קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) הם חשיבות רבה תעשיית התרופות כפי שהם מעורבים למחלות רבות כוללות מטרות היטב המאומת התערבות טיפולית. גילוי של תרכובות עופרת, כולל מולקולות קטנות סינתטי, המעכבות באופן ספציפי את הפונקציה של הקולטן, שלב ראשוני חשוב בפיתוח תרופות, מסתמך על-מבוססות תא מבחני רגישות ספציפית, חזקים. כאן, אנו מתארים assay הסלולר קינטי עם readout פלורסנט בעיקר נועדה לזהות היריבים קולטן ספציפי המעכבות תאיים Ca2 + שחרור עורר על הפעלת הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4) על ידי שלה ליגנד אנדוגני, ליגנד כימוקין CXC 12 (CXCL12). יתרון מפתח של שיטה זו הוא כי זה גם מאפשר הקרנה של תרכובות ניחן מהותי במאפייני היתה ללא-חת (קרי, תרכובות העלאת עלייה תאיים Ca2 + ריכוז בהיעדרו של CXCL12) או תרכובות הכוח ויסות פונקציה הקולטן באמצעות אינטראקציה עם אתרי קישור allosteric (כלומר, מאפננים allosteric חיוביים ושליליים (PAMs ו NAMs, בהתאמה)). בצד למטה, autofluorescent תרכובות שעלולות להפריע העתק של וזמינותו, ובכך פוגעות פרשנות הנתונים אמין. קרוב לוודאי assay הזה ניתן ליישם, עם עיבודים מינימלית, כמו assay גילוי תרופה גנרית עבור רבים אחרים GPCRs מהם הפעלת מוביל לשחרור של Ca תאיים2 +.

Introduction

GPCRs הם superfamily חשוב של חלבונים פני שטח התא להפעיל האות התמרה חושית אשדים על איגוד ליגנד חוץ-תאית. הם יכולים להיות מופעל על ידי מגוון רחב של גירויים כולל פפטידים, הורמונים חלבון, אמינים biogenic של שומנים, דבר המתבטא אתחול של מגוון תאיים איתות המסלולים ותגובות ביולוגיות בסופו של דבר1,2 . יתר על כן, GPCRs מעורבים רבים, אם לא כולם, תהליכים פיזיולוגיים התפתחותיים, למחלות רבות קשורים עם ביטוי איתות או קולטן GPCR לקוי. GPCRs ולכן הם בין המטרות תרופתי המאומת ביותר ברפואה1,3.

עם הסלולר מבחני המיון הפעלת הזיהוי של תרכובות כגון מולקולות קטנות, נוגדנים חד-שבטיים פפטידים יכול לווסת את הפעילות של GPCR מסוים מתחיל בדרך כלל, זרימת עבודה גילוי סמים GPCR. קיימים סוגים רבים ושונים של מבחני כדי לחפש תרכובות כגון גילוי סמים GPCR, אשר רובם תואמים קמפיינים ההקרנה באמצע - כדי תפוקה גבוהה. מבחני הנפוצה ביותר נמנים קולטן איגוד ניסויים, זריחה או הפריה חוץ גופית בסיס מבחני איתור תנודות ברמת כביכול משני שליחים (למשל, Ca2 +, אדנוזין מחזורית monophosphate (כח)), פנוטיפי מבחני המיון והגיוס β-arrestin מבחני4. הבחירה עבור סוג מסוים של assay תלויים גורמים רבים, אך גם נקבעת על-ידי ידע מוקדם לגבי מאפייני GPCR נתון איתות. אגוניסט איגוד GPCR גורם לשינוי הסתגלותי ותזרז את חילופי guanidine diphosphate (תמ ג) עבור guanidine טריפוספט (GTP) בα-יחידת משנה של חלבונים heterotrimeric G. לאחר מכן יחידת -GTP משנהαG dissociates של יחידת משנהβγ G, שני subunits תיזום עוד איתות המסלולים. הידרוליזה של מולקולת GTP ושיוך מחדש העוקבים של Gα- תוצר ו- Gβγ subunits יגרום לשחזור החלבון G לתוך שלו לא פעיל קונפורמציה5,6. מבוסס על רצף הדמיון של יחידת משנהα G מוגדרות סוגים שונים של חלבונים ג'י (GsGאני, ג'יקיו, G12/13)7. איתות באמצעות Gα יחידה משנית נותן לעלות מספר תגובות טיפוסיות כגון העלייה (via Gs) או להקטין (via Gאני) של ייצור מחזורי AMP Ca2 + גיוס תאיים (via Gq)5 ,7. Gβγ subunits מסוגלים גם לזירוז אפקטור תאיים מסלולים. למשל, בעת ההפעלה של Gאני-בשילוב GPCRs, Gβγ ישירות יכול לעורר phospholipase C (PLC-β) כדי לייצר אינוזיטול טריפוספט (IP3) שמפעיל את שחרורו של Ca2 + מחנויות תאיים7 . בעקבות הפעלת קולטן, GPCRs הן phosphorylated על ידי kinases GPCR (GRKs) אשר מקדם את האינטראקציה עם β-arrestins. תהליך זה מסתיימת איתות חלבון G ומוביל אל קולטן הקהיה ובסופו של דבר הפנמה. Β-arrestins הם גם מסוגלים להקים מתחמי מולקולרית רב שניתן להשתמש בהם להנעת איתות המסלולים אחרות עצמאית של חלבון G איתות8.

בתוך תת משפחה של קולטני כימוקין, Gאני-CXCR4 בשילוב זה GPCR זה העלה את עניין רב כמטרה מבטיח לגילוי סמים. בהתחשב בתפקיד הוקמה קולטן שותף מרכזי עבור וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1 הפוסט ויראלי, זיהום, תרכובות מיקוד CXCR4 פותחו בתחילה כמו האיידס סמים מועמדים9. לאחרונה, גוף גדל והולך של ראיות יש הצביע על תפקיד חשוב עבור CXCR4 ב tumorigenesis, סרטן גרורות הפיכתה למטרה טיפולית היטב המאומת באונקולוגיה גם10. CXCR4 מתבטא גבוהה יותר מעשרים סוגי סרטן אנושי, פקדים גידול התא הישרדות, התפשטות, ואת ההעברה, כמו גם אנגיוגנזה הקשורות הגידול10. CXCR4 היריבים של מחלקות כימיים שונים בעבר היה מתואר11,12, אלא רק מולקולה קטנה ש-amd3100 כרגע מאושר לשימוש במרפאה כסוכן גיוס תאי הגזע משמש במהלך הטיפול של לימפומה 13,של חולי מיאלומה14. ניסויים קליניים מתנהלות כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של מספר היריבים האחרים של CXCR4 מחלות אנושיות שונות, אך עם דגש חזק על אונקולוגיה12. בהתחשב של יישומים פוטנציאליים רבים עבור CXCR4 היריבים, נדרש לחפש תרכובות הרומן עם המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת, שיפור הזמינות הביולוגית או שעשויות להיות פחות תופעות לוואי.

במסמך זה, קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית הסלולר assay המשמשת בעיקר כדי מסך עבור תרכובות מסוגל עיכוב CXCR4 מתואר. המדד פלורסנט של שיטה זו מבוססת על גידול ארעי תאיים Ca2 + הריכוז עורר על CXCR4 ההפעלה על-ידי אגוניסט אנדוגני שלה, ליגנד כימוקין CXCL12 (המוכרת בשם תאי סטרומה נגזר (1α פקטור SDF1-α)), ועיכוב פוטנציאלי של CXCL12-induced Ca2 + תגובה זו על ידי תרכובות מסוים. זה assay, משמשים תאים גליובלסטומה האנושי U87 stably להביע את הקולטן CXCR4 אנושי. במקביל, תאים אלה חוסר בביטוי אנדוגני של CXCR7, קולטן כימוקין קשורים המאגד גם CXCL1215,16,17. CXCR7 בעבר גם הוכח להיות מסוגל להרכיב heterodimers עם CXCR4, ובכך להתכוונן המאפיינים איתות של זה האחרון קולטן18. תנודות ברמת תאיים Ca2 + מתווכת על-ידי CXCR4 המפוקחים על-ידי טעינת CXCR4 את+ תאים עם אסתר fluo-2 acetoxymethyl (AM), זיקה גבוהה תא חדיר פלורסנט Ca2 +-איגוד לצבוע. Fluo-2 בבוקר הוא מולקולה פלורסנט אורך גל יחיד יכול להתרגש 490 nm בזמן זריחה הפליטה שלו נמדד ב- 520 ננומטר. זריחה פליטה זו עולה על Ca2 + איגוד, עם טווח דינמי גדול בין Ca2 +-מאוגדים, לא מאוגדים המדינה. העלייה ברמת אות ניאון ארעית, המתרחשים בתוך מרווח זמן של כמה דקות, תרקב לאחר מכן. שיא גובה ה"מפה נוספת פליטה פלורסנט עם הרמה של הפעלת קולטן. הבדיקה עצמה מתבצעת באמצעות קורא microplate קרינה פלואורסצנטית מצויד עם מצלמת CCD התעצמה (ICCD) שמחזיק מערכת pipetting משולבת המאפשרת סטנדרטיזציה של המדרגות pipetting ב וזמינותו (ראה טבלה של חומרים) . בנוסף, המדידה בו זמנית של האות פלורסנט בבארות כל של microplate הוא יתרון נוסף מפתח של הקורא פלורסצנטיות המשמש. במהלך הראשון חלק וזמינותו תרכובות תחת חקירה (למשל, פאנל של מולקולות קטנות על ריכוז קבוע או בסדרה דילול) מתווספים אני fluo-2 נטען CXCR4+ U87 תאים ואחריו ~ תקופת דגירה 10 דקות במהלכו ההשפעה היתה ללא-חת הפוטנציאלי של תרכובות נמדד באופן רציף בזמן אמת. לאחר מכן, אגוניסט אנדוגני (קרי, CXCL12) מתווסף לתאים כדי לעורר את גידול ארעי בתיווך CXCR4 של רמת Ca תאיים2 +. במהלך חלק זה של וזמינותו ניתן להעריך את הפעילות אויבת פוטנציאלית של תרכובות שנבדקו. סקירה סכמטי של זרימת העבודה הכללית של וזמינותו מוצג באיור1.

למרות זו Ca2 + גיוס assay שימש בעיקר לזהות ולקבוע את הפוטנציה המעכבת של אנטגוניסטים תחרותיים CXCR4 (קרי, תרכובות למנוע אגוניסט אנדוגני לאגד ולעורר את הקולטן), זה גם ניתן לזהות אגוניסטים לקולטן, בנוסף, תרכובות זה להפעיל את הפונקציה על-ידי איגוד באתרים allosteric (קרי, אתרים שונים טופוגרפית מאתר איגוד orthosteric שנכבשו על ידי אגוניסט אנדוגני). דוגמאות לאפשרות השנייה של תרכובות אגוניסטים allosteric ו-19,PAMs ו NAMs20. ואילו היריבים קולטן ספציפי, כמו גם NAMs לעכב את התגובה CXCL12-induced Ca2 + , PAMs מקדמים תגובה זו (ראה גם הדיון בסעיף). למרות וזמינותו המתוארים בזאת במפורש מטרות CXCR4, הוא צפוי כי בשיטה זו ניתן להחיל על אחרים GPCRs מאמץ מינימלי אופטימיזציה, לפחות אם הם משדרים דרך שחרורו של Ca תאיים2 +.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הפעולות המתוארות לפי סעיפים 1 ו- 2 מתבצעת בתנאים סטריליים ב- cabinet זרימה שכבתית.

1. אחזקה של U87. CD4.hCXCR4 תאים

  1. לגדל תאי T75 מבחנות תרבות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified.
    הערה: במבחנה תא קו בשימוש פרוטוקול זה הוא קו תא גליובלסטומה U87 stably להביע את האשכול של בידול 4 (CD4) ואת בני האדם CXCR4 כבר שתואר לעיל17. הביטוי פני שטח התא של CD4 ו CXCR4 ברציפות מנוטרת על ידי cytometry זרימה, רמות הביטוי נשארת קבועה לאורך זמן (~ 100% CD4+ ו ~ 100% CXCR4+ תאים). תיאור מפורט של הדור של הקו תא בשימוש ואת הנוהל cytometry זרימה לחקור רמות ביטוי הרצפטור אינו בתוך הטווח של פרוטוקול זה.
    1. תת-תרבות תאים ב- 80-85% confluency. אפשר כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר (RT) לפני תא culturing.
    2. להסיר את המדיום תרבות ממוזגים מתאי ולשטוף את טפט תא פעם אחת עם 5 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS).
    3. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, להפיצו באופן שווה על טפט התא. לאחר מכן להסיר את עודף של טריפסין-EDTA, דגירה עד 5 דקות ב 37 ° C עד תאים נתחיל לנתק.
    4. להוסיף 10 מ של מדיום הגידול שלם טרי (של Dulbecco בינוני (DMEM ששינה רשנה) + 10% סרום שור עוברית (FBS) + 0.01 M HEPES + סוכנים הבחירה המתאימה). Resuspend התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. העברה התליה תא צינור סטרילי 50 מ.
    5. לספור את מספר התאים קיימא באמצעות שיטה של בחירה. במקרה של U87 גליובלסטומה תאים, הכדאיות בדרך כלל מגיע ~ 100%.
      הערה: מספרי הטלפון הנייד יכול להיקבע במספר דרכים. אנו משתמשים באופן שגרתי מערכת ניתוח תא אוטומטית בהתבסס על trypan blue מכתים (ראה טבלה של חומרים) על פי תקן שלו טיפול הליכים, אבל אחרים נימוסים אמור לעבוד באותה מידה.
    6. להוסיף 2 x 106 או 3 x 106 תאים (מעשית) נפח סופי של מדיום הגידול טריים 25 מ ל בקבוקון תרבות T75, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
      הערה: אם 3 x 106 תאים משמשים התאים תגיע 80-90% confluency לאחר יומיים. אם 2 x 106 תאים משמשים, הם יגיעו את confluency אותו אחרי 3 ימים. קצב גדילת התאים קודם ייקבע מדעית אם שורות תאים אחרים משמשים.

2. זריעה של התאים עבור Ca2 + גיוס וזמינותו

  1. ביום של תא passaging (יום 0), מעיל עם קירות שחור פוליסטירן 96-ובכן צלחות עם נקי למטה (ראה טבלה של חומרים) עם פתרון ג'לטין 0.1% כדי להקל על התא מצורף.
    הערה: ציפוי של צלחות 96-ובכן עם ג'לטין עשוי להיות מושמט אם הלוחות מצופים מראש, אשר זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים), משמשים. מומלץ להעריך את השימוש צלחות מצופה מראש במקום ציפוי ידני עבור כל קו תא תחת חקירה לפני שתמשיך עם הפרוטוקול.
    1. להכין את הג'לטין פתרון על-ידי הוספת 1 גר' ג'לטין 100 מ ל PBS להשגת פתרון 1%. לדלל על ידי x 10 עם PBS לפני שימוש נוסף. כדי לשפר את המסיסות של ג'לטין, מחממים את הפתרון 37 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 100 µL של 0.1% ג'לטין פתרון לכל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי. תקופת דגירה של 2 h-RT.
  2. בינתיים להכין את התאים זריעה בצלחת 96-ובכן מצופה.
    1. לנתק את התאים הבקבוקון תרבות, resuspend אותם בתוך מדיום הגידול טריים, ולספור אותם באמצעות trypan כחול מכתימה את השיטה.
    2. ספין למטה התאים בשפופרת 50 מל במשך 5 דקות ב 400 g x-RT.
    3. Resuspend התאים מדיום הגידול טריים (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, שום אנטיביוטיקה) כדי להשיג צפיפות התאים של 0.1 x 106 (מעשית) תאים למ"ל.
  3. הסר את הפתרון ג'לטין הצלחות עם קירות שחור עם התחתון ברור על-ידי היפוך יניף וייבוש זה על טישו. הוסף µL 200/PBS כדי להסיר עודפי ג'לטין להתהפך שוב את הצלחת היטב.
  4. לוותר על µL 200 של התליה תא (תואם ל- 0.2 x 105 תאים) לכל טוב בצלחת 96-ובכן מצופים ג'לטין (מעכשיו אחד הצלחת הזו בהמשך יכונו כפי שלוחית"מדידה").
  5. דגירה את הצלחת בן לילה-CO של 37 ° C ו- 5%-2.

3. טעינה של התאים עם פלורסנט Ca2 + -צבע רגיש

  1. יום 1 לבצע בפועל Ca2 + גיוס וזמינותו, החל הטעינה של התאים הזריעה עם פלורסנט Ca2 +-איגוד לצבוע fluo-שתיים בלילה.
    1. היכונו assay מאגר על-ידי הוספת 40 מ"ל HEPES (1 מ') של 200 מ ל האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS, 10 x, אין פנול אדום, ללא סודיום ביקרבונט). מוסיפים מים הנדסה גנטית כדי לקבל נפח סופי של 2 ל' ולהוסיף 4 g אלבומין שור (BSA). להמיס את BSA באמצעות ערבוב מגנטי. להתאים את ה-pH ל 7.4 (עם NaOH) ולסנן את הפתרון.
      הערה: במהלך כל השלבים הבאים המאגר אותו, המכונה "assay מאגר", משמש.
    2. להכין פתרון מניות (4 מ"מ דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) של פלורסנט Ca2 +-רגיש לצבוע fluo-שתיים בלילה. להימנע מחשיפה מוגזמת אור. להמיס 1 מ ג fluo-2 AM (משקל מולקולרי: 1,061 g/mol) ב דימתיל סולפוקסיד µL 235.6.
    3. להכין את הפתרון עובד fluo-2 בבוקר. לצלחת assay 96-ובכן אחד מערבבים µL 12.5 fluo-2 AM מניות פתרון (4 מ מ) ו 12.5 µL nonionic חומרים פעילי שטח polyol (למשל, pluronic f-127) פתרון (20% משקל/נפח דימתיל סולפוקסיד, ראה טבלה של חומרים). הוסף µL 22 של תערובת זו למאגר assay 11 mL בשפופרת 15 מ"ל. הריכוז הסופי של fluo-2 בבוקר הוא 4 מיקרומטר.
      הערה: חומרים פעילי שטח nonionic משמש כסוכן פיזור לשיפור המסיסות מימית fluo-2 בבוקר ו, ב תוצאה, כדי לשפר את התא טעינה. כדי solubilize חומרים פעילי שטח של דימתיל סולפוקסיד, מחממים את המדגם-37 ° C ו לערבב באופן קבוע להשגת פתרון הומוגני.
    4. הסר מדיום הגידול התאים בעבר הזריעה בצלחת 96-ובכן המדידה על-ידי היפוך יניף וייבוש אותו על מגבת נייר.
    5. להוסיף 100 µL של טעינת לצבוע פתרון לכל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי ולאחר תקופת דגירה של 45 min ב- RT בחושך.

4. הכנת 96-ובכן פוליפרופילן לוחות המכילים את CXCL12 כימוקין ליגנד או תרכובות תחת חקירה

  1. להשיג עגול פוליפרופילן (PP) 96-ובכן לוחות (ראה טבלה של חומרים).
    1. לאפשר את הפתרון מניות של CXCL12 (1 מ"ג/מ"ל) והפתרון מניות של תרכובות תחת חקירה כדי equilibrate-RT.
      הערה: הפתרון מניות של CXCL12 מוכן במים הנדסה גנטית בתוספת 0.01% Tween20, המאוחסנים ב-20 ° C כ- aliquots חד-פעמיים.
    2. להכין 5 x תמיסה מרוכזת של CXCL12 במאגר assay (ng/mL 250 אשר שווה 31.25 ננומטר) ו- 5 x דילול מרוכזת של כל המתחם (במאגר assay).
    3. לוותר על הפתרונות מניות לתוך צלחות 96-ובכן מתאימות לפי פריסה מוגדרת מראש צלחת. לוותר על 75 µL/טוב בתוך לוח המכיל CXCL12 ("כימוקין לצלחת"), לוותר על 50 µL/טוב בתוך לצלחת המכילה תרכובות ("מתחם צלחת").
      הערה: שתי תרכובות ורצון CXCL12 סוף סוף להיות מדולל 5 x על dispensing בצלחת מדידה. זה חשוב גם לכלול בארות שליטה שלילי המכיל רק assay מאגר הן את הצלחת מורכבות, כמו גם את הצלחת כימוקין. גם בקרה חיובית בארות צריך להיות כלול (קרי, בארות CXCL12 בצלחת כימוקין, אבל עם מאגר assay הבארות המקביל של צלחת מורכב).

5. פרוטוקול הגדרות על הקורא Microplate קרינה פלואורסצנטית

הערה: הקורא microplate קרינה פלואורסצנטית בשימוש פרוטוקול זה נקרא את הטבלה של חומרים.

  1. לעבור על יחידת קריר יותר של קרינה פלואורסצנטית צלחת קורא קודם, ולאחר מכן לעבור על הקורא פלורסצנטיות עצמה. תן ליזום לכמה דקות לפתוח את התוכנה של המערכת.
  2. ליצור הפרוטוקול של וזמינותו באמצעות תפריט גרור-ושחרר הכולל את השלבים הבאים:
    1. בתיבת "הגדרות", בחר 'Read_Mode' עם אורך גל עירור: 470-495 ננומטר; פליטה גל: 515-575 ננומטר.
      הערה: אורכי הגל שנבחרו מתאימים לשימוש עם Ca2 +-צבע רגיש fluo2.
    2. כוללות תיבת "לערבב עם TF" (העברת נוזל) עבור ערבוב אוטומטי של תרכובות של החובט מורכבים, יושם במיקום מקור 2 של ההתקן (ראה שלב 6.4). בחר µL 15 של פתרון כל טוב באופן אוטומטי aspirated ולהיות מעורב שלוש פעמים. להתאים את גובה הטיפים פיפטה ב 20 µL מתחת לפני השטח נוזלי. לקבוע את מהירות והשאיפה dispensing-µL 50/s.
      הערה: גובה הטיפים פיפטה מתייחס האחסון שנותר מתחת הטיפים פיפטה. למשל, אם הבארות של צלחת מורכבות מכילות 50 µL, גובה 30 µL מקביל µL 20 מתחת לפני השטח נוזלי. הנפח של תרכובת הפתרון שננקטו כדי לערבב, המהירות של ערבוב, המיקום של פיפטה טיפים במהלך ערבוב, המספר של ערבוב מחזורים כל ניתן להגדרה באמצעות התוכנה.
    3. בתיבה "העברת נוזל", הגדר את µL 20 של כל טוב מהצלחת המתחם יועבר על המשקולת מדידה. מקם את הטיפים פיפטה 20 µL מתחת הנוזל לפני השטח דהיינו, גובה 30 µL במהלך השאיפה של תרכובות ועל גובה 60 µL במהלך dispensing בצלחת מדידה. הגדר את מהירות השאיפה-µL 50/s ואת המהירות של מחלק-µL 25/s.
      הערה: הצלחת תרכובת מכילה 50 µL של פתרון לכל טוב (ראה שלב 4.1.3), ובכך בגובה של 30 µL מקביל µL עמדה 20 מתחת לפני השטח נוזלי. הצלחת מדידה יכילו 80 µL assay מאגר לכל טוב (ראה שלב 6.3), ובכך לגובה של 60 µL מקביל עמדה דומה של הטיפים.
    4. בחר בלחצן "קריאה עם TF". במהלך המרווח הראשון, בחר 60 קריאות (מידות פלורסנט) עם זמן מרווח קריאה של הגדרת ס' 1 קריאות 10 נרשמים לפני dispensing של תרכובות המשקולת מדידה ולאחר 50 קורא אחר כך. להגדיר את מרווח הזמן השני עם זמן מרווח קריאה של 30 s ו- 18 קריאות.
      הערה: במהלך שלב זה קרינה פלואורסצנטית תימדד kinetically (במרווחים זמן מוגדר) עבור ~ 10 דקות בסך הכל.
    5. כוללות לחצן "שטיפת טיפים" בפרוטוקול שלוש פעמים. בתוך כל שלב כביסה, בחר את סוג נוזל: נוזל (מים הנדסה גנטית) או נוזל B (70% אתנול), מספר מחזורי השטיפה (1), המשאבה מהירות (מהר), ולשטוף מספר קווים (5) במהלך כל שלב.
      הערה: במהלך הראשון והאחרון שטיפת שלב A נוזל משמש, במהלך הנוזל שלב שטיפה שנייה ש-b משמש.
    6. כוללים את הפונקציה "Pipettor שתיקה". להגדיר את pipettor כדי להשהות 300 s.
      הערה: על-ידי הכללת שלב זה בפרוטוקול, בראש pipettor, אשר משולב המכשיר קורא את הצלחת פלורסצנטיות, תושהה במשך 5 דקות לפני שתמשיך את הפרוטוקול.
    7. כלול בתיבת "לערבב עם TF" כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של הפתרון CXCL12 בצלחת כימוקין, אשר ימוקמו במיקום מקור 3 של ההתקן (ראה שלב 6.4). בחר µL 15 של פתרון כל טוב באופן אוטומטי aspirated ולהיות מעורב שלוש פעמים. במהלך השאיפה ערבוב, הצב µL 20 טיפים פיפטה מתחת לפני השטח נוזלי. המהירות של מחלק והשאיפה שוכן ב- µL 50/s.
      הערה: דומה באשר לשלב 5.2.2, פרמטרים אלה יכול להיות מותאם.
    8. בתיבה "העברת נוזל" עוקבות, הגדר את µL 25 מכל טוב של כימוקין צלחת יועבר על המשקולת מדידה. מיקום טיפים 20 µL להלן הנוזל לפני השטח קרי, על גובה 55 µL במהלך השאיפה מהצלחת כימוקין המכיל µL 75/טוב (ראה שלב 4.1.3), ועל גובה 80 µL במהלך dispensing בצלחת מדידה. הגדר את מהירות השאיפה-µL 50/s ואת המהירות של מחלק-µL 25/s.
    9. כוללות לחצן "קריאה עם TF". במהלך המרווח הראשון, בחר קריאות 145 עם זמן מרווח קריאה של הגדרת ס' 1 5 קריאות נרשמים לפני dispensing CXCL12 המשקולת מדידה ולאחר 140 קורא אחר כך. להגדיר את מרווח הזמן השני עם זמן מרווח קריאה של 6 s ובחרו 20 קריאות.
      הערה: יחדיו, לאורך כל פרוטוקול כולו נרשמים קריאות 243 (מידות פלורסנט): 78 בשלב 5.2.4 ו 165 במהלך שלב 5.2.9.
    10. דומה צעד 5.2.5, כוללים את הלחצן "כבס טיפים" שלוש פעמים בפרוטוקול.
      הערה: כולל את שלב זה בסוף הפרוטוקול מאפשר כי ניתן להשתמש מחדש הטיפים לביצוע assay אחר ללא צורך לשנות את הטיפים.
  3. הגדר את הטמפרטורה של המכשיר ב 37 ° C על-ידי לחיצה על לחצן "קביעת טמפרטורה הבמה" ובחירה 37 מעלות צלזיוס.

6. הפעלת וזמינותו קרינה פלואורסצנטית

  1. לאחר המדידה יש צלחת מודגרות עם טעינת מאגר למשך 45 דקות (ראה שלב 3.1.5) להסיר את המאגר על-ידי היפוך יניף וזה יבש על טישו.
  2. רוחצים את התאים הזריעה על-ידי הוספת µL 150/טוב של מאגר assay את תקופת דגירה של 2 דקות.
  3. הסר את המאגר שוב על ידי flipping יניף. מוסיפים 80 µL טוב assay מאגר עם פיפטה רב-ערוצי.
  4. להכניס את כל הצלחות ההתקן במיקום המתאים שלהם: את הצלחת המתחם במיקום מקור 2, את הצלחת כימוקין במיקום מקור 3, את הצלחת מדידה במיקום קריאה. לשים קופסה של טיפים שחור במיקום טיפים מקור 1. הדלת של המכשיר, תקופת דגירה של 5 דקות לפני שתמשיך את הפרוטוקול.
  5. בחר בלחצן 'פרוטוקול אות בדיקה' כדי לקבוע את הרקע יחידות קלות יחסית (RLUs) ואת השונות פלורסצנטיות יניף. יופיע חלון חדש. בחר "מבחן אות".
    הערה: במהלך שלב זה, RLUs רקע נקבעים על-ידי המצלמה ICCD, משולב בתוך התא אופטיקה של המכשיר קורא זריחה. RLUs אלה כתוצאה עירור של Ca2 +-רגיש צבען (fluo-2) על ידי דיודות (נוריות) פולטות אור (LED פלט גל 470-495 ננומטר). הערכים של 8,000-10,000 RLUs מתאימים היטב עבור יישום זה. RLUs, במידת הצורך, ניתן להתאמה לצרכיו על-ידי שינוי עוצמת עירור (בחר את העוצמה ללא), או שער המצלמה (בחר שער פתוח). השונות יניף אידיאלי צריך להיות פחות מ- 7.5%.
  6. בחר באפשרות "עדכון" אם ערכי הרקע של 8,000-10,000 RLUs מתקבלים. שמור את פרוטוקול הראשי על ידי לחיצה על הלחצן ' שמור '.
    הערה: בכך הגדרות פרוטוקול אות הבדיקה יחולו גם פרוטוקול הראשי.
  7. הפעל את הבדיקה על-ידי לחיצה על לחצן "הפעל".

7. ניתוח נתונים ואיכות

  1. לאחר סיום וזמינותו, פתח את תיבת "ניתוח" בתוכנה של המערכת.
    1. ללכת "הגדר תיקונים" ובחר "תגובה מעל לבסיס השורה". הגדרת קו בסיס 1 להתחיל מדידה 1 וסוף מדידה 5; ידי קרינה פלואורסצנטית רשע יחושב כל היטב בין מדידה 1 ו- 5.
      הערה: כל המדידות נוספת מ מסוים טוב מחולקים לפי קו בסיס זה ספציפי טוב 1.
      1. הגדרת קו בסיס 2 להתחיל מדידה 78 עד מידה 83 (CXCL12 הוא בגליל לאחר מדידה 83; שוב ידי קרינה פלואורסצנטית רשע מחושב בכל טוב בין פקטור תיקון מידות 78, 83, זו חלה על כל המדידות בעקבות מדידה 83).
    2. להפעיל תיבת תקתוק "הצג כאחוזים" ולחסר "רקע".
    3. . לך "הגדר הפחתת קינטי". כדי להעריך את ההשפעה המעכבת של תרכובות על התגובה CXCL12-induced Ca2 + , בחרו ' מקס-מין החל מדידה 84 (קרי, המדידה הראשונה אחרי אשר ויתרו CXCL12) 243 (קרי, המדד הסופי).
      הערה: על ידי בחירת מקס-מין את ההבדל בין התגובה מינימום ומקסימום מעל בסיסית בין מדידה למדידה 84 243 מדווח. אם מקס-מין נבחר מתחיל בין מדידה 11 מדידה 78, ההבדל בין התגובה מינימום ומקסימום מעל בסיסית יחסית בסיסית 1 הוא דיווח. ערך זה יכול לשמש כדי לנתח את הפעילות היתה ללא-חת פוטנציאלי של תרכובות, ראה דיון).
    4. ניתן לאבחן את הנתונים בתוכנה של המערכת. אם יש צורך, לייצא את הנתונים הגולמיים על ניתוח נוסף ופריטים חזותיים בחבילות תוכנה אחרים ניתוח נפוץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההשפעה של גירוי CXCL12-Ca תאיים2 + הגיוס ב- U87. CD4.CXCR4+ , U87. תאי CD4 הוערך עם Ca2 + גיוס וזמינותו. במקום µL 20 של מתחם מבחן זה בדרך כלל יצורפו במהלך השלב הראשון pipetting של הפרוטוקול (איור 1), נוספה assay מאגר אני fluo-2 נטען U87. CD4.CXCR4+ תאים בצלחת מדידה. במהלך השלב השני שחולק, ריכוזים שונים של CXCL12 (0.2-102.4 ננומטר, הריכוז הסופי) היו בגליל בצלחת מדידה. עלייה למינון פלורסצנטיות, מתאם עם עלייה למינון של שחרור Ca2 +, הוכח (איור 2 א). כאן, דגימת בקרה שלילית מייצגת מאותן בארות שבו על שתי תוספות רק assay מאגר נוסף לצלחת מדידה (קרי, 0 nM CXCL12), וכתוצאה מכך בהיעדר תגובה (איור 2 א). כמויות הולכות וגדלות של CXCL12 לגרום רמות גבוהות של קרינה פלואורסצנטית זה ריקבון לאורך זמן (איור 2 א). מנתונים אלה, עקומת תגובת המינון נוצר בהתבסס על "מקס-מין התגובה על בסיס" בין מדידה 84 (קרי, המדידה הראשונה לאחר תוספת CXCL12) מדידה 243 (כלומר., המדד הסופי בפרוטוקול ). באמצעות רגרסיה לא ליניארית, ערך50 EC (קרי, את הריכוז הדרוש כדי לעורר את התגובה מקסימלי חצי) נקבע, מקביל 1.14 nM (איור 2B). אין פלורסנט Ca2 +-הקשורים התגובה היה עורר על-ידי CXCL12, אפילו על ריכוז גבוה (102.4 nM), כאשר U87. תאי CD4 חסר ביטוי CXCR4 פונקציונלי שימשו. זה מדגים הקולטן-יחודיות של המדידה עורר על-ידי CXCL12 (איור 2C).

מפתח יישומים עבור assay מבוססת-תא הזה הוא הזיהוי של מולקולות קטנות המכוון CXCR4 ובעל יכולת עיכוב גיוס2 + Ca CXCL12-induced. אם ניתן לזהות חומרים פעילים ("להיטים"), הם יכולים להיות עוד יותר מאופיינת בדיקות דילולים טורי של המתחם וניתוח את העוצמה מעכבות בפירוט רב יותר. לדוגמה, האפקט של bicyclam AMD3100, מולקולה קטנה ומבוססת CXCR4 ספציפיים אנטגוניסט עם פעילות אנטי-HIV-1 חזק21,22, מודגם באיור3. סדרת ריכוז AMD3100 (n = 4, 3 מיקרומטר עד 1.37 nM ריכוז האחרון בסדרה דילול 1/3) היה ויתרו על U87. תאים CD4.CXCR4+ במהלך השלב הראשון של הפרוטוקול. המתחם הותר ואז דגירה עם התאים עבור ~ 10 דקות שבמהלכו האות פלורסצנטיות הוקלט ללא הרף. ואז 6.4 nM של CXCL12 (50 ננוגרם למ"ל, הריכוז הסופי) נוספה בארות כל צלחת התא בו זמנית לזירוז בתיווך CXCR4 Ca2 + הגיוס. עיכוב למינון של תגובה זו על-ידי דילולים שונים של AMD3100 מוצג באיור 3 א. במקרה זה, מוצג רק את החלק של הגרף בעקבות תוספת של CXCL12. כמו מאגר רק שליטה שלילי (קו כחול) הוחל ב וזמינותו (אין דגירה מראש עם AMD3100, לא CXCL12 הוסיף את הבארות), והתוצאה היא חוסר התגובה הצפויה. הפקד חיובי (הקו האדום) מקביל הדגימות ב- 6.4 לאיזה nM CXCL12 נוספה בארות ללא דגירה מוקדמת של AMD3100 (איור 3 א). בהתבסס על אלה מוגדרים ואתאיזם שולט ז ' הערך ב- assay הזה הוא בדרך כלל בין 0.5 ל- 1. על מנת לקבוע את הפוטנציה המעכבת של AMD3100 עקומת מנה-תגובה נוצר על ידי רגרסיה ליניארי וכתוצאה מכך לתוך ערך מחושב של50 IC של 770.8 ננומטר (איור 3B). כדי להמחיש עוד יותר את אופן הפעולה של תרכובת-פעיל, נכלל maraviroc בניסוי זה. Maraviroc היא מולקולה כימית קטנה במיוחד עיכוב הקולטן כימוקין CC 5 (CCR5) ובכך חוסם (CCR5)-HIV-1 טרופי זיהום23 . אפילו על ריכוז גבוה (10 מיקרומטר ריכוז סופי) אין ההשפעה המעכבת של מתחם זה נצפתה על בתיווך CXCR4 Ca2 + התגובה (איור 3 א).

לבסוף, כדי להדגים כי זו Ca2 + גיוס assay ניתן להחיל גם ללמוד GPCRs אחרים, לדילול טורי ליגנד כימוקין CC 5 (CCL5), ליגנד אנדוגני עבור CCR5, נוספה לתאים לבטא CCR5 (U87. CD4.CCR5+) באמצעות בדיוק באותם תנאים ניסיוני הגדרות חומרה. למינון פלורסנט Ca2 + תגובה הוכח לאחר תוספת של טורי לדילול CCL5 (איור 3C). בנוסף, ובניגוד שלה השפעה על CXCR4, דגירה מראש עם 100 ננומטר (ריכוז סופי) של maraviroc עכבות חריפה תגובה זו (איור תלת-ממד).

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטי של זרימת העבודה של וזמינותו. על יום 0 תאים לבטא את GPCR עניין (במקרה זה CXCR4) הם נזרע בתוך צלחות 96-ובכן עם קירות שחור עם התחתון ברור, גדלים בין לילה-37 ° C ו- 5% CO2. יום 1 מתבצע מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + וזמינותו. תאים נטענים קודם עם פלורסנט Ca2 +-צבע רגיש (fluo-2 AM) ו הדגירה למשך 45 דקות ב RT בחושך. "כימוקין צלחת" ו "צלחת מתחם" מוכנים (PP = פוליפרופילן). לאחר דגירה עם טעינת לצבוע, תאים הזריעה נשטפים פעם עם מאגר assay (150 µL טוב) לאחר מכן יתווסף µL 80/טוב של מאגר וזמינותו. כל הצלחות ואז מודגרת למשך 5 דקות במכשיר ב 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים וזמינותו. לאחר מכן, תרכובות עניין (למשל, מולקולות קטנות) הם ויתרו על הריכוז הרצוי לתוך הבארות של צלחת המדידה ואת רשאית תקופת דגירה של ~ 10 דקות בזמן זריחה נמדד באופן רציף. בשלב הבא, ריכוז קבוע של אגוניסט אנדוגני של GPCR (CXCL12 כאן) מתווסף לעורר שחרור2 + Ca, קרינה פלואורסצנטית נרשם עוד יותר לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: פעילות אגוניסט של CXCL12 על CXCR4+ תאים וספציפיות של התגובה שזוהו. (א) השפעת למינון CXCL12 על Ca2 + הגיוס ב- U87. תאים CD4.CXCR4+ . (B) מבוסס על התגובה מקס-מין בסיסית בין מדידה 84 ועל 243 עקומת מנה-תגובה נוצר הערך50 EC מחושב (n = 4, זאת אומרת ± SD). (ג) אין תגובה היה שנגזרות CXCL12, כאשר זה היה ויתרו על U87. תאי CD4 חסר CXCR4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: איור של ההשפעה של אנטגוניסט CXCR4 (AMD3100), תרכובת-פעיל (maraviroc) על CXCR4+ תאים והפעלה של CCR5 על ידי אגוניסט אנדוגני שלה, CCL5. (א) למינון ההשפעה המעכבת של AMD3100 על Ca2 + גיוס עורר על-ידי הוספת 6.4 nM CXCL12 U87. תאים CD4.CXCR4+ . Maraviroc (ב 10 הריכוז הסופי של מיקרומטר) הראה השפעה המעכבת על התגובה CXCL12-induced Ca2 + . (B) מבוסס על התגובה מקס-מין מעל בסיסית בין מדידה 84 ו- 243, נוצר מעגל מעכבות מנה-תגובה, הערך50 IC חושבה להיות 770.8 ננומטר (n = 4, זאת אומרת ± SD). (ג) למינון הפעלה של CCR5 על ידי אגוניסט אנדוגני שלה, CCL5. (ד) עיכוב של התגובה2 + Ca בתיווך CCR5 על ידי דגירה מראש של התאים עם 100 ננומטר של maraviroc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 +-גיוס assay המתוארים בזאת שהוצג בעבר להיות כלי חשוב כדי לזהות ולאפיין את היריבים קולטן מיקוד CXCR417. הוא, עם זאת, צפוי כי בשיטה זו ניתן באופן כללי יותר להחיל על קבוצה גדולה של אחרים GPCRs המפעילות Ca2 + שחרור cytosolic בעת ההפעלה שלהם, כמופיע עבור כימוקין קשורים הקולטן CCR5. ואילו במקרה של CCR5 בדיוק באותם תנאים ניסיוני יכול להיות מיושם, מספר שלבים בפרוטוקול (למשל, מספר הטלפון הנייד-ציפוי, העמסה של התאים עם צבע פלורסנט) יהיה צורך אופטימיזציה מחדש לפני העברת וזמינותו כדי GPCRs אחרים על מנת לקבל יחס אות לרעש חיובית. נושא חשוב כאן הוא גם מבחר מתאים במבחנה הסלולר מארח המאפשר ביטוי ברמה גבוהה GPCR של עניין פונקציונלי צימוד על מסלול2 + Ca. במקרה של CXCR4, תאים אנושיים גליובלסטומה U87 נבחרו בגלל: (1) חוסר אנדוגני ביטוי של CXCR7 (כימוקין קשורים קולטן הממלאת אגוניסט אותו כמו CXCR4), (2) יכולת הזוג CXCR4 ההפעלה כדי Ca2 +-איתות מסלול, (3) הטווח הדינמי חיובית של התגובה פלורסנט שהושג לאחר טעינה של התאים עם Ca2 +-צבע רגיש, (4) שדבקו מעולה וזמינותו צלחות מזעור תא הפרעות במהלך ההליך. כל הפרמטרים הללו ייתכן שתצטרך השפעול לקבוע עבור כל הרומן GPCR עניין ואת כל מערכת ביטוי הסלולר.

בעת הגדרת וזמינותו דומה עבור GPCR אחר, מספר צעדים חלופיים או ריאגנטים בפרוטוקול יכול להיחשב. למשל, אחרים Ca2 +-רגיש fluorophores (למשל, fluo-4, fluo-3) עשויה לשמש בתור חלופה עבור fluorophore (fluo-2) בשימוש בפרוטוקול זה. במקרה של תאים באופן רופף הקפדה, שטיפה של התאים עשוי להיות מושמט על ידי החדרת צבע לא-השטיפה כדי למזער את התא הם מוציאים24. בנוסף, למעט השלב כביסה פרוטוקול יוביל להאצה נוספת התפוקה של וזמינותו. למרות assay הזה יכול להתבצע גם עם תאים מציג ביטוי אנדוגני CXCR4, למשל כולל מספר סוגים של סרטן אנושי תא קווים10,25, יצוין כי עם תא stably transfected קווים GPCR גבוהה ניתן להשיג רמות ביטוי זה נשאר יציב לאורך זמן. התוצאה תהיה יותר מבוטא assay מדידות, חלון גדול לפרשנויות נתונים אמינים, ועקבית assay ביצועי לאורך תקופות ארוכות יותר. בעת שימוש בתאים endogenously לבטא CXCR4 זה יהיה הרבה יותר קשה להשיג את התוצאה הזאת.

חיסרון גדול של וזמינותו הוא זה מסתמך על פלורסצנטיות מדידה. לפיכך, תרכובות autofluorescent יכולים להפריע המדידה של וזמינותו, אשר אינה ניתוח בשל פרשנות הנתונים לא אמין. בנוסף, זו Ca2 + גיוס assay אידיאלי מתבצעת באמצעות הנייד מצויד עם מערכת pipetting משולבת המאפשרת ערבוב מתוקננת, dispension של תרכובות אגוניסט קולטן המשקולת מדידה בכל מערכת הסינון בארות בו זמנית. וזמינותו, עם זאת, ייתכן מותאם לשימוש עם השני, פחות קרינה פלואורסצנטית יקר הקוראים microplate עם יכולות מדידה קינטי. התוספת של תרכובות אגוניסט היה אז צריך להתבצע באופן ידני באמצעות פיפטות רב-ערוצי, אשר יגדיל את הידיים-על-הזמן, מוריד את התפוקה של וזמינותו. יתר על כן, קבלת מספר דומה של מדידות קרינה פלואורסצנטית בתוך מרווח זמן נתון של assay קינטי יהיה קשה להשיג כמו קוראים רבים microplate למדוד אותות טוב-מאת-טוב ואילו מערכות הקרנה באיכות גבוהה למדוד כל בארות בעת ובעונה אחת.

היריבים קולטן מניעת איגוד קולטן והפעלה הבאים על ידי אגוניסט אנדוגני (CXCL12) כיום יוצרים את הקטגוריה הראשית של תרכובות המכוון CXCR411,12. AMD3100, מולקולה קטנה שבה השתמשת כדי להמחיש את הביצועים של Ca2 + גיוס וזמינותו, היא אחת הדוגמאות הבולטות ביותר של היריבים CXCR426. מלבד היריבים קולטן, מולקולות GPCR איתות אחרת המסדירים להעלות כלליות של תחומי עניין גם כן. מולקולות אלה כוללים אגוניסטים ההופכי, כמו גם GPCR PAMs NAMs19,20,27. תכונה מעניינת של וזמינותו תיאר כתב יד זה היא כי זה לא רק יכול לזהות היריבים קולטן, אבל גם אגוניסטים, מאפננים allosteric. עם זאת, כמה עיבודים קלים assay, מגבלות צריך להילקח בחשבון.

PAMs ו NAMs לאגד אתרי הקולטן ברורים טופוגרפית מאתר איגוד orthosteric שנכבשו על ידי ליגנד אנדוגני של הקולטן. ואילו PAMs להגביר את עוצמת האנרגיה ו/או יעילות של ligand(s) הקולטן אנדוגני, NAMs לעכב את עוצמת האנרגיה ו/או יעילות של19,ligand(s) אנדוגני20. PAMs יש אין פעילות אגוניסט מהותי. הם פעילים רק בנוכחות אגוניסט אנדוגני, בניגוד אגוניסטים allosteric כביכול. כיוון allosteric GPCR מאפננים היה לעורר פחות תופעות לוואי מאשר היריבים קולטן קלאסית בעת החלת הגדרות קליניים28,29, הן כלים תרופתי יקר. ב שלנו assay, אגוניסטים allosteric היה לעורר גידול ארעי של האות פלורסצנטיות מיד עם תוספת CXCR4+ תאים. קולטן יחודיות של האות הזה ואז ייקבע על-ידי בדיקת באותו המתחם עם וזמינותו אותו, אבל על תאים חסר CXCR4. בעת הקרנת במיוחד עבור PAMs, ריכוז נמוך של אגוניסט אנדוגני צריך לשמש וזמינותו כדי לגרום לתגובה2 + Ca פלורסנט. למרות כמות זו נמוכה יותר של אגוניסט יפיק אות פלורסנט קטנות יותר, זה משאיר חלון גדול יותר כדי לזהות גירוי קולטן נוספים. בדרך כלל, ריכוז אגוניסט המתאים לערך EC10- EC30 של קולטן לגירוי נבחר30,31. תוספת של פאם במהלך החלק הראשון של וזמינותו לא כתוצאה מדידה פלורסנט מוגברת. עם זאת, Ca2 + האות פלורסנט לאחר גירוי עוקבות של הקולטן עם אגוניסט אנדוגני שלה יגדל. באופן דומה, נאם אינו משנה את המדידה פלורסנט לפני חיבור אגוניסט, אך לעכב התגובה של הקולטן לאחר תוספת של אגוניסט. לפיכך, לפרופיל הפעילות של אנטגוניסט, נאם ייראה דומה. שניהם יגרום עיכוב של התגובה פלורסנט לאחר תוספת אגוניסט. לכן, עוד מחקרים ניסיוניים נדרשים להפלות בין אנטגוניסט של נאם. כאן, קולטן איגוד לימודי לפיה תרכובות ללא תווית להתחרות עם כמות קבועה של תווית CXCL12 עבור איגוד בגיל17,CXCR432 יכול להיות אסטרטגיה יקר להפלות בין אנטגוניסט, שימנעו מתויג אגוניסט מ מחייב את הקולטן, נאם זה לא כפי שזה לא לחלוק את אותו אתר איגוד קולטן.

פעילות עצמאית (או הבסיס או מכוננת) ליגנד GPCRs נצפתה עבור GPCRs רבים33 למרות רמת הפעילות הבזליים בדרך כלל נמוכות למדי כאשר GPCRs באים לידי ביטוי recombinantly27. פעילות GPCR הבסיס יכול להיות מוגברת על ידי באופן טבעי מוטציות33 מוטציה שמוביל CXCR4 הבזליים מוגברת פעילות כבר תיאר קודמות34. על ידי צימוד זה מוטציה CXCR4 צורונים פעילים אל השביל התגובה פרומון ב שמרים על ידי איגוד GTPγS [35S] ניסויים, זה הוצג T140 הזה, אנטגוניסט CXCR4 מבוססת על פפטיד עם האיידס חזק פעילות17,35 ירד באופן משמעותי פעילות זו הבזליים, ובכך הראו להתנהג כמו אגוניסט ההופכי34. ראוי לציין, ב Fura-2 מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס assay המחברים אותו נצפתה ירידה ארעי קטן ב Ca2 +-זריחה קשורים בעקבות תוספת של T140 לתאים להביע מוטציה CXCR4, רומז ירידה של הבסיס פעילות הקולטן34. עם זאת, כאשר ניתוח לוח נוסף של מחזורי מבוססי pentapeptide CXCR4 הופכי אגוניסטים תוכנן מן T140, גילוי של פעילות הבזליים מופחתת עם Ca2 + גיוס assay היה פחות ברורה36. כאשר השפעת T140 על תאים המבטאים פראי סוג CXCR4 נותחו באמצעות Ca2 + גיוס וזמינותו כמתואר בכתב היד, אין שינוי אות פלורסצנטיות הבזליים נצפתה17. יתר על כן, תנודות זריחה מהר ארעי, העלאות Ca הבזליים2 + , למשל, לא נצפו בתאים המבטאים G צורונים פעיליםαq-בשילוב קולטנים4. יחדיו, ההשפעה של אגוניסטים הופכי יהיה קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי לזהות ולהעריך באופן אמין עם assay שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות אריק Fonteyn, מירב ניצן שופס לסיוע טכני מעולה. עבודה זו בתמיכתם של לופן KU (מענק. לא. PF/10/018), voor Fonds Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, להעניק. לא. G.485.08), וואדוז Dormeur את Fondation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics