キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

Medicine

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Summary

説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2 +放出を刺激します。

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Claes, S., D'huys, T., Van Hout, A., Schols, D., Van Loy, T. A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators. J. Vis. Exp. (132), e56780, doi:10.3791/56780 (2018).

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Abstract

彼らは多くの疾患に関与している、よく検証された治療的介入の対象としては G タンパク質共役受容体 (Gpcr)、製薬業界にとって非常に重要です。小さく総合的な分子、受容体の機能を阻害する具体的を含む、リード化合物の発見は新薬開発の重要な最初のステップは、敏感な具体的で、堅牢な細胞ベースのアッセイに頼る。ここで、によって運動アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) の活性化に誘発される細胞内の Ca2 +放出を抑制する受容体の拮抗薬を識別するために主に設計されている蛍光読み出しと説明、内因性リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)。この方法の主な利点は、また組み込みの敵対プロパティ (すなわち、化合物の細胞内 Ca2 +濃度がない場合 cxcl 12 の増加を誘発) 又は化合物に恵まれている化合物のスクリーニングできます。アロステリック結合部位との相互作用を介して受容体の機能を調節すること (すなわち、正と負のアロステリック変調 (Pam と NAMs、それぞれ))。ダウン側に蛍光化合物は、アッセイの読み出し、それにより信頼性の高いデータの解釈を妨げると干渉する可能性があります。最も可能性の高いこのアッセイとして実装できます、最小限の適応するの活性化は、細胞内 Ca2 +のリリースにつながる他の多くの Gpcr のジェネリック医薬品検出アッセイ。

Introduction

Gpcr は、細胞外リガンド結合に伴うシグナル伝達カスケードを活性化する細胞表面タンパク質の重要なスーパーファミリーです。彼らは多様な細胞内シグナル伝達経路、最終的に生体反応1,2 の開始で起因するペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン、脂質などの刺激の大きい変化によってアクティブにできます。.また、Gpcr が場合すべてではない発達的および生理学的プロセスの多くでは、関与している、多くの人間の病気は機能不全の GPCR シグナリングまたは受容体発現に関連付けられています。Gpcr したがって医学1,3で最も検証された薬理学的ターゲット中です。

通常、GPCR 創薬探索ワークフローは細胞スクリーニング アッセイなど小さな分子、モノクローナル抗体と特定の GPCR の活性を調節することができるペプチド化合物の識別を有効にすると起動します。ほとんどは、GPCR 創薬アッセイの多くの異なる種類が存在そのような化合物を検索する、半ば-に高スループットス クリーニング キャンペーンと互換性があります。最もよく使われるアッセイは、受容体結合実験蛍光または発光ベースのいわゆる二次メッセンジャーの (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (AMP))、表現型レベルの変動を検出の試金スクリーニング アッセイと β アレスチン募集4をの試金します。特定タイプの試金のための選択は複数の要因によって決まるかもしれないが、または、特定の GPCR シグナリングのプロパティに関する事前の知識によって決まります。アゴニスト GPCR に結合は、ヘテロ三量体 G 蛋白の α サブユニットにグアニジン二リン酸 (GDP) グアニジン三リン酸 (GTP) のための交換の触媒構造変化を誘導します。その後 Gα-GTP サブユニットは Gβγサブユニットから分離し、両方のサブユニット、さらにシグナル伝達経路を開始します。加水分解 GTP 分子と Gα会のそれに続く再 GDP と Gβγサブユニットが復元の G 蛋白質の使用頻度の低い構造5,6に。基づく Gαサブユニットの配列類似性で G タンパク質の種類が定義され (GsG はGq、G12/13)7。Gαを介してシグナル伝達サブユニットを与える (Gs) を介して増加などいくつかの典型的な応答に上昇またはサイクリック AMP 生産と細胞内 Ca2 +動態 (Gq) 経由の (G) を介して減少5 ,7。Gβγサブユニットは、細胞内エフェクター経路を誘発することがあります。G はの活性化の時に、例えば、-結合 Gpcr、Gβγがホスホリパーゼ C (PLC β) イノシトール三リン酸 (IP3) を生成する7 細胞内ストアからの Ca2 +放出をトリガーするを直接刺激できます。.受容体の活性化、次の Gpcr は GPCR キナーゼ (GRKs) β-arrestins との相互作用を促進するリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達を終了し、受容体の脱感作と最終的に内面化に 。Β arrestins は G タンパク質シグナル8に依存しないその他のシグナル伝達経路を引き起こすことができる多分子複合体を形成することがあります。

ケモカイン受容体、Gの亜科内-結合 CXCR4 は GPCR 創薬のための有望なターゲットとして多くの関心を引き起こした。ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の 1 の主要な共受容体としての確立された役割を与えられたウイルスや感染症, CXCR4 をターゲット化合物最初抗 HIV 薬候補9として開発されました。最近では、証拠の成長するボディを指摘している重要な役割 CXCR4 の腫瘍もよく検証された治療上のターゲットを作る腫瘍や癌の転移で10。CXCR4 は、高いひと癌とコントロール腫瘍細胞の生存、増殖、移動および腫瘍関連血管新生10の 20 以上の種類で表されます。CXCR4 アンタゴニストの異なった化学クラス説明11,12, AMD3100 は、リンパ腫の治療中に使用される幹細胞動員エージェントとしての診療所で使用するため承認されています小さな分子のみがされていた骨髄腫患者13,14。臨床試験は、継続的な安全性と他のいくつかの CXCR4 アンタゴニスト腫瘍12に重点が異なる疾患での効果を評価します。CXCR4 アンタゴニストの多くの潜在的なアプリケーションを考えると、改善された薬物動態的特性、バイオアベイラビリティを改善した、または可能性があります少ない副作用と新規物質の探索が必要です。

ここで、キネティック蛍光ベースのアッセイは、主に使用 CXCR4 を妨げることができる化合物をスクリーニングを説明。このメソッドの蛍光測定に基づいてその内因性アゴニスト、ケモカイン リガンド (以前として知られている間質細胞由来因子 1 α (cxcl 12 CXCR4 アクティベーション時に誘発される細胞内 Ca2 +濃度の一時的な増加SDF1-α))、および潜在的な特定の混合物によってこの cxcl 12 による Ca2 +応答抑制。このアッセイ人間 CXCR4 受容体を安定に発現する U87 ひと膠芽腫細胞を使用します。同時にこれらの細胞は、CXCR7、また連結 cxcl 1215,16,17関連ケモカイン受容体の内因性表現を欠いています。CXCR7 以前も示されている CXCR4 とヘテロを形成できるとそれによってこの後者の受容器18の信号の特性を調節すること。細胞内 Ca2 + CXCR4 による媒介のレベルの変動は、CXCR4 を読み込みによって監視される蛍光 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) エステル、細胞膜透過性の高い親和性蛍光 Ca2 +による細胞の+ -色素を結合します。蛍光色 2 AM は 490 で励起されることができます単一波長の蛍光分子 520 でその発光蛍光を測定しながら nm nm。この発光蛍光 Ca2 +結合、Ca2 +の間の広いダイナミック レンジを増加-バインドし、非連結状態。蛍光信号の増加は一時的なもので、数分の時間間隔内で発生する、その後崩壊します。受容体活性化のレベルと蛍光放出さらに相関のピーク高さ。アッセイのピペッティングの手順の標準化を可能にする統合ピペッティング システムを所有している激化 CCD (ICCD) カメラを装備して蛍光マイクロ プレート リーダーを用いて自身を分析 (材料の表を参照).さらに、マイクロ プレートのすべての井戸の蛍光信号の同時測定は、使用される蛍光リーダーのもう一つ重要な利点です。最初の調査 (例えば、小分子固定濃度、希釈系列のパネル) 化合物は蛍光 2 AM に追加される試金の一部ロード CXCR4+ U87 細胞が続いて、~ 10 分潜伏期間中には、化合物の潜在的な敵対効果継続的にリアルタイムで測定されます。その後、内因性アゴニスト (すなわち、cxcl 12) CXCR4 を介した細胞内 Ca2 +のレベルの一時的な増加を換起するセルに追加されます。アッセイのこの部分の間にテストされた化合物の潜在的な敵対的活動を評価できます。図 1として概略試験の一般的なワークフローを説明します。

この Ca2 +動員アッセイは、識別し、競争力のある CXCR4 アンタゴニスト (すなわち、バインドし、受容体を刺激する内因性アゴニストを防ぐ化合物) の抑制の効力を決定に主に使用されていますがそれも受容体アゴニストを識別することができ、さらに、化合物のアロステリック サイト (すなわち、内因性アゴニストによって占められる orthosteric 結合部位とは異なる地形的サイト) で結合することによりその機能を発揮します。化合物の後者のカテゴリーには、アロステリック アゴニストおよび PAMs と NAMs19,20があります。PAMs がこの応答を強化する一方、特定の受容体拮抗薬として NAMs cxcl 12 による Ca2 +応答を阻害するが、(また見なさい議論セクション)。このメソッドは、少なくとも最小限の最適化の努力で他の Gpcr に適用できるが予想されるが、アッセイは、特にターゲット CXCR4 を記載、彼らは細胞内 Ca2 +のリリースを介して信号する場合。

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Protocol

注: 1 と 2 のセクションで説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。

1. U87 のメンテナンス。CD4.hCXCR4 セル

  1. 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコで細胞を成長します。
    注: このプロトコルで使われる培養細胞のラインは安定に発現する分化 4 のクラスター (CD4) と人間 U87 膠芽腫細胞株 CXCR4 と前述の17をされています。CD4 と CXCR4 の細胞表面発現をフローサイトメトリーによる常時監視し、表現のレベルは常に一定 (~ 100 %cd4+と 〜 100 %cxcr4+細胞)。受容体発現レベルを調査する流れ cytometry プロシージャの使用されているセルの行の世代の詳細な説明は、このプロトコルの範囲内ではありません。
    1. 80-85% の confluency にサブカルチャーのセルです。細胞培養する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。
    2. セルから条件培を外し、5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でセル単一層を洗います。
    3. 0.25% トリプシン-EDTA の 3 mL を追加し、単層細胞に均等に配布します。トリプシン-EDTA の過剰を削除し、セル開始をデタッチするまで、37 ° C で最大 5 分を孵化させなさい。
    4. 完全な新鮮な成長媒体 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) + 0.01 M HEPES + 適切な選択エージェント) の 10 mL を追加します。上下に軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。50 mL の滅菌チューブに細胞懸濁液を転送します。
    5. 選択したメソッドを使用して実行可能なセルの数をカウントします。U87 膠芽腫細胞の場合生存率は一般的に達する 〜 100%。
      注: セルの番号は、いくつかの方法で決定できます。我々 は定期的にトリパン ブルー染色 (材料の表を参照) に基づく自動細胞解析装置を使用してその標準処理手順、しかし他のマナーによると同様に動作するはずです。
    6. コート t75 フラスコ培養用フラスコの 25 ミリリットル新鮮な成長培地の最終巻に 2 × 106または 3 x 106 (実行可能な) セルを追加し、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
      注: 3 x 10 の6セルを使用するかどうか、電池が 2 日後 80-90% の confluency に達するでしょう。2 x 10 の6セルを使用している場合彼らが 3 日後に同じ密度に到達します。細胞の成長率は必要があります他のセルの行を使用する場合にまず経験的に定められます。

2. Ca2 +動員アッセイ用細胞の播種

  1. 細胞継 (0 日目) で、コートを黒壁付きのポリスチレン 96 ウェルのプレートの日 (材料の表を参照) を下細胞付着を容易にするために 0.1% ゼラチン液と。
    注: 塗装版とは、市販 (材料の表を参照) を使用している場合は、ゼラチンで 96-ウェル プレートのコーティングを省略可能性があります。各セルライン プロトコルで続行する前に調査の下で手動コーティングの代わりにあらかじめコーティング プレートの使用を評価することをお勧めします。
    1. ゼラチン 1 g を 100 mL の PBS 1% 解を得るために追加することによってゼラチン溶液を準備します。さらに使用する前に PBS で 10 倍に希釈します。ゼラチンの溶解度を高めるためには、熱の 37 ° c. への解決策
    2. マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートのウェルあたり 0.1% ゼラチン溶液 100 μ L を追加します。室温 2 時間インキュベートします。
  2. 一方で、コーティングの 96 ウェル プレートでシードにセルを準備します。
    1. 細胞培養用フラスコからをデタッチし、新鮮な培地にそれらを再停止しなさい、それらを数えるトリパン ブルー染色法を用いたします。
    2. 室温 400 × g で 5 分間 50 mL のチューブに細胞をスピンします。
    3. 新鮮な培地に細胞を再懸濁します (DMEM + 10 %fbs + 1 %hepes、抗生物質) 106 (実行可能な) 細胞/mL x 0.1 の細胞密度を得るため。
  3. 透明な底の黒い壁板から、板の上を反転させて組織の乾燥ゼラチン溶液を削除します。200 μ L/ウェル余分なゼラチンを削除し、再びプレートを裏返して PBS を追加します。
  4. ゼラチン コーティング 96 ウェル プレートのウェルあたり (0.2 x 10 の5セルに対応) 細胞懸濁液 200 μ L を分注 (今から 1 つこのプレートは呼ばれます「測定プレート」として)。
  5. 37 ° C、5% CO2で一晩プレートを孵化させなさい。

3. 蛍光 Ca2 +細胞の読み込み-敏感な染料

  1. 1 日目に実行実際 Ca2 +動員アッセイ、蛍光 Ca2 +とシードのセルの読み込みから始まる-バインド染料蛍光 2 AM。
    1. 40 mL HEPES (1 M) を追加することにより 200 mL ハンクの平衡塩溶液 (HBSS、10 x、フェノール赤なし, ない重炭酸ナトリウム) にアッセイバッファーを準備します。純水 2 L の最終巻を入手し、4 g ウシ血清アルブミン (BSA) を追加するを追加します。電磁攪拌による BSA を溶解します。(NaOH) と 7.4 に pH を調整し、ソリューションをフィルターします。
      メモ: 次のすべての手順の中に「アッセイバッファー」と呼ばれる、同じバッファーが使用されます。
    2. 蛍光 Ca2 +の貯蔵液 (ジメチルスルホキシド (DMSO) 4 mM) の準備-敏感な染料蛍光 2 AM。光に過度の暴露を避けます。解散 1 mg 蛍光 2 AM (分子量: 1,061 g/mol) 235.6 μ L DMSO で。
    3. 蛍光色 2 AM の実用的なソリューションを準備します。1 つの 96 ウェル アッセイ プレート ミックス蛍光 2 AM 原液 (4 mM) の 12.5 μ L と 12.5 μ L 非イオン性界面活性剤 (例えば、プルロニック f-127) ポリオール ソリューション (20% 重量/体積、DMSO の材料表を参照してください)。15 mL チューブ 11 mL アッセイバッファーにこの混合物の 22 μ L を追加します。蛍光色 2 午前の最終濃度は、4 μ M です。
      注: ノニオン界面活性剤は、蛍光 2 AM と、結果、セルの負荷を高めるために水の溶解度を改善するために、分散剤として使用されます。DMSO の界面活性剤の可溶化、熱の 37 ° C および均一な解を得るため定期的にミックスでサンプルを実行します。
    4. プレートをひっくり返すとペーパー タオルの乾燥によって 96 ウェル測定板で以前シード細胞から成長培地を削除します。
    5. 100 μ L/ウェル マルチ チャンネル ピペットを使用して色素溶液を読み込むを追加し、暗闇の中で RT で 45 分間インキュベートします。

4. 準備 96 ウェル ポリプロピレンの板ケモカイン リガンド cxcl 12 または調査中で化合物を含む

  1. 丸底ポリプロピレン (PP) 96 ウェルのプレート (材料の表を参照) を取得します。
    1. Cxcl 12 の原液を許可 (1 mg/mL) と室温平衡に調査中の化合物の原液
      注: [cxcl 12 のストック溶液を調製純水 0.01 %tween20 添加し、使い捨ての因数として-20 ° C で保存します。
    2. アッセイバッファーに cxcl 12 溶液 x 5 の準備 (31.25 に匹敵する 250 の ng/mL nM) と 5 (アッセイバッファー) のそれぞれの化合物の濃縮希釈倍。
    3. 定義済みプレート レイアウトに従って適切な 96 ウェル プレートに溶液を調剤します。調剤 75 μ L/ウェルのプレート cxcl 12 を含む (「ケモカイン プレート」) 分配 50 μ l/ウェルのプレート (「複合プレート」) 化合物を含みます。
      注: 両方最終的になる化合物と cxcl 12 希釈測定板の調剤時に 5 倍。また、ケモカイン プレートと同様、両方の複合板にアッセイバッファーのみを含むネガティブ コントロール井戸を含めることが重要です。また肯定的な制御の井戸が含まれてする必要があります (つまり、井戸のケモカイン プレートに cxcl 12 が複合板の対応する井戸にアッセイバッファー)。

5. プロトコルの設定を蛍光マイクロ プレート リーダー

注: このプロトコルで使用される蛍光マイクロ プレート リーダー材料表で呼ばれます。

  1. まず、蛍光プレート リーダーのクーラー ユニットに切り替えてからと蛍光リーダー自体に。ほんの数分を開始し、オープン システムのソフトウェアができます。
  2. 次の手順が含まれています] メニューのドラッグ アンド ドロップを使用して試金のプロトコルを作成します。
    1. 「設定」ボックスで励起波長と 'Read_Mode' を選択: 470-495 nM;発光波長: 515-575 nM。
      注: 選択した波長が Ca2 +の使用に適した-敏感な染料 fluo2。
    2. デバイスのソース 2 の位置に置かれる複合板の化合物の自動混合の「TF とミックス」(流体) ボックス (手順 6.4 を参照).各ウェルに自動的に吸気混合 3 回で 15 μ L のソリューションを選択します。液体の表面の下の 20 μ L をピペット チップの高さを調整します。吸引と調剤を 50 μ L/秒の速度を設定します。
      注: ピペット チップの高さはピペット チップの下に残っているボリュームです。たとえば、複合板の井戸は、50 μ L を含む場合、30 μ L の高さは液体の表面の下の 20 μ L に対応します。複合ソリューションをミックスして、混合の速度、ピペットの位置のボリュームは、混合時にヒントし、数サイクルの混合のすべてが調整できるソフトウェアを使用しています。
    3. 「流体転送」ボックスで定義を 20 μ l それぞれの化合物プレートからよく測定プレートに転送されます。20 μ L ピペット チップ位置以下の液体表面のすなわち、化合物の吸引中に高さ 30 μ L、高さ 60 μ L 測定板の調剤時に。誤嚥を 50 μ L/秒の速度と 25 μ L/秒での吐出の速度を設定します。
      注: 複合板を含む 50 μ L/ウェル ソリューションの (手順 4.1.3 を参照)、30 μ L の高さが液体の表面の下の位置 20 μ L に対応するため。測定プレート 80 μ L/ウェル アッセイバッファーが含まれます (手順 6.3 を参照)、60 μ L の高さがヒントの同様の位置に対応するため。
    4. 「TF と読み取り」ボタンをを選択します。最初の間隔中に、化合物の測定プレートに塗布する前に 10 の読み取りを記録し、50 を読み取るその後 1 の s. 定義の読み取り間隔で 60 の読み込み (蛍光測定) を選択します。30 の読み取り間隔が 2 番目の間隔を定義する s と 18 の読み取り。
      注: この手順中に蛍光測定されます速度論的 (定義された時間間隔) での ~ の合計 10 分。
    5. 3 回プロトコルに「洗浄のヒント」ボタンがあります。各洗浄工程内流体の種類を選択: 流体 (純水) または液 B (70% エタノール)、洗浄サイクル (1) ポンプの数速度 (高速) とストローク (5) それぞれの間に数ステップを洗います。
      注: 最初と最後洗浄ステップ流体 A で使用されます、2 番目の洗浄手順液 B を使用します。
    6. 「一時停止 Pipettor」関数にはが含まれます。300 のため一時停止する pipettor を設定 s。
      注: プロトコルでこのステップを含めることにより、蛍光プレート リーダー デバイスに統合されて、pipettor の頭を一時停止 5 分プロトコルを続行する前に。
    7. デバイスのソース 3 の位置に位置するケモカイン プレートに cxcl 12 ソリューションの自動混合できるように"TF とミックス"ボックス (手順 6.4 を参照)。各ウェルに自動的に吸気混合 3 回で 15 μ L のソリューションを選択します。吸引と混合の間に液体の表面の下のピペット先端 20 μ L を配置します。吸引と吐出速度は、50 μ L/秒に設定されます。
      注: これらのパラメーターを調整することができますステップ 5.2.2 も同様。
    8. その後「転送流体」ボックスで定義それぞれからその 25 μ l ケモカインのプレート測定プレートに転送されます。位置のヒント 20 μ L 液体下面すなわち、75 μ L/ウェルを含むケモカイン プレートから吸引中に高さ 55 μ L で (手順 4.1.3 を参照)、および測定プレートに調剤中に高さ 80 μ L で。誤嚥を 50 μ L/秒の速度と 25 μ L/秒での吐出の速度を設定します。
    9. 「TF と読み取り」ボタンをがあります。最初の区間中 5 読み取り測定プレートに cxcl 12 を調剤する前に記録され、140 を読み取りその後を 1 s. 定義の読み取り間隔で 145 の読み込みを選択します。6 s と選択の読み取り間隔が 2 番目の間隔を定義する 20 の読み取り。
      注: 一緒に撮影プロトコル全体を通して 243 読み取り (蛍光測定) が記録されます: ステップ 5.2.4 および段階 5.2.9 165 で 78。
    10. 5.2.5 をステップ、プロトコルに「洗浄のヒント」ボタンの 3 回を含めると似ています。
      注: プロトコルの最後でこの手順を含むヒントをヒントを変更せずに別の分析を実行する再利用できるをことができます。
  3. 37 ° C で「段階温度設定」ボタンをクリックし、37 ° C を選択してデバイスの温度を設定します。

6. 蛍光分析の実行

  1. 45 分のバッファーを読み込むと測定後プレートを培養して (3.1.5 のステップを参照)、板の上を反転してバッファーを削除し、組織上で乾燥させます。
  2. アッセイバッファーの 150 μ L/ウェルを追加することによってシードの細胞を洗浄し、2 分間インキュベートします。
  3. 板の上を反転して再度バッファーを削除します。マルチ チャンネル ピペットにアッセイバッファーの 80 μ L/ウェルを追加します。
  4. すべてのプレートを入れて彼らの適切な位置にあるデバイス: ソース 2 の位置に複合板、ソース 3 の位置にケモカイン プレートと読み取り位置測定プレート。ソース 1 のヒントの位置に黒のヒントのボックスを置きます。デバイスのドアをシャット ダウンし、プロトコルを続行する前に 5 分間インキュベートします。
  5. 板の上の背景の相対的な光の単位 (RLUs) と蛍光差異を決定する「プロトコル信号テスト」ボタンを選択します。新しいウィンドウがポップアップ表示されます。「信号をテスト」を選択します。
    注: この手順中に背景 RLUs は蛍光リーダー デバイスの光学コンパートメントに統合された ICCD カメラによって決定されます。Ca2 +の励起に起因するこれらの RLUs-発光ダイオード (Led) による機密性の高い染料 (蛍光-2) (LED 出力波長 470 495 nm)。8,000-10,000 RLUs の値は、このアプリケーションに適しています。RLUs、必要に応じて、適合できる励起強度 (休館ただし強度を選択)、またはカメラのゲート (選択ゲート オープン) を変更することによって。板の上の差異は理想的に 7.5% 未満をする必要があります。
  6. 8,000-10,000 RLUs のバック グラウンド値を取得した場合は、「更新」を選択します。主なプロトコルを保存するには、[保存] ボタンをクリックします。
    注: これによりプロトコル信号テストから設定に実施される主なプロトコル。
  7. 「実行」ボタンを押して測定を実行します。

7. データ分析と品質

  1. 分析が完了した後は、システムのソフトウェアの「分析」ボックスを開きます。
    1. 「修正を構成する」と「ベース ライン経由での応答」を選択に移動します。1、測定 5; 終わり測定開始するベース ライン 1 を定義します。各ウェル測定 1 と 5 の間の平均蛍光が計算されます。
      注: 特定のすべてのさらなる測定もこの井戸固有ベース ライン 1 で分かれています。
      1. 測定 83 まで測定 78 で開始するベース ライン 2 を定義 (測定 83 後 cxcl 12 が分配される; 再び平均蛍光計算各間も次のすべての測定に測定 78、83、この補正係数を適用測定 83)。
    2. チェック ボックスをアクティブにする「パーセンテージで表示」と「背景を引く」。
    3. 「キネティック除去を構成する」に進みます。Cxcl 12 による Ca2 +応答化合物の阻害効果の評価、243 (すなわち、最終測定) 測定 (すなわち、cxcl 12 の調剤後最初の測定) 84 から始めて最大値最小値を選択します。
      注: 選択の最大最小基準 84 の測定と測定の間に最小値と最大応答の違いによって 243 が報告されます。11 測定 78、間最大最小を選択すると、終わるベースライン 1 のベースラインを基準として最小値と最大応答の違いが報告されます。この値使用できます化合物の潜在的な敵対活動を分析、議論を参照してください)。
    4. データは、システムのソフトウェアの視覚化されます。必要な場合は、追加の分析とその他の一般的な解析ソフトウェア パッケージの可視化用の生データをエクスポートします。

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Representative Results

U87 で細胞内 Ca2 +動員に cxcl 12 刺激の影響。CD4.CXCR4+と U87。CD4 細胞は、Ca2 +動員アッセイで評価されました。プロトコル (図 1) の最初の分注ステップ中に通常追加されるテスト混合物の 20 μ L、代わりにアッセイバッファーに追加された蛍光 2 AM U87 を読み込まれます。CD4.CXCR4+細胞測定プレート。2 番目の調剤手順では、濃度の異なる cxcl 12 (0.2 102.4 nM、最終濃度) 測定プレートで分配しました。蛍光、Ca2 +リリースの用量に依存する増加と相関の用量に依存して増加を示した (図 2 a)。ここでは、マイナス コントロールのサンプルを表す測定プレートに追加されたアッセイ バッファーのみ追加した両方でそれらの井戸 (すなわち、0 nM cxcl 12)、(図 2 a) の応答の不在の結果として。Cxcl 12 の増加する量は、(図 2 a) を時間をかけて崩壊蛍光の上昇を誘発します。これらのデータから線量の応答曲線が生成された「最大最小応答に基づいて終わるベースライン"84 (すなわち、cxcl 12 添加後最初の測定) 測定と測定 243 間 (すなわち。 プロトコルで最終測定).非線形回帰を使用して、EC50値 (すなわち、半分の最大応答を換起するために必要な濃度) 決定された、1.14 に対応する nM (図 2 b)。ない蛍光 Ca2 +-応答は高濃度でも cxcl 12、によって誘発された関連 (102.4 nM)、U87。CXCR4 の発現を欠けている CD4 細胞は使用されました。これは cxcl 12 により誘発される測定の受容体特異性を示します (図 2)。

この細胞に基づく試金は小さな分子が特に CXCR4 をターゲットの同定アプリケーションと cxcl 12 による Ca2 +の動員を抑制することができるキーです。活性化合物 (「ヒット」) が指定されている場合、化合物のシリアル希薄をテストし、詳細の抑制力を分析、さらに特徴づけることが。例として、図 3に bicyclam AMD3100、強力な抗 HIV 1 活動21,22、確立された小分子 CXCR4 固有受容体拮抗薬の効果を示します。AMD3100 の一連の濃度 (n = 4、1.37 nM 最終濃度 1/3 希釈系列を 3 μ M) U87 に分配されました。CD4.CXCR4+細胞プロトコルの最初のステップです。化合物の細胞をインキュベートすることを許された ~ 10 分間蛍光信号を継続的に記録されました。その後、6.4 cxcl 12 の海里 (50 ng/mL, 最終濃度) CXCR4 を介する Ca2 +動員を誘発する同時に細胞板のすべてのウェルに追加されました。AMD3100 の異なる希釈率によってこの応答を抑制する用量依存性を図 3 aに示します。この場合、添加 cxcl 12 のグラフの部分のみが表示されます。アッセイ (AMD3100、ない cxcl 12 の井戸に追加でない中古のインキュベーション) のネガティブ コントロール (青線) しかバッファーが適用されると、予想される応答の欠如の結果です。肯定的な制御 (赤い線) が、6.4 のサンプルに対応する AMD3100 の前培養せず井戸に cxcl 12 nM が追加されました (図 3 a)。定義されたこれらに基づいてネガティブとポジティブ コントロール Z' この試金の値は、通常 0.5 と 1 の間です。用量反応曲線は 770.8 の計算 IC50値に生じる非線形回帰によって生成された AMD3100 の抑制の効力を決定するために nM (図 3 b)。非アクティブな化合物の挙動を詳しく説明するため、maraviroc はこの実験に含まれていた。Maraviroc は特にそれにより妨げる CC ケモカイン受容体 5 (CCR5) を阻害する小分子 (CCR5)-熱帯 HIV-1 感染23 。高濃度 (10 μ M 最終濃度) でも CXCR4 を介する Ca2 +応答 (図 3 a) にこの化合物の抑制効果が見られない。

最後に、この Ca2 +動員アッセイは他の Gpcr、CC ケモカイン配位子 5 (CCL5) のシリアル希薄を研究にも適用することができますを示すため、CCR5 の内因性リガンドは CCR5 を発現する細胞に追加されました (U87。CD4.CCR5+) まったく同じ実験条件とハードウェアの設定を使用します。CCL5 のシリアル希釈添加後線量依存性蛍光 Ca2 +応答を示す (図 3)。さらに、その CXCR4 に及ぼす影響、100 中古インキュベーションとは対照的 maraviroc の nM (最終濃度) は、この応答 (図 3 D) を強く抑制。

Figure 1
図 1: アッセイのワークフローの概要。0 日セル (この場合は CXCR4) への関心の GPCR を表現する透明な底の 96 ウェル プレートを黒い壁でシードし、37 ° C および 5% CO2で一晩栽培されています。1 日目で蛍光を用いた Ca2 +測定が実行されます。最初のセルを搭載蛍光 Ca2 +-敏感な染料 (蛍光 2 AM) 暗闇の中で RT で 45 分間インキュベートし、。「ケモカイン プレート」と「複合プレート」を用意 (PP = ポリプロピレン)。ローディングの染料の孵化後、シード細胞は (150 μ L/ウェル) アッセイバッファー アッセイバッファーの 80 μ L/ウェルを追加した後で 1 回洗浄です。すべてのプレートに、分析を開始する前に 37 ° C でデバイスで 5 分間孵化します。関心の (例えば、小分子) の化合物が測定プレートのウェルに必要な濃度で調剤し、インキュベートすること 〜 10 分連続で蛍光を測定中。次に、Ca2 +放出を呼び起こす GPCR (ここ cxcl 12) の内因性アゴニストの固定濃度が追加され、蛍光がさらに時間の経過とともに記録されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: アゴニスト活性 CXCR4 に cxcl 12 の+細胞と検出された応答の特異性です。(A) Ca2 +動員 U87 に cxcl 12 の用量依存的効果。CD4.CXCR4+細胞。84 と 243 の用量-反応曲線の測定と計算された EC50値基準最大最小応答に基づいて (B) (n = 4、平均 ± SD)。(C) 応答によるない cxcl 12 U87 に調剤されたとき。CD4 細胞 CXCR4 を欠けています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 図 CXCR4 CXCR4 アンタゴニスト (AMD3100) と非アクティブな化合物 (maraviroc) の効果の+細胞とその内因性アゴニスト、CCL5 による CCR5 のアクティブ化。(A) 用量依存的阻害 6.4 を追加することによって誘発される Ca2 +動態に及ぼす AMD3100 U87 に cxcl 12 nM。CD4.CXCR4+細胞。Maraviroc (10 μ M の最終濃度) に cxcl 12 による Ca2 +応答抑制効果を示さなかった。(B) に基づいて測定し、84 243 間のベースライン上最大最小応答、阻害の用量-反応曲線が生成され、770.8 に計算された IC50 nM (n = 4、平均 ± SD)。(C) 用量依存性の内因性アゴニスト、CCL5 による CCR5 の活性化。100 の細胞の前培養で CCR5 を介する Ca2 +応答を抑制する (D) maraviroc の nM。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

Ca2 +の動員アッセイ記載以前の識別し、CXCR417のターゲット受容体拮抗薬の分類に貴重なツールであること示されています。ただし、関連ケモカイン受容体 CCR5 の示すようにこのメソッドことができますより一般的にその起動時に、ゾル性細胞質 Ca2 +放出を引き起こす他の Gpcr の大規模なグループに適用することも予想されます。(例えば、セル番号めっきで、蛍光色素を細胞の読み込み) プロトコルのいくつかの手順がするアッセイを転送する前に再最適化する必要があります CCR5 の場合全く同じ実験条件が適用されますが、一方良好な信号対雑音比を得るために他の Gpcr。ここで重要な問題はまた適切な培養細胞ホストの関心と Ca2 +経路の機能的結合の GPCR の高度な表現を許可する選択です。CXCR4、場合 U87 ひと膠芽腫細胞のため選ばれた: (1) CXCR7 の内因性表現の欠如 (関連ケモカイン受容体 CXCR4 として同じアゴニストを占有する)、(2) カップルの Ca2 +CXCR4 活性化する能力-シグナルCa2 +細胞の読み込み後に蛍光応答の良好なダイナミック レンジが得られる経路 (3)-細胞プロシージャ全体で障害の敏感な染料と (4) アッセイへの優れた付着性プレートを最小限に抑えます。これらすべてのパラメーターは、各小説興味の GPCR と各細胞発現システムを実験的に決定する必要があります。

別の GPCR のような試金を設定する場合いくつかの代替の手順またはプロトコルで試薬を考えることが。例えば、その他 Ca2 +-このプロトコルで使用される蛍光体 (ブラック 2) のための代替として使用される (例えば、蛍光色 4、蛍光 3) 敏感な fluorophores が付いています。場合外れ24セルを最小限に抑えるため消毒剤染料の導入によって緩く付着細胞、細胞の洗浄を省略可能性があります。さらに、プロトコルから洗浄工程を除くアッセイのスループットを向上します。この試金は、例えばひと癌細胞ライン1025のいくつかの種類を含む CXCR4 の内因性の式を示す細胞で実行される可能性がそれは固定して transfected セルと行高 GPCR であることを注意すべき時間をかけて安定発現レベルが得られます。これは、結果より、アッセイ測定を発音するには、大きなウィンドウで一貫性のある信頼性の高いデータ解釈のアッセイの長い期間にわたってパフォーマンス。内生的細胞を用いたとき CXCR4 を表現するあろうこの結果を達成するためにはるかに困難。

アッセイの主な欠点は、それが蛍光測定に依存することです。したがって、アッセイの測定は、信頼性の低いデータ解釈のため解析から除外される化合物が干渉することができます。また、この Ca2 +動員アッセイはスクリーニング システム標準化された混合を可能にする統合のピペッティング システムとの化合物と受容体アゴニストのすべての測定プレート分注接種携帯を使用してを実行が理想的です。同時に井戸します。アッセイは、以下の運動測定機能を備えた高価な蛍光マイクロ プレート リーダー、他の使用に適用できる、ただし、こと。アゴニスト化合物の添加は [ハンズオンの時間が増加し、分析のスループットを低下させるマルチ チャネルのピペットを使用して手動で実行する必要があります。さらに、運動アッセイの特定の時間間隔内で蛍光測定の同じような数の取得に多くのマイクロ プレート リーダー測定信号ハイエンド スクリーニング システム測定すべての井戸に対しも--を達成するために困難なります。同時に。

現在受容体や内因性アゴニスト (cxcl 12) によってその後活性化にバインドを防止する受容体拮抗薬は、特に CXCR411,12をターゲット化合物の主なカテゴリを形成します。AMD3100、Ca2 +動員アッセイの性能を説明するために使用された小分子が CXCR4 アンタゴニスト26の最も顕著な例の一つです。受容体拮抗薬以外にも GPCR 異なるシグナル伝達を調節する分子は同様に一般の関心を上げます。これらの分子は、逆アゴニストと同様に GPCR PAMs と NAMs19,20,27に含まれます。本稿で説明している分析の興味深い特徴は、それだけではなくを識別できる受容体拮抗薬もアゴニストとアロステリック変調器です。ただし、いくつかのマイナーな適応アッセイと制限には考慮する必要があります。

PAMs と NAMs は、受容体部位の受容体の内因性リガンドによる占領 orthosteric 結合部位とは異なる地形的にバインドします。Pam は、効力及び受容体の内在性 ligand(s) の薬効を高めるに対し NAMs は効力や内因性 ligand(s)19,20の有効性を阻害します。PAMs は本質的なアゴニスト活性があります。彼らは、いわゆるアロステリック アゴニストとは異なり、内因性アゴニスト存在下でアクティブのみです。アロステリック GPCR 変調古典受容体拮抗薬臨床28,29で適用されたときよりも少ない副作用を呼び起こすため薬理学的に貴重なツールです。我々 の分析でアロステリック作動薬、CXCR4 を添加後すぐに蛍光信号の一時的な増加を引き起こすであろう+細胞。このシグナルの受容体の特異性は、同じ化合物同じアッセイが CXCR4 に欠けているセルをテストすることによって、決定してください。具体的には PAMs のスクリーニング、内因性アゴニストの低濃度は蛍光 Ca2 +応答を誘導する試金で使用ください。アゴニストのこのより低い量は小さい蛍光信号を作成するが、それは追加受容体刺激を検出するより大きいウィンドウを残します。通常、EC10- EC30受容体刺激の値に対応するアゴニスト濃度は30,31が選択されます。アッセイの最初の部分の間に、PAM の付加と増加の蛍光測定されません。しかし、その内因性アゴニストの受容体のそれに続く刺激後蛍光 Ca2 +シグナルを増加させます。同様に、ナムはアゴニスト加算の前に蛍光測定を変更されませんが、アゴニストの付加の後で受容体の反応を抑制するは。したがって、受容体拮抗薬と、ナムの活動プロフィール、似ています。彼らの両方は、アゴニスト添加後蛍光応答の抑制になります。したがって、さらに実験的研究は拮抗し、ナムを区別する必要があります。ここでは、ラベル付けされていない化合物が一定量のと競うという受容体結合試験というラベルの付いた cxcl 12 CXCR417,32でバインドができなくなる、アンタゴニストを区別するための重要な戦略をすることができます、受容体、およびそれと同じ受容体結合部位を共有しないではなく、ナムにバインドからアゴニストをラベル付けします。

Gpcr は recombinantly 表現した場合通常、基底の活動のレベルはかなり低いが、多数の Gpcr33 Gpcr のリガンド独立した (または基底または構成) 活動は観測されて27。自然発生した基底の GPCR の活性を高めることができる変異33と増加基底 CXCR4 活動がされているにつながる点突然変異は、以前34に記載されています。酵母フェロモン応答経路にこの恒常活性 CXCR4 変異体を結合することにより、[35S] GTPγS バインディングを用いて、それを示した、T140、強力な抗 HIV 活性17,35 ペプチド ベース CXCR4 アンタゴニストこの基底活性が減少、したがって逆アゴニスト34として動作するように示されました。注記のうち、フラ 2 蛍光ベース Ca2 +動員試金同じ著者観察小さな一時的な減少 Ca2 +-関連蛍光細胞突然変異体 CXCR4、基底の減少を示唆する次の T140 の追加受容体活動34。ただし、T140 から設計して環状ペプチド ベース CXCR4 の逆アゴニストの追加パネルを分析、Ca2 +動員アッセイと減らされた基底活性の検出より簡単な36才だった。本稿で説明したように Ca2 +動員アッセイを使用して野生型 CXCR4 を発現する細胞に及ぼす T140 を分析したとき、基底の蛍光信号の変化は17認められなかった.さらに、蛍光の変動が高速で過渡と恒常活性 Gαqを発現する細胞で基底 Ca2 +の増加は認め、例えば、-受容体4を結合します。一緒に取られて、逆アゴニストの効果は、非常に難しい場合は不可能ではない、我々 の分析を確実に評価するでしょう。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーン、Geert Schoofs を感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-2 AM Abcam ab142775 fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G pluronic acid
Gelatin Sigma G9391
AMD3100 Sigma A5602-5 mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc kind gift of AnorMed antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12 PeproTech 300-28A
Chemokine ligand CCL5 PeproTech 300-06
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco (Life Technologies) 41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1 M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red Gibco (Life Technologies) 25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Falcon tubes, 50 mL Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid Costar/Fisher Scientific 10530753 assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates Thermo Scientific (VWR) 732-2661 plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system Molecular Devices Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm Molecular Devices 0200-6128 Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm Molecular Devices 0200-6203 emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head Molecular Devices 0310-4536 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks Molecular Devices software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL Beckman Coulter cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile Corning 3340 Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.

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References

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