशिकाओं (लगभग 4-5 दिन) धाराप्रवाह हो जाते हैं । बदलें मीडिया दैनिक, एक बार कोशिकाओं को धाराप्रवाह हैं ।
  5. एक ECM में एनआईएम और प्लेट में 7 दिनों के बाद यात्रा कोशिकाओं-जेल लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट १००% विस्तार मीडिया और 5 माइक्रोन रॉक अवरोधक के 2 मिलीलीटर युक्त । कोशिकाओं को इस बिंदु पर 0 गद्यांश (P0) NPCs माना जाता है । १००% विस्तार मीडिया बनाने के निर्देश के लिए नीचे दिए गए अनुभाग ३.१ देखें ।
  6. खंड ३.४ में वर्णित विधियों का उपयोग करके यात्रा कक्ष । कोशिकाओं P2 तक पहुंच चुके है और dissociating से पहले धाराप्रवाह मार्करों और प्रयोगों के लिए चढ़ाना के लिए दाग (चित्रा 1) के लिए प्रतीक्षा करें ।

3. संस्कृति मीडिया, कोटिंग, और NPCs के रखरखाव

  1. NPCs के रखरखाव के लिए मीडिया की तैयारी (१००% विस्तार मीडिया):
    1. DMEM/F12 के २४.५ एमएल के साथ २४.५ मिलीलीटर के संयोजन से १००% विस्तार मीडिया के ५० मिलीलीटर बनाएं ।
    2. DMEM/F12 + NB समाधान करने के लिए 50x NIS की 1 मिलीलीटर जोड़ें । P/S के २५० μL मीडिया के लिए समाधान जोड़ें ।
      नोट: मीडिया प्रशीतित किया जा सकता है (4 डिग्री सेल्सियस) और 2 सप्ताह तक के लिए इस्तेमाल किया । DMEM/F12 + NB + NIS ५०-एमएल वॉल्यूम के लिए के रूप में एक ही अनुपात का उपयोग कर वॉल्यूम का समायोजन करके मीडिया के छोटे खंड किए जा सकते हैं ।
  2. ECM की तैयारी जेल लेपित संस्कृति प्लेटें एनपीसी के रखरखाव के लिए
    1. Aliquot ECM-काम समाधान के 6 मिलीलीटर बनाने के लिए आवश्यक मात्रा में जेल की नकल । ECM-नकल जेल कमजोर पड़ने का पहलू बैच और लूत के लिए बहुत से भिंन होता है के बाद से विश्लेषण शीट के प्रमाण पत्र को देखकर aliquot मात्रा की गणना ।
    2. गल एक ECM-नकल जेल aliquot पर बर्फ और ठंड DMEM के 6 मिलीलीटर में भंग/
    3. एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से ECM जेल/DMEM/F12 समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ECM-नकल जेल-समाधान के साथ 6 अच्छी तरह से थाली मशीन ।
    4. महाप्राण ECM-नकल जेल समाधान के बाद 30 गर्मी और १००% विस्तार मीडिया या प्रशीतित प्लेटों (4 ° c, 1 सप्ताह तक) aspirating ECM-नकल जेल-समाधान के बिना के साथ की जगह ।
  3. NPCs का रखरखाव
    1. प्लेट एक ECM में १,५००,००० कोशिकाओं के घनत्व पर NPCs-जेल की नकल-लेपित अच्छी तरह से युक्त 2 १००% विस्तार मीडिया की मिलीलीटर ।
    2. 5% CO2के साथ एक नम वातावरण में ३७ ° c पर NPCs की मशीन ।
    3. p या कम, या गल NPCs के लिए, पर NPCs के लिए मीडिया के लिए रॉक अवरोधक के 5 माइक्रोन जोड़ें अत्यधिक कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए । बदलें 24 के बाद मीडिया रॉक अवरोधक हटाने के लिए एच ।
    4. यात्रा कोशिकाओं हर 4-9 दिन, पर निरभर है जब वे धाराप्रवाह हो । कोशिकाओं धाराप्रवाह माना जाता है जब वे एक घनी पैक पकवान सतह के पूरे नीचे कवर monolayer बन जाते हैं ।
    5. प्लेट एक 6 के एक अच्छी तरह से थाली के प्रति एक १,५००,००० कोशिकाओं के घनत्व पर NPCs (३.४ अनुभाग देखें) । निकालें खर्च मीडिया हर ४८ एच और १००% विस्तार मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
  4. लिफ्ट, अलग कर देना, और गोली के रखरखाव के लिए NPCs और/
    1. महाप्राण मध्यम, 1x पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । महाप्राण पंजाबियों और 1 में 1x सेल टुकड़ी समाधान के ५०० μL जोड़ें धाराप्रवाह NPCs. के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 10 मिनट के लिए मशीन ।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) के ५०० μL जोड़ें और अच्छी तरह से धो एक पी-१००० पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को हटाने सुनिश्चित करने के लिए । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल + पंजाबियों समाधान इकट्ठा । पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ फिर से थाली धो और ट्यूब के लिए तरल जोड़ें ।
    3. 5 गोली के लिए मिनट के लिए ३०० x g पर नीचे कोशिकाओं स्पिन ।
    4. सेल गोली से supernatant निकालें और फिर से 1-5 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM/F12 मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित । मीडिया के 1 से ४,०००,००० कोशिकाओं के घनत्व के लिए कोशिकाओं को पतला/ hemocytometer का उपयोग करके कक्षों को बढ़ाता है ।
    5. प्लेट कोशिकाओं की आवश्यक संख्या, या तो एनपीसी रखरखाव के लिए विशिष्ट (धारा ३.३) या व्यक्तिगत परख आयोजित किया जा रहा है (अधिक जानकारी के लिए बाद में वर्गों देखें) ।
    6. सेल निलंबन की मात्रा मीडिया के साथ समायोजित करें ताकि कोशिकाओं के 15 से १०० μL के बीच एक अच्छी तरह से/ इस छोटे चढ़ाना मात्रा सुनिश्चित करता है कि वहां भी सेल वितरण और है कि विकास कारकों, दवाओं, या मध्यम में सब्सट्रेट पतला नहीं कर रहे हैं ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन । बदलें मीडिया हर ४८ एच एनपीसी रखरखाव के लिए या व्यक्तिगत परख के लिए विशिष्ट विवरण देखें ।
  5. प्रायोगिक शर्तों के लिए मीडिया की तैयारी (30% विस्तार मीडिया)
    1. ७०% द्वारा १००% विस्तार मीडिया पतला (30% विस्तार अवधि) 1:1 DMEM/F12 + एनबी समाधान जोड़ने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के लिए मीडिया बनाने के द्वारा ।
    2. १००% विस्तार मीडिया के 6 मिलीलीटर जोड़कर 30% विस्तार मीडिया के 20 मिलीलीटर बनाने और DMEM के 7 मिलीलीटर और 7 मिलीलीटर/F12 मीडिया के साथ कमजोर । P/S समाधान के 5 µ l/एमएल जोड़ें ।
      नोट: यदि १००% मीडिया पहले से ही है p/s, तो जोड़ें 5 μL/mL के लिए संयुक्त-DMEM/F12 + NB = (14 एमएल) x (5 μL/एमएल) = ७० के बजाय १०० µ के पी/
    3. 30% विस्तार मीडिया के लिए वांछित सांद्रता में कोटिंग सब्सट्रेट और विकास कारकों जोड़ें ।

4. डीएनए संश्लेषण, एस चरण प्रविष्टि, और NPCs के सेल संख्या का आकलन

  1. डीएनए संश्लेषण के लिए तैयारी, एस चरण प्रविष्टि, और सेल संख्या परख
    1. डीएच2हे और फ़िल्टर निष्फल में पाली-डी-lysine (PDL) के 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान करें । पतला 1:10 डीएच में2हे बनाने के लिए एक ०.१ मिलीग्राम/एमएल PDL समाधान और एक अच्छी तरह से एक 24 अच्छी प्लेट या एक ३५ मिमी डिश के लिए 1 मिलीलीटर के प्रत्येक कुआं के लिए ३०० μL जोड़ें । आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    2. धो PDL वेल्स 5 मिन के लिए 3 बार डीएच2ओ महाप्राण डीएच2ओ और जोड़ें ३०० μL/अच्छी तरह से या 1 मिलीलीटर/laminin (5 μg/एमएल) के पकवान 1x पंजाबियों में पतला । parafilm के साथ प्लेटों को कवर और एक बाँझ, आर टी (12 से 24 घंटे) में रात भर में सुरक्षा कैबिनेट में रहते हैं ।
    3. 30% विस्तार मीडिया तैयार (३.५ अनुभाग देखें) के बाद 12 से 24 h. वाहनों, वृद्धि कारकों, या ब्याज की दवाओं की मात्रा में वांछित एकाग्रता पर 30% विस्तार माध्यम में कमजोर एनआईएस से बचने के लिए कुल समाधान के 10% से कम कर रहे हैं.
    4. 1x पंजाबियों (5 मिनट प्रत्येक) के साथ दो बार 24-खैर प्लेट की एक अच्छी तरह से धो लें । महाप्राण 1x पंजाबियों और (बिना या दवाओं/विकास कारकों के साथ) मीडिया के ४५० μL जोड़ें । ३७ ° c पर प्लेट थाली चढ़ाना पहले कम से 15 मिनट के लिए मशीन ।
    5. प्रत्येक प्रयोग के लिए, 2-3 कुओं या शर्त प्रति व्यंजन की स्थापना की ।
    6. प्लेट NPCs (३.४ अनुभाग देखें):
    7. एनपीसी ने डीएनए संश्लेषण परख: १००,००० कक्ष/
    8. S-चरण प्रविष्टि: ५००,००० कक्ष/
    9. सेल नंबर परख: ५०,००० कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली में/
  2. तंत्रिका प्रणेता कोशिका डीएनए संश्लेषण परख
    1. प्लेट १००,००० कोशिकाओं/ठीक एक 24-खैर प्लेट में और तपसिल/हालत में आकलन करें ।
    2. रेडियोधर्मी, tritiated [3एच] जोड़ें-संस्कृति में ४६ एच के बाद एक अच्छी तरह से (१.५ μCi/ 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: जब रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग, अपने संस्थान से प्रशिक्षण प्राप्त करते हैं, रेडियोधर्मिता सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें, और उचित निर्दिष्ट अपशिष्ट संदूकों में रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान ।
    3. निकालें और ठीक से रेडियोधर्मी मीडिया के निपटान के बाद 2 घंटे के ३०० μL जोड़ें पूर्व के ०.२५% trypsin-EDTA (०.५ मिमी) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से और गर्मी में ३७ ° c पर 20 मिनट के लिए ।
    4. सेल हार्वेस्टर पर बारी (सामग्री और उपकरण अनुभाग देखें) और पंप और सुनिश्चित करें कि पंप दबाव २०० साई के नीचे है । सेल हार्वेस्टर में अंतरिक्ष के माध्यम से फिल्टर कागज प्लेस और कागज अभिविन्यास चिह्नित करने के लिए सही कोने से आंसू ।
    5. एक खाली "खाली" ट्रे में सेल हार्वेस्टर के ट्यूबों का संग्रह और फिल्टर कागज गीला करने के लिए धोने प्रेस प्लेस । नमूना कुओं में ट्यूबों का संग्रह प्लेस और भागो (शुरू) ।
    6. जब सेल हार्वेस्टर नमूनों का संग्रह समाप्त हो गया है, लिफ्ट दबाना और अग्रिम फिल्टर कागज सभी नमूना सेट के लिए दोहराने के लिए । हमेशा एक खाली, "खाली" थाली में धोने ।
    7. एक प्रकाश स्रोत के तहत सूखे फिल्टर कागज और एक ट्रे में इसी शीशियों की स्थापना की । शीशियों में कागज चढे बाहर पंच और प्रत्येक शीशी में तरल पदार्थ कॉकटेल के 2 मिलीलीटर जोड़ें । कैप और लेबल शीशियों ।
    8. एक जुटाना मशीन पर प्रति मिनट गिनती (सीपीएम) पढ़ने से पहले कम से 1 h के लिए तरल पदार्थ कॉकटेल में गर्मी शीशियों ।
  3. एनपीसी ने एस चरण प्रवेश परख
    1. लिफ्ट, अलग कर देना, गोली, और पुनः निलंबित कोशिकाओं के लिए कदम के लिए अनुभाग ३.४ देखें ।
    2. थाली प्रति डिश ५००,००० कक्ष में ३५ मिमी व्यंजन धारा ४.१ में तैयार, इस चरण के लिए केवल 1 पकवान/
    3. सभी दिशाओं में आगे और पीछे के व्यंजन भी कोशिकाओं के वितरण सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन । ४६ एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
    4. तैयार ३ ३५ mm प्लेट्स के साथ लेपित PDL/Laminin के बाद शर्त प्रति 24 एच । उदाहरण के लिए, यदि 30% विस्तार मीडिया के १ ३५ mm डिश और 30% विस्तार मीडिया के १ ३५ mm डिश है + FGF (10 एनजी/फिर कोट 6 PDL/Laminin प्लेटें अगले दिन उपयोग के लिए ।
    5. 2 एच के लिए ४६ ज. मशीन के बाद संस्कृतियों के लिए 5 मिमी EdU के 2 μL/
    6. अलग कर देना और गोली कोशिकाओं (३.४ अनुभाग देखें) । पुन: निलंबित 30% विस्तार मीडिया या 30% विस्तार मीडिया के 3 मिलीलीटर के 3 मिलीलीटर में सेल गोली + वांछित विकास कारकों/
    7. थाली पूर्व लेपित PDL/Laminin व्यंजन पर पकवान प्रति 1 मिलीलीटर । सभी दिशाओं में आगे और पीछे के व्यंजन भी कोशिकाओं के वितरण सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन । 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन कोशिकाओं पकवान का पालन करने की अनुमति के लिए । सरलीकृत समयरेखा के लिए चित्र 2 देखें ।
  4. एस चरण प्रवेश विश्लेषण
    1. बर्फ के साथ फिक्स व्यंजन-ठंड 4% Paraformaldehyde (1x पंजाब में पीएफए) 20 मिनट के लिए । फिर, बर्तन धो 3 1x पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए बार ।
    2. बैक्टीरियल और फंगल विकास को रोकने के लिए ०.०५% सोडियम Azide के साथ 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें । सेल 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है अगर व्यंजन (parafilm के साथ बंद) को पंजाब + सोडियम Azide समाधान में रखा जाता है, हालांकि नहीं सभी प्रतिरक्षा एंटीजन विश्लेषण में लंबे समय से देरी के बाद अच्छी तरह से संरक्षित हैं ।
    3. एक वाणिज्यिक EdU प्रतिक्रिया किट का उपयोग करके परख कक्ष (निर्माता का प्रोटोकॉल देखें) । DAPI या एक और परमाणु मार्कर, और छवि का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं को दाग ।
    4. 10 व्यवस्थित यादृच्छिक क्षेत्रों (10x) में ब्लाइंड कुल जीवित कोशिकाओं (कुल सेल संख्या) से अधिक EdU सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात का आकलन करें । विश्लेषण में मृत कोशिकाओं को शामिल न करें ।
    5. दोनों चरण इसके विपरीत छवियों और फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग करने के लिए सकारात्मक EdU दाग निर्धारित करने के लिए और जो कोशिकाओं को मृत या जिंदा है पता लगाने के लिए (चित्रा 3) ।
    6. सभी कोशिकाओं है कि चरण इसके विपरीत सेटिंग्स में चिकनी और यहां तक कि कोशिका झिल्ली, और फ्लोरोसेंट DAPI परमाणु दाग द्वारा एक बड़ी unफ़्रेग्मेंटेड नाभिक, के रूप में इन कोशिकाओं को जीवित है गिनती (चित्र 3बी) ।
    7. सभी कोशिकाओं है कि चरण उज्ज्वल है बाहर, एक टूटी असमान कोशिका झिल्ली है, और DAPI फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा visualized के रूप में एक छोटे, गाढ़ा नाभिक है, के रूप में इन कोशिकाओं को मर चुके है (चित्र 3बी) । उज्ज्वल फ्लोरोसेंट edu है कि कोशिकाओं की पहचान के द्वारा शिक्षा की अभिव्यक्ति के लिए जीना कोशिकाओं का आकलन पूरे नाभिक या नाभिक में धब्बेदारing फ्लोरोसेंट धुंधला (चित्रा 3सी) को कवर दाग है ।
  5. एनपीसी ने सेल संख्या परख
    1. संस्कृति, लेबल में 2 दिनों के बाद और १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों तैयार करते हैं । प्रत्येक ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में, Trypan नीले रंग के 5 μL जोड़ें ।
    2. एक अच्छी तरह से 24 प्लेट की एक अच्छी तरह से, मध्यम निकालें और 10 से 15 मिनट के लिए मशीन में 1x सेल टुकड़ी समाधान और जगह के २०० μL जोड़ें ।
    3. आवंटित समय के बाद, एक बार कोशिकाओं को उठा लिया है, 1x पंजाबियों की वांछित राशि प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें ।
      नोट: आमतौर पर, दिन 2 पर, ३०० μL के साथ अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं के लिए 1x पंजाबियों की टुकड़ी समाधान की २०० μL जोड़ने, ५०० μL की कुल मात्रा के लिए । अतिरिक्त संस्कृति मशीन समय के साथ, के रूप में कोशिकाओं को और अधिक धाराप्रवाह हो, आवश्यक के रूप में कमजोर पड़ने की मात्रा में वृद्धि । उदाहरण के लिए, 4 दिन पर, 1x पंजाब के ५०० μL जोड़ें, और 6 दिन पर, 1x पंजाब के ८०० μL जोड़ें । कुल वॉल्यूम क्रमशः ७०० μL और 1 मिलीलीटर होगा ।
    4. एक पी १००० पिपेट का उपयोग करना, पिपेट ऊपर और नीचे प्रत्येक अच्छी तरह से 4 में 5 बार कोशिकाओं को दूर करने के लिए । एक खुर्दबीन के नीचे प्लेट की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं अलग है । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित ।
    5. पलटना १.५ पतला कोशिकाओं के साथ मिलीलीटर ट्यूबों 2 से 3 बार । फिर ट्यूब के बीच से कोशिकाओं की एक ५० μL aliquot ले और Trypan नीले (4.5.1 देखें) के साथ ०.५ मिलीलीटर ट्यूबों में जोड़ें.
    6. पिपेट कक्ष समाधान ऊपर और नीचे 2 से 3 बार । hemocytometer में कक्ष जोड़ें और तुरंत विश्लेषण करें । 10 मिनट से अधिक समय के लिए प्रतीक्षा कर रहा है सेल मौत या कोशिकाओं है कि Trypan नीला ले लिया है की उपस्थिति बढ़ सकता है ।
    7. ध्यान से 10 µ l जोड़ें सेल के + Trypan नीला मिश्रण hemocytometer के प्रत्येक पक्ष को दोहराने की गणना करने के लिए. चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । मृत कोशिकाओं या गहरे नीले रंग की कोशिकाओं है कि Trypan नीला ले लिया है गिनती मत करो ।
    8. कुल कक्ष संख्या प्राप्त करने के लिए, hemocytometer के 4 कोनों से गिना औसत कक्ष संख्या का उपयोग करें और निंन समीकरण को लागू:
      मतलब सेल नंबर एक्स मीडिया volume (एमएल) एक्स १०,००० = कुल सेल नंबर/
    9. महाप्राण और शेष कुओं पर प्रक्रिया को दोहराने । उन कक्षों पर मीडिया परिवर्तित करें, जिनकी गणना नहीं की जा रही है, प्रत्येक ४८ h 4 और 6 दिनों पर परख दोहराएं ।

5. एनपीसी ने Neurite परख

  1. Neurite परख के लिए व्यंजन और मीडिया की तैयारी
    1. डीएच2हे और फ़िल्टर निष्फल में पाली-डी-lysine (PDL) के 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान करें । एक ०.१ मिलीग्राम/एमएल PDL समाधान बनाने के लिए डीएच2हे में पतला 1:10 और प्रत्येक ३५ मिमी डिश के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें । आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    2. इस बीच, 30% विस्तार मीडिया तैयार (३.५ अनुभाग देखें) और जोड़ने के 5 μg/एमएल (5 µ एल/एमएल) के Fibronectin समाधान (1 mg/एमएल स्टॉक) मीडिया के लिए ।
    3. एक बार मीडिया तैयार है, वाहनों, विकास कारकों, या वांछित सांद्रता में ब्याज की दवाओं को जोड़ने ।
      नोट: यह सबसे अच्छा है वाहन जोड़ने के लिए, विकास कारकों, या दवाओं, वॉल्यूम पर < 10% कुल समाधान के कमजोर से बचने के लिए fibronectin और अंय घटकों में 30% विस्तार माध्यम है ।
    4. 20 मिनट के बाद, PDL बर्तन धो 5 मिनट के लिए 3 बार डीएच के साथ2O अतिरिक्त PDL को हटाने के लिए । सुनिश्चित करें कि मीडिया जोड़ने से पहले व्यंजन शुष्क हैं ।
    5. प्रत्येक PDL लेपित पकवान में (के साथ या ड्रग्स के बिना या विकास कारकों) + Fibronectin समाधान मीडिया की 1 मिलीलीटर प्लेस ।
    6. PDL करने के लिए Fibronectin की उचित लगाव को सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले न्यूनतम 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन की मशीन ।
    7. प्रत्येक प्रयोग के लिए, (उदा, 3 वाहन युक्त व्यंजन, 3 दवा युक्त व्यंजन) शर्त प्रति 2-3 व्यंजन की स्थापना की ।
  2. Neurite परख के लिए चढ़ाना NPCs
    1. लिफ्ट, अलग कर देना, गोली, और कोशिकाओं को स्थगित करने के लिए कदम के लिए ३.४ अनुभाग देखें ।
    2. प्लेट ५०,००० कक्ष ५.१ में तैयार व्यंजन में डिश प्रति कोशिकाओं । सभी दिशाओं में आगे और पीछे आंदोलन व्यंजन कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ।
    3. ४८ एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
  3. Neurites का विश्लेषण
    1. ४८ ज, महाप्राण माध्यम के लिए कोशिकाओं की मशीन के बाद, और 20 मिनट के लिए बर्फ ठंड 4% पीएफए के साथ तय व्यंजन ।
    2. 20 मिनट के बाद, धो बर्तन 1x पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार । अंतिम धोने के बाद, ०.०५% सोडियम Azide के साथ 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 32X पर एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप पर आंख बंद करके व्यंजन का विश्लेषण करें । कुल कोशिकाओं और कोशिकाओं 3, 1 सेमी पंक्तियों में neurites के साथ गिनती, यादृच्छिक लेकिन reproducible पदों पर चुना. पर्याप्त नमूना सुनिश्चित करने के लिए डिश प्रति १५० कोशिकाओं की एक ंयूनतम गिनती ।
      नोट: एक neurite एक विस्तार (प्रक्रिया) के रूप में सेल शरीर है कि > 2 सेल शरीर व्यास लंबाई में से परिभाषित किया गया है । एकाधिक प्रक्रियाओं वाले कक्षों के लिए, सबसे लंबी प्रक्रिया को कसौटी के लिए माना जाता है. उन प्रक्रियाओं वाले कक्ष जिनमें लंबाई में < 2 कक्ष मुख्य व्यास शामिल नहीं है (आरेख 4) ।
    4. एक साथ कक्षों की कुल संख्या और प्रत्येक डिश में neurites के साथ कक्षों की कुल संख्या जोड़ें । neurites के साथ कक्षों के% परिकलित करें । neurites के साथ कक्षों का औसत प्रतिशत व्यंजन दोहराने भर । प्रयोगात्मक reproducibility में विश्वास स्थापित किया जाता है जब प्रत्येक डिश के भीतर सभी पंक्तियों के समान हैं, और व्यंजन के बीच औसत बहुत समान हैं, मतलब (SEM) < 10% की मानक त्रुटि के साथ ।
    5. वैकल्पिक रूप से, बीटा-III-tubulin (TUJ1) या MAP2 जैसे मार्कर्स के लिए immunocytochemistry आयोजित करके neurites का विश्लेषण करें. ब्याज के मार्कर के लिए दाग के बाद, 10x पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 10 व्यवस्थित यादृच्छिक छवियों को ले लो । छवि कम से २०० कोशिकाओं । इस मामले में, नहीं भी पकवान के किनारे के पास छवियों का अधिग्रहण । TUJ1 या MAP2 + neurites वाले कक्षों के प्रतिशत का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए चित्र 10 देखें) ।

6. एनपीसी Neurosphere प्रवासन परख

  1. Neurosphere गठन
    1. कोई कोटिंग सब्सट्रेट के साथ एक ३५ मिमी डिश में १००% विस्तार मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें । NPCs चढ़ाना से पहले ३७ ° c पर कम से कम 15 मिनट के लिए व्यंजन बनाना । 2-3 व्यंजन तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें कि सेल प्रवास परख के लिए पर्याप्त neurospheres होगा ।
      नोट: एक कोटिंग सब्सट्रेट के अभाव सुनिश्चित करता है कि NPCs मीडिया, जो neurosphere गठन के लिए आवश्यक है में निलंबित रहते हैं । कोटिंग व्यंजन neurosphere गठन को रोकने जाएगा ।
    2. लिफ्ट, अलग कर देना, और गोली कोशिकाओं के लिए कदम पर धारा ३.४ देखें । पूर्व के 2-5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड १००% विस्तार मीडिया गरम । प्लेट १,०००,००० खंड 6.1.1 में तैयार प्रत्येक ३५ मिमी पकवान में NPCs ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर NPCs के लिए ४८ ९६ एच के लिए NPCs की अनुमति के लिए कुल और फार्म neurospheres । एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप पर एक जीवित शासक का उपयोग कर क्षेत्र आकार का आकलन करें । सबसे क्षेत्रों के लिए रुको १०० µm (± 20 माइक्रोन) (चित्रा 5) के एक अनुमानित व्यास तक पहुंचने के लिए । छोटे क्षेत्रों पूरी तरह से फैलाने और पलायन परख के दौरान अलग तोड़ देंगे ।
  2. Neurosphere प्रवास के लिए प्लेटों की तैयारी परख
    1. भंग ECM-जेल aliquots नकल (३.२ अनुभाग देखें) में 6 30% विस्तार मीडिया के मिलीलीटर । एक बार ECM जेल/30% विस्तार मीडिया समाधान तैयार है, वाहनों, विकास कारकों, या वांछित सांद्रता में हितों की दवाओं को जोड़ने ।
      नोट: वाहन, दवा, और विकास कारक सांद्रता धारा ६.३ में neurospheres के २०० µ एल के अलावा के लिए खाते में वृद्धि की जरूरत है ।
    2. प्लेट 1 ECM की मिलीलीटर-जेल/30% विस्तार मीडिया समाधान (± वाहन, विकास कारकों, या ड्रग्स) एक में अच्छी तरह से एक 6-खैर प्लेट की । प्रायोगिक शर्त के अनुसार 2-3 कुओं बनाओ । वैकल्पिक रूप से, ३५-mm व्यंजन इस्तेमाल किया जा सकता है । ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट के लिए मशीन प्लेटें
      नोट: इस परख के लिए ECM-नकल जेल/30% विस्तार मीडिया समाधान महाप्राण मत करो । एक aspirated ECM पर चढ़ाना क्षेत्रों-नकल जेल तेजी से और अधिक प्रवास के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  3. चढ़ाना Neurospheres
    1. धारा ६.१ में गठित neurospheres इकट्ठा करें और उन्हें एक शंकु ट्यूब में रखें । सभी neurospheres एकत्र कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ ३५ mm व्यंजन धो लें । 5 मिनट के लिए १०० x g पर एकत्र neurospheres नीचे स्पिन ।
    2. पुन: पूर्व के 1-3 मिलीलीटर में neurospheres स्थगित 30% विस्तार मीडिया गरम । neurospheres की 1 डिश एकत्र की है, तो मीडिया के 1 मिलीलीटर क्षेत्रों reसस्पेंड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अगर 2 व्यंजन एकत्र कर रहे हैं, मीडिया के 2 मिलीलीटर reसस्पेंड क्षेत्रों में जोड़ रहे हैं, आदि धीरे पिपेट और केवल एक पी १००० क्षेत्रों को सुनिश्चित करने के लिए उपयोग नहीं टूट रहे हैं ।
    3. प्लेट २०० μL में reसस्पैंड neurospheres के ECM-नकल जेल/30% विस्तार धारा ६.२ में बनाया समाधान । रॉक प्लेटें सभी दिशाओं में समान रूप से neurospheres वितरित करने के लिए । ३७डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच के लिए प्लेटें ।
    4. निकालें ECM-नकल जेल/30% विस्तार मीडिया समाधान और 4% पीएफए में कोशिकाओं को ठीक, धो, और 1x में कोशिकाओं रखने + ०.०५% सोडियम Azide ।
  4. Neurospheres का विश्लेषण
    1. 10x पर चरण कंट्रास्ट सेटिंग्स का उपयोग कर पूरे neurospheres की छवियों को प्राप्त । सुनिश्चित क्षेत्रों एक दूसरे को छू नहीं रहे हैं । ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके औसत माइग्रेशन मापने ।
    2. मुक्तहस्त रेखा उपकरण का उपयोग कर neurosphere के बाहरी समोच्च का पता लगाएँ । मुक्तहस्त रेखा "सीधे" लाइन आइकन पर राइट-क्लिक करके पहुँचा जा सकता है । माउस का उपयोग करके मैंयुअली ट्रेस करना ।
    3. ट्रेस के क्षेत्र की गणना करने के लिए माप फ़ंक्शन का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि "क्षेत्र" "सेट माप" विंडो में एक पठन-आउट के रूप में चयनित है विश्लेषण टैब के अंतर्गत पाया । नीले रंग में बाहरी समोच्च का पता लगाने के लिए चित्रा 6 देखें ।
    4. क्षेत्रों और माप क्षेत्र के भीतरी कोशिका द्रव्यमान का पता लगाएँ । लाल रंग में भीतरी समोच्च का पता लगाने के लिए चित्रा 6 देखें । कुल neurosphere क्षेत्र से भीतरी कोशिका द्रव्यमान घटा कर औसत माइग्रेशन बढ़ाता है ।
    5. उपाय neurospheres है कि प्रदर्शन के एक निरंतर कालीन के रूप में बाहर पलायन कोशिकाओं के साथ एक घनी पैक भीतरी कोशिका द्रव्यमान (चित्रा 6) ।
    6. कक्ष कालीन के बाहर या माप के लिए neurosphere से अलग शामिल न करें । बाह्य कालीन मापन से बहिष्कृत किए गए कक्षों के उदाहरणों (सफ़ेद में गोलाकार) के लिए चित्र 6 देखें । प्रत्येक शर्त के लिए 20 neurospheres की एक ंयूनतम विश्लेषण ।

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Representative Results

इन अध्ययनों का एक लक्ष्य के लिए NPCs की प्रफलन गतिविधि परिभाषित है, कि है, सेल की संख्या में वृद्धि हुई है । यह कुल कोशिका जनसंख्या, एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण है कि रेडियोधर्मी अनुरेखक tritiated thymidine के सेल निष्कर्षों में शामिल करने के उपाय के डीएनए संश्लेषण का आकलन करके हासिल की है, और एस चरण में लगे सभी कोशिकाओं को दर्शाता है, चाहे वे कर रहे हैं 5 मिनट या पूरे दो घंटे के लिए synthesizing । इसके अतिरिक्त, इन परख कोशिकाओं के अनुपात के निर्धारण की अनुमति है कि एस चरण और कुल सेल संख्या, एकल कोशिकाओं के एक और अधिक श्रम गहन परख दर्ज करें । कोशिकाओं एस में डीएनए संश्लेषित चरण, एक कदम है कि बँटवारा और कोशिका विभाजन है, जो क्रम में सेल संख्या बढ़ाने के लिए होने चाहिए पहले । चूंकि इन प्रक्रियाओं में कुछ समय लगेगा, ४८ घंटे में मूल्यांकन डीएनए संश्लेषण में परिवर्तन इस समय बिंदु पर कक्ष संख्या में परिवर्तन के साथ संबद्ध नहीं हो सकता है । बहरहाल, यह पाया गया कि ४८ घंटे में डीएनए संश्लेषण में परिवर्तन मज़बूती से 4 और 6 दिनों में सेल संख्या की वृद्धि की भविष्यवाणी.

डीएनए संश्लेषण का आकलन करने में, कोशिकाओं के एक घनत्व पर चढ़ाया जाता है १००,००० कोशिकाओं (~ ५०% धाराप्रवाह) एक 24 अच्छी थाली में और माप करने से पहले ४८ घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है. इस घनत्व का उपयोग सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को उनके monolayer वातावरण के समान है, लेकिन यह भी एक ४८ एच अवधि में इतनी जल्दी नहीं बढ़ती है कि मीडिया भी अंलीय हो जाता है । मीडिया है कि बहुत अंलीय है काफी सेल चयापचय को प्रभावित कर सकते है और इस प्रकार, परिवर्तन प्रसार परिणाम । यदि विशिष्ट कोशिका लाइनों अत्यधिक प्रफलन हैं, शोधकर्ता उच्च अंलीय स्थितियों को रोकने के लिए सेल घनत्व, मीडिया मात्रा, या मीडिया विनिमय आवृत्ति फेरबदल पर विचार करना चाहिए । यदि स्थितियाँ परिवर्तित हो जाती हैं, तो भिन्न कक्ष पंक्तियों की तुलना करते समय संगत होना महत्वपूर्ण है क्योंकि कक्ष-से-कक्ष संपर्क निर्भर परिवर्तन निश्चित रूप से वृद्धि दर को प्रभावित करते हैं. इन परख के सरल डिजाइन हमें विभिंन विकास कारकों का परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है । के रूप में चित्रा 7में देखा, fibroblast वृद्धि कारक के अलावा (FGF, 10 एनजी/एमएल) ४८ घंटे के लिए ~ ४०% द्वारा डीएनए संश्लेषण बढ़ जाती है । इसके अलावा, डीएनए संश्लेषण परख reproducible है के रूप में सभी क्लोनों और व्यक्तियों FGF उत्तेजना के बाद डीएनए संश्लेषण में वृद्धि दिखा । आधारभूत और FGF की परिवर्तनशीलता के लिए संभावित विभिंन अप्रभावित व्यक्तियों के बीच डीएनए संश्लेषण को प्रेरित किया, साथ ही साथ एक ही व्यक्ति में क्लोनिंग परिवर्तनशीलता के लिए संभावित तालिका 1में प्रदर्शित किया जाता है । इस परिवर्तनशीलता के कारण, यह व्यक्तिगत प्रति एकाधिक iPSC क्लोन परीक्षण महत्वपूर्ण है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में 3 से 5 एनपीसी प्रत्येक अलग iPSC क्लोन से व्युत्पंन लाइनों की एक ंयूनतम आकलन । प्रत्येक एनपीसी लाइन के लिए 3 प्रयोगों का एक ंयूनतम प्रदर्शन किया गया ।

डीएनए संश्लेषण परख हमें तेजी से एक उच्च प्रवाह फैशन में कई प्रयोगात्मक समूहों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है और माप एस चरण अवधि (5 मिनट से 2 घंटे) की परवाह किए बिना डीएनए संश्लेषण की कुल योग को दर्शाता है. एस-फेज में लगे कक्षों के अनुपात को परिभाषित करने के लिए एस-फेज की प्रवेश परख कार्यरत थी । इस परख के लिए, कोशिकाओं को एक ही घनत्व पर बड़े हो रहे है के रूप में पहले monolayer की अनुमति देने के लिए उल्लेख किया है, लेकिन फिर वे 2 दिनों के बाद असंबद्ध है और संक्षेप में प्लेटों का पालन करने के लिए एकल सेल विश्लेषण आचरण की अनुमति दी । एक monolayer में गिनती कोशिकाओं को उच्च कोशिका के लिए सेल संपर्क और प्लेट में क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता के कारण मुश्किल हो सकता है । इस प्रतिमान हमें एक monolayer के रूप में मॉडल के लिए और फिर उंहें एकल कोशिकाओं के रूप में विश्लेषण की अनुमति देता है । यह भी डीएनए संश्लेषण परख में प्राप्त आंकड़ों के एक methodologically स्वतंत्र पुष्टि के रूप में कार्य करता है । के रूप में चित्रा 8में देखा, FGF के ४८ घंटे (10 एनजी/उत्तेजना S-चरण में प्रवेश कोशिकाओं के अनुपात ~ 25% से बढ़ जाती है ।

सेल संख्या का आकलन करने में, एक कम सेल घनत्व aforementioned परख में की तुलना में प्रयोग किया जाता है, ५०,००० कोशिकाओं के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जा रहा है । फिर, इस घनत्व सुनिश्चित करने के लिए चुना गया था कि तेजी से सेल लाइनों इतनी जल्दी से 6 दिन की अवधि में विकसित नहीं है कि माध्यम का पीएच भी अंलीय हो जाता है और पीले रंग बदल जाता है । चित्रा 9में, जबकि सेल नंबर नियंत्रण और FGF के बीच काफी अलग नहीं हो सकता है (10 एनजी/एमएल) समूहों में 2 दिन, ४८ पर डीएनए संश्लेषण में परिवर्तन एच (चित्रा 7) 4 और 6 दिनों में सेल संख्या में परिवर्तन के पूर्वानुमान हैं ।

जबकि NPCs आम तौर पर उच्च घनत्व पर, neurite परख ५०,००० एक ३५-mm डिश में चढ़ाया कोशिकाओं के एक घनत्व पर आयोजित की जाती है क्रम में एकल कोशिकाओं का आकलन कर रहे हैं । यहां तक कि इस कम घनत्व पर, एनपीसी ने संस्कृतियों cytoskeletal प्रोटीन और प्रतिलेखन कारकों NPCs की विशेषता जैसे NESTIN, SOX2, और PAX6 (चित्रा 10 ए डी) । यह इंगित करता है कि एक कम घनत्व संवर्धन काफी इस समय सीमा में सेल भाग्य बदल नहीं है । इसके अलावा, इसी तरह के कम घनत्व की स्थिति चूहे और माउस संस्कृति प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया है कि phenotypes का पता लगाने के लिए अंततः vivo16,17,18,19में reproducible थे, 20,21,22,23. मशीन के ४८ घंटे के बाद, NPCs के एक छोटे से अनुपात के रूप में चित्रा 11A और बी में देखा neurites विस्तार शुरू , और चित्रा 11Cमें ग्राफ में quantified । neurites का विस्तार करने वाले कक्षों का अनुपात, neurites की लंबाई, और neurites/सेल की संख्या को विकासात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है । आदेश में neurite के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत का सही आकलन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं या < 5 कोशिकाओं के समूहों के रूप में और नहीं बड़े समुच्चय के रूप में चढ़ाया जाता है । जैसा कि चित्रा 10 ई एफमें देखा, कोशिकाओं असर neurites (सफेद तीर) भी अपरिपक्व ंयूरॉंस मार्कर बीटा III tubulin (TUJ1) व्यक्त करते हैं । के रूप में तरीकों में उल्लेख किया है, फ्लोरोसेंट छवियों TUJ1 सना हुआ NPCs का अधिग्रहण किया जा सकता है और फिर इन छवियों TUJ1 के अनुपात के लिए गिना जा सकता है + neurites प्रक्रियाओं के ंयूरॉन मूल सुनिश्चित करने के लिए । हमारी प्रयोगशाला में, या तो विधि द्वारा विश्लेषण सांख्यिकीय समान परिणाम मिले हैं ।

सरल डिजाइन और neurite परख के तेजी से प्रकृति भी हमें विकास प्रासंगिक विकास कारकों, साइटोकिंस के प्रभाव का परीक्षण करने की अनुमति है, और पेप्टाइड्स । उदाहरण के लिए, चित्र 11 से पता चलता है कि neuropeptide पिट्यूटरी adenylate cyclase सक्रिय पॉलीपेप्टाइड (PACAP, 3 एनएम) neurite में NPCs वृद्धि बढ़ जाती है. PACAP एक महत्वपूर्ण विकासात्मक कारक है कि सीएनएस में व्यापक अभिव्यक्ति है और करने के लिए दिखाया गया है मस्तिष्क के विकास में महत्वपूर्ण हो । हमारी प्रयोगशाला और अंय प्रयोगशालाओं में कुतर अध्ययनों से पता चला है कि PACAP व्यापक मंच पर निर्भर विकासात्मक प्रभाव जैसे neurite वृद्धि विनियमन, प्रवास, और दोनों hindbrain और forebrain16,22में प्रसार है, 29,30,31. आत्म्याने एट अल द्वारा हाल ही में अध्ययन । (२०१६) का उपयोग कर संस्कृति मानव भ्रूण cortical कोशिकाओं का संकेत है कि न्यूरॉन गतिविधि PACAP जीन अभिव्यक्ति में एक 9 गुना वृद्धि, मानव न्यूरॉन्स विकास में पेप्टाइड्स के महत्व का संकेत३२लाती है. दरअसल, तालिका 2 नियंत्रण और PACAP (3 एनएम) में neurites के प्रतिशत से पता चलता है कई अप्रभावित व्यक्तियों से व्युत्पंन लाइनों के बीच की स्थिति । के रूप में 2 तालिकामें देखा, वहां एक ही व्यक्ति से अलग क्लोन और विभिंन व्यक्तियों से व्युत्पंन NPCs से व्युत्पंन सेल लाइनों में व्यक्त neurites के प्रतिशत में कुछ परिवर्तनशीलता है । हालांकि, इन अप्रभावित व्यक्तियों PACAP के जवाब में neurite वृद्धि में वृद्धि हुई है, परख के reproducibility का संकेत है ।

neurite वृद्धि की तरह, सेल माइग्रेशन एक महत्वपूर्ण विकासात्मक उचित कनेक्शन, संगठन, और मस्तिष्क के तारों के लिए आवश्यक प्रक्रिया है । Neurospheres हमें एक ठेठ उच्च घनत्व की हालत में एनपीसी प्रवासन का अध्ययन करने की अनुमति है कि सेल NPCs के बीच सेल संपर्क (चित्रा 12) का कहना है । विकास से संबंधित कारकों को भी neurospheres पर परीक्षण किया जा सकता है प्रवास पर उनके प्रभाव का आकलन । उदाहरण के लिए, चित्र 12 दिखाता है कि PACAP (10 एनएम) NPCs का माइग्रेशन बढ़ाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:3 मार्ग पर NPCs । पी पी पी पर NPCs कई चरण-विशिष्ट मार्करों सहित (क) pluripotent प्रतिलेखन कारक, SOX2 (ख) प्रतिलेखन कारक forebrain NPCs, PAX6 के लिए विशिष्ट है, और एनपीसी ने cytoskeletal प्रोटीन NESTIN । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एस चरण प्रवेश परख के योजनाबद्ध । एस चरण प्रवेश परख की समयरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: एस-चरण प्रविष्टि को बढ़ाता है. चरण-अंधेरे लाइव कोशिकाओं (सफेद तीर), एक चरण-उज्ज्वल मृत कोशिका (सफेद तारा) और एक चरण उज्ज्वल लाइव सेल (हरा तीर) दिखाने के चरण छवि । (ख) फ्लोरोसेंट DAPI एक जीवित कोशिका (सफेद और हरे रंग के तीर) में एक मृत कोशिका (सफेद सितारा) और बड़े नाभिक में गाढ़ा नाभिक दिखा दाग । (C) चमकदार edu धनात्मक नाभिक (लाल तीर) और धब्बेदार edu धनात्मक नाभिक (लाल सितारा) को दिखाने वाली फ्लोरोसेंट EdU छवि । (घ) चरण और छवियों के फ्लोरोसेंट विलय 3 सी-3 सी ।

Figure 4
आरेख 4: neurites की पहचान करना. NPCs की चरण-कंट्रास्ट छवियां । (a) एक प्रक्रिया के साथ एक कक्ष > 2 लंबाई में सेल निकायों, जिससे एक neurite के लिए कसौटी पर बैठक । (B) किसी कक्ष में प्रक्रिया < 2 सेल निकायों की लंबाई के साथ, और इसलिए neurite-असर नहीं माना जाता है । (C) 2 प्रक्रियाओं के साथ किसी कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है-neurite मापदंड के लिए लंबी प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: माइग्रेशन परख के लिए neurospheres का चयन करना. (क) neurospheres के एक प्रतिनिधि क्षेत्र के चरण विपरीत छवि पर 24 ज. क्षेत्रों सभी १०० माइक्रोन से कम कर रहे है और इस प्रकार, प्रवास परख के लिए एकत्र नहीं कर रहे हैं । (ख) ७२ एच पर neurospheres के एक प्रतिनिधि क्षेत्र के चरण कंट्रास्ट छवि सभी क्षेत्रों १०० माइक्रोन ± 20 µm रेंज के भीतर हैं, यह दर्शाता है कि वे माइग्रेशन परख के लिए एकत्र होने के लिए तैयार हैं ।

Figure 6
चित्र 6: माइग्रेशन को बढ़ाता है. (a) एक प्रतिनिधि neurosphere के चरण कंट्रास्ट छवि । (B) नीली बाह्यरेखा कुल neurosphere क्षेत्र को मापने के लिए ट्रेस को प्रदर्शित करती है । लाल भीतरी कोशिका द्रव्यमान के क्षेत्र को मापने के लिए प्रयुक्त समोच्च से पता चलता है । माइग्रेशन कुल neurosphere क्षेत्र-भीतरी सेल मास क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है । नोट, सफ़ेद वृत्तियां उन कक्षों को दिखाती है जो क्रमिक कालीन में नहीं होते हैं, क्योंकि इन कक्षों को माइग्रेशन आकृति से बाहर रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: डीएनए संश्लेषण का आकलन. FGF-इलाज NPCs. FGF बनाम नियंत्रण के प्रतिनिधि परिणाम (10 एनजी/एमएल) ४८ एच (पी ≤ 1 एक्स 10-3) में डीएनए संश्लेषण बढ़ जाती है । (n = 2-4 वेल्स/समूह/प्रयोग; 3 प्रयोग) । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

Figure 8
चित्र 8: S-चरण में प्रवेश करने वाले कक्षों का अनुपात. (क) एनपीसी ने नियंत्रण में FGF बनाम (10 एनजी/एमएल) ४८ घंटे के लिए इलाज मीडिया की मशीन के चरण इसके विपरीत छवियों नियंत्रण में फ्लोरोसेंट EdU मार्कर और 10 एनजी/एमएल FGF मीडिया के लिए दाग कोशिकाओं के उच्च आवर्धन छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । लाल तीर उन कक्षों को इंगित करते हैं, जो edu धनात्मक है और सफ़ेद तीर उन कक्षों को इंगित करते हैं, जो edu नकारात्मक हैं । (ख) नियंत्रण के प्रतिनिधि परिणामों का ग्राफ बनाम FGF (10 एनजी/NPCs. FGF बढ़ जाती है S-चरण प्रविष्टि पर ४८ h (p ≤ 1 x 10-3) । (n = 2-4 व्यंजन/समूह/प्रयोग; 3 प्रयोग) । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

Figure 9
चित्र 9:2, 4 और 6 दिनों में कक्षों की गणना कर रहा है । (A) नियंत्रण और FGF (10 एनजी/एमएल) में कक्षों के चरण कंट्रास्ट छवियां 2, 4, और 6 दिनों में मीडिया का इलाज किया । (ख) प्रतिनिधि परिणामों का ग्राफ; ध्यान दें कि FGF (10 एनजी/एमएल) हमेशा 2 दिन में सेल संख्या में वृद्धि नहीं करता है, लेकिन 4 और 6 दिन बढ़ जाती है (पी ≤ ०.०५) स्पष्ट कर रहे हैं । (n = 2-4 वेल्स/समूह/प्रयोग; 3 प्रयोग) । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

Figure 10
चित्रा 10: कम घनत्व की स्थिति में NPCs के लक्षण वर्णन । (A, C, E) कम घनत्व की स्थिति में NPCs के चरण कंट्रास्ट छवियां । (ख) NPCs एक्सप्रेस स्टेम/जनक सेल मार्करों NESTIN (हरा), SOX2 (लाल), और परमाणु मार्कर DAPI (नीला) । (D) PAX6 (लाल), DAPI (नीला) । (च) कम घनत्व पर, neurites (सफेद तीर) का विस्तार कोशिकाओं को भी अपरिपक्व ंयूरॉन मार्कर TUJ1 (हरा) व्यक्त करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: Neurite । (क) NPCs के चरण कंट्रास्ट छवि । काले तीर neurites के साथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं । (ख) neuropeptide PACAP (3 एनएम) के अलावा neurites (पी ≤ 1 एक्स 10-2) के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाता है । (ग) ठहराव नियंत्रण में neurite की वृद्धि और 3 एनएम PACAP युक्त मीडिया । (n = 2-4 व्यंजन/समूह/प्रयोग; 3 प्रयोग) । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

Figure 12
चित्र १२: Neurosphere प्रवास. (क) neurospheres के चरण कंट्रास्ट छवियां । (ख) PACAP (10 एनएम) के अतिरिक्त neurosphere सेल माइग्रेशन (p ≤ 10-2) (C) ठहराव सेल माइग्रेशन बढ़ाता है । (n = 20 क्षेत्रों/समूह/प्रयोग, 3 प्रयोग) । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

मीडिया
मरीज क्लोन# ctrl FGF
(10 एनजी/
रोगी 1 1 २१,८५३ ४७,५३८
2 २०,३३६ ३८,०७०
रोगी 2 1 ७,६६४ १४,०६०
2 १६,५७३ ३०,०८७

तालिका 1: डीएनए संश्लेषण. दो अप्रभावित व्यक्तियों प्रति दो iPSC क्लोन से व्युत्पंन NPCs के डीएनए संश्लेषण मूल्यों का एक सारांश (सीपीएम में) ।

मीडिया
मरीज क्लोन# ctrl PACAP
(3 एनएम)
रोगी 1 1 १३.६०% १८.१०%
2 १६.५०% २१.१०%
रोगी 2 1 ८.९०% १४.१०%
2 १४.२०% २१.१०%

तालिका 2: Neurites के साथ कक्षों का प्रतिशत। दो अप्रभावित व्यक्तियों प्रति दो iPSC क्लोन से व्युत्पंन NPCs में neurites असर कोशिकाओं के प्रतिशत का एक सारांश ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत त्वरित और सरल तरीकों को मौलिक neurodevelopmental प्रक्रियाओं और परीक्षण विकास कारकों और hiPSC का उपयोग कर दवाओं-व्युत्पंन तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उदाहरण देकर स्पष्ट करना । hiPSC प्रौद्योगिकी प्रभावित व्यक्तियों से मानव न्यूरॉन कोशिकाओं जीने के लिए अभूतपूर्व पहुँच के साथ हमें प्रदान करके neurodevelopmental रोगों के रोगजनन के अध्ययन में क्रांति ला दिया है. वास्तव में, वहां Rett सिंड्रोम, तीमुथियुस सिंड्रोम, नाजुक एक्स सिंड्रोम सहित neurodevelopmental विकारों के कई hiPSC अध्ययन किया गया है, और एक प्रकार का पागलपन है, जो रोग का पता लगाया है dendrites, synapses में विशिष्ट विचलन, और न्यूरॉन फंक्शन4,३३,३४,३५,३६. इन अध्ययनों के अधिकांश मुख्य रूप से टर्मिनल विभेदित, पोस्ट-mitotic न्यूरॉन्स जो, हालांकि अपेक्षाकृत कार्यात्मक अपरिपक्व माना जाता है पर ध्यान केंद्रित किया है, इस तरह के प्रसार और प्रवास के रूप में पहले neurodevelopmental प्रक्रियाओं का अध्ययन शामिल नहीं है । इन प्रक्रियाओं के बाद भारी neurodevelopmental विकारों और वारंट के रोगजनन में फंसाया गया है आगे की पढ़ाई8,9,10,11,12 , ३५ , ३७ , ३८. NPCs का उपयोग हमें इन महत्वपूर्ण पहले की घटनाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जबकि यह भी कोशिकाओं की क्षमता की तरह अधिक परिपक्व प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अपरिपक्व axons/dendrites (neurites) का विस्तार करने का अवसर प्रदान करता है । इसके अलावा, इन परख के कुछ भी ऐसे neurite लंबाई, संख्या के रूप में अंय मापदंडों, अध्ययन बढ़ाया जा सकता है, और शाखाओं या दूर दूरी एक सेल द्वारा कूच ।

कुछ नए अध्ययनों organoid मॉडल सिस्टम का इस्तेमाल किया है एक 3 में पहले विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन डी "मिनी मस्तिष्क प्रणाली"1,३९,४०। फिर भी, इन organoid प्रणालियों में, प्रफलन अग्रदूत सेल जनसंख्या सीमित है और जल्दी परिपक्वता और प्रवास के लिए15,३९अध्ययन मुश्किल है । इसके अलावा पहले विकास की घटना के अध्ययन को सीमित करने के लिए, टर्मिनली विभेदित ंयूरॉंस या organoids का उपयोग अक्सर समय लेने वाली है, महंगा है, और चर कि प्रणाली में मूल्यांकन किया जा सकता है की संख्या को सीमित करता है । ऐसा इसलिए है क्योंकि ंयूरॉंस और organoids वायरल प्रेरण प्रोटोकॉल, विशेष मशीन और उपकरण, समय के कई सप्ताह, और मीडिया की बड़ी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है । इसके विपरीत, डीएनए संश्लेषण परख के अपवाद के साथ (जो बाद में नीचे संबोधित है), इस प्रोटोकॉल को आसानी से neurodevelopmental विकारों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है और व्यापक प्रशिक्षण, महंगा उपकरण, और संसाधनों, या सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है । आसानी और इन परख में दवाओं और विकास कारकों को जोड़ने के अपेक्षाकृत कम लागत, इस प्रोटोकॉल एक उपयोगी उच्च प्रवाह प्रौद्योगिकी neurodevelopmental और neuropsychiatric रोगों के लिए विभिंन संभावित उपचार परीक्षण करने के लिए बनाते हैं । इसके अलावा, के बाद से विकास कारकों परिभाषित सेलुलर संकेत मार्ग के माध्यम से अधिनियम, वे भी उपकरणों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता प्रणालियों के विकास में संभावित संकेत दोष के लिए परीक्षण । अंत में, के बाद से NPCs एक प्रफलन स्वयं जनसंख्या का नवीनीकरण कर रहे हैं, कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में उत्पादन किया जा सकता है और cryopreserved हर बार iPSCs से NPCs बनाने के लिए बिना कुशलतापूर्वक आयोजित किया जा करने की अनुमति प्रयोगों ।

सफलतापूर्वक इन परख को रोजगार के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि निंनलिखित महत्वपूर्ण कदम नोट । इस प्रोटोकॉल रखरखाव और विस्तार बनाम प्रयोग के लिए स्थितियों भिंन में NPCs स्थानों । विशेष रूप से, जबकि NPCs प्रेरित, बड़े हो रहे हैं, और मध्यम तंत्रिका प्रेरण अनुपूरक (एनआईएस), हमारे प्रयोगात्मक शर्तों से पूरक कम ७०% है, जो एक सीमित वातावरण में कोशिकाओं स्थानों, हमें वापस जोड़ने का अवसर की अनुमति और महत्वपूर्ण विकास कारकों के प्रभाव का परीक्षण करें । दूसरे, यह NPCs के पारित होने का ट्रैक रखने के लिए आवश्यक है । हमारे अध्ययन में, हम आम तौर पर है p-P8 से सेल लाइनों के बीतने संख्या प्रतिबंधित । पहले से ही में पी पी से अंश, कुछ लाइनें मजबूती से विशेषता मार्करों व्यक्त नहीं करते । उच्च मार्ग पर है, जबकि कुछ सेल लाइनों बहुत लगातार वृद्धि दर या विकास कारकों के जवाब है, अंय सेल लाइनों सेल वृद्धि या प्रतिक्रिया में नाटकीय परिवर्तन हो सकता है । हालांकि नियमित रूप से रिपोर्ट नहीं, हम, और कई अंय उच्च मार्ग पर प्रफलन दरों में इस नाटकीय परिवर्तन का अनुभव किया है । इस के लिए कारण अनिश्चित है, लेकिन यह परिवर्तन NPCs के एक सीमित स्व-नवीकरण क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । परिभाषित क्यों और कैसे प्रसार दर को बढ़ाया मार्ग में परिवर्तन विकास और रोग रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, लेकिन आगे अनुसंधान किए जाने की आवश्यकता होगी । अंत में, वाणिज्यिक तंत्रिका प्रेरण प्रोटोकॉल है कि हम कभी भी गरीब गुणवत्ता तंत्रिका स्टेम सेल उपज का उपयोग कर रहे हैं, खासकर अगर शुरू iPSCs उच्च गुणवत्ता के नहीं है (यानी, सेल कालोनियों की सीमाओं पर कोशिकाओं अंतर है, कैरयोटाइप विषमता) । कुछ मामलों में, कक्ष आकृति विज्ञान विकृत है और मार्कर की अभिव्यक्ति मौजूद नहीं है । इन संस्कृतियों का प्रयोग न करें । अंय मामलों में, NPCs चापलूसी "contaminant" कोशिकाओं है, जो एक अंतर सेल टुकड़ी समाधान उपचार का उपयोग करने के प्रयोगों में उपयोग करने से पहले वस्तुतः शुद्ध एनपीसी आबादी सुनिश्चित हटाया जा सकता है के साथ बढ़ती है । होने उच्च गुणवत्ता वाले NPCs उचित परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है: एक तंत्रिका प्रेरण प्रोटोकॉल के लिए एक कड़ी के लिए सामग्री और उपकरण अनुभाग देखें जहां उच्च और निंन गुणवत्ता NPCs की छवियां पाया जा सकता है ।

प्रस्तुत परख के प्रत्येक के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए निंनलिखित महत्वपूर्ण कदम, संभावित त्रुटियों, और समस्या निवारण युक्तियां ध्यान दें । कोशिका संख्या, डीएनए संश्लेषण, और neurite परख के लिए, यह असंबद्ध एकल कोशिकाओं के रूप में और नहीं झुरमुट के रूप में प्लेट कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, इस डीएनए संश्लेषण के उपाय, कोशिका गिनती, और neurite व्यवहार तिरछा कर सकते हैं के रूप में. कोशिकाओं के झुरमुट को सुनिश्चित करने के लिए नहीं चढ़ाया जाता है, एक P1000 के साथ कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा नमूना, एक स्लाइड पर प्लेट, और जांच अगर सेल के झुरमुट मौजूद हैं । यदि झुरमुट नोट कर रहे हैं, पिपेट कोशिकाओं को ऊपर और नीचे करने के लिए मैंयुअल रूप से चढ़ाना से पहले अलग झुरमुट तोड़ । डीएनए संश्लेषण और कोशिका संख्या परख के लिए, कोशिकाओं को गिनती और विश्लेषण के लिए एंजाइमों के साथ उठा रहे हैं । यह नेत्रहीन कोशिकाओं की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है पूरी तरह से संस्कृति पोत से उठा लिया करने के लिए सही मायने रखता है और यदि आवश्यक हो, अब एंजाइम मशीन समय इस्तेमाल किया जा सकता है । कम सेल गिनती या डीएनए संश्लेषण परख के लिए कम सीपीएम के मामले में, कोशिकाओं को उच्च प्रारंभिक घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है, रेडियोधर्मी tritiated [3एच]-thymidine डबल समय (2 के बजाय 4 घंटे) के लिए जोड़ा जा सकता है, या tritiated [3एच]-thymidine एकाग्रता दोगुनी हो सकती है । neurite परख के लिए, प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व बढ़ा सेल जोखिम से सेल संपर्क के बिना दोगुनी हो सकती है । एक डिश भर में कोशिकाओं के वितरण पर ध्यान दें और इस तरह के पकवान के प्रत्येक भाग नमूना है कि 1 सेमी पंक्तियों गिनती । यदि neurite प्रतिशत ४८ ज में बहुत कम है, परख 6 दिन या कोटिंग सब्सट्रेट प्रकार या एकाग्रता के लिए बढ़ाया जा सकता है neurites के अधिक से अधिक प्रतिशत को बढ़ावा देने के लिए बदला जा सकता है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि कोटिंग बार और तरीकों हम प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है इष्टतम neurite वृद्धि और सेल स्वास्थ्य के लिए चयनित कई विभिंन सब्सट्रेट, सब्सट्रेट सांद्रता, और कोटिंग बार परीक्षण के बाद किया गया । neurosphere परख के लिए, छोटे pipettors का उपयोग (P20, P200) बड़े क्षेत्रों के बाल काटना और टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, यह जरूरी है कि pipetting धीरे से किया जाता है और एक P1000 या एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ । neurospheres गोली के लिए, कम गति (३०० एक्स जी के बजाय १०० x g) भी neurosphere पृथक्करण को रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । क्षेत्र चढ़ाना के दौरान, क्षेत्रों के लिए क्षेत्र से संपर्क प्रवास को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में उचित रूप में अलग स्थान हैं कि सुनिश्चित करें । मामलों में जहां माइग्रेशन बहुत तेज है या बहुत धीमी गति से, मशीन समय क्रमशः कम या बढ़ सकता है । कोटिंग सब्सट्रेट भी माइग्रेशन दरों को बदलने के लिए बदला जा सकता है ।

जबकि तकनीक का इस्तेमाल तेजी से कर रहे हैं, सरल और neurodevelopmental विकारों के अध्ययन के लिए लागू है, वहां कुछ सीमाएं हैं । एक के लिए, प्रस्तुत विश्लेषण के कई (कक्ष संख्या परख, neurite परख, प्रवास परख) जांचकर्ताओं को व्यक्तिपरक निर्णय करने की आवश्यकता (जैसे, यह एक neurite है? इस सेल मर चुका है?) संभावित जांचकर्ता पूर्वाग्रह और कम reproducibility करने के लिए अग्रणी । हालांकि, आचरण विश्लेषण अंधा और प्रत्येक एक परख के भीतर किए गए निर्णय के लिए सख्त मानकों की स्थापना, के रूप में तरीकों में सचित्र, इन पूर्वाग्रहों उंनति कर सकते हैं । इसी तरह, इन परख मैनुअल माप और गिनती की आवश्यकता है, जो समय लेने वाली और श्रम गहन हो सकता है । हालांकि, प्रयोगशालाओं में है कि उपकरण और तकनीकी संसाधन है, इन परख अप स्वचालित सेल काउंटर और प्रोग्राम है कि स्वचालित माप४१,४२आचरण कर सकते है के उपयोग के साथ उड़ सकते हैं । डीएनए संश्लेषण परख के मामले में, इन तरीकों हमारे सेल हार्वेस्टर और जुटाना मशीन के लिए विशिष्ट है (सामग्री और उपकरण देखें); हालांकि, वहां अंय उपलब्ध मॉडल और तरीकों कि ऐसी Omnifilter-९५ सेल हार्वेस्टर के रूप में एक ही जानकारी हासिल किया जा सकता है । कुछ संस्थानों के लिए, रेडियोधर्मी स्रोतों का उपयोग संभव नहीं हो सकता है । इस मामले में, एक वैकल्पिक विधि ऐसी EdU के रूप में एक फ्लोरोसेंट thymidine अनुरूप, का उपयोग कर, एक फ्लोरोसेंट microplate रीडर पर विश्लेषण किया, डीएनए संश्लेषण४४के थोक विश्लेषण पर एक ही जानकारी के अधिग्रहण के लिए अनुमति देगा ।

हमारे कम घनत्व संस्कृति प्रणाली व्यक्तिगत कोशिकाओं या छोटे झुरमुट में NPCs अलग, एक शर्त है कि विकासशील तंत्रिका ट्यूब में NPCs की घनी पैक प्रकृति से भिंन है । फिर भी, NPCs स्वस्थ और व्यक्त उचित मार्करों (चित्रा 1, चित्रा 10) कर रहे हैं । इसके अलावा, हमारे माउस और चूहे cortical संस्कृतियों में इन विट्रो संस्कृतियों में समानांतर निष्कर्षों दिखा के पहले अध्ययन, और vivo में मॉडल उपयोगिता और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर के मूल्य संकेत16,17,18 , 19 , 24. इसके अतिरिक्त, यह प्रणाली कोशिकाओं की परिपक्वता और अध्ययन कोशिका उप आबादी को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, immunohistochemistry neurite परख पर क्या विशिष्ट न्यूरॉन सेल प्रकार एक neurite का विस्तार है निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जा सकता है । अंततः, कुछ सीमाओं के बावजूद, इस अनूठी प्रोटोकॉल neurodevelopmental विकारों का अध्ययन करने के लिए सरल, शक्तिशाली, और तेजी से तरीकों प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम चिकित्सा अनुसंधान और Autism के उपचार के लिए ंयू जर्सी के गवर्नर परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), नैंसी Lurie मार्क्स परिवार फाउंडेशन, Mindworks धर्मार्थ नेतृत्व ट्रस्ट, और यहूदी समुदाय ग्रेटर MetroWest ंयू जर्सी के फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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