Visualisere intracellulære SNARE handel af fluorescens levetid Imaging mikroskopi

Immunology and Infection
 

Summary

Denne protokol beskriver en ny metode giver mulighed for kvantitative visualisering af komplekse dannelsen af SNARE proteiner, baseret på Förster resonans energioverførsel og fluorescens levetid imaging mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Verboogen, D. R., Baranov, M. V., ter Beest, M., van den Bogaart, G. Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (130), e56745, doi:10.3791/56745 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Opløselige N- ethylmaleimide følsomme fusion protein (NSF) vedhæftet fil protein receptor (SNARE) proteiner er nøglen til membran menneskehandel, som de katalyserer membran fusion i eukaryote celler. SNARE protein familie består af omkring 36 forskellige medlemmer. Specifikke intracellulære transportruter er katalyseret af bestemte sæt af 3 eller 4 SNARE proteiner, der dermed bidrager til specificitet og troskab af membran handel. Men at studere de præcis funktion af SNARE proteiner teknisk udfordrende, fordi snarer er meget rigelige og funktionelt overflødig, med de fleste snarer at have flere og overlappende funktioner. I denne protokol, er en ny metode for visualisering af SNARE kompleks dannelse i levende celler beskrevet. Denne metode er baseret på at udtrykke SNARE proteiner C-terminalt smeltet til fluorescerende proteiner og måle deres interaktion ved Förster resonans energi overføre (FRET) beskæftiger fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). Ved montering af fluorescens levetid histogrammer med en stand i tænderne model, tillader FRET-FLIM (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af SNARE kompleks dannelse på forskellige vesikler. Denne protokol har været anvendt med succes til at visualisere SNARE kompleks dannelse på plasma membran og endosomal rum i pattedyr cellelinjer og primære immunceller, og let kan udvides til at studere SNARE funktioner på andre organeller i dyr, planter og svampe celler.

Introduction

Membran handel er et centralt element i eukaryote celler, hvor membranen vesikler bud ud fra en donor organelle og derefter flytte til og smelter med en target organelle1,2. Med undtagelse af mitokondrier, er alle disse membran fusion trin katalyseret af medlemmer af SNARE protein familie1,2. SNARE protein familie består af omkring 36 medlemmer i pattedyrsceller og ca. 20 i gær2. SNARE proteiner indeholder en eller to ~ 52 rester-lang, indbygget ustruktureret regioner, kaldet SNARE-motiver. SNARE proteiner er ofte bundet til membraner af en C-terminale transmembrane helix1,2. Snarer kan kategoriseres baseret på de centrale rester de bidrager til den komplekse SNARE ind arginin (R) og glutamin (Q) snarer1,2. Membran fusion er drevet af samspillet mellem 3 eller 4 beslægtet snarer, der sammen bidrager 4 SNARE-motiver og er fordelt over både donor og acceptor membran1,2. En SNARE komplekset består af en R-FÆLDE motiv og tre Q-SNARE motiver (betegnes Qa, Qb og Qc). Kompleks dannelse starter på N-termini SNARE-motiver, danner en såkaldt trans-SNARE-kompleks, og provenuet mod C-termini, danner en stram α-spiralformet rullet coil bundt kaldet et cis-SNARE-kompleks. Komplekse dannelsen af endnu en enkelt SNARE komplekse trækker donor og acceptor membraner sammen og overvinder energi barrieren for membran fusion3.

Tildele forskellige SNARE komplekser til specifikke transportruter i cellerne ofte teknisk udfordrende. Selvom snarer klart bidrage til specificiteten af membran handel, de er promiskuøs, funktionelt overflødige, og deres funktioner overlapper1,2. På grund af dette medfører undertrykkelse af netbårne eksperimenter målrettet snarer, som genet knockout, RNA-interferens, indførelsen af blokering antistoffer eller med opløselige SNARE fragmenter som dominerende negativer, ofte ikke klart fænotyper som andre Snarer kompensere2,4. Derudover er det vanskeligt at skelne specifikke membran fusion trin fra opstrøms menneskehandel begivenheder, fordi snarer kan inddrages i flere transport ruter2. Lokalisering undersøgelser af snarer ved mikroskopi metoder, ved hjælp af immunolabeling eller genetiske fusion til fluorescerende reporter proteiner, lider problemerne der: (i) snarer lokalisere til flere organeller som de ofte mægle flere menneskehandel trin, og (ii) deres lokaliseringer ensbetydende ikke automatisk med de er funktionelt involveret i SNARE kompleks dannelse. Endelig SNARE komplekser kan identificeres ved hjælp af immunoprecipitation eksperimenter ved hjælp af en af snarer som agn og andre snarer som mål, men det tillader ikke tildelingen af disse komplekser til specifikke organeller eller smuglerruter. Således i øjeblikket, er der ingen alternative teknik til at visualisere SNARE komplekser med organellar opløsning. Immunfluorescens er ikke i stand til at bevise SNARE interaktioner men kan vise kun tilstedeværelsen eller fraværet af co lokalisering, mens immunoprecipitation kun kan vise SNARE interaktioner i hele celle befolkningen men ikke tildele organeller hvor disse interaktioner forekomme.

For at overvinde disse begrænsninger, var for nylig udviklet en roman metode giver mulighed for kvantitative visualisering af SNARE komplekser i levende celler med organellar opløsning af Verboogen et al. 5 denne metode er baseret på udtryk for par af snarer med spektralt skiftede fluorescerende proteiner smeltet C-terminalt til deres transmembrane skruelinjer. Efter afslutningen af membran fusion og dannelsen af et cis-SNARE komplekse, disse fluorophores på C-termini af de transmembrane helices er straks sammenstillet med hinanden. Fluorophores er så godt i Förster afstand (typisk < 5 nm), resulterende i FRET fra green-skiftet donor fluorophore til rød-forskudt acceptor fluorophore5,6. ÆRGRE resultater i quenching donor fluorophore og en øget udledning af acceptoren fluorophore, der kan måles fra forholdet mellem donor og acceptor emission (ratiometric FRET). Dog ratiometric FRET mellem to forskellige molekyler udfordrende, på grund af fluorescens cross-talk og forskellige niveauer af donor og acceptor snarer på forskellige organeller og blandt celler7,8. FRET kan også måles fra fluorescens levetid, som er tid mellem excitation og emission af en foton. Hvis donor fluorophore kan frigive sin energi af ÆRGRE, denne konkurrerende proces resulterer i en tilsyneladende afkortning af fluorescens levetid. Dette kan måles ved FLIM7,8. Levetid FRET er meget mere robust end ratiometric FRET for måling interaktioner mellem to forskellige molekyler, som fluorescens levetid er en iboende egenskab ved et fluorophore og er ufølsom over for dets koncentration. Derudover er FRET tilnærmelse kvantitative, fordi effektiviteten af FRET er omvendt proportional med den sjette effekt af afstanden mellem donor og acceptor fluorophores (hovedsagelig en step-funktion). Derfor, ved montering af fluorescens levetid histogrammer registreres af FLIM med en dobbelt-komponent henfald model, FRET-FLIM giver mulighed for den (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af SNARE molekyler engageret i SNARE kompleks dannelse5.

For nylig, denne FRET-FLIM metode blev brugt af Verboogen et al. at visualisere SNARE kompleks dannelse i primære dendritiske celler i immunsystemet5. Det var vist, at ved støder en patogene stimulus, dendritiske celler omdirigere deres membran handel ledsaget af en øget kompleksbindende Rasmussen-SNARE vesikel-associerede membran protein (VAMP) 3 med Qa-SNARE syntaxin 4 specifikt på den plasma membran. Denne øgede SNARE kompleks dannelse er sandsynligvis skal opfylde den øgede sekretoriske kapacitet for udskillelsen af inflammatoriske cytokiner som interleukin-65. Denne protokol beskriver de eksperimenterende trin, der bruges til erhvervelse af FRET-FLIM data visualisering og (semi-) kvantitativ måling af SNARE komplekser.Det er forklaret, hvordan til at passe de hele-celle fluorescens levetid histogrammer med mono - og bi-eksponentiel henfald funktioner, resulterer i den tilsyneladende fluorescens levetid som et kvantitativt skøn til SNARE interaktioner. I denne protokol, den udbredte HeLa cellelinie bruges som eksempel, men metoden, der let kan udvides til også for at studere SNARE komplekser i andre eukaryote celler.

Protocol

1. forberedelse af mikroskopet prøver

  1. Udtryk af Qa-SNARE syntaxin 4 sammenvokset til mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; donor fluorophore) og R-SNARE VAMP3 sammenvokset til mCherry (VAMP3-mCherry)
    Bemærk: Andre snarer med fluorescerende proteiner smeltet til deres C-terminal transmembrane helices kan også bruges. I stedet for mCitrine-mCherry, kan andre donor-acceptor par spektralt adskilt fluorophores også være brugt (f.eks.fælles fiskeripolitik-YFP).
    1. Vokse HeLa celler og dele 900.000 HeLa celler over tre 35 mm-diameter glas bund retter egnede til mikroskopi.
      Bemærk: I princippet denne protokol kan tilpasses andre eukaryote celletyper og mikroskopi retter.
      1. Vedligeholde HeLa cellekulturer i T75 kolber med 10 mL af høje glukose Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM), suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% antibiotikum-antimykotikum (indeholdende amphotericin B, penicillin og streptomycin) ved 37 ° C og 5% CO 2 i en celle kultur inkubator.
      2. Genopbygge medium to gange om ugen og opdele celler 1:10, en gang om ugen eller når cellerne kommer 85-90% confluency til nye T75 kolber (500.000 celler/kolbe, i gennemsnit).
      3. Fjerne DMEM og vaske HeLa encellelag to gange med 8 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i 3 min.
      4. Fjerne PBS og der tilsættes 2 mL PBS med 2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA).
      5. Inkuber celler for 5 min. ved 37 ° C og 5% CO2 i celle kultur inkubator og efterfølgende let agitere kolben for at adskille HeLa celler fra bunden af kolben.
      6. Skylle cellerne ud med 10 mL af medium, overføre suspension til en 15 mL tube og fjerne en 10 µL delprøve til optælling.
      7. Fortynd delprøve 1:1 med 0,4% trypan blå plet og tælle celler med en Bürker hemocytometer9.
        Bemærk: Tæller to 4 x 4 firkanter og flere celle antallet af 10.000 for antallet af celler/mL.
      8. Efter celle optælling, tage 900.000 celler fra 15 mL tube, opdele dem over 3 glas bund retter (Se trin 1.1.1) og forberede Transfektion.
    2. Transfect cellerne af elektroporation10 (Se Tabel af materialer) med syntaxin 4-mCitrine konstruktion (donor kun, prøveeksemplar #1), syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (Sample #2), og syntaxin 3 sammenvoksede til både mCitrine og mCherry ( Sample #3).
      Bemærk: Andre celle Transfektion metoder kan også være brugte11. Tandem-konstruktionen i prøve #3 er en positiv kontrol til estimering af den korteste levetid expectable (dvs.maksimal expectable FRET).
  2. Kultur cellerne om natten i høje glukose DMEM leveres med 10% FCS og 1% antibiotikum antimykotikum ved 37 ° C med 5% CO2 i en celle kultur inkubator.
  3. Opsug DMEM og vaske cellerne en gang med levende celle imaging medium (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; Se Tabel af materialer) for 2 min og efterfølgende placere cellerne i frisk billedbehandling medium.

2. optagelse af FLIM Data

  1. Sted prøve #2 under en tid-domæne FLIM Konfokal mikroskop med en pulserende magnetisering kilde for donor fluorophore (dvs., mCitrine) og tidsopløst dataopsamling. Holde cellerne ved 37 ° C med en opvarmet fase.
    Bemærk: Konfokal mikroskop bruges i denne protokol er udstyret med en 63 X 1,20 NA vand fordybelse mål, en pulserende hvide lys laser (80 MHz pulserende, < 100 ps impulslængde), en foton multiplikator tube (PMT), og en Time-Correlated enkelt foton tælle (TCSPC ) system (Se Tabel af materialer til specifik opsætning bruges). Andre FLIM mikroskoper kan også være brugt (f.eks.enkelt-foton lavine dioder (SPAD) i stedet for PMTs, single-bølgelængde pulserende lasere i stedet for en hvid-lys impuls lasere).
  2. Marker en celle med synlige udtryk for mCitrine og mCherry-mærket SNARE proteiner og optage en Konfokal billede af 256 × 256 pixels med samtidige excitation af begge fluorophores før hver FLIM måling. En pixel trin af omkring 2-fold mindre end diffraktion begrænset rumlige opløsning af mikroskop (~ 200 nm) bør anvendes. For mCitrine, begejstre på 516 nm og indsamle emission fra 521-565 nm; for mCherry, begejstre på 610 nm og indsamle emission fra 613-668 nm.
    Bemærk: Må ikke holdning imaging flyet for tæt på bunden af skålen (inden for ~ 2 µm afstand), da dette vil resultere i en refleksion peak i fluorescens levetid histogram. Samtidige excitation af donor og acceptor fluorophores foretrækkes, da det giver mulighed for at overvinde de potentielle problem prøve bevægelighed. Dog kan sekventielle excitation bruges som godt.
  3. Post en FLIM billede ved at klikke på Kør FLIM med FLIM billedet bliver registreret med den samme dimensioner og rumlige opløsning som Konfokal billedet optaget på trin 2.2. Optage billedet mindst 50.000 fotoner til hele-celle FLIM analyse, eller mindst 400 fotoner/pixel. Kun vække mCitrine donor fluorophore og ikke mCherry acceptor fluorophore, og dermed vække på 516 nm og indsamle emission fra 521-565 nm.
  4. Gentag trin 2.1-2.3 for flere celler og for andre prøveeksemplar #1 (donor kun) og prøve #3 (mCitrine-mCherry tandem konstruktion).
  5. Optage et instrument svar funktion (IRF). Tune monochromator af emission detektor til magnetisering bølgelængde (fx, post emission fra 510-550 nm) og derefter optage en FLIM billede med den tilbage spredning fra en ren glas dækning slip ved at klikke på knappen Kør FLIM. Brug den samme excitation bølgelængde (516 nm) og laser power som bruges til registrering af celledata på trin 2.1-2.4.
    Bemærk: Hvis flere toppe er synlige i IRF eller hvis emission monochromators ikke kan indstilles, IRF kan også måles med en opløsning af fluorescerende farvestof med ultrahurtig levetid, for eksempel ved fluorescens dæmper en økologisk farvestof i en mættet vandig løsning af kaliumiodid. Derudover er det ikke strengt nødvendigt at optage et IRF, fordi tænderne hældningen af fluorescens histogrammer kan også monteres uden deconvolution af IRF. Men en IRF gør det muligt for at korrigere for timing Karakteristik af photon detektoren anvendes og gør dermed anfald af levetid histogrammer mere nøjagtige.

3.Konvertering af Photon optagelser til FLIM billeder

  1. Hent og Installer PT32ICS konvertering software5.
    Bemærk: Levetid data kan også analyseres af anden software, herunder software fra flere leverandører, mikroskop.
  2. Konfigurere PT32ICS software.
    1. Angive størrelse på 256 × 256 pixels billedstørrelse via Indstillinger | Størrelse.
    2. Indstil kanal til 2 via Indstillinger | Størrelse.
      Bemærk: Kanal mCitrine emission er udelukkende afhængig af konfigurationen af mikroskopet. En forkert kanal vil resultere i en FLIM billede med ingen fotoner (dvs.sort billede) og som et resultat en tom LifetimeTable.txt-fil. Den korrekte kanal kan identificeres ved hjælp af trial and error.
    3. Indstil Output til ImageJ (xyz) (eller TRI2 (xyt)) til at generere FLIM billeder (trin 3,4).
  3. Tryk på Konverter og indlæse en eller flere photon spor (.pt3 filer). For at vælge flere photon spor, skal du holde tasten Ctrl nede.
    Bemærk: Nyere 64 bit .ptu format kan også blive konverteret.
  4. Sikre, at PT32ICS software genererer følgende filer i samme mappe som hvor pt3 filerne gemmes: en foton stak pr. .pt3 photon spor i billedet flowcytometri standardformat (.ics), en bitmapfil pr. .pt3 photon trace (.bmp), en tekstfil pr. konvertering (_Report.txt) indeholdende oplysninger om photon statistikker (dvs., det samlede antal fotoner i hvert .pt3 photon spor, tidsopløsning af detektor), og en anden tekstfil pr. konvertering (_LifetimeTable.txt) der indeholder samlede Fluorescens levetid histogrammer i tabulatorsepareret format for hver .pt3 photon spor.
    Bemærk: .ics fil kan bruges til enkelt pixel montering for at generere FLIM billeder, for eksempel med TRI2 software12,13 eller SLIM kurven montering bibliotek i FIJI ImageJ14,15. Denne fil kan også bruges til Phasor analyse16, for eksempel med tid Gated Phasor plugin for FIJI fra Spechron. Bitmap-fil indeholder ingen levetid oplysninger. Den anden tekstfil bruges til det hele-celle FLIM analyse i trin 4.

4. montering af fluorescens levetid histogrammer for hele-celle FLIM analyse

Bemærk: Dette trin (deconvoluted montering af IRF) kræver software i stand til at deconvoluted montering. Montering skråningerne af fluorescens histogrammer uden deconvolution af IRF kan gøres med anden software.

  1. Åbn den data analyse softwareprogram der kan montering med deconvolution (Table of Materials) og Importer den fil, der indeholder histogram for hver foton trace (_LifetimeTable.txt) via fil | Import | Enkelt ASCII.
  2. Omorganisere tabellen, at IRF er i den anden kolonne i tabellen (ved hjælp af Kopier og Sæt ind). Placer IRF i den anden kolonne B ved siden af klokkeslætsværdier i den første kolonne A.
  3. Bestemme kvaliteten af de registrerede photon spor ved at vælge alle kolonner ved at trykke på Ctrl + A og vælge Plot | Multi panel | 9 panel. Ikke analysere photon spor med en høj refleksion peak (figur 4F).
  4. Marker alle kolonner, der indeholder kvalitetskontrollerede levetid histogrammer, der vil blive monteret og IRF i kolonne B ved hjælp af Ctrl nøglen og indlæse ikke-lineære montering via analyse | Montering | Ikke-lineære Curve Fit | Åbne dialogboksen.
  5. Indlæse deconvoluted fit funktion (tilgængelig i supplerende fil 1) ved at tilføje denne funktion til analyse software (via kategori | Bruger defineret | Funktion | Tilføj). Vælg filen fit funktion 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Denne funktion passer fluorescens levetid histogrammer med en mono-eksponentiel henfald funktion deconvoluted med IRF (dvs., den anden kolonne B i tabellen) (ligning 1):
    Equation 1(Ligning 1)
    med t tid, τ tilsyneladende fluorescens levetid, A amplitude og y0 forskydningen.
    NOTE: En anden mulighed er at passe levetid histogrammer med en bi-eksponentiel fit funktion (ligning 2):
    Equation 2(Ligning 2)
    Ved fastsættelse af levetiden for komponenten langsom (τ1) til donor eneste betingelse (trin 1.1.2: prøveeksemplar #1) og at dette af den hurtige komponent (τ2) til tandem konstruktion (Sample #3), giver mulighed for vurdering af fraktion af SNARE proteiner i komplekset (F) fra amplituder af de langsomme (A1) og hurtig komponenter (A2; Se diskussion; Ligning 3):
    Equation 3(Ligning 3)
    Filen fit funktion til deconvoluted bi-eksponentiel montering 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' er tilgængelige i den supplerende fil 2.
  6. Vælg monteret kurver | X-datatype som samme som Input-Data.
    Bemærk: Dette vil resultere i den passende x-akse skalering af monteret kurver.
  7. Passe kurver ved at trykke på Tilpas.
    Bemærk: Dette vil konvertere fit og generere en rapport ark i matrixen med en tabel, der indeholder fluorescens levetider, forskydninger og amplituder. Det vil også generere et datablad med monteret kurver og residualer fit.

Representative Results

Begrundelsen for at analyse til måling af SNARE interaktioner af FRET-FLIM er vist i figur 1. C-termini af de transmembrane helices beslægtet SNARE proteiner er smeltet sammen til et par af spektralt skiftede fluorescerende proteiner (fx, mCitrine og mCherry). Dannelsen af en SNG-SNARE komplekse på membran fusion resultater i disse fluorescerende proteiner bliver straks sammenstillet til hinanden og ÆRGRE. Figur 2 viser repræsentative Konfokal billeder af HeLa celler udtrykker fluorescently mærket SNARE proteiner. Vist en celle udtrykker syntaxin 4-mCitrine (donor fluorophore) med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore), samt kontrol betingelser af celler, der udtrykker kun syntaxin 4-mCitrine konstruktion (donor kun, ingen FRET) og syntaxin 3 sammenvoksede til både mCitrine og mCherry i tandem (maksimal expectable FRET). Figur 3 viser den ledsagende fluorescens levetid og FLIM billeder genereret ved at montere levetid histogrammer for hver pixel med mono-eksponentiel henfald funktioner (figur 3A-B) og bi-eksponentiel henfald () funktioner Figur 3 c - D). figur 4A viser IRF af vores setup målt ved tilbage spredning af et mikroskop dækslet glas. I figur 4B-E, repræsentative fluorescens levetid histogrammer af hele cellen FLIM analyse sammen med ledsager fit er kurver for mono-eksponentiel henfald funktioner vist. Figur 4F viser en fluorescerende levetid histogram af et eksperiment, afbildet for tæt på overfladen af mikroskop cover glas, hvilket resulterer i en fremtrædende refleksion peak. Figur 4 g viser en levetid histogram med repræsentant passer med en bi-eksponentiel henfald funktion.

Figure 1
Figur 1: ordning af begrundelsen for at visualisere SNARE komplekser af FRET. (A) strukturelle model af neuronal snarer (protein database 3HD717) vesikel-associerede membran protein (VAMP) 2 (blå; Rasmussen), syntaxin 1 (rød; Qa-SNARE), og SNAP25 (grøn, indeholder både en Qb - og Qc-SNARE motiv). C-terminus af den transmembrane helix syntaxin-1 er konjugeret til mCitrine (donor fluorophore; protein database 3DQ118). C-terminus af den transmembrane helix af VAMP2 er konjugeret til mCherry (acceptor fluorophore, protein database 2H5Q19). (B) ordningen af SNARE medieret membran fusion resulterer i FRET. Efter membran fusion ved stiftelse af et cis-SNARE komplekse, snarer er straks sammenstillet til hinanden resulterer i FRET. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: udtryk for SNARE proteiner smeltet til fluorescerende proteiner. Første kolonne: donor fluorophore, spændt på 516 nm. Anden kolonne: acceptor fluorophore, spændt på 610 nm. (A) Donor kun betingelse. Repræsentative Konfokal billede af en HeLa celler udtrykker syntaxin 4-mCitrine (donor fluorophore; grøn i brevfletning). Acceptor kanalen (anden kolonne) viser fluorescens cross-talk. (B) negativ kontrol (ingen FRET). Repræsentative Konfokal billede af en HeLa celler udtrykker begge syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore, magenta i brevfletning). (C) positiv kontrol (maksimal expectable FRET). Repræsentative Konfokal billede af en HeLa celler udtrykker syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem konstruere. Bemærk, at fluorescens signalet fra mCitrine og mCherry signaler er ikke fuldstændig overlapning, sandsynligvis på grund af en lavere modstand af mCitrine for lysosomale nedbrydning i forhold til mCherry (Se diskussion afsnit). BF: lysfelt. Skalere barer, 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: FLIM billeder af SNARE kompleks dannelse. (A) repræsentative fluorescens levetid billeder af de celler, der er vist i figur 2. Billederne blev genereret ved først at konvertere photon spor registreres af et TCSPC system (.pt3) til det billede flowcytometri standard (.ics) ved hjælp af PT32ICS software. Enkelt pixel monteret fluorescens levetid billeder blev derefter genereret ved hjælp af TRI2 software12,13 med tærskel fra 15-100% intensitet, 7 pixel cirkulære binning og monoexponential montering algoritme (Marquardt). Farven angiver den gennemsnitlige tilsyneladende fluorescerende levetid. (B) FLIM billeder hvor fluorescens levetid billeder (vises i panel A) var højtravende med fluorescens-intensiteten af den mCitrine donor fluorophore (vist i figur 2). Foldning blev udført med FIJI ImageJ ved hjælp af en skræddersyet makro (Se Tabel af materialer). (C) Fluorescens levetid og FLIM billeder af HeLa celler udtrykker både syntaxin 4-mCitrine og VAMP3-mCherry fra paneler A-B, men nu med montering med bi-eksponentiel henfald kurver (med levetider fast kontrol levevilkår; se trin 4.4 i Protocol). Pixel farverne angiver de anslåede fraktioner F af syntaxin 4 i kompleks med VAMP3 (ligning 3). (D) samme som panel B, men for bi-eksponentiel passe. Foldning blev udført med FIJI ImageJ ved hjælp af en skræddersyet makro (Se Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: hele cellen FLIM analyse. (A) instrument svar funktion (IRF) af opsætningen. IRF blev målt ved hjælp af den tilbage spredning på glas-vand interface (ved hjælp af en ren glas mikroskopi fad med vand).(B-E) Hele cellens levetid histogrammer for de celler, der er vist i figur 2 og figur 3. Alle fotoner i billederne var samlet. Kurverne blev deconvoluted med IRF og forsynet med mono-eksponentiel henfald funktioner (ligning 1). For disse celler, fluorescens levetid blev indhentet af 2,82 ns (celler udtrykker kun syntaxin 4-mCitrine, donor kun, bedømmelseskomite B), 2,09 ns (celler, der samtidig udtrykker syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry, bedømmelseskomite C) og 2,08 ns (celler, der udtrykker syntaxin 3 - mCitrine-mCherry tandem konstruere; maksimal expectable FRET kontrol; panelet D). Inlays vise de samme grafer, men nu med logaritmisk skalering af y-aksen. Panel E viser en overlejring af henfald kurver af paneler B-D. (F) eksempel på en fluorescerende levetid histogram indspillet for tæt på overfladen af mikroskop dække slip. Dette resulterer i en stor refleksion peak (afbildet af den gule skraverede område). (G) samme som panel C, men nu passer med en bi-eksponentiel henfald kurve med levetider fast kontrol betingelser (Se trin 4.4 i protokollen). Amplituder af de hurtige (A1) og langsom (A2) komponenter blev 14.42 og 0,01, henholdsvis, hvilket resulterer i en anslået brøkdel af snarer i komplekse F af 0,99 (ligning 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Funktionen fil FLIM_convoluted_IRF venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Funktionen fil FLIM_convoluted_IRF_biexp venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol demonstrerer brugen af FRET-FLIM til visualisering af SNARE interaktioner mellem syntaxin 4 og VAMP3 i live HeLa celler. Syntaxin 4 er en Qa-SNARE protein overvejende at lokalisere på plasmamembran hvor det medierer exocytose1,2,20,21. VAMP3 er en R-FÆLDE, som beskrives primært for at finde på genbrug endosomal rum og formidler handel til andre endosomes samt om plasma membran1,2,20. FRET-FLIM assay kan dog let tilpasses til at studere andre SNARE proteiner. Den eneste betingelse er, at disse snarer indeholder et C-terminale transmembrane helix, hvilket er tilfældet for de fleste SNARE proteiner af langt1,2. Derudover kan protokollen beskrevet her tilpasses til visualisering af SNARE komplekser i alle eukaryote celletype, herunder planter og gær. I denne protokol brugte vi afkortning af fluorescens levetid af donor fluorophore som en foranstaltning af FRET. Som en supplerende tilgang, levetid af acceptoren fluorophore kunne undersøges, fordi den overfølsomme over emission forårsager en særskilt anledning fase som giver utvetydige beviser at resonans energioverførsel opstår.

I øjeblikket, kan FRET-FLIM teknik muligvis ikke visualisere SNARE komplekser i lysosomale rum. For syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem konstruktion, kan mCherry fluorescens ofte findes mere akkumulerede i et juxtanuclear område, hvilket sandsynligvis svarer til lysosomale rum, mCitrine signalet er mere rigelige i cellulære periferien5. En lignende juxtanuclear akkumulering af mCherry i forhold til mCitrine blev observeret, når de samme SNARE proteiner smeltet til disse fluorescerende proteiner var Co udtrykte5. Lysosomer er karakteriseret ved en meget lav pH (< 4) og en høj aktivitet af Proteolytiske enzymer. Juxtanuclear akkumulering af mCherry er sandsynligvis forårsaget af en højere modstand af mCherry fluorophore for lysosomale nedbrydning i forhold til mCitrine fluorophore. Det er ikke på grund af pH-quenching af mCitrine, da juxtanuclear akkumulering af mCherry også sker efter fiksering af celler5. Derved, FRET-FLIM teknik undervurderer mængden af FRET i regionerne juxtanuclear (lysosomale) og dette ville kræve andre fluorescerende reporter proteiner, at overlever de barske betingelser i lumen af lysosomer.

FRET-FLIM i princippet gør det muligt for at opnå en (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af snarer i komplekse5. Som vi forklarede i denne protokol, kræver dette montering af fluorescens levetid histogrammer med dobbelt-eksponentiel henfald funktioner (ligning 2), hvor amplituden af komponenten hurtig er proportional med brøkdel af snarer i komplekse ( Ligning 3). Sådan montering med en to-komponent model er dog teknisk udfordrende. Montering med flere gratis fit parametre (to fluorescens levetider og to amplituder) kræver et meget stort antal fotoner, især da parametrene, der vil påvirke hinanden og små fejl i levetid vil amplituder og vice omvendt. For at overvinde disse montering problemer, fluorescens levetider af den langsomme komponent kan fastgøres til levetid af donor eneste betingelse (dvs.ingen FRET; kun mCitrine nuværende) og af komponenten hurtig til levetid af tandem bygge) maksimal expectable FRET). Men dette skal også tolkes med omhu, fordi fluorescens levetid ikke kan være den samme som i staterne kontrol, og kan afvige på grund af flere årsager (selvstændig quenching, dipol orientering, variationer i mikromiljø). Flere SNARE komplekser i umiddelbar nærhed (< 10 nm) kan resultere i afstand-afhængige FRET, samme princip, der tillader FRET skal bruges som en "Molekylær hersker", men i dette tilfælde tilslører kvantificering af SNARE komplekser. Derudover er et kvantitativt skøn ikke altid meningsfuld, fordi mærket snarer konkurrere med endogene (umærkede) snarer. Som følge heraf er udtryk niveau af mCherry-mærket SNARE en vigtigste faktor for procentdelen FRET5. På grund af alle disse forbehold anbefales det at passe fluorescerende levetid histogrammer med en mono-eksponentiel henfald funktion (ligning 1). Dette har den fordel, at det ikke kræver nogen forudgående viden om levetid og den resulterende tilsyneladende gennemsnitlig fluorescerende levetid giver en solid foranstaltning for SNARE kompleksbindende5.

Ikke desto mindre forventes det, at kvantitative FRET-FLIM billeddannelse af to-komponent montering modeller vil have potent fremtidige ansøgninger. SNARE-kodning gener i kromosomet kan være smeltet med fluorescerende reporter proteiner, for eksempel af CRISPR/CAS9. Dette resulterer i fluorescerende mærkning af endogene SNARE proteiner, med endogene protein niveauer og ingen baggrund af umærket snarer, og giver mulighed dermed for en meningsfuld kvantitative skøn over brøkdel af SNARE komplekser af FRET-FLIM. Mens udtrykket niveauer af endogent snarer kan være ganske lav og give lav relativt fluorescerende signaler, det forventes, at et tilstrækkeligt antal fotoner kan indhentes, især for hele cellen FLIM (som kræver kun et par 1.000 s af fotoner). Desuden kan disse FRET-FLIM målingen foretages med mere følsomme lavine fotodiode detektorer, som medfører også højere fluorescens signaler og bedre photon statistik.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en Hypatia stipendium fra Radboud University Medical Center, en karriere udvikling Award fra Human Frontier Science Program, Gravitation programmet 2013 fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI tilskud fra NWO (ALW VIDI 864.14.001), og en begyndende tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs syvende rammeprogram (Grant aftale nummer 336479).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' Addgene ID 92422 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' Addgene ID 92423 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' Addgene ID 92426 Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes  Willco Wells HBST-3522 Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco, Life Technologies 31966-021
Fetal calf serum Greiner Bio-one 758093
Antibiotic-antimycotic solution Gibco, Life Technologies 15240-062 Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium Thermo Fisher Scientific A14291DJ Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective Leica SP8 Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser Leica SP8 Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system PicoQuant PicoHarp 300
PT32ICS conversion software Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution Originlabs OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity Fiji ImageJ Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer VWR 630-1541
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
PBS B Braun Melsungen  AG 362 3140
EDTA 2 mM Merck 108417 CAS: 60-00-4
15 mL tubes Greiner Bio-one 188271
Trypan blue Sigma Aldrich 93595 CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device Thermo Fisher Scientific MPK5000S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (9), 631-643 (2006).
  2. Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744, (2), 120-144 (2005).
  3. van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3, (4), 204-205 (2011).
  4. Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10, (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
  5. Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
  6. Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33, (13), 5507-5523 (2013).
  7. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21, (11), 1387-1395 (2003).
  8. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  9. JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. (2017).
  10. Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. (2017).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  12. Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).
  13. Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6, (Suppl 1), S93-S105 (2009).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 271-281 (2012).
  17. Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460, (7254), 525-528 (2009).
  18. Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105, (36), 13362-13366 (2008).
  19. Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45, (32), 9639-9647 (2006).
  20. Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317, (13), 1817-1829 (2011).
  21. Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95, (2), 305-312 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics