Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

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Developmental Biology

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Summary

Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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Abstract

Die Entwicklung des menschlichen Gehirns durchläuft eine Reihe von genau orchestrierte Prozessen mit früheren Stadien zeichnen sich durch Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs; und spätere Phasen geprägt von Axon/Dendrit Auswuchs und Synapse Bildung. In Neuroentwicklungsstörungen sind oft eine oder mehrere dieser Prozesse gestört führt zu Anomalien im Gehirn Bildung und Funktion. Mit dem Aufkommen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Technologie haben Forscher nun ein reichhaltiges Angebot an menschlichen Zellen, die in nahezu jedem Zelltyp, einschließlich Neuronen unterschieden werden können. Diese Zellen können verwendet werden, um normale Gehirnentwicklung und Pathogenese der Krankheit zu studieren. Eine Reihe von Protokollen mit HiPSCs, neuropsychiatrische Krankheit Verwendung unheilbar zu modellieren differenzierten Neuronen oder 3D Culture Nutzungssysteme als Organellen bezeichnet. Während diese Methoden bei der Untersuchung der Pathogenese der Krankheit beim Menschen von unschätzbarem Wert erwiesen haben, gibt es einige Nachteile. Differenzierung der HiPSCs in Neuronen und Generierung von Organellen sind langwierige und kostspielige Prozesse, die Auswirkungen haben können, dass die Anzahl der Experimente und Variablen, die beurteilt werden können. Darüber hinaus während Post-mitotische Neuronen und Organellen die Untersuchung von krankheitsbezogenen Prozessen ermöglichen, einschließlich Dendrit Auswuchs und Synaptogenese, schließt sie die Studie von früheren Prozessen wie Proliferation und Migration. In Neurodevelopmental Störungen wie Autismus gibt reichliche Beweise für genetische und Post-Mortem-Mängel im frühen Entwicklungsprozessen. Neurale Vorläuferzellen (NPCs), eine hohe proliferative Zellpopulation, möglicherweise ein geeignetes Modell, um Fragen über ontogenetische Prozesse und Krankheit Einleitung. Wir erweitern nun Methoden daraus gelernt Entwicklung bei Maus und Ratte kortikale Kulturen an menschliche NPCs. Die Verwendung von NPCs kann wir untersuchen krankheitsbezogenen Phänotypen und definieren, wie die verschiedenen Variablen (z.B., Wachstumsfaktoren, Drogen) Auswirkungen Entwicklungsprozesse einschließlich Proliferation, Migration und Differenzierung in nur wenigen Tagen. Letztlich kann dieses Toolset in gewissem Sinne reproduzierbar und hohem Durchsatz zur krankheitsspezifische Mechanismen und Phänotypen in Neuroentwicklungsstörungen zu identifizieren.

Introduction

Die Verwendung von einfacher Organismen und Maus-Modellen hat die Mechanismen der grundlegenden Gehirnentwicklung sowie Pathogenese der Krankheit aufgeklärt. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Ätiologie der vielen neuropsychiatrischen Störungen schwer, weil nicht alle Befunde in einfacheren Organismen direkt für komplexe Aspekte der Krankheit beim Menschen relevant sind. Darüber hinaus die größere Komplexität des menschlichen Gehirns oft macht es schwierig, Modell menschlicher Entwicklung und Erkrankungen bei Tieren. Mit der Entwicklung und der Fortschritt der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) Technologie können Körperzellen an Stammzellen umprogrammiert und dann differenziert in neuronalen Zellen, menschlichen Krankheiten zu studieren. Fortschritte in der HiPSCs und "Omic" (Genomik, Transkriptom, Proteomik, Metabolomik) versprechen, das Verständnis der Entwicklung des menschlichen Gehirns zu revolutionieren. Diese Technologien ermöglichen nun einen "Präzisionsmedizin" Ansatz zur Charakterisierung der neuropsychiatrischen Erkrankungen auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage.

Die aktuellen Heftklammer im Feld HiPSC Krankheit-Modellierung ist es, Zellen in bestimmten neuronalen Subtypen in einem monomolekularen Film zu unterscheiden oder eine 3D Culture-System namens eine organoide verwenden, um Aspekte des Gehirns Entwicklung1,2zu rekapitulieren, 3. Diese Systeme wurden unglaublich wertvoll im Studium und die Aufdeckung der einzigartigen Aspekte der menschlichen Entwicklung und Krankheit4,5,6,7. Erfordern jedoch neuronalen Kulturen und Organellen oft überall von Wochen bis Monate in Kultur bevor sie bereit sind zu lernen. Die aufwändige Art der diese Protokolle und die Menge an Ressourcen benötigt um zu halten, dass diese Systeme oft zu begrenzen, die Zahl der Versuche, die durchgeführt werden können und die Anzahl der Variablen (wie Wachstumsfaktoren oder Drogen), die getestet werden können. Darüber hinaus haben viele Studien, die Verwendung von Post-mitotische Neuronen und Organellen auf Prozesse wie Dendrit Auswuchs oder Synapse Bildung, konzentriert, die später in der Entwicklung auftreten. Während dieser Prozesse in der Pathologie des Entwicklungsstörungen wie Autismus und Schizophrenie verwickelt waren, sind früher Entwicklungsstörungen Ereignisse, die vor dem endgültigen neuronaler Differenzierung auftreten auch wichtig für die Pathogenese der Krankheit8 ,9,10,11,12,13. In der Tat zeigen den letzten genomische Studien, dass der Mitte fötale Periode, die Verbreitung, Prozess Auswuchs und Migration besteht, besonders wichtig bei Autismus Pathogenese11,14 ist. So ist es wichtig zu untersuchen, neurale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellpopulationen zu diesen früheren Vorgänge besser zu verstehen. Organoide Systeme, die als bessere Zusammenfassend menschlichen Gehirnentwicklung wegen ihrer 3D Natur und organisierte Struktur sind, enthalten einen Stammvater Pool, der verwendet worden ist, um einige dieser früheren Ereignisse zu untersuchen. Jedoch die Stammvater Bevölkerung in Organellen ist oft spärlich und eher wie radiale Gliazellen als neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen5,15. Daher wäre es vorteilhaft, eine Hochdurchsatz Methode zur frühe Stadien von Neurodevelopment in einem aktiv proliferativer Zellpopulation zu studieren.

Im Labor haben wir eine Protokoll das HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), eine gemischte Bevölkerung von neuronalen Stammzellen und Vorläuferzellen hoch proliferative verwendet, Entwicklungsstörungen Prozesse wie Proliferation, Zellmigration, zu studieren und Startvorgang (Neuriten) Verlängerung. Diese Tests wurden von Techniken, die in unserem Labor seit Jahrzehnten erfolgreich studieren Neurodevelopment in Ratte und Maus kortikale Kulturen16,17,18,19,20entwickelt, 21,22,23. Wichtiger ist, es wurde auch gezeigt, dass Phänotypen und regulatorische Signale definiert in der Ratte und Maus Kultur hoch prädiktive Mechanismen aktiv in Vivo sind, die den Wert dieser Techniken16, 17,18,19,24. Nach anfänglichen Differenzierung der HiPSCs mit NPCs erlauben diese Methoden uns, wichtige Entwicklungsprozesse in wenigen Tagen zu studieren. Diese Methoden haben viele Vorteile: (1) sie erfordern wenig anspruchsvolle Geräte und sind einfach zu implementieren, (2) zahlreiche experimentelle Wiederholungen durchgeführt werden können, in kurzer Zeit, so dass für die schnelle Bestätigung die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und (3) Kultur-Variablen wie Beschichtung Matrizen, Effekte von Wachstumsfaktoren und Tätigkeit der Drogen können schnell und kostengünstig getestet werden. Darüber hinaus nutzen wir die etablierten Rolle von extrazellulärer Wachstumsfaktoren als wichtige Regulatoren der unterschiedlichen Entwicklungsprozessen. NSCs wurden ausgesetzt, um Entwicklungsstörungen Signale auswählen, die direkt Veranstaltungen wie Proliferation, Neurit Auswuchs und Zellwanderung zu stimulieren, und haben festgestellt, dass sie zur Verbesserung der Fähigkeit, Mängel zu identifizieren, die nicht offensichtlich im Steuerelement Bedingungen19 , 25 , 26 , 27 , 28. ebenso die einfache Bewertung von Medikamenten bietet eine leistungsstarke Allee um Präzision-Medizin-Techniken um zu testen, die Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Interventionen zu übernehmen. Dieses Protokoll ermöglicht so ein hoher Durchsatz, reproduzierbar, und einfache Methode zur frühen Entwicklung des Gehirns, Pathogenese der Krankheit und der potenziellen vorteilhaften Wirkungen von Wachstumsfaktoren und Drogen auf Entwicklungsstörungen Phänotypen zu studieren.

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Protocol

(1) Sicherheitsverfahren und Biosafety Cabinet Wartung

  1. Biosafety Level-2 (BSL-2) Sicherheitsverfahren
    1. Richtlinien des Instituts auf die Arbeit mit Materialien BSL-2. Entsorgen Sie BSL-2 Materialien entsprechend der Institution Praktiken. Zeigen Sie Räume und Geräte, die für BSL-2 Materialien verwendet werden. Alle persönlichen Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Kittel und Handschuhe zu tragen.
  2. Biosafety Cabinet Wartung
    1. Verwenden Sie eine biologische Kabinett zertifiziert für den Einsatz von BSL-2 Ebene Materialien.
    2. Schalten Sie das UV-Licht in der Biosicherheit Schrank für mindestens 15 Minuten, und sprühen Sie Oberflächen mit 10 % Bleichmittel-Lösung. Lassen Sie das Bleichmittel-Lösung für 15 min sitzen, wischen Sie das Gehäuse und schalten Sie den Luftstrom vor dem Gebrauch.
  3. Radioaktiven gegebenenfalls [3H]-Thymidin (Tritium) Sicherheitsverfahren
    Hinweis: Tritium ist eine Kategorie 5 radioaktiven Quelle, 'den unwahrscheinlichsten gefährlich' Kategorie. Richtlinien des Instituts für das Arbeiten mit Radioaktivität. Einige Institutionen erfordern Zertifizierungen oder Handhabung von Tritium ermöglicht.
    1. Geschult von der Institution wie richtig handhaben und entsorgen von Tritium. Entsorgen von radioaktiven Abfällen in geeignete Behälter gemäß den Richtlinien des Instituts. Tragen Sie beim Arbeiten mit Tritium PSA.

(2) neurale Induktion von iPSCs

Hinweis: Um NPCs zu machen, folgte eine leicht modifizierte Version eines Protokolls, das eine im Handel erhältlichen neurale Induktion Kit begleitet. Das Kit besteht aus Neurobasal (NB) Medien und ein 50 x neurale Induktion Ergänzung (NIS), die verwendet wird, um eine 1 x neurale Induktion Medium (NIM) zu machen. NIS wird auch verwendet, um 100 % zu machen Expansion Medium (siehe Abschnitt 3.1). Ein Link zum Protokoll findet sich in den Materialien und Ausrüstungen und Verweise Abschnitt43.

  1. Durchgang iPSCs wenn sie 70 %-80 % Zusammenfluss geworden.
  2. Platte 300.000 iPSCs in 1 auch von einer hESC-qualifizierte extrazelluläre Matrix-Mimic Gel (ECM-Mimic Gel) beschichtet 6-Well-Platte mit 2 mL Medium Feeder-freien iPSC mit 5 μM ROCK-Inhibitor. Beschichtung-Brunnen mit ECM-Mimic Gel Anleitungen finden Sie unter Abschnitt 3.2.
  3. Einen Tag später, entfernen der iPSC Medium + ROCK-Inhibitor und waschen iPSCs einmal mit 1 X PBS. Die iPSCs 2 mL NIM hinzufügen.
    Hinweis: 50 mL NIM erfolgt durch Zugabe von 1 mL 50 x NIS und 250 µL (50 Einheiten/mL, 5 μL/mL) von Penicillin/Streptomycin (P/S) bis 49 mL NB Medien.
  4. Wechsel-Medien der neuralen Induktion alle 2 Tage durch Absaugen verbrachte Mittel- und ersetzen mit 2 mL NIM bis Zellen werden konfluierende (ca. 4-5 Tage). Wechseln Sie Medium täglich, sobald Zellen konfluierende sind.
  5. Durchgang Zellen nach 7 Tagen im NIM und Platte in einer ECM-Mimic-Gel beschichtet 6-Well-Platte mit 2 mL 100 % Expansion Medien und 5 μM ROCK-Inhibitor. Die Zellen werden Passage 0 (P0) als NPCs an dieser Stelle. Siehe Abschnitt 3.1 unter Anweisungen zu 100 % Expansion Medien.
  6. Durchgang-Zellen unter Verwendung der in Abschnitt 3.4 beschriebenen Methoden. Warten Sie, bis die Zellen erreicht haben P2 und konfluierende vor abkoppelt um Fleck für NPC-Marker und Überzug für Experimente (Abbildung 1).

3. Kultur, Medien, Beschichtung und Wartung von NPCs

  1. Medien-Vorbereitung für Wartung von NPCs (100 % Erweiterung Media):
    1. Durch die Kombination von 24,5 mL DMEM/F12 mit 24,5 mL NB 50 mL 100 % Expansion Medien zu machen
    2. DMEM/F12 + NB Lösung 1 mL 50 X NIS hinzufügen. Medien 250 μL P/S-Lösung hinzufügen.
      Hinweis: Media kann gekühlt (4 ° C) und für bis zu 2 Wochen verwendet. Kleinere Mengen an Medien können erfolgen durch eine Anpassung der Mengen von DMEM / F12 + NB + NIS verwenden die gleichen Verhältnisse wie bei der 50 mL Volumen.
  2. Vorbereitung der ECM-Mimic Gel beschichtet Kultur Platten für NPC-Wartung
    1. Aliquoten ECM-Mimic-Gel mit der Lautstärke 6 mL Arbeitslösung machen musste. Berechnen Sie aliquoten Volumen durch das Zertifikat Analyse Blatt zu betrachten, da ECM-Mimic gel Verdünnungsfaktor von Charge zu Charge und Charge zu Charge variieren.
    2. Ein ECM-Mimic Gel Aliquoten auf Eis auftauen und lösen sich in 6 mL kalte DMEM/F12-Medien.
    3. Fügen Sie 1 mL der ECM-Mimic Gel/DMEM/F12 Lösung in jede Vertiefung eine 6-well-Platte. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit ECM-Mimic Gel-Lösung für 30 min bei 37 ° c
    4. Aspirieren Sie ECM-Mimic Gel Lösung nach 30 min Inkubation und ersetzen Sie durch 100 % Expansion Medien oder kühlen Platten (4 ° C, bis zu 1 Woche) ohne Absaugen von ECM-Mimic Gel-Lösung.
  3. Wartung von NPCs
    1. Platte NPCs in einer Dichte von 1,5 Millionen Zellen in einer ECM-Mimic Gel beschichtet gut mit 2 mL 100 % Expansion Medien.
    2. Inkubieren Sie NPCs bei 37 ° C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO2.
    3. Die Medien fügen Sie 5 μM ROCK Inhibitor für NPCs bei P3 oder niedriger oder aufgetauten NPCs, um übermäßigen Zelltod zu verhindern hinzu. Ändern Sie die Medien nach 24 h, ROCK-Inhibitor zu entfernen.
    4. Durchgang Zellen alle 4 bis 9 Tage, je nachdem, wann sie konfluierende geworden. Zellen sind konfluierende betrachtet, wenn sie einen dicht gepackten monomolekularen Film deckt die gesamte Unterseite der Schüssel Oberfläche werden.
    5. NPCs in einer Dichte von 1 bis 1,5 Millionen Zellen pro einen Brunnen von einem 6-Well-Platte-Platte (siehe Abschnitt 3.4). Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 48 h und mit 2 mL 100 % Expansion Medien ersetzen.
  4. Heben, distanzieren und Pellet-NPCs für Wartung und/oder Beschichtung für experimentellen Bedingungen
    1. Aspirieren Sie Mittel, waschen Zellen einmal mit 1 X PBS. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 500 μl 1 X Zelle Ablösung Lösung in 1 auch von konfluierende NPCs. Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
    2. Fügen Sie 500 μL der Raumtemperatur (RT) PBS und waschen Sie, die gut mit einer Pipette P-1000 zur Entfernung der Zellen zu gewährleisten. Sammeln Sie die Zellen + PBS-Lösung in ein 15 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Platte wieder mit 1 mL PBS und Flüssigkeit in das Rohr.
    3. Drehen Sie die Zellen nach unten mit 300 X g für 5 min zu Pellets.
    4. Entfernen Sie überstand aus der Zelle Pellet und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1-5 mL vorgewärmten DMEM/F12-Medien. Verdünnen Sie Zellen zu einer Dichte von 1, 4 Millionen Zellen/mL der Medien. Zellen mit einem Hemocytometer zu quantifizieren.
    5. Platte die erforderliche Anzahl von Zellen, spezifisch für NPC Wartung (Abschnitt 3.3) oder der einzelnen Test durchgeführt (siehe nachfolgende Abschnitte für weitere Details).
    6. Einstellen Sie mit Medien Zelle Aussetzung Lautstärke, so dass für jedes gut/Gericht zwischen 15 und 100 μL der Zellen verwendet werden. Dieses kleine Beschichtung Volumen sorgt dafür, dass es sogar Zelle Verteilung und Wachstumsfaktoren, Drogen oder Substrate in das Medium nicht verdünnt werden.
    7. Zellen bei 37 ° c inkubieren Ändern Sie Medien alle 48 h für NPC Wartung oder finden Sie die spezifischen Details für individuelle Assays.
  5. Medien-Vorbereitung auf die experimentellen Bedingungen (30 % Expansion Media)
    1. Verdünnen Sie die 100 % Expansion Medien um 70 % (30 % bezeichnet Expansion) durch Zugabe von 1:1 DMEM/F12 + NB Lösung um Medien für experimentellen Bedingungen zu machen.
    2. Machen Sie 20 mL 30 % Expansion Medien durch Hinzufügen von 6 mL 100 % Expansion Medien und verdünnen mit 7 mL NB und 7 mL DMEM/F12 Medien. 5 µL/mL P/S-Lösung zugeben.
      Hinweis: Enthält 100 % Medien bereits P/S, dann fügen Sie 5 μL/mL für kombinierte DMEM / F12 + NB (14 mL) = x (5 μL/mL) = 70 μL der P/S anstelle von 100µL.
    3. Beschichtung der Substrate und Wachstumsfaktoren in gewünschten Konzentrationen zu den 30 % Expansion Medien hinzufügen.

4. Bewertung von DNA-Synthese, S-Phase eintritt und Zellzahlen von NPCs

  1. Vorbereitung auf die DNA-Synthese, S-Phase Eintritt und Zelle Nummer Assay
    1. Machen Sie eine 1 mg/mL Stammlösung von Poly-D-Lysin (PDL) in dH2O und Filter zu sterilisieren. 01:10 dH2O machen eine 0,1 mg/mL PDL Lösung und jedes gut von einer 24-well-Platte oder 1 mL in eine 35-mm-Schale 300 μL hinzufügen zu verdünnen. 20 min bei RT inkubieren
    2. Waschen Sie PDL Brunnen 3 Mal für 5 min mit dH2O. Aspirat dH2O und 300 μl/Well oder 1 mL/Schüssel mit Laminin (5 μg/mL) 1 X PBS verdünnt. Abdeckplatten mit Parafilm und halten in einer sterilen, Biosafety Kabinett über Nacht bei RT (12 bis 24 h).
    3. Bereiten Sie 30 % Expansion Medien (siehe Abschnitt 3.5) nach 12 bis 24 h. Add Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen auf die gewünschte Konzentration in Mengen, die weniger als 10 % der Gesamtlösung, NIS in der 30 % Verdünnung zu vermeiden sind von Interesse Expansion Medium.
    4. Waschen Sie jeweils auch von der 24-Well-Platte zweimal mit 1 X PBS (5 min). 1 X PBS Aspirieren und 450 μL der Medien (ohne oder mit Drogen/Wachstumsfaktoren) hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für mindestens 15 Minuten vor der galvanischen Zellen.
    5. Für jedes Experiment Brunnen oder Gerichte pro Zustand 2-3 einrichten.
    6. Platte NPCs (siehe Abschnitt 3.4):
    7. NPC-DNA-Synthese-Assay: 100.000 Zellen/Brunnen in einer 24-well-Platte
    8. S-Phase Eintrag: 500.000 Zellen/35-Millimeter-Teller
    9. Zelle Nummer Assay: 50.000 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte
  2. Neuronale Vorläufer Zelle DNA Synthese Assay
    1. 100.000 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte-Platte und in dreifacher Ausfertigung/Zustand zu beurteilen.
    2. Fügen Sie radioaktiv, gegebenenfalls [3H]-Thymidin in das Kulturmedium (1,5 μCi/mL) in jede Vertiefung nach 46 h im Kultur. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 2 h.
      Hinweis: Bei Verwendung von radioaktiven Materialien geschult von Ihrer Institution, folgen Radioaktivität Sicherheitsprotokolle und radioaktive Stoffe in den entsprechend ausgewiesenen Abfall Behälter entsorgen.
    3. Entfernen Sie und ordnungsgemäß entsorgen Sie radioaktive Medien nach 2 h. hinzufügen 300 μL von 0,25 % Trypsin-EDTA (0,5 mM) vorgewärmt in jede Vertiefung und 20 min bei 37 ° c inkubieren
    4. Biegen Sie auf die Zelle-Erntemaschine (siehe Material und Ausrüstung Abschnitt) und die Pumpe und sicherzustellen, dass der Pumpendruck unter 200 PSI. Legen Sie Filterpapier durch den Raum in der Zelle Harvester und Abreißen der rechten Ecke, Papierausrichtung zu markieren.
    5. Sammeln Röhren von Cell Harvester in eine leere "blank" Fach und drücken Sie das Filterpapier anfeuchten eingespült. Sammeln von Rohren in Probe Brunnen und laufen Sie (Start).
    6. Nach Beendigung die Zelle Harvester Proben heben Sie Klemme und Advance Filterpapier für alle Sample-Sets zu wiederholen. Immer in einen leeren, "blank" Teller Vorwäsche.
    7. Filterpapier unter einer Lichtquelle zu trocknen und entsprechenden Fläschchen in einem Fach eingerichtet. Stanzen Sie Papier Chads in Fläschchen aus und jedes Fläschchen fügen Sie 2 mL liquid funkeln cocktail hinzu. Kappe und Label Fläschchen.
    8. Inkubieren Sie das Fläschchen in liquid funkeln cocktail für mindestens 1 h vor dem Lesen der Zählungen pro Minute (CPMs) auf einer Maschine funkeln.
  3. NPC S-Phase Eintrag Assay
    1. Siehe Abschnitt 3.4 für Schritte heben, distanzieren, pellet und Zellen wieder auszusetzen.
    2. Platte 500.000 Zellen pro Schale in die 35 mm-Gerichte, zubereitet in Abschnitt 4.1, nur 1 Gericht/Bedingung für diesen Schritt.
    3. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie Zellen bei 46 h 37 ° C.
    4. Bereiten Sie drei 35-mm-Platten beschichtet mit PDL/Laminin pro Zustand nach 24 Stunden. Zum Beispiel, wenn es ein 35 mm-Gericht von 30 % Expansion Medien und ein 35 mm-Gericht von 30 % Expansion Media + FGF (10 ng/mL) dann Mantel 6 PDL/Laminin-Platten für den Einsatz am nächsten Tag.
    5. Fügen Sie 2 μL/mL 5 mm EdU Kulturen nach 46 h Inkubation für 2 h.
    6. Distanzieren und pellet-Zellen (siehe Abschnitt 3.4). Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 3 mL 30 % Expansion Medien oder 3 mL 30 % Expansion Medien + gewünschten Wachstumsfaktoren/Drogen.
    7. Platte 1 mL pro Teller auf vorbeschichtete PDL/Laminin-Gerichte. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubation bei 37 ° C für 2 h damit die Zellen an das Gericht zu halten. Siehe Abbildung 2 für eine vereinfachte Timeline.
  4. S-Phase Eintrag Analyse
    1. Befestigen Sie Gerichte mit eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA in 1 X PBS) für 20 Minuten. Dann spülen Sie Geschirr 3 Mal für 5 min mit 1 X PBS.
    2. Fügen Sie 1 mL 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid Bakterien- und Pilzinfektionen Wachstum zu verhindern. Zellen können für bis zu 6 Monate bei 4 ° C gelagert werden, wenn Gerichte (mit Parafilm versiegelt), in der PBS + Natrium gehalten werden Azid Lösung, obwohl nicht alle immunologischen Antigene sind gut erhaltene nach langen Verzögerungen in der Analyse.
    3. Zellen unter Verwendung einer kommerziellen EdU Reaktion Assay kit (siehe Protokoll des Herstellers). Zellen mit DAPI oder einem anderen nuklearen Marker zu beflecken, und Bild mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
    4. Den Anteil der EdU positive Zellen über insgesamt lebenden Zellen (Zelle Summe Anzahl) Blind in 10 systematisch Zufallsfelder (10 X) zu beurteilen. Enthalten Sie abgestorbenen Zellen nicht in der Analyse.
    5. Nutzen Sie sowohl Kontrast Phasenbilder und fluoreszierende Bilder um positive EdU Färbung bestimmen und um festzustellen, welche Zellen tot sind oder lebendig (Abbildung 3).
    6. Zählen, die alle Zellen, die haben beide glatt und sogar Zellmembran in Phase Kontrasteinstellungen und einen großen unfragmentiert Kern von nuklearen fluoreszierende DAPI färben, wie diese Zellen sind live (Abbildung 3A-B).
    7. Ausgeschlossen Sie werden alle Zellen, die Phase hell sind, haben Sie eine defekte ungleichmäßige Zellmembran und haben Sie einen kleinen, kondensierten Kern wie durch DAPI Leuchtstofflampen bildgebende Verfahren, wie diese Zellen tot sind (Abb. 3A-B) visualisiert. Bewerten Sie lebenden Zellen für den Ausdruck der EdU durch die Identifizierung von Zellen, die hell fluoreszierende EdU Fleck deckt den gesamten Kern oder gesprenkelten fluoreszierende Färbung im Zellkern (Abbildung 3).
  5. NPC Zelle Nummer Assay
    1. Beschriften Sie nach 2 Tagen in Kultur und bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL und 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie in jedem 0,5 mL Röhrchen 5 μL Trypan blau.
    2. Entfernen Sie in jede Vertiefung von einer 24-well-Platte Medium und 200 μl 1 x Zelle Ablösung Lösung und Platz im Inkubator für 10 bis 15 Minuten.
    3. Nach der vorgegebenen Zeit sobald Zellen aufgehoben haben, fügen Sie die gewünschte Menge 1 X PBS in jede Vertiefung.
      Hinweis: In der Regel am 2. Tag, fügen Sie 300 μl 1 X PBS gut enthaltenden Zellen plus 200 μL der Ablösung Lösung für ein Gesamtvolumen von 500 μL. Mit zusätzlichen Kultur Inkubationszeit wie Zellen mehr konfluierende geworden, Lautstärke Verdünnung wie nötig. Zum Beispiel am 4. Tag fügen Sie 500 μl 1 x PBS und an Tag 6 hinzu, fügen Sie 800 μl 1 X PBS hinzu. Gesamtmengen werden 700 μl und 1 mL betragen.
    4. Mit einer P-1000-Pipette, pipette rauf und runter in jeder gut 4 bis 5 Mal um Zellen zu entfernen. Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass alle Zellen getrennt haben. Übertragen Sie Zellen auf 1,5 mL Röhrchen.
    5. Invertieren Sie 1,5 mL Röhrchen mit verdünnter Zellen 2 bis 3 Mal. Dann nehmen Sie eine 50 μL aliquoten von Zellen aus der Mitte des Rohres und 0,5 mL Röhrchen mit Trypan blau hinzufügen (siehe 4.5.1).
    6. Pipette Zelle Lösung nach oben und unten 2 bis 3 Mal. Die Hemocytometer Zellen hinzufügen und sofort zu analysieren. Warten länger als 10 min erhöhen kann, Zelltod oder das Vorhandensein von Zellen, die Trypan blau aufgegriffen haben.
    7. Fügen Sie sorgfältig 10 µL der Zelle + Trypan blau Mischung auf jeder Seite des Hemocytometer replizieren Zählungen durchführen. Anzahl Zellen mit der Phase-Kontrast-Mikroskop. Zählen Sie nicht abgestorbenen Zellen oder die dunklen blauen Zellen, die Trypan blau aufgegriffen haben.
    8. Um der gesamte Zelle Nummer, Verwendung der Durchschnitt zu ermitteln Handynummer von 4 Ecken des die Hemocytometer gezählt und gelten die folgende Gleichung:
      Meine Handynummer x Media-Volumen (mL) X 10,000 = Zelle Summe Anzahl/Brunnen
    9. Aspirieren Sie, und wiederholen Sie den Vorgang auf verbleibenden Brunnen. Wechseln Sie das Medium auf die Zellen, die nicht, alle 48 h. Wiederholung Assay auf Tage 4 & 6 gezählt werden.

(5) NPC Neuriten Assay

  1. Vorbereitung der Gerichte und Medien für Neuriten Assay
    1. Machen Sie eine 1 mg/mL Stammlösung von Poly-d-Lysin (PDL) in dH2O und Filter zu sterilisieren. 01:10 dH2O zu machen eine PDL-Lösung 0,1 mg/mL und 1 mL zu jeder 35-Millimeter-Teller zu verdünnen. 20 min bei RT inkubieren
    2. In der Zwischenzeit bereiten Sie 30 % Expansion Medien (siehe Abschnitt 3.5) und den Medien fügen Sie 5 μg/mL (5 µL/mL) der Fibronektin-Lösung (1 mg/mL Brühe hinzu).
    3. Sobald die Medien vorbereitet ist, fügen Sie Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen.
      Hinweis: Es empfiehlt sich, Fahrzeug, Wachstumsfaktoren oder Drogen, bei Lautstärken hinzufügen < 10 % der Gesamtlösung zu verdünnen der Fibronektin und anderen Komponenten in das 30 % Expansion Medium.
    4. Nach 20 min PDL Abwasch, 3 Mal für 5 min mit dH2O, überschüssige PDL zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Gerichte trocken sind, bevor Sie Medien hinzufügen.
    5. Legen Sie 1 mL der Medien (mit oder ohne Drogen/Wachstumsfaktoren) + Fibronektin Lösung in jeder PDL beschichtete Teller.
    6. Inkubieren Sie Gerichte bei 37 ° C für mindestens 30 min vor der galvanischen Zellen, um die ordnungsgemäße Befestigung des der Fibronektin an die PDL zu gewährleisten.
    7. Für jedes Experiment 2-3 Gerichte pro Zustand (z.B. 3 Fahrzeug-haltigen Gerichte, 3 wirkstoffhaltigen Gerichte) eingerichtet.
  2. Beschichtung-NPCs für Neuriten Assay
    1. Siehe Abschnitt 3.4 für Schritte heben, distanzieren, pellet und Aufschwemmen Zellen.
    2. Platte 50.000 Zellen pro Schale in den Gerichten, die in Abschnitt 5.1. Schütteln Sie Gerichte hin und her in alle Richtungen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 48 h.
  3. Analyse der Neuriten
    1. Nach Inkubation der Zellen für 48 h, Aspirieren Medium, und beheben Sie Gerichte mit Eis kalt 4 % PFA für 20 Minuten.
    2. Waschen Sie nach 20 min Geschirr 3 Mal für 5 min mit 1 X PBS. Nach dem letzten Waschen fügen Sie 1 mL 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid.
    3. Analysieren Sie blind auf eine Phase Kontrast Mikroskop bei 32 X Gerichte. Zählen Sie insgesamt Zellen und Zellen mit Neuriten in 3, 1 cm-Reihen, aber reproduzierbare Positionen nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Zählen Sie ein Minimum von 150 Zellen pro Schale um angemessene Stichproben zu gewährleisten.
      Hinweis: Ein Neurit ist definiert als eine Erweiterung (Prozess) aus der Zelle Körper, > 2 Zellkörper Durchmessern in der Länge. Für Zellen mit mehreren Prozessen gilt als der längste Prozess für das Kriterium. Zellen mit Prozessen, die < 2 Zellkörper Durchmesser Länge sind nicht enthalten (Abbildung 4).
    4. Addieren Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Gesamtzahl der Zellen mit Neuriten in jedes Gericht. Berechnen Sie die % der Zellen mit Neuriten. Durchschnitt der Anteil der Zellen mit Neuriten über Replicate Gerichte. Vertrauen in experimentellen Reproduzierbarkeit wird eingerichtet, wenn alle Zeilen innerhalb jedes Gericht ähneln und Durchschnittswerte unter Gerichte sehr ähnlich, mit der Standardfehler des Mittelwertes (SEM sind) < 10 %.
    5. Alternativ Neuriten analysieren, durch die Durchführung von Immunocytochemistry für Marker wie z. B. Beta-III-Tubulin (TUJ1) oder MAP2. Nach der Färbung für die Markierung von Interesse, 10 systematisch Zufallsbilder am ein Fluoreszenz-Mikroskop um 10 X statt. Mindestens 200 Zellen. In diesem Fall erwerben Sie die Bilder nicht zu nah an den Rand der Schale. Den Anteil der Zellen mit TUJ1 oder MAP2 + Neuriten (siehe Abbildung 10 ein Beispiel) zu analysieren.

(6) NPC Neurosphäre Migration Assay

  1. Neurosphäre Bildung
    1. Fügen Sie 1 mL 100 % Expansion Medien in eine 35-mm-Schale mit Substrat keine Beschichtung. Inkubieren Sie Geschirr für mindestens 15 Minuten bei 37 ° C, bevor plating NPCs. Prepare 2-3 Gerichte um sicherzustellen, dass es genügend Neurosphären für die Zelle Migration Assay werden.
      Hinweis: Das Fehlen eines Substrats, Beschichtung sorgt dafür, dass NPCs in den Medien, schweben die für Neurosphäre Bildung unerlässlich ist. Beschichtung-Gerichte werden Neurosphäre Bildung verhindern.
    2. Siehe Abschnitt 3.4 auf Schritte zu heben, zu distanzieren und pellet-Zellen. Aufschwemmen Zelle Pellet in 2-5 mL vorgewärmten 100 % Expansion Medien. Platte 1 Million NPCs in jedes 35-mm-Gericht im Abschnitt 6.1.1 vorbereitet.
    3. Inkubieren Sie NPCs bei 37 ° C für 48 bis 96 h NPCs zu aggregieren und Form Neurosphären zu ermöglichen. Kugelgröße mit einem live Lineal auf dem Phasenkontrast-Mikroskop zu beurteilen. Warten Sie auf die meisten Kugeln, um einen ungefähren Durchmesser von 100 µm (± 20 μm) zu erreichen (Abbildung 5). Kleinere Kugeln werden vollständig zerstreuen und während der Migration Test auseinander brechen.
  2. Vorbereitung der Platten für Neurosphäre Migration Assay
    1. Lösen Sie ECM-Mimic Gel Aliquote (siehe Abschnitt 3.2 auf) in 6 mL 30 % Expansion Medien. ECM-Mimic gel/30% Expansion Medienlösung vorbereitet, fügen Sie Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen der Interessen bei gewünschten Konzentrationen hinzu.
      Hinweis: Fahrzeug, Drogen- und Wachstumsfaktor Konzentrationen müssen erhöht werden, um die Zugabe von 200 µL des Neurosphären in Abschnitt 6.3 zu berücksichtigen.
    2. Platte 1 mL der ECM-Mimic gel 30 % Expansion Medienlösung (± Fahrzeuge, Wachstumsfaktoren oder Drogen) in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte. 2-3 Brunnen pro Versuchsbedingung zu machen. Alternativ können die 35-mm-Gerichte verwendet werden. Inkubieren Sie Platten für mindestens 30 min bei 37 ° C.
      Hinweis: Aspirieren Sie ECM-Mimic gel/30% Erweiterung Media-Lösung für diesen Test nicht. Kugeln auf einem aspirierten ECM-Mimic Gel Überzug führt zu schnellen und überschüssige Migration.
  3. Beschichtung Neurosphären
    1. Sammeln Sie Neurosphären gebildet in Abschnitt 6.1 zu und legen Sie sie in eine konische Rohr. Waschen Sie die 35 mm gesammelten Gerichte mit 1 mL 1 X PBS um alle Neurosphären zu sicherzustellen. Spin-down den gesammelten Neurosphären 100 X g für 5 Minuten.
    2. Wieder aussetzen die Neurosphären in 1-3 mL vorgewärmten 30 % Expansion Medien. Wenn 1 Teller von Neurospheres erhoben werden, wird 1 mL der Medien verwendet, um Kugeln aufzuwirbeln. Wenn 2 Gerichten erhoben werden, 2 mL der Medien werden hinzugefügt, um die Kugeln zu Aufschwemmen, etc. Pipette vorsichtig und nur eine P-1000 zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Kugeln nicht gebrochen werden.
    3. Platte 200 μL der resuspendierte Neurosphären in der ECM-Mimic gel/30% Expansion Lösung in Abschnitt 6.2 gemacht. Rock-Platten in alle Richtungen Neurosphären gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platten für 48 h bei 37° c
    4. ECM-Mimic gel/30% Erweiterung Media Lösung entfernen und reparieren Zellen in 4 % PFA, waschen und halten Zellen in 1 x PBS + 0,05 % Natriumazid.
  4. Analyse von Neurospheres
    1. Bilder des gesamten Neurosphären mit Phase Kontrasteinstellungen bei 10 X zu erwerben. Sicherstellen Sie, dass die Kugeln sich nicht gegenseitig berühren. Durchschnittliche Migration mit ImageJ-Software zu messen.
    2. Die Außenkontur des Neurosphäre, die mit dem Freihandlinie Werkzeug zu verfolgen. Die Freihandlinie kann durch einen Rechtsklick auf das Symbol "geraden" zugegriffen werden. Manuell Ablaufverfolgung mithilfe einer Maus.
    3. Verwenden Sie die Messfunktion zur Berechnung der Fläche der Ablaufverfolgung. Sicherstellen Sie, dass "Raum" als eine Auslesung im Fenster "Set Messungen" finden Sie unter der Registerkarte "Analyze" ausgewählt ist. Spur der Außenkontur in Blau finden Sie unter Abbildung 6 .
    4. Der inneren Zellmasse der Kugel und Maßnahme zu verfolgen. Siehe Abbildung 6 für Spur der Innenkontur in rot. Durchschnittliche Migration durch Subtraktion der inneren Zellmasse aus dem gesamten Neurosphäre zu quantifizieren.
    5. Maßnahme Neurosphären, die einen dicht gedrängten inneren Zellmasse mit Zellen, die Migration als einen zusammenhängenden Teppich (Abbildung 6) aufweisen.
    6. Enthalten Sie Zellen außerhalb des Teppichs oder losgelöst von der Neurosphäre für die Messung nicht. Siehe Abbildung 6 Beispiele für Zellen (eingekreist in weiß), die von der äußeren Teppich Messung ausgeschlossen sind. Analysieren Sie ein Minimum von 20 Neurospheres für jede Bedingung.

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Representative Results

Ein Ziel dieser Studien ist die proliferative Aktivität der NPCs, d. h., ein Anstieg der Zellzahlen definieren. Dies wird erreicht durch die DNA-Synthese des gesamten Zellpopulation, eine Hochdurchsatz-Ansatz, der misst der Aufnahme radioaktiver Tracer gegebenenfalls Thymidin in Zelle Extrakten und spiegelt alle Zellen in der S-Phase, seien es Bewertung Synthese für 5 Minuten oder die ganzen zwei Stunden. Darüber hinaus können diese Tests die Bestimmung des Anteils von Zellen, die S-Phase und Zelle Summe zahlen, ein arbeitsintensiver Assay einzelner Zellen eingeben. Zellen synthetisieren DNA in der S-Phase, ein Schritt, der vorangeht, Mitose und Zellteilung, die auftreten müssen, um Zellzahlen zu erhöhen. Da diese Prozesse einige Zeit in Anspruch nehmen, können Veränderungen in der DNA-Synthese in 48 Stunden überprüft nicht Änderungen in Zelle Zahlen zu diesem Zeitpunkt zugeordnet werden. Dennoch wurde festgestellt, dass Veränderungen in der DNA-Synthese bei 48 Stunden Anstieg der Zellzahlen am Tag 4 und 6 zuverlässig vorherzusagen.

Bei der Beurteilung der DNA-Synthese, Zellen sind bei einer Dichte von 100.000 Zellen (~ 50 % Zusammenfluss) in einer 24-Well-Platte beschichtet und dürfen für 48 Stunden vor dem Durchführen von Messungen zu wachsen. Diese Dichte wird sichergestellt, dass die Zellen ihrer Umgebung Monolage ähneln, aber auch nicht so schnell wachsen, in einem Zeitraum von 48 Stunden, den die Medien zu sauer werden. Medien, die zu sauer können Zellstoffwechsel erheblich beeinflussen und verändern damit, Verbreitung Ergebnisse. Wenn bestimmte Zell-Linien hoch proliferative, der Forscher sollten die Zelldichte, Datenträger, zu verändern oder Medien austauschen Frequenz zu stark saure Bedingungen zu verhindern. Wenn Bedingungen geändert werden, ist es wichtig, konsequent zu sein, wenn verschiedene Zelllinien zu vergleichen, weil-Zellezelle Kontakt abhängige Änderungen sicherlich Wachstumsraten beeinflussen. Das geradlinige Design von dieser Assays ermöglicht es uns, verschiedene Wachstumsfaktoren zu testen. Wie in Abbildung 7, die Zugabe von Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF, 10 ng/mL) für erhöht 48 Stunden DNA Synthese von ~ 40 %. Darüber hinaus die DNA-Synthese-Assay ist reproduzierbar als alle Klone und Individuen zeigen einen Anstieg der DNA-Synthese nach FGF-Stimulation. Das Potenzial für die Variabilität der Basislinie und FGF stimuliert DNA-Synthese unter verschiedenen nicht betroffenen Individuen als auch das Potenzial für klonale Variabilität in der gleichen Person in Tabelle 1gezeigt wird. Aufgrund dieser Variabilität ist es wichtig, mehrere iPSC-Klone pro Person zu testen, sowie ein Minimum von 3 bis 5 NPC Linien abgeleitet von jeder anderen iPSC-Klon zu beurteilen. Ein Minimum von 3 Versuche für jeden NPC-Linie wurde durchgeführt.

Der DNA-Synthese-Test ermöglicht es uns, schnell beurteilen, zahlreichen experimentelle Gruppen in einer Hochdurchsatz-Mode und die Maßnahme spiegelt die Summe der DNA-Synthese unabhängig von der Dauer der S-Phase (5 Minuten bis 2 Stunden). Um den Anteil der Zellen in der S-Phase zu definieren, wurde die S-Phase Eintrag Assay eingesetzt. Für diesen Test Zellen werden in die gleiche Dichte wie bereits erwähnt Monolayer-ähnliche Dynamik auftreten ermöglichen angebaut, aber dann sind sie getrennt nach 2 Tagen und kurz an Platten, einzellige Analyse halten durfte. Zählen von Zellen in einem monomolekularen Film kann aufgrund hoher Zell-Zell-Kontakt und regionaler Variabilität in der Platte schwierig sein. Dieses Paradigma lässt sich modellieren Sie die Zellen als eine Monolage und dann als einzelne Zellen zu analysieren. Es fungiert auch als eine methodisch unabhängige Bestätigung der Daten, die in der DNA-Synthese-Assay. Wie in Abbildung 8sehen, erhöht 48 Stunden der FGF (10 ng/mL) Stimulation sich den Anteil der Zellen in der S-Phase um ~ 25 %.

Bei der Beurteilung der Zellzahlen, wird eine geringere Dichte Zelle verwendet, als in den oben genannten Tests mit 50.000 Zellen wird pro Bohrloch eine 24 verchromt Platte gut. Wiederum wurde dieser Dichte gewählt, um sicherzustellen, dass schnellere Zelllinien nicht so schnell über die 6-Tage-Frist wachsen, dass der pH-Wert des Mediums zu sauer wird und wird gelb. In Abbildung 9während Zellzahlen 2 Tage nicht signifikant unterschiedlich zwischen Kontrolle und FGF (10 ng/mL) Gruppen sind die Veränderungen in der DNA-Synthese bei 48 h (Abbildung 7) prädiktiv für Änderungen in Zelle Zahlen 4 und 6 Tage.

Während NPCs in der Regel in hoher Dichte kultiviert werden, wird der Neurit-Test bei einer Dichte von 50.000 Zellen bei der Beurteilung einzelne Zellen in eine 35-mm-Schale vergoldet durchgeführt. Auch bei dieser geringen Dichte Kulturen die NPC express Zellskelett Proteine und Transkriptionsfaktoren, die charakteristisch für NPCs wie NESTIN und SOX2 PAX6 (Abbildung 10 A-D). Dies bedeutet, dass ein niedriger Dichte Kultivierung nicht deutlich Zelle Schicksal in diesem Zeitrahmen ändert. Darüber hinaus wurden ähnliche Low-Density-Bedingungen in der Ratte und Maus Kultur-Systeme zur Phänotypen erkennen, die letztlich reproduzierbare in Vivo16,17,18,19waren, 20,21,22,23. Nach 48 Stunden Inkubation ein kleiner Teil der NPCs beginnen zu Neuriten zu verlängern, wie in Abbildung 11A und B, und in das Diagramm in Abbildung 11quantifiziert. Der Anteil der Zellen, die Neuriten, die Länge der Neuriten und die Anzahl der Neuriten/Zelle erweitern kann gemessen werden, um Entwicklungsstörungen Parameter zu bewerten. Um den Prozentsatz der Zellen mit Neuriten Auswuchs richtig einschätzen, ist es wichtig, dass als einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen überzogen sind < 5 Zellen und nicht so großen Aggregaten. Wie in Abbildung 10 E-F, express Zellen mit Neuriten (weißer Pfeil) auch unreif neuronalen Marker Beta III Tubulin (TUJ1). Wie in den Methoden erwähnt, fluoreszierende Bilder von TUJ1 gebeizt NPCs erworben werden können und dann diese Bilder gezählt werden können, für den Anteil von TUJ1 + Neuriten, neuronale Ursprung der Prozesse zu gewährleisten. In unserem Labor haben Analysen von beiden Methoden statistisch ähnliche Ergebnisse erbracht.

Das schlichte Design und die schnelle Art des Neuriten Assays ermöglichen auch die Auswirkungen der entwicklungspolitisch relevanten Wachstumsfaktoren, Zytokine und Peptide zu testen. Zum Beispiel Abbildung 11 zeigt, dass das Neuropeptid Hypophyse Adenylat-Cyclase Aktivierung Polypeptid (PACAP, 3 nM) erhöht Neuriten Auswuchs in NPCs. PACAP ist ein wichtiger Entwicklungsstörungen Faktor, die breiten Ausdruck im ZNS und hat gezeigt, dass in die Entwicklung des Gehirns wichtig sein. Nagetiere Studien in unserem Labor und anderen Labors haben festgestellt, dass PACAP weit verbreitete Bühne-abhängige Entwicklungsstörungen wie Regulierung Neuriten Auswuchs, Migration und Proliferation in beiden das Hinterhirn und Vorderhirn16,22, 29,30,31. Neuere Studien von Ataman Et al. (2016) mit kultivierten menschlichen fetalen kortikale Zellen zeigen, dass neuronaler Aktivität eine 9-fold Zunahme der PACAP Genexpression induziert, die Peptide Bedeutung im menschlichen neuronalen Entwicklung32. In der Tat, Tabelle 2 zeigt den Prozentsatz der Neuriten Kontroll-und PACAP (3 nM) Bedingungen zwischen zahlreichen Linien von nicht betroffenen Individuen abgeleitet. Wie aus Tabelle 2ersichtlich, gibt es gewisse Variabilität des Anteils der Neuriten ausgedrückt in Zelllinien aus verschiedene Klone von der gleichen Person und von NPCs aus verschiedenen Individuen abgeleitet. Jedoch haben diese nicht betroffenen Individuen eine Erhöhung Neuriten Auswuchs in Reaktion auf PACAP, unter Angabe der Reproduzierbarkeit des Assays.

Wie Neuriten Auswuchs ist Zellmigration eine wichtige Entwicklungsprozess unerlässlich für die richtige Verbindung, die Organisation und die Verdrahtung des Gehirns. Neurosphären ermöglichen es uns, NPC Migration in einem typischen High-Density-Zustand zu studieren, die Zell-Zell-Kontakt zwischen NPCs (Abbildung 12) verwaltet. Entwicklungspolitisch relevante Faktoren können auch auf Neurosphären zur Bewertung ihrer Auswirkungen auf Migration getestet werden. Abbildung 12 zeigt z. B. PACAP (10 nM) erhöht die Migration von NPCs.

Figure 1
Abbildung 1: NPCs in der Passage 3. NSCs auf P3 express mehrere Phase-spezifische Marker einschließlich (A) pluripotenten Transkriptionsfaktor, SOX2 Transkriptionsfaktor, der spezifisch für Vorderhirn NPCs, PAX6, (B) und NPC Zellskelett Protein NESTIN. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische der S-Phase Eintrag Assay. Zeitachse der S-Phase Eintrag Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Quantifizierung der S-Phase Eintritt. Leben Sie (A) Phase Bild zeigt Phase-dunkel Zellen (weiße Pfeile), eine Phase-helle tote Zelle (weißer Stern) und eine Phase-hell live Zelle (grüner Pfeil). (B) fluoreszierende DAPI färben mit kondensierter Kern in eine tote Zelle (weißer Stern) und große Kerne in einer live-Zelle (weiße und grüne Pfeile). (C) fluoreszierende EdU Bild zeigt helle EdU positive Kerne (roter Pfeil) und gesprenkelten EdU positive Kerne (roter Stern). (D) Phase und fluoreszierende Zusammenführen der Bilder 3A - 3 C.

Figure 4
Abbildung 4: Identifizierung von Neuriten. Phasenkontrast-Bilder von NPCs (A) A-Zelle mit einem Prozess > 2 Zellkörper in der Länge, damit erfüllen das Kriterium für ein Neurit. (B) eine Zelle mit einem Prozess < 2 Zellkörper in Länge und daher nicht als Neurit-Lager. (C) steht für eine Zelle mit 2 Prozesse, die längere Prozess für die Neuriten Kriterium bewertet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Auswahl von Neurospheres für Migration Assay. (A) Phase Kontrast Bild eines repräsentativen Feldes von Neurospheres um 24 h Kugeln sind alle weniger als 100 μm und sind daher nicht für die Migration-Assay gesammelt. (B) Phase Kontrast Bild eines repräsentativen Feldes von Neurospheres bei 72 h. Alle Kugeln sind innerhalb von 100 µm ± 20 µm Bereich, darauf hinweist, dass sie bereit sind, für die Migration-Assay gesammelt werden.

Figure 6
Abbildung 6: Migration zu quantifizieren. (A) Phase Kontrast Bild von einer repräsentativen Neurosphäre. (B) blaue Linie zeigt die Spur um insgesamt Neurosphäre Fläche zu messen. Rot zeigt die Kontur verwendet, um den Bereich der inneren Zelle messen Masse. Migration ist definiert als insgesamt Neurosphäre Bereich innere Zelle Masse Fläche. Beachten Sie, dass die weißen Kreise zeigen Zellen, die nicht in einem zusammenhängenden Teppich sind, da diese Zellen aus den Konturen der Migration ausgeschlossen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Bewertung von DNA-Synthese. Repräsentative Ergebnisse der Kontrolle versus FGF-behandelten NPCs. FGF (10 ng/mL) erhöht DNA-Synthese bei 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2 bis 4 Brunnen/Gruppe/Experiment; 3 Experimente). Fehlerbalken darzustellen SEM

Figure 8
Abbildung 8: Anteil der Zellen, die in S-Phase. (A) Phase kontrastreiche Bilder von NPC-Zellen inkubiert Kontrolle versus FGF (10 ng/mL) behandelten Medien für 48 h. Einsätze Bilder mit höherer Vergrößerung der Zellen gebeizt für fluoreszierende EdU-Marker in Kontrolle und 10 ng/mL FGF Medien vertreten. Rote Pfeile zeigen, dass Zellen, die EdU positive und weißen Pfeile sind Zellen zeigen, die EdU negativ sind. (B) Diagramm der repräsentative Ergebnisse der Kontrolle versus FGF (10 ng/mL) behandelt NPCs. FGF erhöht S-Phase Eintrag bei 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2 bis 4 Gerichte/Gruppe/Experiment; 3 Experimente). Fehlerbalken darzustellen SEM

Figure 9
Abbildung 9: Auflisten von Zellen am Tag 2, 4 und 6. (A) Phase Kontrast Aufnahmen von Zellen im Steuerelement und FGF (10 ng/mL) behandelten Medien am Tag 2, 4 und 6. (B) Diagramm der repräsentative Ergebnisse; Beachten Sie, dass FGF (10 ng/mL) erhöht Zellzahlen nicht immer 2 Tage, aber bei 4 und 6 Tage Erhöhungen sind offensichtlich (p ≤0.05). (n = 2 bis 4 Brunnen/Gruppe/Experiment; 3 Experimente). Fehlerbalken darzustellen SEM

Figure 10
Abbildung 10: Charakterisierung von NPCs in geringer Dichte Bedingungen. (A, C, E) Phase Kontrast Bilder von NPCs in Low-Density-Bedingungen. (B) NPCs express Stamm/Stammvater Zelle Marker NESTIN (grün), SOX2 (rot) und nukleare Marker DAPI (blau). (D) PAX6 (rot), DAPI (blau). (F) zum Ausdruck bringen, Low-Density, Zellen Ausweitung Neuriten (weißer Pfeil) auch unreif Neuron Marker TUJ1 (grün). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11: Neurit Auswuchs. (A) Phase Kontrast Bild von NPCs. Die schwarzen Pfeile zeigen auf die Zellen mit Neuriten. (B) Zugabe von Neuropeptid PACAP (3 nM) erhöht den Prozentsatz der Zellen mit Neuriten (p ≤1 x 10-2). (C) Quantifizierung der Neurit Auswuchs in Kontrolle und 3 nM PACAP enthaltenden Medien. (n = 2 bis 4 Gerichte/Gruppe/Experiment; 3 Experimente). Fehlerbalken darzustellen SEM

Figure 12
Abbildung 12: Neurosphäre Migration. (A) Phase kontrastreiche Bilder von Neurospheres. (B) Zugabe von PACAP (10 nM) erhöht Neurosphäre Zellwanderung (p ≤10-2) (C) Quantifizierung der Zellmigration. (n = 20 Kugeln/Gruppe/Experiment, 3 Experimente). Fehlerbalken darzustellen SEM

Medien
Patienten # Zu klonen STRG-TASTE FGF
(10 ng/mL)
Patient 1 1 21.853 47.538
2 20.336 38.070
Patient 2 1 7.664 14.060
2 16.573 30.087

Tabelle 1: DNA-Synthese. Eine Übersicht über die DNA-Synthese-Werte (in CPMs) der NPCs aus zwei iPSC-Klone pro zwei nicht betroffenen Individuen abgeleitet.

Medien
Patienten # Zu klonen STRG-TASTE PACAP
(3 nM)
Patient 1 1 13.60 % 18.10 %
2 16,50 % 21.10. %
Patient 2 1 8,90 % 14.10 %
2 14,20 % 21.10. %

Tabelle 2: Anteil der Zellen mit Neuriten. Eine Übersicht über den Prozentsatz der Zellen, wobei Neuriten NPCs aus zwei iPSC-Klone pro zwei nicht betroffenen Individuen abgeleitet.

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Discussion

Die hier vorgestellten Protokolle zeigen, schnelle und einfache Methoden, um grundlegende Neurodevelopmental Prozesse zu studieren und Wachstumsfaktoren und Drogen mit HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen zu testen. HiPSC Technologie hat die Untersuchung der Pathogenese von Entwicklungsstörungen Krankheiten revolutioniert, indem wir uns mit noch nie da gewesenen Zugang zu menschlichen Nervenzellen von betroffenen Personen leben. In der Tat gab es zahlreiche HiPSC Studien von Entwicklungsstörungen des Rett-Syndrom, Timothy-Syndrom, Fragile-X-Syndrom, einschließlich und Schizophrenie, die krankheitsspezifische Aberrationen in Dendriten ausgegraben haben, Synapsen, und neuronale Funktion4,33,34,35,36. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich in erster Linie auf unheilbar differenziert, Post-mitotische Neuronen, die, obwohl relativ funktional unreif, schließt das Studium der früheren neurodevelopmental, Prozesse wie z. B. Proliferation und Migration. Diese letztere Prozesse haben stark in der Pathogenese der Neuroentwicklungsstörungen verwickelt worden und Haftbefehl weiter studieren8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. die Verwendung von NPCs ermöglicht es uns, diese wichtige frühere Ereignisse zu studieren und gleichzeitig die Möglichkeit zu untersuchen, reifer Prozesse wie die Fähigkeit der Zellen, unreife Axone/Dendriten (Neuriten) zu verlängern. Weiter, einige der diese Tests auch erweiterbar um weitere Parameter, wie Neuriten Länge, Anzahl, und verzweigen oder die weiteste zurückgelegte Strecke von einer Zelle zu studieren.

Einige neueren Studien haben organoide Modellsysteme verwendet, um früher Entwicklungsstörungen Ereignisse in einer 3-d "Mini-Gehirn-System" studieren1,39,40. Doch auch in diesen Systemen organoide proliferative Vorläufer-Zell-Population ist begrenzt und frühe Reifung und Migration sind schwer,15,39zu studieren. Neben der Begrenzung die Studie früher Entwicklungsstörungen Phänomene, die Verwendung von unheilbar differenzierten Neuronen oder Organellen ist oft zeitaufwendig, teuer und begrenzt die Anzahl der Variablen, die in das System beurteilt werden kann. Dies ist weil Neuronen und Organellen möglicherweise virale Induktion Protokolle, speziellen Inkubatoren und Ausrüstung, mehrere Wochen Zeit und große Mengen an Medien. Im Gegensatz dazu, mit der Ausnahme von der DNA-Synthese-Assay (die später folgenden eingegangen ist), dieses Protokoll kann leicht auf das Studium der Neuroentwicklungsstörungen angewendet werden und erfordert keine umfangreiche Schulungen, teure Werkzeuge und Ressourcen oder Software. Die Leichtigkeit und die relativ geringen Kosten der Zugabe von Drogen und Wachstumsfaktoren in diese Tests machen dieses Protokoll nützlich Hochdurchsatz-Technologie, verschiedene mögliche Behandlungsmethoden für Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrischen Erkrankungen zu testen. Darüber hinaus da Wachstumsfaktoren Gesetz über zelluläre Signalwege definiert, können sie auch als Werkzeuge verwendet werden für potenzielle Signalisierung von Fehlern bei der Entwicklung von Systemen zu testen. Schließlich, da NPCs eine proliferative selbst erneuernde Population sind, große Mengen von Zellen herstellbar und kryokonserviert ermöglicht Experimente effizient durchgeführt werden, ohne NPCs aus iPSCs jedes Mal machen.

Um diese Tests erfolgreich einsetzen zu können, ist es wichtig, die folgenden kritischen Schritte beachten. Dieses Protokoll stellt NPCs in den unterschiedlichen Bedingungen für Wartung und Ausbau im Vergleich zu experimentieren. Insbesondere während der NPCs induziert werden, reduzieren gewachsen und passagiert in neurale Induktion ergänzen (NIS)-haltigem Medium, unserer experimentellen Bedingungen die Ergänzung um 70 %, die Orte von Zellen in einer einschränkenden Umgebung, ermöglicht es uns die Möglichkeit, wieder hinzufügen und testen Sie die Auswirkungen von wichtigen Wachstumsfaktoren. Zweitens ist es unerlässlich, den Durchgang der NPCs nachzuverfolgen. In unseren Studien haben wir in der Regel Passagenanzahl der Zelllinien von P3 - P8 eingeschränkt. In Passagen früher als P3, einige Zeilen nicht robust charakteristische Markierungen zum Ausdruck bringen. Bei höheren Passagen während einigen Zelllinien sehr konsequent Wachstumsraten oder Antworten auf Wachstumsfaktoren, können anderen Zelllinien dramatische Veränderungen im Zellwachstum oder Antwort haben. Obwohl nicht routinemäßig berichtet, haben wir und viele andere diese drastische Änderung in proliferative Preise bei höheren Passagen erlebt. Der Grund kann für dies ungewiss ist, aber diese Änderungen kann einer begrenzten Fähigkeit der Selbsterneuerung von NPCs. definieren, warum und wie ausgedehnte Passagen Verbreitung Tarife umstellen Einblicke in Entwicklung und Pathogenese der Krankheit, aber weitere Forschung durchgeführt werden müssen. Schließlich kann das kommerzielle neurale Induktion-Protokoll, das wir verwenden manchmal schlechter Qualität neurale Stammzellen, Ausbeute, insbesondere dann, wenn der Start iPSCs nicht von hoher Qualität sind (zB., Differenzierung der Zellen an den Grenzen der Zelle Kolonien, haben Karyotyp Anomalien). In einigen Fällen Zellmorphologie wird verzerrt und Ausdruck der Marker ist nicht vorhanden. Verwenden Sie nicht diese Kulturen. In anderen Fällen wachsen die NPCs mit flacher "Verunreinigung" Zellen, die mit einer differenzierten Zelle Ablösung Lösung Behandlung nahezu reine NPC Populationen vor Gebrauch in Experimenten darauf entfernt werden können. Qualitativ hochwertige NPCs ist entscheidend für die richtige Ergebnisse: siehe Materialien und Ausstattung Abschnitt für einen Link zu einem neuronalen Induktion Protokoll wo Bilder von hoher und niedriger Qualität NPCs gefunden werden können.

Für jeden der die Assays vorgestellt ist es wichtig, beachten die folgenden kritischen Schritte, mögliche Fehler und Tipps zur Fehlerbehebung. Für die Anzahl von Zellen, DNA-Synthese und Neurit Assays ist es wichtig, Platte Zellen Einzelzellen zu trennen und nicht als Klumpen, wie diese können zerren, DNA-Synthese Maßnahmen Zellzahlen und Neurit Verhalten. Um sicherzustellen, dass Klumpen von Zellen nicht überzogen sind, probieren Sie eine kleine Menge von Zellen mit einem P1000, Platte auf einer Folie und überprüfen Sie, ob die Zelle Klumpen vorhanden sind. Wenn Klumpen auszeichnen, pipette Zellen nach oben und unten um manuell auseinander Klumpen vor der Beschichtung zu brechen. Für die DNA-Synthese und die Zelle Nummer Assay werden Zellen mit Enzymen für Zähl- und Analyse gehoben. Es ist entscheidend für visuell bestätigen Zellen haben völlig aus das Kulturgefäß zu genaue zählt gehoben und ggf. längere Inkubationszeiten Enzym verwendet werden können. Bei niedrigen Zellzahlen oder niedrige TKPs für die DNA-Synthese-Assay, können Zellen bei höheren anfänglichen dichten, radioaktive gegebenenfalls [3H] beschichtet werden - Thymidin nachrüstbar für doppelte Zeit (4 Stunden statt 2) oder gegebenenfalls [3H] - Thymidin Konzentration kann verdoppelt werden. Für die Neuriten Assay kann erste Beschichtung Dichte verdoppelt werden, ohne zu riskieren, erhöhten Zell-Zell-Kontakt. Achten Sie auf die Verteilung der Zellen in eine Schüssel und zählen Sie 1 cm Zeilen zu, so dass jeder Teil der Schale gesampelt wird. Wenn der Neurit Prozentsatz bei 48 h zu niedrig ist, der Assay erweiterbar bis zu 6 Tage oder die Beschichtung Substrattyp oder Konzentration kann geändert werden, um größere Prozentsatz der Neuriten zu fördern. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Beschichtung Zeiten und Methoden, die wir, in das Protokoll vorgestellt haben für optimale Neuriten Auswuchs und Zell-Gesundheit ausgewählt wurden, nach dem Test zahlreiche verschiedene Substrate, Substrat-Konzentrationen und Beschichtung Zeiten. Für die Neurosphäre Assay kann Verwendung von kleineren Nadeln (P20, P200) zu scheren und Bruch von größeren Bereichen führen. So ist es unerlässlich, dass Pipettieren sanft und mit einem P1000 oder einer serologischen Pipette erfolgt. Für den Neurosphären Pelletierung, sollten niedrigere Drehzahlen (100 X g statt 300 X g) auch Neurosphäre Dissoziation zu verhindern. Während Kugel Beschichtung, sicherzustellen Sie, dass die Kugeln entsprechend beabstandet sind, wie Kugel, Kugel Kontakt Migration beeinflussen kann. In Fällen, in denen Migration zu schnell oder zu langsam ist, kann Inkubationszeit verringert oder erhöht bzw.. Beschichtung der Substrate können auch geändert werden, um Migration Preisänderungen vorbehalten.

Während die Techniken verwendet, schnelle, einfache und auf das Studium der Neuroentwicklungsstörungen anwendbar sind, gibt es gewisse Einschränkungen. Zum einen erfordern viele Analysen (Zelle Nummer Assay, Neurit Assay, Migration-Assay) Ermittler, subjektive Entscheidungen zu treffen (z.B., ist dies ein Neurit? "Ist diese Zelle tot?) potenziell führt Ermittler Voreingenommenheit und unteren Reproduzierbarkeit. Jedoch kann die Durchführung von Analysen blind und strenge Maßstäbe für jede Entscheidung, die innerhalb einer Probe, wie in den Methoden, diese Vorurteile lindern. In ähnlicher Weise erfordern diese Assays manuelle Messungen und Zählungen, die zeitaufwendig und arbeitsintensiv sein kann. Jedoch können in Laboren, die Ausrüstung und technische Ressourcen verfügen, diese Tests beschleunigt werden mit dem Einsatz von automatisierten Zelle Zähler und Programme, die automatisierte Messungen41,42durchführen können. Bei der DNA-Synthese-Assay, diese Methoden sind speziell für unsere Zelle Harvester und funkeln-Maschine (siehe Material und Ausrüstung); Es gibt jedoch andere verfügbare Modelle und Methoden, die verwendet werden können, um die gleichen Informationen, wie z. B. die Inspirationsfilter-95-Zelle-Erntemaschine zu gewinnen. Für einige Institutionen kann die Verwendung von radioaktiven Quellen nicht möglich sein. In diesem Fall wird eine alternative Methode mit einer fluoreszierenden Thymidin analog, wie EdU, analysiert auf einem fluoreszierenden Mikrotestplatte Leser Erwerb derselben Informationen auf Massenanalyse von DNA-Synthese44ermöglichen.

Unsere Low-Density Kultursystem trennt NPCs in Einzelzellen oder kleine Klumpen, eine Bedingung, die unterscheidet sich von der dicht gepackten Natur von NPCs in den Entwicklungsländern Neuralrohr. Dennoch sind die NPCs gesund und ausdrückliche entsprechende Markierungen (Abbildung 1, Abbildung 10). Darüber hinaus unsere früheren Studien von Maus und Ratte kortikale Kulturen zeigen parallel Ergebnisse in in-vitro- Kulturen und in-Vivo -Modelle zeigen, den nutzen und Wert für die Verwendung dieser Ansatz16,17,18 , 19 , 24. Darüber hinaus bietet dieses System einen leistungsfähigen Ansatz zu verstehen, Reifung der Zellen und Sub-Zellpopulationen zu studieren. Zum Beispiel kann Immunohistochemistry Neuriten Test um festzustellen, welche bestimmte neuronale Zelle ein Neurit erweitert durchgeführt werden. Letztlich, trotz einiger Einschränkungen dieses einzigartigen Protokoll einfache, leistungsstarke und schnelle stellt Methoden bereit, um Neuroentwicklungsstörungen zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den Gouverneur von New Jersey Rat für medizinische Forschung und Behandlung von Autismus (CAUT13APS010; unterstützt. CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markiert Familienstiftung, Coverversion Charitable Lead Trust und der jüdischen Gemeinde-Stiftung von größeren MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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References

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