Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

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Developmental Biology

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Summary

Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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Abstract

Le développement du cerveau humain procède par une série de précisément les processus orchestrés, avec des stades antérieurs se distingués par la prolifération, la migration et la croissance des neurites ; et des étapes ultérieures, caractérisées par la formation de l’excroissance et synapse axon/dendrite. Dans les troubles du développement neurologique, souvent un ou plusieurs de ces processus sont perturbés, conduisant à des anomalies dans la formation du cerveau et de la fonction. Avec l’avènement de la technologie (hiPSC) les cellules souches humaines pluripotentes induites, chercheurs disposent maintenant d’une offre abondante de cellules humaines qui peuvent être différenciés dans pratiquement n’importe quel type de cellule, y compris les neurones. Ces cellules peuvent être utilisés pour étudier le développement normal du cerveau et pathogenèse de la maladie. Un certain nombre de protocoles à l’aide de hiPSCs pour modéliser les maladies neuropsychiatriques utilisation en phase terminale différenciées des neurones ou utilisation systèmes 3D appelé organoïdes. Bien que ces méthodes sont révélés inestimables pour étudier la pathogenèse de la maladie humaine, il y a quelques inconvénients. Différenciation des hiPSCs dans les neurones et la génération d’organoïdes sont des processus longs et coûteux qui peuvent influer sur le nombre d’expériences et de variables qui peuvent être évalués. En outre, alors qu’organoïdes et neurones post-mitotiques permettent l’étude des processus liés à la maladie, y compris la croissance dendritique et synaptogenèse, ils s’opposent à l’étude des processus antérieurs tels que la prolifération et la migration. Dans les troubles du développement neurologique, comme l’autisme, abondantes preuves génétiques et post-mortem indiquent les défauts dans les processus de développement précoces. Les cellules précurseurs neurales (PNJ), une population de cellules hautement proliférante, peuvent être un modèle approprié permettant de poser des questions sur les processus ontogénétiques et initiation de la maladie. Nous étendons maintenant des méthodes tirées de l’étude de développement dans les cultures corticales souris et le rat à des PNJ humains. L’utilisation de PNJ nous permet d’enquêter sur les phénotypes liés à la maladie et de définir comment les différentes variables (p. ex., facteurs de croissance, médicaments) impact du développement processus y compris la prolifération, la migration et la différenciation en seulement quelques jours. En fin de compte, cet ensemble d’outils peut être utilisé de façon reproductible et haut débit afin d’identifier les mécanismes propres à la maladie et des phénotypes dans les troubles du développement neurologique.

Introduction

L’utilisation des organismes plus simples et des modèles de souris a élucidé les mécanismes de développement du cerveau de base ainsi que pathogenèse de la maladie. Malgré ces avancées, l’étiologie de nombreux troubles neuropsychiatriques reste insaisissable, parce que pas tous les résultats dans des organismes plus simples sont directement liées à des aspects complexes de la maladie humaine. En outre, la plus grande complexité du cerveau humain rend difficile le développement humain modèle souvent et troubles chez les animaux. Avec l’évolution et les progrès de la technologie (hiPSCs) des cellules souches humaines pluripotentes induites, les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches et puis se différencient en cellules neuronales pour étudier les maladies humaines. Percées dans les technologies hiPSCs et « omic » (génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique) promettent de révolutionner la compréhension du développement du cerveau humain. Ces technologies désormais rendent possible une approche de « médecine de précision » pour la caractérisation des maladies neuropsychiatriques sur une base de cas-par-cas.

L’aliment de base actuel en matière de modélisation des maladies hiPSC est à différencier des cellules en sous-types neuronales spécifiques dans une monocouche ou utiliser un système de culture 3D appelé un organoïde pour récapituler les aspects du cerveau développement1,2, 3. Ces systèmes ont été extrêmement précieux pour l’étude et de découvrir des aspects uniques du développement humain et maladie4,5,6,7. Toutefois, les cultures de neurones et organoïdes exigent souvent n’importe où de semaines à mois de culture avant qu’ils soient prêts à étudier. Le caractère chronophage de ces protocoles et le montant des ressources nécessaires pour maintenir que ces systèmes de culture limitent souvent le nombre d’expériences qui peuvent être effectuées et le nombre de variables (comme facteurs de croissance ou médicaments) qui peuvent être testés. En outre, de nombreuses études utilisant des organoïdes et des neurones post-mitotiques ont mis l’accent sur les processus tels que la formation de l’excroissance ou synapse dendrite, apparaissant plus tard dans le développement. Tandis que ces processus ont été impliqués dans la pathologie des troubles du développement comme l’autisme et la schizophrénie, plus tôt les événements développementaux qui surviennent avant la différenciation neuronale définitive sont également importants pour la pathogenèse de la maladie8 ,9,10,11,12,13. En effet, des études de génomiques récentes montrent que la période de mi-foetale, qui est composée de prolifération, l’excroissance des processus et la migration, est particulièrement importante dans l’autisme pathogenèse11,14. Ainsi, il est important d’étudier les souches neurales et populations de cellules progénitrices de mieux comprendre ces processus antérieurs. Organoïde systèmes, qui sont le développement du cerveau humain rappel réfléchie pour mieux en raison de leur nature 3D et la structure organisée, contiennent une piscine progénitrices qui a été utilisée pour étudier certains de ces événements antérieurs. Cependant, la population progénitrices dans organoïdes est souvent éparse et plus comme des cellules gliales radiales que neural souches ou progénitrices cellules5,15. Ainsi, il serait utile de prévoir une méthode de haut débit pour l’étude des premiers stades de développement neurologique dans une population de cellules prolifératives activement.

En laboratoire, nous avons créé un protocole qui utilise des cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC (PNJ), une population mixte de tige de neurones et des cellules progénitrices qui est hautement proliférante, d’étudier les processus neurologiques telles que la prolifération, la migration cellulaire, et extension du processus initial (neurites). Ces essais ont été mis au point des techniques utilisées dans notre laboratoire depuis des décennies à étudier avec succès développement neurologique en rat et souris cultures corticale16,17,18,19,20, 21,22,23. Ce qui est important, on a aussi montré que les phénotypes et les signaux réglementaires définies dans les systèmes de culture de rat et la souris sont très révélatrices des mécanismes qui sont actifs en vivo, indiquant la valeur de ces techniques16, 17,18,19,24. Après différenciation initiale de hiPSCs aux PNJs, ces méthodes nous permettent d’étudier les processus de développement vitales en quelques jours. Ces méthodes présentent de nombreux avantages : (1) qu’ils exigent un équipement peu sophistiqué et sont faciles à mettre en œuvre, (2) nombreuses répliques expérimentales peuvent être effectuées dans un court laps de temps, ce qui permet une confirmation rapide de la reproductibilité des résultats et (3) variables de culture telles que les matrices de revêtement, les effets des facteurs de croissance et l’activité des médicaments peuvent être testées rapidement et à moindre coût. Par ailleurs, nous profitons du rôle bien établi des facteurs de croissance extracellulaires comme régulateurs critiques des divers processus de développement. PNJ ont été exposés pour sélectionner les signaux du développement directement stimulent des événements tels que la prolifération, la croissance des neurites et la migration cellulaire et ont trouvé qu’ils améliorent la capacité à repérer les défauts qui ne sont pas évidents dans des conditions de contrôle19 , 25 , 26 , 27 , 28. de même, la facilité d’évaluation des médicaments fournit un moyen puissant pour adopter des techniques de médecine de précision pour tester l’efficacité de diverses interventions thérapeutiques. Ainsi, le présent protocole facilite un haut débit, reproductible et une méthodologie simple pour étudier le développement précoce du cerveau, pathogenèse de la maladie et les effets bénéfiques potentiels de facteurs de croissance et de drogues sur le développement neurologique des phénotypes.

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Protocol

1. consignes et l’entretien du Cabinet de prévention des risques biotechnologiques

  1. Procédures de sécurité de niveau de biosécurité 2 (BSL-2)
    1. Suivez les directives de l’établissement travaille avec des matériaux de BSL-2. Disposer des matériaux de BSL-2 selon les pratiques de l’institution. Indiquer les pièces et équipements qui sont utilisés pour les matériaux de BSL-2. Portez tous les équipement de protection individuelle (EPI), y compris les gants et blouse de laboratoire.
  2. Entretien du Cabinet de prévention des risques biotechnologiques
    1. Utiliser une armoire de sécurité biologique homologuée pour l’utilisation de matériaux niveau BSL-2.
    2. Allumez la lumière UV dans la prévention des risques biotechnologiques armoire pendant au moins 15 minutes et puis vaporiser des surfaces avec une solution javellisée de 10 %. Laisser la solution d’eau de Javel pour se reposer pendant 15 min, essuyer le cabinet et tourner sur le flux d’air avant de l’utiliser.
  3. Radioactive tritiée [3H]-thymidine (Tritium) des procédures de sécurité
    NOTE : Le Tritium est une source radioactive de catégorie 5, « le plus improbable être dangereuse » catégorie. Suivez les directives de l’institution pour l’utilisation de la radioactivité. Certaines institutions peuvent exiger des certifications ou permet de gérer le tritium.
    1. Reçoivent une formation de l’institution sur la façon de bien gérer et disposer de tritium. Élimination de déchets radioactifs dans des récipients appropriés, conformément aux politiques de l’institution. Porter les EPI pour travailler avec tritium.

2. Induction neurale du CISP

Remarque : Pour rendre les PNJs, une version légèrement modifiée d’un protocole qui accompagne un kit à induction neurale disponibles dans le commerce a été suivie. Le kit se compose des médias de la Neurobasal (n.-b.) et 50 x Supplément de Induction neurale (NIS), qui sert à fabriquer un 1 x milieu d’Induction neurale (NIM). NIS est également utilisé pour faire 100 % Expansion moyenne (voir Section 3.1). Un lien vers le protocole se trouve dans les matériaux et les équipements et les références article43.

  1. CISP de passage quand ils deviennent confluente de 70 à 80 %.
  2. CISP plaque 300 000 en 1 bien de qualifié un CSEh extracellulaire matrice-mimic plaque de 6 puits de gel (gel de l’ECM-mimic) enduit contenant 2 mL de milieu exempt d’engraissement iPSC avec 5 μM d’inhibiteur de la roche. Voir la Section 3.2 pour obtenir des instructions sur les puits de revêtement avec gel ECM-mimic.
  3. Le lendemain, enlever l’iPSC moyen + ROCK CISP inhibiteur et lavage une fois avec 1 x PBS. Ajouter 2 mL de NIM le CISP.
    Remarque : 50 mL de NIM est effectuée en ajoutant 1 mL de 50 x NIS et 250 µL (50 unités/mL, 5 μL/mL) de pénicilline/streptomycine (P/S) à 49 mL des médias NB.
  4. Médias de changement de l’induction neurale tous les 2 jours en aspirant passé moyen et remplacement avec 2 mL de NIM jusqu'à devenus confluentes de cellules (environ 4-5 jours). Changer les médias tous les jours, une fois les cellules confluentes.
  5. Cellules de passage après 7 jours de NIM et plaque dans un gel d’ECM-mimic enduit plaque 6 puits contenant 2 mL 100 % Expansion Media et inhibiteur de ROCK 5 μM. Les cellules sont considérés comme Passage 0 (P0) PNJs à ce stade. Voir la Section 3.1 ci-dessous pour obtenir des instructions faire 100 % Expansion Media.
  6. Cellules de passage en utilisant les méthodes décrites à la Section 3.4. Attendez que les cellules ont atteint P2 sont confluentes avant la dissociation pour souiller de marqueurs NPC et d’enrichissement pour les expériences (Figure 1).

3. les milieux de Culture, revêtement et d’entretien des PNJs

  1. Préparation de médias pour l’entretien de PNJ (augmentation de 100 % Media) :
    1. Faire 50 mL 100 % Expansion médias en combinant 24,5 mL de DMEM/F12 avec 24,5 mL du Nouveau-Brunswick.
    2. Ajouter 1 mL de 50 x NIS au DMEM/F12 + solution NB. Ajouter 250 μL de solution de P/S aux médias.
      NOTE : Media peut être réfrigéré (4 ° C) et utilisé pendant 2 semaines. Des volumes moins importants des médias est possible en ajustant les volumes de DMEM / F12 + NB + NIS en utilisant les ratios de mêmes en ce qui concerne le volume de 50 mL.
  2. Préparation du Gel de l’ECM-mimic revêtus de plaques de Culture pour NPC entretien
    1. Aliquote ECM-mimic gel au volume nécessaire pour faire les 6 mL de solution de travail. Calculer le volume aliquote en regardant la fiche du certificat d’analyse puisque le facteur de dilution de gel ECM-mimic varie d’un lot à l’autre et d’un lot.
    2. Décongeler une aliquote de gel ECM-mimic sur la glace et se dissoudre dans 6 mL de froid DMEM/F12 médias.
    3. Ajouter 1 mL de solution de gel/DMEM/F12 ECM-mimic à chaque puits d’une plaque 6 puits. Incuber la plaque 6 puits avec ECM-mimic-solution de gel pendant 30 min à 37 ° C.
    4. Aspirer la solution de gel ECM-mimic après 30 min d’incubation et remplacer par 100 % Expansion Media ou réfrigérer les plaques (4 ° C, jusqu'à 1 semaine) sans aspirer ECM-mimic-solution de gel.
  3. Entretien des PNJs
    1. Plaque de PNJ à une densité de 1,5 millions de cellules dans un enduit gélifié cupule contenant 2 mL de 100 % Expansion Media ECM-imitateur.
    2. Incuber à 37 ° C dans un milieu humide avec 5 % de CO2les PNJs.
    3. Ajoutez 5 μM d’inhibiteur de la roche aux médias pour les PNJs à P3 ou plus bas, ou pour PNJ décongelés, pour prévenir la mort cellulaire excessive. Modifier les médias après 24h pour enlever l’inhibiteur de la roche.
    4. Cellules de passage tous les jours 4 à 9, selon quand ils deviennent confluentes. Les cellules sont considérés comme confluentes quand ils deviennent une monocouche dense qui couvre tout le fond de la surface du plat.
    5. Plaque de PNJs à une densité de 1 à 1,5 millions de cellules par un puits d’une plaque de 6 puits (voir Section 3.4). Retirez les supports usés toutes les 48 h et remplacez par 2 mL de 100 % Expansion Media.
  4. Soulever, se dissocient et Pellet PNJ pour l’entretien ou ensemencement des Conditions expérimentales
    1. Aspirer les cellules moyennes, laver une fois avec 1 x PBS. Aspirer les PBS et ajouter 500 μl de solution de détachement cellulaire 1 x en 1 bien de confluentes PNJs. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
    2. Ajouter 500 μl de la température ambiante (RT) PBS puis laver le bien, avec une pipette de P-1000 afin d’assurer l’élimination des cellules. Recueillir les cellules + solution de PBS dans un tube conique de 15 mL. Laver la plaque avec 1 mL de PBS et ajouter le liquide dans le tube.
    3. Faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min granuler.
    4. Retirez le culot cellulaire de surnageant et remettre en suspension les cellules de 1 à 5 mL de préchauffé DMEM/F12 médias. Diluer les cellules à une densité de 1 à 4 millions de cellules/mL de médias. Quantifier les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Plaque le nombre requis de lymphocytes, spécifiques pour l’entretien NPC (Section 3.3) ou le test individuel en cours (voir les sections suivantes pour plus de détails).
    6. Ajuster le volume de suspension cellulaire avec les médias afin qu’entre 15 et 100 μL de cellules sont utilisées pour chaque puits/plat. Ce volume de placage petit garantit qu’il n’y a même cellule distribution et que des facteurs de croissance, de drogues ou des substrats dans le milieu ne sont pas dilués.
    7. Incuber les cellules à 37 ° C. Modifier les médias toutes les 48 h pour l’entretien NPC ou voir les détails spécifiques pour les épreuves individuelles.
  5. Préparation des médias pour des Conditions expérimentales (30 % Expansion Media)
    1. Diluer les médias d’Expansion de 100 % de 70 % (appelé 30 % Expansion) en ajoutant une solution NB + 1:1 DMEM/F12 pour faire des médias pour des conditions expérimentales.
    2. Prendre 20 mL de 30 % Expansion Media en ajoutant 6 mL de 100 % Expansion Media et en diluant avec 7 mL de NB et 7 mL de DMEM/F12 médias. Ajouter 5 µL/mL de solution de P/S.
      Remarque : Si 100 % médias contient déjà P/S, puis ajoutez 5 μL/mL pour les combinés-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μL/mL) = 70 μL de P/S au lieu de 100 µl.
    3. Ajouter des substrats de revêtement et de facteurs de croissance à des concentrations souhaitées pour les médias d’agrandissement de 30 %.

4. Appréciation de la synthèse de l’ADN, entrée de la Phase S et nombre de cellules de PNJ

  1. Préparation pour la synthèse d’ADN et S-ouverture de la phase analyse nombre de cellules
    1. Faire un 1 mg/mL de solution de poly-D-lysine (PDL) en dH2O et filtre stériliser. Diluer à 01:10 dH2O faire un 0,1 mg/mL solution PDL et ajouter 300 μl à chaque puits d’une plaque 24 puits ou 1 mL à un plat de 35 mm. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
    2. Laver les puits PDL 3 fois pendant 5 min avec dH2O. aspirer dH2O et ajouter 300 μL/puits ou 1 mL/assiette de laminine (5 μg/mL) diluée dans du PBS de x 1. Recouvrir les plaques avec du parafilm et garder dans un stérile, prévention des risques biotechnologiques cabinet du jour au lendemain au RT (12 à 24 h).
    3. Préparer 30 % Expansion Media (voir la Section 3.5) après 12 à 24 h. Ajouter véhicules, facteurs de croissance ou médicaments d’intérêt à la concentration voulue dans les volumes qui sont moins de 10 % de la solution totale pour éviter la dilution NIS dans les 30 % moyen d’Expansion.
    4. Laver chaque puits de la plaque 24 puits deux fois avec du PBS 1 x (5 min). Aspirer la solution 1 PBS x et ajouter 450 μL de médias (sans ou avec des facteurs de croissance/drogues). Incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 15 min avant l’ensemencement de cellules.
    5. Pour chaque expérience, mis en place 2-3 puits ou vaisselle par État.
    6. PNJ de plaque (voir Section 3.4) :
    7. Test de synthèse d’ADN NPC : 100 000 cellules/puits dans une plaque 24 puits
    8. Phase S entrée : plat 500 000 cellules/35 mm
    9. Analyse nombre de cellules : 50 000 cellules par puits dans une plaque 24 puits
  2. Test de synthèse d’ADN cellulaire précurseurs neuronaux
    1. 100 000 cellules/puits dans une plaque 24 puits de la plaque et évaluer en triple exemplaire/État.
    2. Ajouter radioactif, tritiée [3H]-thymidine au milieu de culture (1.5 μCi/mL) dans chaque puits après 46 h en culture. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h.
      Remarque : Lors de l’utilisation de matières radioactives, reçoivent une formation de votre institution, protocoles de sécurité suivi radioactivité et dispose de matières radioactives dans les rebuts dûment désignés.
    3. Enlever et jeter des médias radioactifs après que 2 h. Ajouter 300 μL de préchauffée à 0,25 % de trypsine-EDTA (0,5 mM) dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
    4. Allumez le moissonneur de la cellule (voir le matériel et l’équipement section) et la pompe et faire en sorte que la pression de la pompe est inférieure à 200 lb/po2. Placer le papier filtre à travers l’espace dans la moissonneuse de cellule et déchirez le coin droit pour marquer l’orientation du papier.
    5. Placer les tubes de collecteurs de moissonneuse de cellule dans un bac vide « en blanc », puis appuyez sur prélavage pour humidifier le papier filtre. Placer les tubes de collecteurs dans les puits d’échantillon et exécuter (start).
    6. Quand la moissonneuse de cellule a terminé le prélèvement d’échantillons, un ascenseur de serrage et avance papier filtre à répéter pour tous les ensembles d’échantillons. Prélaver toujours dans une assiette vide, « vide ».
    7. Sécher le papier-filtre sous une source lumineuse et mis en place des correspondants les flacons dans un plateau. Poinçonner chads papier dans deux flacons et ajouter 2 mL de cocktail de scintillation liquide à chaque flacon. Flacons bouchon et étiquette.
    8. Incuber les flacons à scintillation liquide cocktail pendant au moins 1 h avant de lire les coups par minute (CPM) sur une machine de scintillation.
  3. Test d’entrée phase S NPC
    1. Voir la Section 3.4 pour obtenir la procédure pour soulever, dissocier, pellet et remettre en suspension les cellules.
    2. Plaque de 500 000 cellules par plat dans les 35 mm des plats préparés à la Section 4.1, 1 seul plat/condition pour cette étape.
    3. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 46 heures.
    4. Préparer trois plaques 35 mm recouverts de PDL/Laminin par condition après 24h. Par exemple, s’il y a un plat de 35 mm de 30 % Expansion Media et un plat de 35 mm de 30 % Expansion Media + FGF (10 ng/mL) puis enduire 6 plaques PDL/laminine pour une utilisation sur le lendemain.
    5. Ajouter 2 μL/mL de 5 mM EdU aux cultures après 46 h. Incuber pendant 2 h.
    6. Dissocier et granules des cellules (voir Section 3.4). Resuspendre le culot dans 3 mL de 30 % Expansion Media ou 3 mL de 30 % Expansion Media + désiré de facteurs de croissance/drogues.
    7. Plaque de 1 mL par capsule sur plats revêtus de PDL/laminine. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber à 37 ° C pendant 2 h permettre à des cellules d’adhérer au plat. Voir la Figure 2 pour qu’une chronologie simplifiée.
  4. Analyse de l’entrée de la phase S
    1. Difficulté des plats avec glacée 4 % paraformaldéhyde (PFA dans du PBS 1 x) pendant 20 min. Ensuite, laver la vaisselle 3 fois pendant 5 min avec du PBS 1 x.
    2. Ajouter 1 mL de PBS 1 x 0,05 % d’Azide de Sodium pour prévenir la croissance bactérienne et fongique. Les cellules peuvent être stockés à 4 ° C pendant 6 mois si plats (scellés avec du parafilm) ont été maintenues dans le PBS + Sodium solution d’azoture, quoique pas tout immunologiques antigènes sont bien conservés après de longs retards dans l’analyse.
    3. Dosage des cellules à l’aide d’une réaction commerciale de EdU kit (voir le protocole du fabricant). Détachant des cellules à l’aide de DAPI ou un autre marqueur nucléaire et l’image à l’aide de la microscopie en fluorescence.
    4. Évaluer la proportion de cellules positives EdU sur aveugles (nombre total de cellules) des cellules vivantes total dans 10 domaines systématiquement aléatoires (x 10). N’incluez pas les cellules mortes en analyse.
    5. Utiliser les deux images de contraste de phase et images fluorescentes pour déterminer une coloration positive EdU et de déterminer quelles cellules sont morts ou vivants (Figure 3).
    6. Compter toutes les cellules qui ont toutes deux lissent et même membrane cellulaire dans les paramètres de contraste de phase et un gros noyau non fragmenté par fluorescent DAPI nucléaire tachent, que ces cellules sont en direct (Figure 3 a-B).
    7. Exclure toutes les cellules qui sont la phase lumineuse, ont une membrane de cellule inégale brisée et ont un noyau petit et condensé comme visualisés par l’imagerie, que ces cellules sont morts des fluorescente DAPI (Figure 3 a-B). Évaluer des cellules vivantes pour l’expression de EdU en identifiant les cellules pour lesquelles lumineuse fluorescente EdU tache couvrant le noyau entier ou une coloration fluorescente moucheté dans le noyau (Figure 3).
  5. Analyse nombre de cellules de NPC
    1. Après 2 jours de culture, étiqueter et préparer des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et 0,5 mL tubes de microcentrifuge. Dans chaque tube de 0,5 mL, ajouter 5 μl de bleu de Trypan.
    2. Dans chaque puits d’une plaque 24 puits, éliminer le milieu et ajouter 200 μL de 1 x solution de détachement cellulaire et place en incubateur pendant 10 à 15 min.
    3. Après le temps imparti, une fois que les cellules ont levé, ajouter la quantité désirée de solution 1 PBS x dans chaque puits.
      Remarque : En règle générale, le jour 2, ajoutez 300 μl de PBS 1 x dans les cellules contenant bien plus de 200 μl de la solution de détachement, pour un volume total de 500 μL. Avec temps d’incubation de culture supplémentaires, comme les cellules deviennent plus confluentes, augmenter le volume de dilution si nécessaire. Par exemple, le jour 4, ajouter 500 μl de 1 x PBS et le jour 6, ajoutez 800 μL de PBS 1 x. Le volume total sera de 700 ml et 1 mL, respectivement.
    4. À l’aide d’une pipette de P-1000, Pipetter en haut et en bas dans chaque puits 4 à 5 fois pour éliminer les cellules. Examiner la plaque sous microscope pour s’assurer que toutes les cellules ont détaché. Cellules de transfert pour tubes de 1,5 mL.
    5. Il faut inverser les tubes de 1,5 mL avec cellules dilués 2 à 3 fois. Ensuite prendre un 50 μL aliquote de cellules à partir du milieu du tube et ajouter aux tubes de 0,5 mL avec le fil bleu Trypan (voir 4.5.1).
    6. Solution de la pipette cellule haut et bas de 2 à 3 fois. Ajouter des cellules à l’hémocytomètre et analyser immédiatement. Attendre plus longtemps que 10 min peut augmenter la mort cellulaire ou la présence de cellules qui ont repris le bleu Trypan.
    7. Ajouter avec précaution 10 µL de cellules + mélange bleu Trypan de chaque côté du hémocytomètre pour effectuer des comptages répétés. Compter les cellules à l’aide du microscope à contraste de phase. Ne pas compter les cellules mortes ou les cellules bleus foncés qui ont repris le bleu Trypan.
    8. Pour obtenir l’utilisation de numéro, cellulaire totale moyenne nombre de cellules à compter de 4 coins de l’hémocytomètre et appliquer l’équation suivante :
      Nombre de cellule x volume (mL) x 10,000 de médias moyen = nombre de Total de cellules/puits
    9. Aspirer et répétez la procédure sur les puits restants. Modifier les médias sur les cellules qui ne sont pas être comptées, chaque test de répétition de 48 h. sur 4 jours et 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Préparation des plats et des médias pour l’analyse de neurites
    1. Faire un 1 mg/mL de solution de poly-d-lysine (PDL) en dH2O et filtre stériliser. Diluer à 01:10 dH2O pour faire une solution PDL de 0,1 mg/mL et ajouter 1 mL dans chaque plat de 35 mm. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
    2. Entre-temps, préparer les milieux Expansion de 30 % (voir la Section 3.5) et ajouter 5 μg/mL (5 µL/mL) de solution de la fibronectine (1 mg/mL de bouillon) aux médias.
    3. Une fois que le support est prêt, ajouter véhicules, facteurs de croissance ou médicaments d’intérêt à la concentration désirée.
      Remarque : Il est préférable d’ajouter le véhicule, facteurs de croissance ou de drogues, à des volumes < 10 % de la solution globale pour éviter la dilution de la fibronectine et autres composants dans le milieu de l’expansion de 30 %.
    4. Après 20 min, laver la vaisselle PDL 3 fois pendant 5 min avec dH2O pour enlever l’excès PDL. S’assurer que les plats sont sèches avant d’ajouter des médias.
    5. Placer 1 mL de médias (avec ou sans facteurs de croissance/drogues) + solution de fibronectine dans chaque plat enduit de PDL.
    6. Incuber les plats à 37 ° C pendant au moins 30 min avant l’ensemencement des cellules pour assurer une bonne fixation de la fibronectine de la PDL.
    7. Pour chaque expérience, mis en place 2 ou 3 plats par État (p. ex., 3 plats contenant du véhicule, 3 plats contenant un medicament).
  2. Placage de PNJs pour dosage de neurites
    1. Voir la Section 3.4 pour obtenir la procédure pour soulever, dissocier, pellet et remettre en suspension les cellules.
    2. Plaque 50 000 cellules par plat dans les plats préparés à la Section 5.1. Agiter les plats en arrière dans toutes les directions afin d’assurer une répartition égale des cellules.
    3. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 48 h.
  3. Analyse des Neurites
    1. Après incubation des cellules pendant 48 h, aspirer moyen et Difficulté des plats avec de la glace froide 4 % PFA pendant 20 min.
    2. Après 20 min, laver la vaisselle 3 fois pendant 5 min avec du PBS 1 x. Après le lavage final, ajouter 1 mL de PBS 1 x 0,05 % d’Azide de Sodium.
    3. Analyser les plats aveuglément sur un microscope à contraste de phase à 32 X. Compter les cellules totales et avec neurites dans 3, lignes de 1 cm, choisis au hasard des postes mais reproductibles. Compter un minimum de 150 cellules par plat pour garantir un échantillonnage adéquat.
      NOTE : Une neurite est définie comme une extension (processus) du corps cellulaire qui est > 2 diamètres de corps cellulaire dans la longueur. Pour les cellules avec plusieurs processus, le processus plus long est considéré pour le critère. Cellules avec des procédés qui sont < 2 corps cellulaire diamètres de longueur ne sont pas inclus (Figure 4).
    4. Additionnez le nombre total de cellules et le nombre total de cellules avec des neurites dans chaque plat. Calculer le % de cellules avec des neurites. Moyenne du pourcentage de cellules avec des neurites à travers des plats répétées. Confiance dans la reproductibilité expérimentale est établie lorsque toutes les lignes dans chaque plat sont similaires, et les moyennes entre les plats sont très similaires, avec l’erreur-type de la moyenne (SEM) < 10 %.
    5. Vous pouvez également analyser les neurites en effectuant l’immunocytochimie pour marqueurs tels que bêta-III-tubuline (TUJ1) ou carte2. Après coloration pour le marqueur d’intérêt, prendre 10 images systématiquement au hasard sur un microscope à fluorescence à 10 X. Image d’au moins 200 cellules. Dans ce cas, acquérir les images pas trop près du bord du plat. Analyser le pourcentage de cellules avec des neurites TUJ1 ou MAP2 + (voir la Figure 10 pour obtenir un exemple).

6. NPC Neurosphère Migration test

  1. Neurosphère Formation
    1. Ajouter 1 mL de 100 % Expansion Media dans un plat de 35 mm avec aucun substrat du revêtement. Incuber les plats pendant au moins 15 min à 37 ° C avant électrodéposition PNJs. préparer 2 ou 3 plats pour s’assurer qu’il sera assez neurospheres pour le test de migration cellulaire.
      Remarque : L’absence d’un substrat de revêtement assure que les PNJ reste suspendues dans les médias, ce qui est essentiels pour la formation Neurosphère. Plats de revêtement empêchera Neurosphère formation.
    2. Voir la Section 3.4 sur mesures pour soulever, se dissocient et cellules de granule. Resuspendre le culot dans 2 à 5 mL de pré chauffé 100 % Expansion Media. Plaque 1 million PNJs dans chaque plat 35 mm préparé à la section 6.1.1.
    3. Incuber les PNJs à 37 ° C pendant 48 à 96 h permettre des PNJ d’agrégation et la forme neurospheres. Évaluer la taille de sphère en utilisant une règle direct sur un microscope à contraste de phase. Attendez que la plupart des sphères atteindre un diamètre approximatif de 100 µm (± 20 μm) (Figure 5). Petites sphères vont complètement se dispersent et se défassent pendant le test de migration.
  2. Préparation des plaques pour l’analyse de Migration Neurosphère
    1. Dissoudre le ECM-mimic gel aliquotes (voir la Section 3.2) dans 6 mL de 30 % Expansion Media. Une fois préparé, ECM-mimic gel/30% solution Expansion Media ajouter véhicules, facteurs de croissance ou de drogues d’intérêts à des concentrations souhaitées.
      Remarque : Véhicule, drogue et concentrations de facteur de croissance doivent être augmentée pour tenir compte de l’ajout de 200 µL de neurospheres dans la Section 6.3.
    2. Plaque de 1 mL de l’ECM-mimic gel solution Media Expansion de 30 % (± véhicules, facteurs de croissance ou de drogues) dans un puits d’une plaque de 6 puits. Faire 2-3 puits par condition expérimentale. Sinon, mets 35 mm peuvent être utilisés. Incuber les boîtes pendant au moins 30 min à 37 ° C.
      Remarque : Ne pas aspirer le ECM-mimic gel/30% solution Expansion Media pour ce dosage. Placage de sphères sur un gel de ECM-Mimic aspiré conduira à migration rapide et excessive.
  3. Neurospheres de placage
    1. Recueillir des neurospheres formé à la Section 6.1 et placez-les dans un tube conique. Laver le 35 mm plats avec 1 mL de solution de 1 PBS x pour assurer tous les neurospheres sont collectées. Tournez en bas les neurospheres recueillies à 100 x g pendant 5 min.
    2. Remettre en suspension les neurospheres en 1 à 3 mL de préchauffé 30 % Expansion Media. Si 1 plat de neurospheres est recueilli, 1 mL de médias est utilisé pour remettre en suspension les sphères. Si 2 plats sont collectés, 2 mL de médias sont ajoutés pour remettre en suspension les sphères, etc. , déposer délicatement et seulement un P-1000 permet de s’assurer que les sphères ne sont pas brisés.
    3. Plaque de 200 μl de la suspension neurospheres dans l’ECM-mimic gel/30% solution d’extension faite à la Section 6.2. Plaques de roche dans toutes les directions à répartir neurospheres. Incuber les boîtes pendant 48 h à 37° C.
    4. Retirer l’ECM-mimic gel/30% Expansion Media solution et fixer les cellules à 4 % PFA, lavage et garder les cellules en 1 x PBS + 0,05 % d’Azide de Sodium.
  4. Analyse des Neurospheres
    1. Acquisition d’images de neurospheres ensemble à l’aide de paramètres de contraste de phase à 10 X. S’assurer que les sphères ne sont touchent pas entre eux. Mesure moyenne migration en utilisant le logiciel ImageJ.
    2. Tracer le contour extérieur de la Neurosphère à l’aide de l’outil en ligne à main levée. La ligne à main levée est accessible par un clic droit sur l’icône « rectiligne ». Traces manuellement à l’aide d’une souris.
    3. Utilisez la fonction de mesure pour calculer la superficie de la trace. Veiller à ce que la « zone » est sélectionné comme un affichage dans la fenêtre « Set Measurements » sous l’onglet analyse. Voir la Figure 6 pour trace du contour extérieur en bleu.
    4. Tracer la masse cellulaire interne de la zone de la sphère et de mesure. Voir la Figure 6 pour trace du contour intérieur en rouge. Quantifier la migration moyenne en soustrayant la masse cellulaire interne de la zone totale Neurosphère.
    5. Neurospheres de mesure qui présentent une masse cellulaire interne dense avec des cellules sur la migration comme un tapis contigu (Figure 6).
    6. N’incluez pas les cellules à l’extérieur de la moquette ou détaché de la Neurosphère pour la mesure. Voir la Figure 6 pour des exemples de cellules (encerclés en blanc) qui sont exclus de la mesure de tapis extérieur. Analyser un minimum de 20 neurospheres pour chaque condition.

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Representative Results

Un des buts de ces études sont de définir l’activité proliférative des PNJ, c'est-à-dire l’augmentation du nombre de cellules. Ce résultat est obtenu en évaluant la synthèse de l’ADN de la population totale de cellules, une approche de haut débit qui mesure l’incorporation de thymidine tritiée traceur radioactif dans des extraits cellulaires et tient compte de toutes les cellules engagées en phase S, qu’ils soient synthèse pendant 5 minutes ou les deux heures ensemble. En outre, ces tests permettent la détermination de la proportion de cellules qui entrent dans la phase S et le nombre de cellules total, un dosage plus fastidieux de cellules individuelles. Cellules synthétisent ADN en phase S, une étape qui précède la mitose et division cellulaire, qui doit avoir lieu afin d’augmenter le nombre de cellules. Puisque ces processus prennent un certain temps, les changements dans la synthèse de l’ADN évaluée à 48 heures n’est peut-être pas associés à des variations dans le nombre de cellules à ce point dans le temps. Néanmoins, il a été constaté que des changements dans la synthèse de l’ADN à 48 heures prévoient de manière fiable des augmentations du nombre de cellules 4 et 6 jours.

Dans l’évaluation de synthèse de l’ADN, les cellules sont plaqués avec une densité de 100 000 cellules (confluent de ~ 50 %) dans une plaque 24 puits et sont autorisés à cultiver pendant 48 heures avant la prise de mesures. Cette densité s’assure que les cellules ressemblent à leur environnement de monocouche, mais aussi ne se développent pas si vite dans une période de 48 h que les médias devient trop acide. Médias qui sont trop acides peuvent affecter significativement le métabolisme de la cellule et altèrent ainsi, résultats de prolifération. Si les lignées cellulaires spécifiques sont hautement proliférantes, le chercheur devrait envisager de modifier la densité cellulaire, volume de médias, ou médias échangent fréquence afin d’éviter des conditions très acides. Si les conditions sont modifiées, il est essentiel d’être cohérente lorsque l'on compare les différentes lignées cellulaires parce que les changements de charge contact cellule-cellule certainement une incidence sur les taux de croissance. La conception simple de ces tests nous permet de tester les différents facteurs de croissance. Comme on le voit dans la Figure 7, l’ajout de facteur de croissance fibroblastique (FGF, 10 ng/mL) pour 48 heures augmente la synthèse de l’ADN d’environ 40 %. En outre, le test de synthèse d’ADN est reproductible comme tous les clones et individus montrent une augmentation de la synthèse d’ADN après stimulation FGF. Le potentiel de la variabilité du niveau de référence et FGF stimule la synthèse de DNA entre différents individus non affectés, ainsi que le potentiel pour la variabilité clonale chez le même individu est démontrée dans le tableau 1. En raison de cette variabilité, il est important de tester plusieurs clones iPSC par personne, en plus d’évaluer un minimum de 3 à 5 lignes NPC dérivés de chaque clone iPSC différents. Un minimum de 3 expériences pour chaque ligne NPC a été réalisé.

L’essai de synthèse de l’ADN nous permet d’évaluer rapidement les nombreux groupes expérimentaux dans un mode haut débit et la mesure reflète la somme totale de synthèse de l’ADN quelle que soit la durée de la phase S (5 minutes à 2 heures). Pour définir la proportion de cellules engagées en phase S, le test d’entrée phase S travaillait. Pour ce test, les cellules sont cultivées à la même densité, tel que mentionnée précédemment pour permettre monocouche comme dynamique de se produire, mais puis ils sont dissociés après 2 jours et a permis d’adhérer brièvement aux plaques d’analyser des unicellulaires. Compter les cellules dans une monocouche peut être difficile en raison de la forte contact cellule-cellule et la variabilité régionale dans la plaque. Ce paradigme permet de modéliser les cellules comme une monocouche et ensuite les analyser comme des cellules individuelles. Il agit également comme une confirmation indépendante sur le plan méthodologique des données obtenues lors de l’essai de synthèse d’ADN. Comme on le voit à la Figure 8, 48 heures de stimulation de FGF (10 ng/mL) augmente la proportion de cellules entrant dans la phase S de ~ 25 %.

En évaluant le nombre de cellules, une plus faible densité cellulaire est utilisée que dans les essais susmentionnés, avec 50 000 cellules étant plaqués / puits d’une 24 puits plaque. Encore une fois, cette densité a été choisie pour s’assurer que les lignées de cellules plus rapides ne se développent pas si vite au cours de la période de 6 jours que le pH du milieu devient trop acide et se colore en jaune. Dans la Figure 9, tandis que le nombre de cellules ne peut être significativement différent entre les groupes témoin et FGF (10 ng/mL) à 2 jours, les changements dans la synthèse de l’ADN après 48 h (Figure 7) sont prédictifs de l’évolution du nombre de cellules à 4 et 6 jours.

Alors que les PNJs sont généralement cultivés à haute densité, le dosage des neurites est réalisé sur une densité de 50 000 cellules plaqué dans un plat de 35 mm afin d’évaluer les cellules individuelles. Même à cette faible densité, le NPC cultures protéines cytosquelettiques express et des facteurs de transcription caractéristiques des PNJs comme NESTIN, SOX2 et PAX6 (Figure 10 A-D). Cela indique qu’une faible densité de culture ne modifie pas significativement sort de cellule dans ce laps de temps. En outre, des conditions de faible densitées similaires ont été utilisées dans les systèmes de culture de rat et la souris pour détecter les phénotypes qui ont été finalement reproductibles en vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Après 48 heures d’incubation, une faible proportion des PNJs commencent à étendre des neurites comme on le voit à la Figure 11 a et B et quantifié dans le graphique en Figure 11. La proportion de cellules qui s’étendent des neurites, la longueur des neurites et le nombre de neurites/cellulaire peut être mesurée pour évaluer les paramètres de développement. Afin d’évaluer avec précision le pourcentage de cellules avec des neurites, il est important que les cellules sont plaqués comme des cellules individuelles ou des groupes de < 5 cellules et pas aussi gros agrégats. Comme on le voit dans la Figure 10 E-F, cellules porteuses des neurites (flèche blanche) également expriment tubuline bêta-III de marqueur neuronal immatures (TUJ1). Comme mentionné dans les méthodes, les images fluorescentes peuvent être acquises de TUJ1 teinté de PNJs et puis ces images peuvent être comptés pour la proportion des neurites TUJ1 + pour assurer l’origine neuronale des processus. Dans notre laboratoire, des analyses effectuées par les deux méthodes ont donné des résultats statistiquement similaires.

La conception simple et la nature rapide du dosage neurites nous permettent également de tester les effets de développemental pertinent des facteurs de croissance, les cytokines et les peptides. Par exemple, la Figure 11 montre que le neuropeptide l’adénylate cyclase hypophysaire polypeptide activant (PACAP, 3 nM) augmente la croissance des neurites dans PNJs. PACAP est un facteur important du développement qui a large expression dans le système nerveux central et s’est avéré être important dans le développement du cerveau. Études sur les rongeurs dans notre laboratoire et d’autres laboratoires ont trouvé que PACAP a répandu stade dépendant des effets du développement tels que la régulation de la croissance des neurites, la migration et la prolifération dans les deux le cerveau postérieur et du prosencéphale16,22, 29,30,31. Études récentes par Ataman et al. (2016) à l’aide de culture humaine des cellules corticales foetales indiquent que l’activité neuronale induit une augmentation de l’expression génique PACAP, indiquant l’importance des peptides dans le développement neuronal humain329-fold. En effet, le tableau 2 indique le pourcentage des neurites en contrôle et PACAP (3 nM) conditions entre nombreuses lignes provenant d’individus non affectés. Comme on le voit dans le tableau 2, il y a une variabilité du pourcentage des neurites exprimée dans les lignées cellulaires dérivées de clones différents de la même personne et de PNJs provenant de différents individus. Toutefois, ces individus non affectés ont une augmentation dans la croissance des neurites en réponse au PACAP, indiquant la reproductibilité des essais.

Comme la croissance des neurites, la migration cellulaire est un processus important de développement essentiel pour la bonne connexion, organisation et câblage du cerveau. Neurospheres nous permettent d’étudier la migration des PNJ dans un état de haute densité typique qui maintient le contact de cellule-cellule parmi les PNJs (Figure 12). Facteurs pertinents développemental peuvent également être testés sur neurospheres pour évaluer leurs effets sur les migrations. Par exemple, la Figure 12 montre que PACAP (10 nM) augmente la migration des PNJ.

Figure 1
Figure 1 : PNJ au passage 3. PNJs à P3 expriment des marqueurs spécifiques au stade multiples y compris (A) facteur de transcription pluripotentes, SOX2 (B) facteur de transcription spécifique pour le prosencéphale PNJs, PAX6, et protéines du cytosquelette NPC NESTIN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma du dosage d’entrée phase S. Chronologie du S-ouverture de la phase de test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : quantifier l’entrée de la phase S. (A) Phase image montrant phase sombre live (flèches blanches) des cellules, une cellule morte de phase-brillant (étoile blanche) et une cellule phase-brillant direct (flèche verte). (B) Fluorescent DAPI tache montrant noyau condensé dans une cellule morte (étoile blanche) et gros noyaux dans une cellules vivantes (flèches blanches et vertes). (C) EdU Fluorescent, l’image lumineuse EdU noyaux positifs (flèche rouge) et moucheté EdU noyaux positifs (étoile rouge). (D) Phase et fluorescente fusion d’images 3 a - 3C.

Figure 4
Figure 4 : identification des neurites. Images de contraste de phase de PNJs. (A) A cellule avec un processus > 2 corps cellulaires en longueur, répondant ainsi au critère pour un neurites. (B) une cellule avec un processus < 2 corps cellulaires en longueur et par conséquent pas considéré comme portant des neurites. (C) représente une cellule avec 2 processus-le processus plus long est évalué pour le critère des neurites. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : sélection neurospheres pour l’analyse de la migration. Image de contraste de Phase (A) d’un champ représentant des neurospheres à 24 h. sphères sont tous moins de 100 μm et ainsi, ne sont pas collectées pour l’analyse de la migration. (B) Phase contraste l’image d’un champ représentant des neurospheres 72 h. Toutes les sphères sont comprise 100 μm ± 20 µm, ce qui indique qu’ils sont prêts à être prélevés pour l’analyse de la migration.

Figure 6
Figure 6 : Migration de quantifier. (A) Phase contrast image d’un Neurosphère représentatif. (B) contour bleu affiche la trace pour mesurer la superficie totale Neurosphère. Rouge indique le contour utilisé pour mesurer la surface de la cellule interne massive. Migration est définie comme zone de masse cellulaire zone intérieure Neurosphère total. Remarque, les cercles blancs montrent des cellules qui ne sont pas dans un tapis contigu, comme ces cellules sont exclues du périmètre de rayonnement de migration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : évaluation de synthèse de l’ADN. Les résultats représentatifs du contrôle par rapport aux traités FGF PNJs. FGF (10 ng/mL) synthèse de l’ADN augmente après 48 h (p, ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 puits/groupe/expérience ; 3 expériences). Barres d’erreur représentent SEM

Figure 8
Figure 8 : Proportion des cellules entrant dans la Phase S. (A) Phase contraste des images de cellules NPC incubées en contrôle par rapport aux supports traités de FGF (10 ng/mL) pour 48 h. EISN représente des images de grossissement plus élevés de cellules colorées pour marqueur fluorescent de EdU en contrôle et 10 ng/mL de milieu de FGF. Flèches rouges indiquent cellules EdU positives et blancs flèches indiquent les cellules qui sont négatif EdU. (B) graphique de résultats représentatifs du contrôle versus FGF (10 ng/mL) traités PNJs. FGF augmentations phase S entrée 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 plats/groupe/expérience ; 3 expériences). Barres d’erreur représentent SEM

Figure 9
Figure 9 : énumération des cellules à 2, 4 et 6 jours. (A) Phase contraste des images de cellules dans le contrôle et la FGF (10 ng/mL) médias traités à 2, 4 et 6 jours. (B) graphique de résultats représentatifs ; Remarque Cette FGF (10 ng/mL) n’augmente pas toujours nombre de cellules à 2 jours, mais en 4 et 6 jours, l’augmentation est apparent (p ≤ 0,05). (n = 2-4 puits/groupe/expérience ; 3 expériences). Barres d’erreur représentent SEM

Figure 10
Figure 10 : caractérisation des PNJs dans des conditions de faible densité. (A, C, E) Images de contraste de phase de PNJ dans des conditions de faible densitées. (B) PNJs expriment des marqueurs de cellules souches/progénitrices NESTIN (vert), SOX2 (rouge) et des marqueurs nucléaires DAPI (bleu). (D) PAX6 (rouge), DAPI (bleu). (F) à faible densité, cellules qui s’étend des neurites (flèche blanche) aussi expriment marqueur immatures neurone TUJ1 (vert). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : la croissance des neurites. (A) image de contraste de Phase de PNJ. Les flèches noires indiquent les cellules avec des neurites. (B) Addition de neuropeptide PACAP (3 nM) augmente le pourcentage de cellules avec des neurites (p ≤ 1 x 10-2). (C) Quantification des neurites en contrôle et 3 nM PACAP contenant des médias. (n = 2-4 plats/groupe/expérience ; 3 expériences). Barres d’erreur représentent SEM

Figure 12
Figure 12 : Neurosphère Migration. (A) Phase contraste des images de neurospheres. (B) Addition de PACAP (10 nM) augmente la migration cellulaire Neurosphère (p ≤ 10-2) (C) Quantification de la migration cellulaire. (n = 20 sphères/groupe/expérience, 3 expériences). Barres d’erreur représentent SEM

Médias
Patient Clone # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Patient 1 1 21 853 47 538
2 20 336 38 070
Patient 2 1 7 664 14 060
2 16 573 30 087

Tableau 1 : Synthèse de l’ADN. Une synthèse de l’ADN synthèse valeurs (CPMs) de PNJ provenant de deux clones iPSC par deux individus non affectés.

Médias
Patient Clone # CTRL PACAP
(3 nM)
Patient 1 1 13.60 % 18.10 %
2 16,50 % 21.10 %
Patient 2 1 8,90 % 14.10 %
2 14.20 % 21.10 %

Tableau 2 : Pourcentage de cellules avec des Neurites. Un résumé du pourcentage de cellules porteuses de neurites au PNJ provenant de deux clones iPSC par deux individus non affectés.

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Discussion

Les protocoles présentés ici illustrent des méthodes rapides et simples pour étudier les processus fondamentaux de développement neurologique et de tester les facteurs de croissance et de médicaments à l’aide de cellules précurseurs neurales dérivé de hiPSC. hiPSC technologie a révolutionné l’étude de la pathogenèse des maladies neurologiques en nous fournissant un accès sans précédent à vivre les cellules neuronales humaines de personnes touchées. En effet, il y a eu de nombreuses études hiPSC des troubles du développement neurologique, y compris le Syndrome de Rett, Syndrome de Timothy, syndrome de le X-Fragile, et la schizophrénie, qui ont mis au jour des aberrations spécifiques à certaines maladies dans les dendrites, synapses et neuronale fonction4,33,34,35,36. La plupart de ces études ont principalement porté sur terminalement différenciées, des neurones post-mitotiques qui, bien que considéré comme relativement fonctionnellement immatures, exclut l’étude de neurodéveloppement antérieure processus tels que la prolifération et la migration. Ces derniers processus ont été fortement impliqués dans la pathogenèse des troubles neurodéveloppementaux et mandat encore étudier8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. l’utilisation de PNJ nous permet d’étudier ces importants événements antérieurs tout en offrant l’occasion d’étudier des processus plus matures comme la capacité des cellules à étendre immatures axones/dendrites (neurites). En outre, certains de ces tests peuvent être étendu pour étudier d’autres paramètres, comme la longueur des neurites, nombre et ramification ou l’autre distance parcourue par une cellule.

Certaines études plus récentes ont utilisé des systèmes modèles organoïde pour étudier plus tôt des événements développementaux dans un 3-d « système mini-cerveau »1,39,40. Pourtant, même dans ces systèmes organoïde, la population de cellules prolifératives précurseur est limitée et le début de la maturation et de migration sont difficiles à étudier le15,39. En plus de limiter l’étude des plus tôt les phénomènes du développement, l’utilisation de terminalement différenciées neurones ou organoïdes est souvent longue et coûteuse et limite le nombre de variables qui peuvent être évalués dans le système. C’est parce que les neurones et organoïdes peut exiger des protocoles d’induction virale, équipement de plusieurs semaines de temps et de grandes quantités de médias et incubateurs spéciales. En revanche, à l’exception de l’essai de synthèse d’ADN (ce qui est abordé plus loin ci-dessous), ce protocole peut être facilement appliqué à l’étude des troubles du développement neurologique et ne nécessite pas de formation approfondie, des outils coûteux et les ressources ou logiciel. La facilité et le coût relativement faible de l’ajout de médicaments et facteurs de croissance dans ces essais, rendre cette technologie de protocole un haut débit utile pour tester les différents traitements possibles pour le développement neurologique et maladies neuropsychiatriques. En outre, étant donné que des facteurs de croissance Loi via défini les voies de signalisation cellulaires, ils également utilisable comme outils pour tester la possibilité de défauts dans le développement de systèmes de signalisation. Enfin, PNJs étant une population autorenouvellement proliférative, de grandes quantités de cellules peuvent être produites et cryoconservés permettant aux expériences effectuées efficacement sans devoir faire des PNJs de CISP chaque fois.

Pour utiliser une ces tests avec succès, il est important de noter les étapes essentielles suivantes. Ce protocole place PNJs dans différentes conditions pour l’entretien et l’expansion contre l’expérimentation. Plus précisément, alors que les PNJ sont induits, cultivé et repiquées dans un milieu contenant des neurones Induction supplément (NIS), nos conditions expérimentales réduisent le supplément de 70 %, ce qui place les cellules dans un environnement restrictif, nous donner la possibilité de rajouter et tester les effets des facteurs de croissance importants. Deuxièmement, il est essentiel de suivre le passage des PNJ. Dans nos études, nous avons généralement limité nombre de passage des lignées cellulaires de P3 - P8. Dans les passages plus tôt que P3, certaines lignes n’expriment pas les robustement marqueurs caractéristiques. À des passages plus élevés, tandis que certaines lignées cellulaires ont des taux de croissance très régulier ou des réactions aux facteurs de croissance, autres lignées cellulaires peuvent avoir changements dramatiques dans la croissance cellulaire ou de réponse. Bien que pas systématiquement signalées, nous et beaucoup d’autres avons vécu ce changement spectaculaire des taux prolifératives à passages supérieurs. La raison c’est incertaine, mais ce changement peut refléter une capacité limitée d’auto-renouvellement des PNJs. définir pourquoi et comment les taux de prolifération passer de longs passages peut apporter un éclairage sur le développement et la pathogenèse de la maladie, mais des recherches supplémentaires devra être fait. Enfin, le protocole d’induction neurale commerciaux que nous utilisons peut produire parfois mauvaise qualité des cellules souches neurales, particulièrement si le CISP de départ n’est pas de grande qualité (i.e., avoir la différenciation des cellules sur les frontières des colonies de cellules, anomalies du caryotype). Dans certains cas, la morphologie des cellules est déformée et expression des marqueurs n’est pas présente. Ne pas utiliser ces cultures. Dans d’autres cas, PNJs se développent avec des cellules « contaminant » plus plats, qui peuvent être éliminées avec un traitement de solution de détachement cellulaire différencié pour les populations de NPC pratiquement pures avant de l’utiliser dans des expériences. Ayant qualité de PNJs est critique pour des résultats corrects : voir les matériaux et l’équipement de l’article un lien vers un protocole d’Induction neurale où se trouvent les images de PNJ de haute et de basse qualité.

Pour chacune des analyses présentées, il est important de noter le suivants étapes critiques, les erreurs potentielles et des conseils de dépannage. Pour le nombre de cellules, synthèse de l’ADN et dosages de neurites, il est important de cellules de plaque comme dissocient des cellules individuelles et pas en touffes, car cela peuvent biaiser mesures de synthèse ADN, des numérations globulaires et le comportement de neurites. Pour s’assurer que les amas de cellules ne sont pas plaqués, déguster un petit volume de cellules avec un P1000, plaque sur une diapositive et vérifier si les amas de cellules sont présents. Si on remarque des touffes, Pipetter cellules haut et bas pour briser manuellement des touffes dehors avant l’ensemencement. Pour la synthèse de l’ADN et l’analyse de nombre de cellules, les cellules sont levées avec les enzymes de comptage et d’analyse. Il est essentiel de confirmer visuellement les cellules ont complètement levées depuis le récipient de culture pour obtenir des chiffres précis et si nécessaire, des périodes d’incubation enzyme plus peuvent être utilisés. Dans le cas des numérations globulaires faible ou faible CPM pour l’essai de synthèse de l’ADN, les cellules peuvent être plaqués à des densités plus élevées initiales, radioactive tritiée [3H] - thymidine peut être ajouté pour doubler le temps (4 heures au lieu de 2), ou tritiée [3H] - thymidine concentration peut être doublée. Pour le dosage de neurites, densité placage initial peut être doublée sans risquer de contact cellule-cellule accru. Faites attention à la répartition des cellules dans un plat et compter 1 cm de rangs tels que chaque partie du plat est échantillonné. Si le pourcentage de neurites est trop faible après 48 h, l’essai peut être prolongée jusqu'à 6 jours ou le type de substrat de revêtement ou de concentration peut être modifiée afin de promouvoir le plus grand pourcentage des neurites. Cependant, il est important de noter que les temps de revêtement et les méthodes que nous avons présentés dans le protocole ont été sélectionnés pour optimal neurites excroissance et cellule de santé après avoir testé de nombreux substrats différents, concentrations du substrat et des temps de revêtement. Pour le dosage de Neurosphère, utilisation des petites pipettes (P20, P200) peut conduire à la tonte et la rupture des sphères plus grandes. Ainsi, il est impératif que le pipetage se fait doucement et avec un P1000 ou une pipette sérologique. Pour l’enrobage de la neurospheres, à basse vitesse (100 x g au lieu de 300 x g) est également recommandés pour prévenir la dissociation Neurosphère. Au cours de l’électrodéposition de sphère, veiller à ce que sphères sont espacées convenablement comme sphère-à-sphère contact peut influencer la migration. Dans le cas où la migration est trop rapide ou trop lent, temps d’incubation peut être diminué ou augmenté respectivement. Substrats de revêtement peuvent également être modifiées pour modifier les taux de migration.

Alors que les techniques utilisées sont rapides, simples et applicables à l’étude des troubles du développement neurologique, il existe certaines limitations. D’une part, bon nombre des analyses présentées (analyse de nombre de cellules, dosage des neurites, test de migration) nécessitent des enquêteurs pour prendre des décisions subjectives (par exemple, est-ce une neurite ? Est cette cellule morte ?) pouvant déboucher sur la partialité de l’enquêteur et de la reproductibilité inférieure. Cependant, réalisation d’analyses aveugles et établissant des normes strictes pour chaque décision prise au sein d’un test, tel qu’illustré dans les méthodes, peut atténuer ces biais. De même, ces tests nécessitent des mesures manuelles et les chefs d’accusation, qui peuvent exiger beaucoup de temps et du travail. Toutefois, dans les laboratoires disposant de l’équipement et les ressources techniques, ces tests peuvent être accélérés avec l’utilisation de cellule automatisée des compteurs et des programmes qui peuvent mener des mesures automatisées41,,42. Dans le cas de l’essai de synthèse de l’ADN, ces méthodes sont spécifiques à notre machine de moissonneuse et scintillation de cellule (voir matériel et équipement) ; Cependant, il y a des autres modèles disponibles et des méthodes qui peuvent servir à obtenir les mêmes informations, telles que la moissonneuse de cellule Omnifilter-95. Pour certains établissements, l’utilisation de sources radioactives ne pourrait pas être réalisable. Dans ce cas, une méthode alternative en utilisant un fluorescent thymidine analogique, tels que EdU, analysé sur un lecteur de microplaques fluorescent, permettra l’acquisition des mêmes informations sur l’analyse de la majeure partie de l’ADN de synthèse44.

Notre système de culture basse densité sépare les PNJs dans des cellules individuelles ou de petites touffes, une condition qui se distingue de la nature dense de PNJ dans le développement du tube neural. Pourtant, les PNJ sont des marqueurs appropriées sains et express (Figure 1, , Figure 10). Par ailleurs, nos études antérieures de la souris et le rat des cultures corticales montrant parallèlement conclusions dans des cultures in vitro , et in vivo modèles indiquent l’utilité et la valeur de l’utilisation de cette approchent16,17,18 , 19 , 24. en outre, ce système offre une approche puissante pour comprendre la maturation des cellules et d’étudier des sous-populations de cellules. Par exemple, immunohistochimie peut être effectuée sur l’essai de neurites pour déterminer quel type de cellules neuronales spécifiques s’étend un neurites. En fin de compte, malgré quelques limitations, ce protocole unique fournit des méthodes simples, puissantes et rapides pour l’étude des troubles du développement neurologique.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le gouverneur du New Jersey Conseil pour la recherche médicale et le traitement de l’autisme (CAUT13APS010 ; CAUT14APL031 ; CAUT15APL041), Nancy Lurie marque la Fondation de la famille et la Fondation de la communauté juive de Greater MetroWest New Jersey Mindworks Charitable Trust de plomb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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