Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lo sviluppo del cervello umano procede attraverso una serie di precisamente orchestrati processi, con fasi precedenti illustri di proliferazione, migrazione e neuriti; e fasi successive, caratterizzate dalla formazione di escrescenza e sinapsi dell'assone/dendrite. In disturbi dello sviluppo neurologico, spesso uno o più di questi processi sono interrotti, che conduce alle anomalie nella formazione del cervello e funzione. Con l'avvento della tecnologia (hiPSC) sulle cellule staminali umane pluripotenti indotte, i ricercatori hanno ora un'abbondante fornitura di cellule umane che possono essere differenziati in praticamente qualsiasi tipo di cellula, compresi i neuroni. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo normale del cervello e la patogenesi della malattia. Un numero di protocolli di utilizzo hiPSCs per modello malattia neuropsichiatrica uso terminalmente differenziate neuroni o sistemi di coltura 3D uso definito organoids. Mentre questi metodi hanno dimostrato preziosi per lo studio della patogenesi della malattia umana, ci sono alcuni svantaggi. Differenziazione di hiPSCs in neuroni e generazione dei organoids sono processi lunghi e costosi che possono influenzare il numero di esperimenti e le variabili che possono essere valutate. Inoltre, mentre organoids e neuroni post-mitotici consentono lo studio dei processi di relazione con la malattia, tra cui dendrite escrescenza e sinaptogenesi, precludono lo studio dei processi precedenti come proliferazione e la migrazione. In disturbi dello sviluppo neurologico, come l'autismo, la prova genetica e post-mortem abbondante indica difetti nei processi di sviluppo precoce. Le cellule precursori neurali (NPC), una popolazione altamente proliferative delle cellule, possono essere un modello adatto in cui porre domande su processi ontogenetici e l'inizio di malattia. Estendiamo ora metodologie imparati dallo studio sviluppo nel topo e ratto culture corticali di NPC umani. L'uso dei PNG permette di indagare fenotipi correlati alla malattia e definire come le diverse variabili (ad es., fattori di crescita, farmaci) impatto inerente allo sviluppo processi tra cui la proliferazione, migrazione e differenziazione in pochi giorni. In definitiva, questo set di strumenti utilizzabile in modo riproducibile e ad alta produttività per identificare i meccanismi specifici di malattia e fenotipi in disturbi dello sviluppo neurologico.

Introduction

L'uso di organismi più semplici e modelli murini ha chiarito i meccanismi di sviluppo di base del cervello così come la patogenesi della malattia. Nonostante questi progressi, l'eziologia di molti disturbi neuropsichiatrici resta sfuggente, perché non tutti i risultati negli organismi più semplici sono direttamente rilevanti per aspetti complessi della malattia umana. Inoltre, la maggiore complessità del cervello umano spesso rende difficile lo sviluppo umano di modello e disturbi negli animali. Con l'evoluzione e il progresso della tecnologia (hiPSCs) le cellule staminali pluripotenti indotte umane, cellule somatiche può essere riprogrammate in cellule staminali e quindi differenziate in cellule di un neurone per studiare la malattia umana. Gli avanzamenti nelle tecnologie hiPSCs e "omiche" (genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica) promettono di rivoluzionare la comprensione dello sviluppo del cervello umano. Queste tecnologie rendono ora possibile un approccio di "precisione medicina" per la caratterizzazione della malattia neuropsichiatrica caso per caso.

La graffetta corrente nel campo di malattia-modellazione hiPSC è di differenziare le cellule in sottotipi neuronali specifici in un monostrato o a utilizzare un sistema di cultura 3D chiamato un organoid per ricapitolare gli aspetti del cervello sviluppo1,2, 3. Questi sistemi sono stati incredibilmente preziosi nello studio e scoprire aspetti unici di sviluppo umano e malattia4,5,6,7. Tuttavia, sia colture neuronali e organoids spesso richiedono ovunque da settimane a mesi nella cultura prima che siano pronti a studiare. La natura che richiede tempo di questi protocolli e la quantità di risorse necessarie per mantenere che questi sistemi di cultura spesso limitano il numero di esperimenti che possono essere effettuati e il numero di variabili (come fattori di crescita o farmaci) che possono essere testati. Inoltre, molti studi che utilizzano organoids e neuroni post-mitotici sono concentrati sui processi come la formazione di dendrite escrescenza o sinapsi, che si verificano più avanti nello sviluppo. Mentre questi processi sono stati implicati nella patologia di disturbi dello sviluppo come l'autismo e la schizofrenia, all'inizio dello sviluppo eventi che si verificano prima definitiva differenziazione neuronale sono anche importanti per la patogenesi della malattia8 ,9,10,11,12,13. Infatti, recenti studi genomici mostrano che il periodo di metà-fetale, che è composto di proliferazione, conseguenza del processo e la migrazione, è particolarmente importante nell'autismo patogenesi11,14. Pertanto, è importante studiare le staminali neurali e popolazioni di cellule progenitrici per comprendere meglio questi processi precedenti. Organoid sistemi, che sono lo sviluppo del cervello umano di riepilogo considerato al meglio a causa della loro natura 3D e la struttura organizzata, contengono un pool di cellule progenitrici che è stato utilizzato per studiare alcuni di questi eventi precedenti. Tuttavia, la popolazione di cellule progenitrici in organoids è spesso scarsa e più come cellule gliali radiali di neurali staminali o progenitrici cellule5,15. Così, sarebbe utile avere un metodo di throughput elevato per studiare le prime fasi del neurosviluppo in una popolazione delle cellule attivamente proliferative.

In laboratorio, abbiamo creato un protocollo che utilizza le cellule precursori neurali hiPSC-derivato (NPC), una popolazione mista di progenitrici cellule staminali neurali e che è altamente proliferative, di studiare i processi neurodevelopmental quali la proliferazione, migrazione cellulare, e estensione del processo iniziale (neurite). Queste analisi sono state sviluppate da tecniche utilizzate nel nostro laboratorio per decenni per studiare con successo neurosviluppo nei ratti e topi culture corticali16,17,18,19,20, 21,22,23. D'importanza, inoltre è stato indicato che fenotipi e segnali di regolazione definiti nei sistemi di coltura di ratti e topi sono altamente predittivi di meccanismi che sono attivi in vivo, che indica il valore di queste tecniche16, 17,18,19,24. Dopo la differenziazione iniziale di hiPSCs di NPC, questi metodi ci permettono di studiare processi vitali dello sviluppo in pochi giorni. Questi metodi hanno molti vantaggi: (1) richiedono poco sofisticate apparecchiature e sono facili da implementare, (2) numerose repliche sperimentali possono essere condotti in un breve periodo di tempo, permettendo per conferma veloce della riproducibilità dei risultati e (3) variabili di cultura come matrici di rivestimento, gli effetti dei fattori di crescita e l'attività dei farmaci possono essere testate in modo rapido ed economico. Inoltre, approfittiamo del ruolo ormai consolidato di fattori di crescita extracellulari come regolatori critici di diversi processi di sviluppo. I PNG sono stati esposti per selezionare i segnali dello sviluppo che direttamente stimolano eventi come proliferazione, neuriti e migrazione cellulare e hanno trovato che migliorano la capacità di identificare i difetti che non sono evidenti in condizioni di controllo19 , 25 , 26 , 27 , 28. allo stesso modo, la facilità di valutazione farmaci fornisce un potente viale per adottare tecniche di medicina di precisione per verificare l'efficacia dei vari interventi terapeutici. Così, questo protocollo facilita un throughput elevato, riproducibile e semplice metodologia per studiare lo sviluppo iniziale del cervello, patogenesi della malattia e gli effetti benefici potenziali di fattori di crescita e di droghe sui fenotipi neurodevelopmental.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. armadio di sicurezza biologica manutenzione e procedure di sicurezza

  1. Procedure di sicurezza livello di biosicurezza 2 (BSL-2)
    1. Seguire le linee guida dell'istituzione lavorando con materiali BSL-2. Smaltire materiali BSL-2 secondo le pratiche dell'istituzione. Indicare le camere e le attrezzature che vengono utilizzati per BSL-2 materiali. Indossare tutti i dispositivi di protezione individuale (PPE), camice e guanti.
  2. Armadio di sicurezza biologica manutenzione
    1. Utilizzare un armadio di sicurezza biologica certificato per l'utilizzo di materiali di livello BSL-2.
    2. Accendere la luce UV nella biosicurezza armadietto per almeno 15 min e poi spruzzare le superfici con soluzione di candeggina al 10%. Consentire la soluzione di candeggina riposare per 15 minuti, strofinare il cabinet e accendere il flusso d'aria prima dell'uso.
  3. Trizio radioattivo [3H]-timidina (trizio) procedure di sicurezza
    Nota: Il trizio è una sorgente radioattiva di categoria 5, 'il più improbabile essere pericoloso' categoria. Seguire le linee guida dell'istituzione per lavorare con la radioattività. Alcune istituzioni possono richiedere certificazioni o permette di gestire il trizio.
    1. Ricevono l'addestramento da parte dell'istituzione su come gestire correttamente e smaltire il trizio. Smaltire i rifiuti radioattivi in recipienti corretta, in base ai criteri dell'istituzione. Lavorando con trizio, indossare PPE.

2. neurale induzione da iPSCs

Nota: Per rendere i PNG, una versione leggermente modificata di un protocollo che accompagna un kit disponibile in commercio induzione neurale è stata seguita. Il kit è composto da media Neurobasal (NB) e un 50 x supplemento di induzione neurale (NIS), che è usato per fare un 1 x medio di induzione neurale (NIM). NIS è utilizzato anche per rendere 100% medio di espansione (Vedi sezione 3.1). Un link al protocollo si trova nei materiali e attrezzature e riferimenti sezione43.

  1. Passaggio iPSCs quando diventano 70-80% confluenti.
  2. Piastra 300.000 iPSCs in 1 bene di un qualificato hESC extracellulare matrix-mimico gel (gel di ECM-mimico) rivestito 6 pozzetti contenenti 2 mL di medium privo di alimentatore iPSC con 5 μM di inibitore di roccia. Per istruzioni sui pozzi di rivestimento con ECM-mimico gel, vedere la sezione 3.2.
  3. Il giorno dopo, rimuovere l'iPSC medium + ROCK iPSCs inibitore e lavata una volta con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di NIM i iPSCs.
    Nota: 50 mL di NIM è effettuata aggiungendo 1 mL di 50 x NIS e 250 µ l (50 unità/mL, 5 µ l/mL) di penicillina/streptomicina (P/S) a 49 mL di NB Media.
  4. Variazione media dell'induzione neurale ogni 2 giorni aspirando speso medio e sostituzione con 2 mL di NIM fino a cellule diventano confluenti (circa 4-5 giorni). Modifica supporto quotidiano, una volta che le cellule sono confluenti.
  5. Cellule di passaggio dopo 7 giorni in NIM e piastra in un gel di ECM-mimico rivestito 6 pozzetti contenenti 2 mL di 100% Media espansione e dell'inibitore di roccia di 5 μM. Le cellule sono considerate passaggio 0 (P0) NPC a questo punto. Vedere sezione 3.1 qui di seguito per istruzioni su come realizzare un supporto di espansione 100%.
  6. Cellule di passaggio utilizzando i metodi descritti nella sezione 3.4. Attendere che le cellule hanno raggiunto P2 e sono confluenti prima dissociare per macchiare per marcatori di NPC e placcatura per esperimenti (Figura 1).

3. terreni di coltura, verniciatura e manutenzione dei PNG

  1. Preparazione di terreni per la manutenzione di NPCs (100% espansione Media):
    1. Preparare 50 mL di Media espansione 100% combinando 24,5 mL di DMEM/F12 con 24,5 mL di NB
    2. Aggiungere 1 mL di 50 x NIS al DMEM/F12 + soluzione NB. Aggiungere 250 μL di soluzione di P/S ai media.
      N.B.: Può essere refrigerato (4 ° C) e utilizzato per fino a 2 settimane. Volumi più piccoli dei media possono essere effettuate regolando i volumi di DMEM / F12 + NB + NIS utilizzando gli stessi rapporti per quanto riguarda il volume di 50 mL.
  2. Preparazione del Gel di ECM-mimico di cultura piastre rivestite per manutenzione NPC
    1. Aliquotare ECM-mimico gel al volume necessario per rendere 6 mL di soluzione di lavoro. Calcolare il volume aliquota guardando il certificato di analisi foglio dal ECM-mimico fattore di diluizione del gel varia da lotto a lotto e lotto.
    2. Scongelare un'aliquota di gel ECM-mimico sul ghiaccio e si dissolvono in 6 mL di freddo DMEM/F12 media.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di ECM-mimico gel/DMEM/F12 in ciascun pozzetto di una piastra ben 6. Incubare la piastra a 6 pozzetti con ECM-mimico-soluzione di gel per 30 min a 37 ° C.
    4. Aspirare la soluzione di ECM-mimico gel dopo 30 min di incubazione e sostituire con 100% espansione Media o refrigerare piastre (4 ° C, fino a 1 settimana) senza aspirare la soluzione di gel ECM-mimico.
  3. Manutenzione dei PNG
    1. Piastra NPC ad una densità di 1,5 milioni di cellule in un ECM-mimo ben contenente 2 mL di Media espansione 100% gel-rivestita.
    2. Incubare i PNG a 37 ° C in un ambiente umido con 5% CO2.
    3. Aggiungere 5 μM di inibitore di roccia ai media per NPC a P3 o inferiore, o per NPC scongelati, per prevenire la morte cellulare eccessiva. Modifica supporto dopo 24 h per rimuovere inibitore di roccia.
    4. Cellule di passaggio ogni 4-9 giorni, dipendendo dalla quando diventano confluenti. Le cellule sono considerate confluenti quando diventano un monostrato densamente coprendo l'intero fondo della superficie del piatto.
    5. Piastra NPC ad una densità di 1 a 1,5 milioni di cellule per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (vedere sezione 3.4). Rimuovere i supporti esauriti ogni 48 h e sostituire con 2 mL di Media espansione 100%.
  4. Sollevare, dissociare e a Pellet NPC per manutenzione e/o placcatura per condizioni sperimentali
    1. Aspirare le cellule medie, lavare una volta con 1x PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 500 μL di soluzione di distacco di 1 x cella in 1 bene di confluenti NPC. Incubare per 10 min a 37 ° C.
    2. Aggiungere 500 μL di temperatura ambiente (TA) PBS e lavare bene usando una pipetta di P-1000 per garantire la rimozione delle cellule. Raccogliere le cellule + soluzione PBS in una provetta conica da 15 mL. Lavare la piastra nuovo con 1 mL di PBS e aggiungere liquido nella provetta.
    3. Selezione delle cellule verso il basso a 300 x g per 5 min a pellet.
    4. Rimuovere il supernatante dal pellet e risospendere le cellule in 1-5 mL di pre-riscaldato DMEM/F12 media. Diluire le cellule ad una densità di 1 a 4 milioni di cellule/mL di media. Quantificare le celle utilizzando un emocitometro.
    5. Piatto il numero di cellule, specifiche per manutenzione NPC (sezione 3.3) o il dosaggio individuale in corso (vedere le sezioni successive per maggiori dettagli).
    6. Regolare volume di sospensione cellulare con i media in modo che tra 15 e 100 μL di cellule sono utilizzati per ogni pozzetto. Questo volume di piccola placcatura assicura che non esiste una distribuzione anche delle cellule e fattori di crescita, droghe o substrati nel mezzo non sono diluiti.
    7. Incubare le cellule a 37 ° C. Cambiare supporto ogni 48 h per manutenzione NPC o vedere i dettagli specifici per singoli saggi.
  5. Preparazione di terreni per condizioni sperimentali (30% espansione Media)
    1. Diluire il Media di espansione 100% 70% (denominate 30% espansione) con l'aggiunta di 1:1 DMEM/F12 + NB soluzione per realizzare un supporto per condizioni sperimentali.
    2. Fare 20 mL di 30% espansione Media aggiungendo 6 mL di Media espansione 100% e diluire con 7 mL di NB e 7 mL di DMEM/F12 media. Aggiungere 5 µ l/mL di soluzione di P/S.
      Nota: Se il supporto di 100% contiene già P/S, quindi aggiungere 5 µ l/mL per combinato-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 µ l/mL) = 70 μL di P/S invece di 100 µ l.
    3. Aggiungere il rivestimento di substrati e fattori di crescita alle concentrazioni desiderate per il supporto di espansione del 30%.

4. valutazione di sintesi del DNA, entrata in fase S e numeri di cellulare dei PNG

  1. Preparazione per la sintesi del DNA, entrata in fase S e analisi di numero delle cellule
    1. Fare un 1 mg/mL di soluzione madre di poli-D-lisina (PDL) in dH2O e filtro sterilizzare. Diluire 01:10 in dH2O fare un 0,1 mg/mL soluzione PDL e aggiungere 300 μL in ogni pozzetto di una piastra ben 24 o 1 mL per un piatto di 35 mm. Incubare per 20 minuti a TA.
    2. Lavare i pozzetti PDL per 5 min con dH2dH aspirato O.2O per 3 volte e aggiungere 300 μL/pozzetto o 1 mL/piatto di laminina (5 μg/mL) diluito in 1X PBS. Coprire le piastre con parafilm e mantenere in una sterile, biosicurezza armadietto pernottamento presso RT (12-24 h).
    3. Preparare il supporto di espansione 30% (Vedi sezione 3.5) dopo 12-24 h. Aggiungi veicoli, fattori di crescita o farmaci di interesse alla concentrazione desiderata in volumi che sono meno del 10% della soluzione totale per evitare la diluizione NIS nel 30% medio di espansione.
    4. Lavare ogni bene della piastra 24-ben due volte con PBS 1X (5 minuti ciascuno). Aspirare 1X PBS e aggiungere 450 μL dei media (senza o con farmaci/fattori di crescita). Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 15 min prima di cellule di placcatura.
    5. Per ogni esperimento, impostare 2-3 pozzi o piatti a condizione.
    6. Piastra NPC (Vedi sezione 3.4):
    7. Saggio di sintesi del DNA NPC: 100.000 cellule/pozzetto in un piatto ben 24
    8. Fase S Entry: piatto 500.000 cellule/35 mm
    9. Analisi di numero delle cellule: 50.000 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti
  2. Analisi di sintesi di precursori neurali delle cellule del DNA
    1. Piastra di 100.000 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e valutare in triplice copia/condizione.
    2. Aggiungere radioattivo, contenente tritio [3H]-timidina al terreno di coltura (1,5 μCi/mL) in ciascun pozzetto dopo 46 h nella cultura. Incubare le cellule a 37 ° C per 2 h.
      Nota: Quando si utilizza materiali radioattivi, ricevere formazione da vostra istituzione, seguire i protocolli di sicurezza radioattività e smaltire materiali radioattivi in contenitori di rifiuti in modo appropriato designati.
    3. Rimuovere e correttamente smaltire radioattivo media dopo 2 h. aggiungere 300 μL di pre-riscaldati 0,25% tripsina-EDTA (0,5 mM) ad ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C.
    4. Accendere la mietitrice di cella (Vedi materiali e attrezzature sezione) e la pompa e assicurarsi che la pressione della pompa sia inferiore a 200 PSI. Posizionare la carta da filtro attraverso lo spazio nella mietitrice di cella e strappare l'angolo giusto per contrassegnare l'orientamento della carta.
    5. Inserire tubi di raccolta della mietitrice di cella in un cassetto vuoto "in bianco" e premere prelavaggio per inumidire la carta da filtro. Inserire tubi di raccolta in pozzetti ed eseguire (start).
    6. Al termine della mietitrice di cella di raccolta dei campioni, sollevare il morsetto e avanzamento carta da filtro di ripetere per tutti i set di esempio. Prelavaggio sempre in un piatto vuoto, "vuoto".
    7. Asciugare la carta da filtro sotto una sorgente di luce e impostare il corrispondente fiale in un vassoio. Punch out chads carta nei flaconi e aggiungere 2 mL di cocktail di scintillazione liquida per ogni flaconcino. Fiale di tappo ed etichetta.
    8. Incubare le fiale a scintillazione liquida cocktail per almeno 1 h prima di leggere i conteggi al minuto (CPM) su una macchina di scintillazione.
  3. Analisi voce NPC S-fase
    1. Vedere sezione 3.4 per la procedura a sollevare, dissociare, pellet e risospendere le cellule.
    2. Piastra di 500.000 cellule per ogni piatto in 35mm piatti preparati nella sezione 4.1, solo 1 piatto/condizione per questo passaggio.
    3. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule a 37 ° C per 46 h.
    4. Preparare tre piastre di 35 mm rivestite con PDL/laminina a condizione dopo 24 h. Ad esempio, se c'è un piatto di 35 mm di Media espansione 30% e un piatto di 35 mm di Media espansione 30% + FGF (10 ng/mL) poi cappotto 6 PDL/Laminin piastre per uso il giorno successivo.
    5. Aggiungere 2 µ l/mL di 5mm EdU a culture dopo 46 h. Incubare per 2 h.
    6. Dissociare e appallottolare le celle (Vedi sezione 3.4). Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di 30% espansione Media o 3 mL di 30% espansione Media + fattori di crescita/droghe desiderate.
    7. Piastra 1 mL per ogni piatto il prepatinato PDL/Laminin piatti. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare a 37 ° C per 2 h permettere alle cellule di aderire al piatto. Vedere la Figura 2 per un diario semplificato.
  4. Analisi voce di fase S
    1. Difficoltà piatti con gelido 4% paraformaldeide (PFA in PBS 1X) per 20 min. Quindi, lavare i piatti 3 volte per 5 min con PBS 1X.
    2. Aggiungere 1 mL di PBS 1x con 0,05% Sodio Azide per prevenire la crescita batterica e fungina. Cellule possono essere conservate a 4 ° C per fino a 6 mesi se piatti (sigillati con parafilm) vengono conservati nel PBS + Sodio Azide soluzione, però non tutti immunologici antigeni sono ben conservati dopo lunghi ritardi nell'analisi.
    3. Analisi di cellule mediante una reazione di EdU commerciale kit (Vedi il protocollo del produttore). Macchia le celle utilizzando DAPI o un altro marcatore nucleare e l'immagine usando la microscopia di fluorescenza.
    4. Valutare la percentuale di cellule positive EdU nel totale di cellule vive (numero totale delle cellule) ciechi in 10 campi sistematicamente casuali (10x). Non includono le cellule morte in analisi.
    5. Utilizzare sia immagini di contrasto di fase e immagini fluorescenti per determinare la macchiatura positiva di EdU e per accertare le celle che sono morte o vivo (Figura 3).
    6. Conteggio di tutte le celle che hanno entrambi liscio e anche della membrana cellulare in impostazioni di contrasto di fase e un grande nucleo non frammentato da fluorescente DAPI nucleare macchia, come queste cellule sono vivo (Figura 3A-B).
    7. Escludere tutte le celle che sono fase brillante, hanno una membrana di cellule irregolare rotta e hanno un nucleo piccolo, condensato come visualizzati da fluorescente DAPI imaging, come queste cellule sono morte (Figura 3A-B). Valutare cellule vive per l'espressione di EdU identificando le celle con luminose fluorescenti EdU macchia che copre l'intero nucleo o maculato colorazione fluorescente nel nucleo (Figura 3).
  5. Analisi di numero delle cellule di NPC
    1. Dopo 2 giorni nella cultura, etichettare e preparare provette per microcentrifuga da 1,5 mL e 0,5 mL microcentrifuga. In ogni provetta 0,5 mL, aggiungere 5 μL di Trypan Blue.
    2. A ciascun pozzetto di una piastra ben 24, rimuovere il mezzo e aggiungere 200 μL di 1 x cella distacco soluzione e posto in incubatrice per 10-15 min.
    3. Dopo il tempo assegnato, una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere la quantità desiderata di 1X PBS in ciascun pozzetto.
      Nota: In genere, il giorno 2, aggiungere 300 μL di PBS 1X per le celle contenente oltre 200 μL della soluzione di distacco, per un volume totale di 500 μL. Con il tempo di incubazione di impostazioni cultura aggiuntive, come le cellule diventano più confluenti, aumentare il volume di diluizione come necessario. Ad esempio, il giorno 4, aggiungere 500 μL di 1X PBS, e il giorno 6, 800 μL di PBS 1X. Totali volumi saranno 700 μL e 1 mL, rispettivamente.
    4. Utilizzando una pipetta P-1000, pipettare su e giù in ogni ben 4 a 5 volte per rimuovere le cellule. Esaminare la piastra sotto un microscopio per garantire che tutte le cellule hanno staccato. Trasferire le cellule per provette da 1,5 mL.
    5. Invertire i tubi da 1,5 mL con cellule diluite 2 o 3 volte. Poi prendere un 50 μL aliquota delle cellule dalla metà del tubo e aggiungere 0,5 mL provette con Trypan Blue (Vedi 4.5.1).
    6. Pipetta cella soluzione su e giù per 2 o 3 volte. Aggiungere celle all'emocitometro e analizzare immediatamente. In attesa per più di 10 min può aumentare la morte delle cellule o la presenza di cellule che hanno preso di Trypan Blue.
    7. Aggiungere con cautela 10 µ l di cell + miscela di tripan blu ad ogni lato dell'emocitometro per eseguire conteggi replicati. Contare le celle utilizzando il microscopio a contrasto di fase. Non contano le cellule morte o le cellule blu scure che hanno preso di Trypan Blue.
    8. Per ottenere l'uso di numero totale delle cellule la media cella numero contato dai 4 angoli dell'emocitometro e applicare la seguente equazione:
      Numero di cellulare x media del volume (mL) x 10,000 medio = numero totale delle cellule/pozzetto
    9. Aspirare e ripetere la procedura su pozzetti rimanenti. Cambiare il supporto sulle cellule che non sono essere contati, ogni saggio di ripetizione h. 48 giorni 4 & 6.

5. NPC del Neurite Assay

  1. Preparazione di piatti e Media per l'analisi del Neurite
    1. Fare un 1 mg/mL di soluzione madre di poli-d-lisina (PDL) in dH2O e filtro sterilizzare. Diluire 01:10 in dH2O per fare una soluzione PDL di 0,1 mg/mL e aggiungere 1 mL per ogni piatto di 35 mm. Incubare per 20 minuti a TA.
    2. Nel frattempo, preparare il supporto di espansione del 30% (Vedi sezione 3.5) e aggiungere 5 μg/mL (5 µ l/mL) di soluzione di fibronectina (1 mg/mL di brodo) ai media.
    3. Una volta preparato il supporto, è possibile aggiungere veicoli, fattori di crescita o droghe di interesse alle concentrazioni desiderate.
      Nota: Si consiglia di aggiungere veicolo, fattori di crescita o droghe, a volumi < 10% della soluzione totale per evitare di diluire la fibronectina e altri componenti nel mezzo di espansione del 30%.
    4. Dopo 20 minuti, lavare i piatti PDL 3 volte per 5 min con dH2O rimuovere PDL in eccesso. Garantire piatti siano asciutti prima di aggiunta di file multimediali.
    5. Posizionare 1 mL di soluzione di fibronectina + supporto (con o senza farmaci/fattori di crescita) in ogni piatto rivestito di PDL.
    6. Incubare piatti a 37 ° C per almeno 30 min prima di cellule per garantire un collegamento corretto della fibronectina al PDL di placcatura.
    7. Per ogni esperimento, è possibile impostare 2-3 piatti a condizione (per esempio, 3 veicolo contenente piatti, 3 piatti contenenti droga).
  2. NPC di placcatura per dosaggio del Neurite
    1. Vedere sezione 3.4 per la procedura a sollevare, dissociare, pellet e risospendere le cellule.
    2. Piastra di 50.000 cellule per ogni piatto in piatti preparati nella sezione 5.1. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule.
    3. Incubare le cellule a 37 ° C per 48 h.
  3. Analisi dei Neurites
    1. Dopo incubazione le cellule per 48 h, aspirare medio e difficoltà piatti con ghiaccio freddo 4% PFA per 20 min.
    2. Dopo 20 minuti, lavare i piatti 3 volte per 5 min con PBS 1X. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di PBS 1x con 0,05% Sodio Azide.
    3. Analizzare i piatti alla cieca su un microscopio di contrasto di fase a 32x. Conteggio totale cellule e cellule con neuriti in 3, righe di 1cm, scelte a caso ma riproducibile posizioni. Contare un minimo di 150 celle per ogni piatto per garantire un prelievo corretto.
      Nota: Una neurite è definita come un'estensione (processo) dal corpo cellulare che è > 2 corpo cellulare diametri di lunghezza. Per le celle con più processi, il processo più lungo è considerato per il criterio. Cellule con processi che sono < corpo cellulare 2 diametri di lunghezza non sono in dotazione (Figura 4).
    4. Sommare il numero totale delle cellule e il numero totale di cellule con neuriti in ogni piatto. Calcolare la % di cellule con neurites. Media la percentuale di cellule con neurites attraverso piatti replicare. Fiducia nella riproducibilità sperimentale viene stabilita quando tutte le righe all'interno di ogni piatto sono simili, e medie tra i piatti sono molto simili, con l'errore standard della media (SEM) < 10%.
    5. In alternativa, analizzare i neurites conducendo immunocytochemistry per gli indicatori quali beta-III-tubulina (TUJ1) o MAP2. Dopo la colorazione per il marcatore di interesse, prendere 10 immagini sistematicamente casuale su un microscopio a fluorescenza a 10x. Immagine almeno 200 celle. In questo caso, acquisire le immagini non troppo vicino al bordo del piatto. Analizzare la percentuale di cellule con TUJ1 o MAP2 + neurites (per un esempio, vedere Figura 10 ).

6. NPC Neurosphere migrazione Assay

  1. Neurosphere formazione
    1. Aggiungere 1 mL di Media espansione 100% in un piatto di 35 mm con nessun substrato di rivestimento. Incubare, piatti per almeno 15 min a 37 ° C prima di placcatura NPC. preparare 2-3 piatti per assicurarsi che non vi sarà abbastanza neurosfere per l'analisi di migrazione delle cellule.
      Nota: L'assenza di un substrato di rivestimento assicura che i PNG rimangono sospesi nei media, che è essenziali per la formazione di neurosphere. Piatti di rivestimento impedirà la formazione di neurosphere.
    2. Vedere sezione 3.4 su passaggi di sollevare, dissociare ed il pellet di cellule. Risospendere il pellet cellulare in 2-5 mL di pre-riscaldato 100% Media espansione. Piastra 1 milione gli NPC in ogni piatto di 35mm preparato nella sezione 6.1.1.
    3. Incubare i PNG a 37 ° C per 48 a 96 h permettere gli NPC di neurosfere aggregato e forma. Valutare la dimensione di sfera utilizzando un righello dal vivo su un microscopio a contrasto di fase. Attendere che la maggior parte delle sfere raggiungere un diametro approssimativo di 100 µm (± 20 μm) (Figura 5). Sfere più piccole saranno completamente disperdere e rompono durante il test di migrazione.
  2. Preparazione delle piastre per l'analisi di migrazione Neurosphere
    1. Sciogliere le aliquote di gel ECM-mimico (Vedi sezione 3.2) in 6 mL di 30% espansione Media. Una volta preparato ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione Media, aggiungere veicoli, fattori di crescita o droghe di interesse alle concentrazioni desiderate.
      Nota: Veicolo, droga e concentrazioni del fattore di crescita necessario essere aumentato per tenere conto l'aggiunta di 200 µ l di neurosfere in sezione 6.3.
    2. Piastra 1 mL di ECM-mimico gel 30% soluzione di espansione Media (± veicoli, fattori di crescita o farmaci) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Fare 2-3 pozzi a condizione sperimentale. In alternativa, possono essere utilizzati piatti 35 mm. Incubare le piastre per almeno 30 min a 37 ° C.
      Nota: Non aspirare l'ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione Media per questo test. Sfere in un gel di ECM-mimico aspirato di placcatura porterà alla migrazione rapida e in eccesso.
  3. Placcatura neurosfere
    1. Raccogliere neurosfere formata nella sezione 6.1 e inserirli in una provetta conica. Lavare i piatti con 1 mL di 1X PBS per garantire tutti i neurospheres sono raccolti in 35 mm. Rotazione verso il basso la neurospheres raccolti a 100 x g per 5 min.
    2. Risospendere il neurosfere in 1-3 mL di pre-riscaldato 30% Media espansione. Se 1 piatto di neurosfere raccolti, 1 mL di media viene utilizzato per risospendere le sfere. Se vengono raccolti 2 piatti, 2 mL di media vengono aggiunti per risospendere le sfere, ecc. Pipettare delicatamente e utilizzare solo una P-1000 per garantire sfere non sono rotti.
    3. Piastra 200 μL del sedimento neurosfere nell'ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione fatta nella sezione 6.2. Lastre di roccia in tutte le direzioni per distribuire uniformemente neurosfere. Incubare le piastre per 48 h a 37° C.
    4. Rimuovere la soluzione di espansione Media gel/30% ECM-mimico e difficoltà cellule in 4% PFA, lavare e mantenere le cellule in 1X PBS + 0.05% di Sodio Azide.
  4. Analisi di neurosfere
    1. Acquisire immagini di neurosfere intero utilizzando le impostazioni di contrasto di fase a 10x. Garantire sfere non si toccano. Misura media migrazione utilizzando il software ImageJ.
    2. Tracciamento del contorno esterno del neurosphere utilizzando lo strumento linea a mano libera. La linea a mano libera può essere letta cliccando col tasto destro sull'icona di "retta". Manualmente traccia utilizzando un mouse.
    3. Utilizzare la funzione di misura per calcolare l'area della traccia. Assicurarsi che la "zona" è selezionato come una lettura nella finestra "Impostare misure" trovata sotto la scheda analizza. Vedere la Figura 6 per traccia di contorno esterno in blu.
    4. Traccia la massa cellulare interna della sfera e misura dell'area. Vedere la Figura 6 per traccia di contorno interno in rosso. Quantificare media migrazione sottraendo la massa interna delle cellule dall'area totale neurosphere.
    5. Misura neurosfere che presentano una massa cellulare interna densamente imballato con le cellule di migrare fuori come un tappeto contiguo (Figura 6).
    6. Non includono le cellule di fuori del tappeto o staccata dal neurosphere per la misurazione. Vedere la Figura 6 per esempi di celle (cerchiate in bianco) che sono esclusi dalla misurazione del tappeto esterno. Analizzare un minimo di 20 neurosfere per ogni condizione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uno degli obiettivi di questi studi consiste nel definire l'attività proliferativa degli NPC, vale a dire un aumento nei numeri delle cellule. Questo risultato è ottenuto mediante la valutazione di sintesi del DNA della popolazione cellulare totale, un approccio di alto-rendimento che misura l'incorporazione di timidina contenente tritio tracciante radioattivo in estratti cellulari e riflette tutte le celle impegnate nella fase S, siano essi sintetizzando per 5 minuti o le ore due intere. Inoltre, questi saggi permettono di determinare la proporzione di cellule che entrano in fase S e numeri di cellulare totale, un'analisi di più alta intensità di lavoro delle singole cellule. Cellule di sintetizzare DNA in fase S, un passo che precede la mitosi e la divisione cellulare, che deve avvenire al fine di aumentare il numero di cellulare. Poiché questi processi richiedere molto tempo, cambiamenti nella sintesi del DNA valutato a 48 ore non possono essere associati con i cambiamenti nei numeri delle cellule a questo punto del tempo. Tuttavia, è stato trovato che i cambiamenti nella sintesi del DNA alle 48 ore prevedono in modo affidabile aumenti di numeri di cellulare ai giorni 4 e 6.

Nel valutare la sintesi del DNA, le cellule sono placcate con una densità di 100.000 cellule (~ 50% confluenti) in una piastra a 24 pozzetti e sono autorizzate a crescere per 48 ore prima di effettuare misurazioni. Utilizzando questa densità assicura che le cellule assomigliano loro ambiente monostrato, ma anche non crescere così in fretta in un periodo di 48 h media diventa troppo acido. Media che è troppo acido può significativamente influenzare il metabolismo delle cellule e quindi alterare i risultati di proliferazione. Se le linee cellulari specifiche sono altamente proliferative, il ricercatore dovrebbe considerare alterando densità cellulare, volume dei supporti, o mezzi di scambio frequenza per evitare condizioni altamente acide. Se si cambiano le condizioni, è fondamentale essere coerenti quando si confrontano diverse linee cellulari perché modifiche dipendenti contattare cellula--cellula certamente influenzano i tassi di crescita. Il design lineare di queste analisi ci permette di testare diversi fattori di crescita. Come illustrato nella Figura 7, l'aggiunta del fattore di crescita del fibroblasto (FGF, 10 ng/mL) per 48 ore aumenta la sintesi del DNA di ~ 40%. Inoltre, l'analisi della sintesi del DNA è riproducibile come tutti i cloni e gli individui mostrano un aumento nella sintesi del DNA dopo stimolazione FGF. Il potenziale variabilità della linea di base e FGF ha stimolato la sintesi del DNA tra diversi individui inalterati, così come il potenziale per variabilità clonale nello stesso individuo è dimostrato nella tabella 1. A causa di questa variabilità, è importante testare più iPSC cloni per ogni individuo, nonché a valutare un minimo di 3 a 5 NPC linee derivate da ogni clone iPSC differenti. Un minimo di 3 esperimenti per ogni linea NPC è stato eseguito.

Il dosaggio di sintesi del DNA permette di valutare velocemente numerosi gruppi sperimentali in una moda di alto-rendimento e la misura riflette la somma totale della sintesi del DNA, indipendentemente dalla durata della fase S (5 minuti a 2 ore). Per definire la proporzione di cellule impegnati nella fase S, è stato impiegato il test di ingresso di fase S. Per questo test, le cellule sono coltivate presso la stessa densità come precedentemente accennata per consentire monostrato-come dinamiche per verificarsi, ma poi sono dissociate dopo 2 giorni e ha permesso di aderire brevemente alle piastre per condurre analisi unicellulare. Contando le cellule in un monostrato può essere difficile a causa di elevato contatto cellula-cellula e variabilità regionale nella piastra. Questo paradigma consente di definire le celle come un monostrato e poi analizzarli come singole cellule. Agisce anche come metodologicamente indipendente conferma dei dati ottenuti con il test di sintesi del DNA. Come si vede nella Figura 8, 48 ore di stimolazione di FGF (10 ng/mL) aumenta la proporzione di cellule entrare in fase S ~ 25%.

Nel valutare i numeri delle cellule, una bassa densità delle cellule è usata che nelle analisi di cui sopra, con 50.000 cellule essere placcate per pozzetto di un 24 così piatto. Ancora una volta, questa densità è stato scelto per garantire che le linee cellulari più veloce non crescere così in fretta durante il periodo di 6 giorni che il pH del mezzo diventa troppo acido e diventa giallo. Nella Figura 9, mentre i numeri di cellulare non possono essere significativamente differenti fra controllo e gruppi di FGF (10 ng/mL) a 2 giorni, i cambiamenti nella sintesi del DNA a 48 h (Figura 7) sono predittivi di cambiamenti nei numeri delle cellule a 4 e 6 giorni.

Mentre gli NPC sono tipicamente coltivati ad alta densità, il dosaggio del neurite è condotta a una densità di 50.000 cellule placcato in un piatto di 35 mm al fine di valutare le singole cellule. Anche a questa bassa densità, il NPC culture proteine citoscheletriche express e fattori di trascrizione caratteristici dei PNG come NESTIN, SOX2 e PAX6 (Figura 10 A-D). Questo indica che una coltura a bassa densità non altera significativamente destino della cellula in questo lasso di tempo. Inoltre, condizioni simili a bassa densità sono state utilizzate in sistemi di coltura di ratto e topo per rilevare fenotipi che erano in ultima analisi, riproducibile in vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Dopo 48 ore di incubazione, una piccola percentuale di NPC cominciano ad estendere i neurites come visto in Figura 11A e B e quantificato nel grafico in Figura 11. La proporzione di cellule che estendono neurites, la lunghezza dei neuriti e il numero di neuriti/cella può essere misurata per valutare i parametri inerenti allo sviluppo. Al fine di valutare con precisione la percentuale di cellule con la conseguenza del neurite, è importante che le cellule sono placcate come cellule singole o gruppi di < 5 celle e non come grandi aggregati. Come si vede in Figura 10 E-F, cuscinetto neurites (freccia bianca) anche le cellule esprimono marker neuronale immatura beta-III tubulina (TUJ1). Come accennato nei metodi, immagini fluorescenti possono essere acquisite di TUJ1 macchiato i PNG e quindi queste immagini possono essere conteggiate per la proporzione di TUJ1 + neurites affinché origine neuronale dei processi. Nel nostro laboratorio, analisi di entrambi i metodi hanno dato risultati statisticamente simili.

Il design semplice e la natura rapida del dosaggio del neurite inoltre ci permettono di testare gli effetti dell'inerente allo sviluppo rilevanti fattori di crescita, citochine e peptidi. Ad esempio, la figura 11 Mostra che il neuropeptide pituitario adenilato ciclasi attivazione del polipeptide (PACAP, 3 nM) aumenti neuriti in NPC. PACAP sono un importante fattore di sviluppo che ha ampia espressione nel SNC e ha dimostrato di essere importante nello sviluppo del cervello. Gli studi del roditore nel nostro laboratorio e altri laboratori hanno trovato che il PACAP ha effetti sullo sviluppo diffusi di fase-dipendente come la regolazione della conseguenza del neurite, la migrazione e la proliferazione sia del hindbrain e del forebrain16,22, 29,30,31. Studi recenti di Ataman et al. (2016) utilizzando coltivate umano fetale cellule corticali indicano che l'attività neuronale induce un aumento di 9 volte nell'espressione genica PACAP, indicando l'importanza dei peptidi in sviluppo di un neurone umano32. Infatti, la tabella 2 Mostra la percentuale di neuriti in controllo e PACAP (3 nM) condizioni tra numerose linee derivate da individui inalterati. Come si vede nella tabella 2, c'è qualche variabilità della percentuale dei neurites espressi in linee cellulari derivate da cloni diversi dallo stesso individuo e da NPC derivati dagli individui differenti. Tuttavia, questi individui inalterati hanno un aumento in conseguenza del neurite in risposta a PACAP, che indica la riproducibilità delle analisi.

Come conseguenza del neurite, migrazione cellulare è un importante processo di sviluppo essenziale per il corretto collegamento, organizzazione e cablaggio del cervello. Neurosfere ci permettono di studiare la migrazione NPC in una tipica condizione ad alta densità che mantiene i contatti cellula-cellula fra i PNG (Figura 12). Fattori pertinenti inerente allo sviluppo possono essere testati anche su neurosfere per valutare i loro effetti sulla migrazione. Ad esempio, nella figura 12 Mostra che PACAP (10 nM) aumenta la migrazione dei PNG.

Figure 1
Figura 1: NPC al passaggio 3. NPC a P3 esprimono multipli marcatori di fase-specifici, tra cui (A) fattore di trascrizione pluripotenti, SOX2 (B) il fattore di trascrizione specifico per proencefalo NPC, PAX6, e proteina del citoscheletro NPC NESTINA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: schema di analisi della voce di S-fase. Timeline di fase S Entry test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: quantificazione entrata in fase S. (A) fase immagine visualizzando fase-scuro vivere cellule (frecce bianche), una cellula morta fase-brillante (stella bianca) e una fase luminosa tensione delle cellule (freccia verde). (B) fluorescente DAPI macchia mostrando nucleo condensato in una cellula morta (stella bianca) e i grandi nuclei in una cellula viva (frecce bianche e verdi). (C) fluorescente EdU immagine Mostra brillante EdU nuclei positivi (freccia rossa) e maculato EdU nuclei positivi (stella rossa). (D) fase e fluorescente Unione di immagini 3A - 3C.

Figure 4
Figura 4: identificazione neurites. Immagini di contrasto di fase della NPC. (A) A cella con un processo > 2 corpi cellulari di lunghezza, rispondendo così il criterio per un neurite. (B) una cella con un processo < 2 corpi cellulari in lunghezza e quindi non considerato del neurite-cuscinetto. (C) rappresenta una cella con 2 processi-il processo più lungo viene valutato per il criterio del neurite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: selezione di neurosfere per l'analisi di migrazione. Immagine di contrasto di fase (A) di un campo rappresentativo di neurosfere alle h. 24 sfere sono tutti meno di 100 μm e pertanto non sono raccolti per l'analisi di migrazione. Immagine a contrasto di fase e (B) di un campo rappresentativo di neurosfere a 72 h. Tutte le sfere sono raggio di 100 μm ± 20 µm, che indica sono pronti per essere raccolti per l'analisi di migrazione.

Figure 6
Figura 6: quantificazione migrazione. (A) immagine di contrasto di fase di un rappresentante neurosphere. (B) contorno blu viene visualizzata l'analisi per misurare neurosphere totale area. Rosso indica che il profilo utilizzato per misurare l'area della cella interna massa. Migrazione è definita come zona di massa zona-interno cella totale neurosphere. Si noti che i cerchi bianchi indicano le celle che non sono in un tappeto contiguo, come queste cellule sono esclusi dai contorni migrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: valutazione di sintesi del DNA. Risultati rappresentativi di controllo contro FGF-trattati NPC. FGF (10 ng/mL) aumenti di sintesi del DNA a 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 pozzi/gruppo/esperimento; 3 esperimenti). Barre di errore rappresentano SEM

Figure 8
Figura 8: proporzione di cellule entrare in fase S. Immagini di contrasto di fase (A) delle cellule NPC incubati in controllo contro media trattata di FGF (10 ng/mL) per 48 h. inserti rappresentano immagini di ingrandimento superiore delle cellule hanno macchiato per marcatore fluorescente EdU in controllo e 10 ng/mL FGF media. Le frecce rosse indicano le celle che sono EdU positive e bianche frecce indicano le celle che sono EdU negativo. (B) il grafico dei risultati rappresentativi di controllo contro FGF (10 ng/mL) trattati NPC. FGF aumenti dello S-phase voce a 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 piatti/gruppo/esperimento; 3 esperimenti). Barre di errore rappresentano SEM

Figure 9
Figura 9: l'enumerazione delle cellule ai giorni 2, 4 e 6. (A) fase immagini di contrasto delle celle nel controllo e FGF (10 ng/mL) media trattata ai giorni 2, 4 e 6. (B) il grafico dei risultati rappresentativi; Nota che FGF (10 ng/mL) non aumenta sempre numeri di cell a 2 giorni, ma a 4 e 6 giorni aumenti sono apparente (p ≤ 0.05). (n = 2-4 pozzi/gruppo/esperimento; 3 esperimenti). Barre di errore rappresentano SEM

Figure 10
Figura 10: caratterizzazione di NPCs in condizioni di bassa densità. (A, C, E) Immagini di contrasto di fase di NPCs in condizioni di bassa densità. (B) gli NPC esprimono marcatori di cellule staminali/progenitrici NESTINA (verde), SOX2 (rosso) e marcatore nucleare DAPI (blu). PAX6 (D) (rosso), DAPI (blu). (F) presso a bassa densità, estendendo i neurites (freccia bianca) anche le cellule esprimono marcatore neurone immaturo TUJ1 (verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: neuriti. (A) immagine di contrasto di fase di NPC. Le frecce nere scegliere le celle con i neurites. (B) aggiunta di neuropeptide PACAP (3 nM) aumenta la percentuale di cellule con neurites (p ≤ 1 x 10-2). (C) quantificazione dei neuriti in controllo e 3 nM PACAP contenente media. (n = 2-4 piatti/gruppo/esperimento; 3 esperimenti). Barre di errore rappresentano SEM

Figure 12
Figura 12: Neurosphere migrazione. (A) immagini di contrasto di neurosfere di fase. (B) aggiunta di PACAP (10 nM) aumenta la migrazione cellulare neurosphere (p ≤ 10-2) (C) quantificazione della migrazione cellulare. (n = 20 sfere/gruppo/esperimento, 3 esperimenti). Barre di errore rappresentano SEM

Media
Paziente Clonare n. CTRL FGF
(10 ng/mL)
Paziente 1 1 21.853 47.538
2 20.336 38.070
Paziente 2 1 7.664 14.060
2 16.573 30.087

Tabella 1: Sintesi del DNA. Un riepilogo dei valori di sintesi di DNA (in CPM) di NPCs derivate da due cloni di iPSC per due individui inalterati.

Media
Paziente Clonare n. CTRL PACAP
(3 nM)
Paziente 1 1 13,60% 18,10%
2 16.50% 21.10%
Paziente 2 1 8,90% 14.10%
2 14,20% 21.10%

Tabella 2: Percentuale di cellule con Neurites. Una sintesi della percentuale di cellule che sopportano i neurites in NPC derivato da due cloni di iPSC per due individui inalterati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I protocolli presentati qui illustrano i metodi di semplici e veloci per lo studio dei processi fondamentali dello sviluppo neurologico e verificare i fattori di crescita e farmaci che utilizzano cellule precursori neurali hiPSC-derivati. la tecnologia hiPSC ha rivoluzionato lo studio della patogenesi delle malattie neurodevelopmental fornendoci un accesso senza precedenti a vivere umane cellule neuronali da individui affetti. Infatti, ci sono stati numerosi studi hiPSC di disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui la sindrome di Rett, sindrome di Timothy, sindrome Fragile-X, e la schizofrenia, che hanno portato alla luce le aberrazioni specifiche di malattia nei dendriti, le sinapsi e di un neurone funzione4,33,34,35,36. La maggior parte di questi studi sono concentrati principalmente su terminalmente differenziate, neuroni post-mitotici che, se considerato relativamente funzionalmente immaturo, esclude lo studio di neurodevelopmental precedenti processi quali la proliferazione e migrazione. Questi processi di quest'ultimi sono stati pesantemente implicati nella patogenesi di disturbi dello sviluppo neurologico e mandato ulteriore studio8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. l'uso dei PNG permette di studiare questi importanti eventi precedenti, fornendo inoltre la possibilità di indagare i processi più maturi come la capacità delle cellule di estendere immaturi assoni/dendriti (neuriti). Ulteriormente, alcuni di questi test può essere esteso anche per studiare altri parametri, quali la lunghezza dei neuriti, numero e ramificazione o ulteriore distanza percorsa da una cella.

Alcuni studi più recenti hanno utilizzato sistemi modello organoid per studiare all'inizio dello sviluppo eventi in un 3-d "sistema mini-cervello"1,39,40. Eppure, anche in questi sistemi organoid, la popolazione delle cellule proliferative precursore è limitata e precoce maturazione e migrazione sono difficili da studiare15,39. Oltre a limitare lo studio di precedenti fenomeni inerente allo sviluppo, l'uso di terminalmente differenziate neuroni o organoids è spesso richiede tempo, costosa e limita il numero di variabili che possono essere valutati nel sistema. Questo è perché facendo i neuroni e organoids può richiedere protocolli di induzione virale, speciali incubatrici e attrezzature, più settimane di tempo e grandi quantità di media. Al contrario, con l'eccezione del dosaggio di sintesi di DNA (che si rivolge più tardi sotto), questo protocollo può essere facilmente applicato allo studio dei disturbi dello sviluppo neurologico e non richiede una formazione completa, strumenti costosi e risorse o software. La facilità e il costo relativamente basso di aggiunta di farmaci e fattori di crescita in queste analisi, rendono questa tecnologia di protocollo un alto-rendimento utile per testare vari trattamenti potenziali per neurodevelopmental e malattie neuropsichiatriche. Inoltre, poiché i fattori di crescita atto via definito vie di segnalazione cellulare, può anche essere utilizzati come strumenti per verificare la potenziale difetti nello sviluppo di sistemi di segnalazione. Infine, poiché gli NPC sono una popolazione autorinnovabile proliferativa, grandi quantità di cellule può essere prodotto e crioconservati consentendo esperimenti per essere condotta in modo efficiente senza dover fare gli NPC da iPSCs ogni volta.

Per impiegare con successo queste analisi, è importante tenere presente i seguenti punti critici. Questo protocollo posti NPC in diverse condizioni per il mantenimento e l'espansione contro sperimentazione. In particolare, mentre gli NPC sono indotti, cresciuta e attraversate in medium che contiene neurale induzione supplemento (NIS), le nostre condizioni sperimentali riducono il supplemento del 70%, che pone le cellule in un ambiente di limitazione, che ci permette la possibilità di aggiungere nuovamente e verificare gli effetti dei fattori di crescita importanti. In secondo luogo, è essenziale per tenere traccia del passaggio degli NPC. Nei nostri studi, abbiamo generalmente limitato numero di passaggio delle linee cellulari da P3 - P8. Nei passaggi precedenti a P3, alcune linee non robustamente esprimono marcatori caratteristici. A più passaggi, mentre alcune linee cellulari hanno tassi di crescita molto consistente o risposte ai fattori di crescita, altre linee cellulari possono avere cambiamenti drammatici nella crescita delle cellule o risposta. Anche se non regolarmente segnalato, abbiamo e molti altri abbiamo sperimentato questo radicale cambiamento nei tassi proliferativi a passaggi più alti. Il motivo per questo è incerto, ma questo cambiamento può riflettere una limitata capacità di auto-rinnovamento di NPC. definizione perché e come tassi di proliferazione cambiano sopra estesi passaggi può fornire indicazioni nello sviluppo e nella patogenesi della malattia, ma ulteriori ricerche dovrà essere fatto. Infine, il protocollo di induzione neurale commerciale che stiamo usando può a volte produrre cellule staminali neurali di scarsa qualità, in particolare se la partenza iPSCs non sono di alta qualità (cioè., hanno la differenziazione delle cellule ai confini delle colonie delle cellule, anomalie del karyotype). In alcuni casi, morfologia delle cellule è distorta ed espressione di marcatori non è presente. Non utilizzare queste culture. In altri casi, gli NPC crescono con più piatte cellule "contaminante", che possono essere rimosso utilizzando un trattamento della soluzione distacco differenziali delle cellule per garantire praticamente puri popolazioni NPC prima dell'uso in esperimenti. Avere alta qualità NPC è critico per risultati corretti: Vedi sezione di materiali e delle attrezzature per un link a un protocollo di induzione neurale si trovano immagini di NPC di alto e di bassa qualità.

Per ciascuno dei saggi presentati, è importante notare le seguenti fasi critiche, potenziali errori e suggerimenti sulla risoluzione dei problemi. Per il numero delle cellule, sintesi del DNA e le analisi del neurite, è importante alle cellule di piastra come dissociato cellule singole e non come grumi, come questo possono inclinare misure di sintesi del DNA, conteggi delle cellule e comportamento del neurite. Per garantire grumi di cellule non sono placcati, assaggiare un piccolo volume delle cellule con un P1000, piastra in una diapositiva e controllare se i grumi di cellule sono presenti. Se si notano grumi, pipettare cellule su e giù per interrompere manualmente apart ciuffi prima di placcatura. Per la sintesi del DNA e l'analisi di numero delle cellule, le cellule vengono sollevate con enzimi per il conteggio e analisi. È fondamentale per confermare visivamente le cellule hanno completamente sollevato dal recipiente di coltura per ottenere conteggi precisi e se necessario, i periodi di incubazione più lungo di enzima possono essere utilizzati. In caso di bassa conta di cellule o bassa CPM per il dosaggio di sintesi di DNA, cellule possono essere placcate a densità iniziale superiori, contenente tritio radioattivo [3H] - timidina può essere aggiunto per raddoppiare il tempo (4 ore invece di 2), o contenente tritio [3H] - timidina la concentrazione può essere raddoppiata. Per il dosaggio del neurite, può raddoppiare la densità di placcatura iniziale senza rischiare un maggiore contatto cellula--cellula. Prestare attenzione alla distribuzione delle cellule attraverso un piatto e conteggio delle righe 1 cm tale che ogni parte del piatto viene campionata. Se la percentuale del neurite è troppo bassa a 48 h, il dosaggio può essere esteso fino a 6 giorni o il tipo di substrato di rivestimento o concentrazione può essere modificato per promuovere una maggiore percentuale di neuriti. Tuttavia, è importante notare che le volte di rivestimento e i metodi che abbiamo presentato nel protocollo sono stati selezionati per la salute delle cellule e di conseguenza del neurite ottimale dopo aver testato numerosi substrati differenti, concentrazioni nel substrato e tempi di rivestimento. Per il dosaggio di neurosphere, uso di piccoli pipettatori (P20, P200) può portare alla tosatura e rottura delle sfere più grandi. Pertanto, è imperativo che il pipettaggio è fatto con delicatezza e con un P1000 o una pipetta sierologica. Per appallottolare le neurosfere, velocità più basse (100 g x invece di 300 x g) raccomanda inoltre di evitare neurosphere dissociazione. Durante placcatura sfera, garantire che sfere sono opportunamente distanziati come contatto di sfera in sfera può influenzare la migrazione. Nei casi in cui la migrazione è troppo veloce o troppo lento, tempo di incubazione può essere diminuito o aumentato rispettivamente. Rivestimento di substrati può anche essere modificato per modificare i tassi di migrazione.

Mentre le tecniche utilizzate sono rapidi, semplici e applicabili allo studio dei disturbi dello sviluppo neurologico, ci sono alcune limitazioni. Per uno, molte delle analisi presentate (analisi di numero delle cellule, dosaggio del neurite, analisi di migrazione) richiedono gli investigatori per prendere decisioni soggettive (ad esempio, questo è una neurite? Questa cella è morto?) può potenzialmente condurre all'investigatore bias e bassa riproducibilità. Tuttavia, lo svolgimento di analisi cieche e stabilisce norme rigorose per ogni decisione presentata all'interno di un test, come illustrato nei metodi, può migliorare questi pregiudizi. Allo stesso modo, queste analisi richiedono misurazioni manuali e conta, che può richiedere molto tempo e lavoro. Tuttavia, nei laboratori che hanno le attrezzature e le risorse tecniche, queste analisi possono essere velocizzate con l'uso di contatori di cella automatizzata e programmi che possono condurre misure automatizzate41,42. Nel caso il dosaggio di sintesi del DNA, questi metodi sono specifici alla nostra macchina mietitrice e scintillazione di cella (Vedi materiali e attrezzature); Tuttavia, ci sono altri modelli disponibili e i metodi che possono essere utilizzati per ottenere le stesse informazioni, come ad esempio la mietitrice di cella Omnifilter-95. Per alcune istituzioni, l'uso di sorgenti radioattive non può essere fattibile. In questo caso, un metodo alternativo utilizzando una timidina fluorescente analogica, quale EdU, analizzati su un lettore di micropiastre fluorescente, consentirà per l'acquisizione delle stesse informazioni su analisi di massa di DNA sintesi44.

Il nostro sistema di coltura a bassa densità separa gli NPC in celle individuali o piccoli gruppi, una condizione che si differenzia dalla natura densamente imballata di NPC nel tubo neurale in via di sviluppo. Ancora, gli NPC sono sani ed esprimere marcatori appropriati (Figura 1, , Figura 10). Inoltre, i nostri studi precedenti di topo e ratto culture corticali risultati paralleli risultati nelle colture in vitro e in vivo modelli indicano l'utilità e il valore di utilizzo di questo approccio16,17,18 , 19 , 24. Inoltre, questo sistema fornisce un approccio potente per comprendere la maturazione delle cellule e studiare sub-popolazioni cellulari. Ad esempio, immunohistochemistry può essere condotta sul dosaggio del neurite per determinare quale tipo di cellule neuronali specifici sta estendendo un neurite. In definitiva, nonostante alcuni limiti, questo protocollo unico fornisce metodi semplici, potenti e veloce per studiare i disturbi dello sviluppo neurologico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio del governatore New Jersey per la ricerca medica e trattamento di autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie segna la Fondazione di famiglia, Mindworks Charitable Trust di piombo e la Fondazione di comunità ebraica di maggiore MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20, (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320, (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66, (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94, (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155, (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171, (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474, (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155, (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33, (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139, (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21, (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29, (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72, (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26, (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66, (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90, (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5, (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33, (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39, (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10, (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47, (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539, (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23, (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20, (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45, (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15, (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22, (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1, (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5, (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics