الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الغربية قياسية النشاف البروتوكول الأمثل لتحليل عدد قليل من 500 الجذعية المكونة للدم أو الخلايا السلف. التحسين يشمل حذراً في التعامل مع العينة الخلية والحد من عمليات نقل بين أنابيب مباشرة ليسينج الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنموذج لايمملي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) خلايا نادرة، مع الماوس نخاع العظام التي تحتوي على فقط 25,000 ~ المظهرية طويلة الأجل إعادة إسكانها يكونوا هسكس. وكان بروتوكول blotting غربية الأمثل ومناسبة لتحليل إعداد صغيرة من هسكس (500-15,000 الخلايا). هسكس المظهرية تنقيته، وحسابها بدقة، وتفكيك مباشرة في لايملي عينة المخزن المؤقت. ليساتيس التي تحتوي على إعداد متساوية من خلايا تم تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، ووصمة عار وأعد وتجهيزها بعد الغربية القياسية النشاف البروتوكولات. باستخدام هذا البروتوكول، 2,000-5,000 هسكس يمكن تحليلها بصورة روتينية، وفي بعض الحالات يمكن الحصول على بيانات من عدد قليل من الخلايا 500، مقارنة بخلايا 20,000 إلى 40,000 عنها في معظم المنشورات. هذا البروتوكول ينبغي أن ينطبق عموما على الخلايا الأخرى المكونة للدم، ويتيح التحليل الروتيني لإعداد صغيرة من الخلايا باستخدام الإجراءات المختبرية القياسية.

Introduction

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي الذاتي تجديد الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى جميع الدم الأنساب. فهي نادرة نسبيا من الخلايا في نخاع العظام، يجعل من الصعب التحليلات الكيميائية الحيوية. النهج المناسبة لتحليل خلايا نادرة، مثل التدفق الخلوي، كانت مفيدة للغاية لقياس الكميات النسبية من علامات سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، يتطلب تحليل البروتينات داخل الخلايا باستخدام الخلية بيرميبيليزيشن إجراءات لتمكين الوصول إلى جسم، وليس كل الخلايا السطحية [ابيتوبس] البقاء على قيد الحياة هذه الإجراءات1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، الأجسام المضادة التي تميز بين منتجات بروتين مختلف isoforms أو الانقسام ولا تتوفر غالباً للتدفق الخلوي، وذلك المحققين لا تزال تعتمد على البقع الغربية لبعض أنواع التحليل.

تحليل لطخة غربية للخلية ليساتيس إجراء روتيني في معظم المختبرات. يمكن تنقية الخلايا تحت ظروف الأم التي تحافظ على [ابيتوبس] جزيئات سطح الخلية، ويمكن بعد ذلك أعد ليساتيس الخلية وتحليلها. ومع ذلك، يمكن أن يتطلب تحليل البروتينات في الخلية الأولية نادرة السكان بالغربية لطخة يوثانيزينج إعداد كبيرة من الحيوانات للحصول على ما يكفي من خلايا. بإجراء تعديلات صغيرة على عدة خطوات، كان بروتوكول blotting غربية تقليدية قادرة على الكشف عن البروتينات في عدد قليل نسبيا من هسكس (500-15,000، اعتماداً على بروتين الفائدة). وتشمل التعديلات بدقة عد الخلايا، بدقة التعامل مع الخلية بيليه، الحد من عمليات نقل الخلايا بين أنابيب تقليل الخسائر في الخلية، وليسينج عدد محدد من الخلايا مع تحميل تتركز العازلة التي تحتوي على بروتوزوم و مثبطات الفوسفاتيز. وتشمل العديد من التقارير المنشورة البقع الغربية التي تم الحصول عليها مع 20,000 أو أكثر هسكس3،،من45،،من67؛ سوف يقلل هذا الإجراء البسيط عدد الخلايا والحيوانات التجريبية اللازمة لإنتاج بيانات مكافئة من بين 4 و 40 ضعفا. البروتوكول يهدف إلى تطبيع النتائج على أساس كل خلية، بدلاً من رقابة داخلية. وهذا يتيح الكشف عن التخفيضات الإجمالية في مستويات البروتين التي يمكن التغاضي عنها إذا هي تطبيع البيانات إلى رقابة داخلية. ووصفت أهمية تطبيع على أساس كل خلية لتحليل البيانات التعبير الجيني8، وينطبق نفس المبدأ على تحديد كمية البروتينات بوصمة عار الغربية. هذا البروتوكول الأمثل ينبغي أن يكون مفيداً لأي شخص بحاجة إلى تحليل عدد صغير من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن تتم جميع الإجراءات وفقا لاستخدام الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للرعاية. الإجراءات التي وضعت من أجل تحليل مورين الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسكس و HPs)، ولكن يمكن تكييفها لتحليل السكان خلية أخرى.

1-التدفق الخلوي عزلة هسكس مورين و HPs

  1. حصاد خلايا نخاع العظام مورين كما هو موضح في الأدب6.
    ملاحظة: في البيانات المعروضة في الشكل 1 و الشكل 2، وكان حصاد نخاع العظام من الفئران C57BL/6J.
  2. أداء نسب استنفاد الخلايا نخاع العظام باستخدام مجموعة أدوات استنفاد نسب ماوس، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة ضد علامات الخلية السطحية للفائدة ك وصف7. في هذه التجارب هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2، تستخدم الأجسام المضادة للهيئة-1 كيت، Flt3 وعلامات النسب (لين) Mac1، Gr1، CD3e، B220، و Ter119.
  4. فرز 2,000 20,000 لينSca1++ Flt3 عدة خلايا (HSCs) أو لينSca1الخلايا كيت+ (هبس) في أنابيب ايبندورف 1.5 مل يحتوي على 0.1 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الأبقار الجنين 2% مصل الدم (FBS).
    ملاحظة: للبيانات المبينة في الشكل 1 و الشكل 2، تم فرز الخلايا استخدام Cytometer التدفق مع فوهة 70 ميكرومتر. حجم جمع الحد الأقصى 1.4 مل.

2. إعداد نموذج

ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة. عملية العينة بعناية فائقة. عند إزالة المادة طافية، يكون حريصا جداً على عدم تعكير بيليه الخلية.

  1. أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل الأنابيب التي تحتوي على خلايا تم فرزها في دوار دلو يتأرجح عند 4 درجة مئوية، 500 غرام x، لأدنى 5 إزالة كافة ولكن ما يقرب من 100 ميليلتر من المادة طافية من الخلية بيليه جداً برفق باستخدام ماصة وتلميح بيبيت ميليلتر 20. عدم الإزعاج بيليه.
    1. إذا كانت العينة تحتوي على خلايا أقل من 5,000، وأقل من 0.2 مل من الحجم الإجمالي للعينة تم فرزها، نقل الخلايا أولاً إلى ربط انخفاض 0.2 مل أنابيب PCR قبل الطرد المركزي.
    2. إذا كان النموذج يحتوي على خلايا أقل من 5,000 وحجم أكثر من 0.2 مل، تدور الخلايا إلى الأسفل مع أجهزة الطرد مركزي في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق، وإزالة كافة ولكن 200 ميليلتر من المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا الأعلاف في ميليلتر 200 المتبقية من المادة طافية، ثم نقل الخلايا إلى أنابيب PCR 0.2 مل وتدور إلى أسفل مرة أخرى. إزالة كافة ولكن 20-30 ميليلتر من بيليه بعد الدوران الثاني وتعليق إعادة الخلايا.
  2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في اليسار طافية في الأنبوب. إذا لزم الأمر، إضافة برنامج تلفزيوني إضافي بنسبة 2% FBS/برنامج تلفزيوني (يمكنك أيضا استخدام 2% ألبومين المصل البقري (BSA)/برنامج تلفزيوني، أو برنامج تلفزيوني وحدها) للحصول على تركيز 5 x104 إلى 5 × 105 خلايا/مل.
    ملاحظة: استخدام حساب الخلية التي تجمعها الخلوي لتقدير حجم تستخدم لتعليق الخلايا.
  3. استخدام ميليلتر 2-5 تعليق إعادة الخلايا لتحديد تركيز خلية دقيقة استخدام عداد الآلي خلية (اتباع إرشادات الشركة المصنعة) أو هيموسيتوميتير9.
  4. نقل كمية من تعليق إعادة الخلايا التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا إلى 1.5 مل أنابيب جديدة. للتجربة في الشكل 1، نقلوا هسكس أو هبس 2,000، 1000 أو 500. العدد المطلوب من الخلايا تعتمد على قوة الإشارة التي حصل عليها لطخة غربية، ويتحدد تجريبيا. إجراء النقل باستخدام ميليلتر 20 أو 100 ميليلتر ايبندورف ماصة تلميح.
  5. الطرد المركزي الخلايا في دوار دلو يتأرجح في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق.
  6. لإنشاء 100 × حلول الأسهم، حل مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  7. تحضير x Laemmli 2 عينة المخزن المؤقت بتمييع العازلة عينة x Laemmli 4 المقدمة من الشركة المصنعة مع مبلغ مساو من الماء المقطر. إضافة مبلغ مناسب للمخزون 100 x من مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز للحصول على تركيز نهائي لمثبطات x 2 في المخزن المؤقت لنموذج x Laemmli 2.
    ملاحظة: يمكن إجراء المخزن المؤقت نموذج x Laemmli 2 مسبقاً، ولكن ينبغي إضافة مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز فورا قبل إضافة 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت (بالإضافة إلى مثبطات) لبيليه الخلية الخلايا، وكما هو موضح في الخطوة التالية.
  8. إزالة جزء من المادة طافية من بيليه الخلية، وإلى المادة طافية المتبقية في الأنبوب مع بيليه الخلية بعناية، وإضافة وحدة تخزين تساوي 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت بالإضافة إلى مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز لتحقيق تركيز نهائي 500 خلايا/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا قمت بنقل الخلايا 2,000 في إجمالي حجم 20 ميليلتر لأنبوب في "الخطوة 2، 5"، بعد سينتريفوجينج الخلايا (الخطوة 2.6) يجب عليك إزالة ميليلتر 18 من المادة طافية من بيليه، وميليلتر 2 من المادة طافية المتبقية إضافة وحدة تخزين متساوية (2 ميليلتر) من 2 × لايملي عينة العازلة لتحقيق تركيز نهائي من الخلايا 500/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت.
  9. ريسوسبيند بيليه لتوليد في أقرب وقت ممكن. عند هذه النقطة، يمكن أن تكون العينات اليكتروفوريسيد فورا من خلال المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-الصفحة، أو يمكن انطباق المجمدة في سائل ن2 وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3-التفريد

  1. الحرارة ليساتيس في كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية أو في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
  2. اليكتروفوريسي 1-40 ميليلتر من ليساتيس (التي تحتوي على من 500 حتى 20,000 خلية مكافئات) من خلال الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية في 100 فولت باستخدام البروتوكولات القياسية10.
    ملاحظة: وحدة التخزين المحملة في الهلام ليستي يتحدد بعدد الخلايا اللازمة لتوليد إشارة المرغوب فيه، وسوف يعتمد على وفرة البروتين من الفائدة، ونوعية الأجسام المضادة. تم الحصول على البيانات في الشكل 1 مع 2,000، 000 1 و 500 خلية مكافئات من ليساتي. عرض البئر ينبغي في المجموعة من 3 مم إلى 1.5 مم-1.5 ملم يمكن أن تكون الأسنان قص من مشط متاحة تجارياً مع أوسع الأسنان باستخدام مقص.

4-نقل وكتلة

ملاحظة: إجراء وصمة عار غربية عقب البروتوكولات القياسية11. ويرد موجز الخطوات هنا:

  1. بريتريت غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع الميثانول ل 10 s، ثم أغسل الغشاء بإيجاز مع الماء المقطر.
  2. نقل البروتين من جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للغشاء اتباع الإرشادات الموجودة في دليل المستخدم توفيرها من قبل الشركة المصنعة للجهاز على نقل.
  3. بعد نقل، كتلة الغشاء مع 2 مل من 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في ببست (برنامج تلفزيوني مع 0.1% توين) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية عقب البروتوكولات القياسية11.

5-جسم وسم

  1. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة على شاكر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية استخدام تخفيف الجسم المضاد الذي أوصت به البائع.
    ملاحظة: في "الجدول للمواد"، يتم إظهار الأجسام المضادة، الذي كنا قد صدق هسكس و HPs وتخفيف جسم المقابلة،. أداء جسم العلامات باستخدام إجراءات معيارية8.

6-كشف

  1. يغسل الغشاء 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل في ببست في درجة حرارة الغرفة.
  2. احتضان الغشاء مع 2 مل من المخزن المؤقت تشيميلومينيسسينسي المعززة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كشف الإشارات استخدام نظام تصوير عقب تعليمات، الشركة المصنعة أو الفيلم autoradiography وتحميض أفلام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر نتائج تمثيلية من 500-000 2 المنقي هسكس و HPs في الشكل 1 و الشكل 2. ويمكن الكشف عن إشارة β-أكتين في الشكل 1 من عدد قليل من 500 هسكس وهبس تنقيته من نخاع العظام واحدة بالماوس. ملاحظة أن تحميل ليساتيس في الآبار 1.5 مم تنتج إشارة أقوى بكثير من 500 HPs من التحميل إلى الآبار 3.0 ملم. الرقم 2 هو وصمة عار غربية من EIF4G والفسفره Rps6 (ف-Rps6)، اللذين يشاركون في تنظيم بروتين الترجمة12، في هسكس، وفي هبس مع أو بدون التحفيز بالخلايا الجذعية عامل (SCF) في المختبر.

Figure 1
رقم 1: لطخة غربية ل β أكتين يؤديها مع ليساتيس من الفاري هسكس و HPs. تم فرز هسكس من خلايا نخاع العظام مورين النسب المنضب كلينSca1++ Flt3 عدة خلايا ، و HPs كانت Sca1 لينكيت+. كانت اليكتروفوريسيد ليساتيس أعد من أرقام مختلفة من الخلايا عن طريق جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% المعدة باستخدام ألواح زجاجية مصغرة مع الفواصل 1 مم. وكان سبر وصمة عار مع الأجسام المضادة إلى β أكتين. وصمة عار يظهر إشارات المقارنة β-أكتين من 500 إلى هبس 2,000 عندما تم تحميل في ليساتيس في آبار 1.5 مم (الممرات 4-6) مقارنة بالآبار 3 مم (الممرات 1-2). تم تحميل ليساتيس من 000 2 إلى 500 الخلايا على الممرات 7 إلى 9. M، علامات الوزن الجزيئي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل لطخة غربية هسكس طازجة معزولة، و HPs وحفز في المختبر مع سيتوكين الخلايا الجذعية عامل (SCF). هبس تم تنقيته من الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، وفصل، حراكه في 2% FBS/برنامج تلفزيوني، عد، ثم انقسم إلى اثنين من أنابيب. وقد حفزت هبس في الأنبوب الأول مع صندوق إنقاذ الطفولة (10 نانوغرام/مل) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (+ صندوق إنقاذ الطفولة)، و HPs في الثانية كانت مثقف أنبوب لمدة 5 دقائق في الغياب من صندوق إنقاذ الطفولة (-SCF). ثم تم فصل الخلايا وتفكيك خلية بيليه مع لايملي عينة المخزن المؤقت. هسكس تنقيته وتفكيك مباشرة مع لايملي عينة المخزن المؤقت دون استزراع. تم تحميله في الآبار 1.5 مم ليساتيس واليكتروفوريسيد من خلال المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-الصفحة 12%. وقد وضعت وصمة عار مع الأجسام المضادة لعامل استطالة المبادر ز 4 (EIF4G)، β-أكتين، ووحدة فرعية الريبوسوم الصغيرة فوسفوريلاتيد S6 (ف-Rps6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النشاف الغربية تقنية شائعة لكشف البروتينات المحددة وتفعيل مسارات الإشارات في الأنسجة أو الخلايا. عن طريق إدخال تعديلات بسيطة على إجراء استخداماً، كنا قادرين على اكتشاف البروتينات المختلفة 15 (جدول المواد) بشكل روتيني في هسكس 15,000، وفي بعض الحالات في عدد قليل من هسكس 500. The most الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول: 1) دقة عد الخلايا 2) التقليل إلى أدنى حد من عدد عمليات نقل بين أنابيب و 3) ليسينج الخلايا مباشرة مع لايملي عينة المخزن المؤقت. عندما ليسينج بيليه الخلية مع لايملي عينة المخزن المؤقت، وجدنا أنه بدلاً من إزالة كل من المادة طافية من بيليه الخلية وإعادة تعليق في "لايملي عينة المخزن المؤقت"، إذا نحن بدلاً من ترك كمية صغيرة من المادة طافية في الأنبوب وإضافة ما يعادل حجم 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت، يمكن أن نتجنب فقدان الخلية. سينتريفوجينج الخلايا في دوار دلو يتأرجح انخفض أيضا خطر فقدان الخلية. تقليل عرض البئر تقليم أسنان المشط تحسنت حساسية الكشف.

مع هذه التعديلات البسيطة للإجراء، كنا قادرين على الحصول على النتائج استنساخه مساوية لتلك في الورقات المنشورة التي تستخدم أكثر من 10-20 مرات الخلايا3،4،،من56، 7-علاوة على ذلك، يمكن تجريد البقع لإعادة النشاف اتباع الإجراءات القياسية13، زيادة مقدار المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عدد صغير من الخلايا. سيكون محدودا القدرة على اكتشاف البروتينات ذات الاهتمام بنوعية الأجسام المضادة ووفرة البروتين. هذا الأسلوب تم التعديل ينبغي أن يقلل كثيرا من عدد الحيوانات اللازمة للحصول على بيانات البروتين من الخلية نادرة السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تعارض في المصالح تعلن.

Acknowledgments

المعاهد الوطنية "للصحة" منح R01 CA149976 (N.A.S) تدعم هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175, (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30, (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509, (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148, (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122, (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30, (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151, (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics