Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zeldzame cellen, met de muis het beenmerg met slechts 25.000 ~ fenotypische lange termijn repopulatie HSCs. Een westelijke bevlekkende protocol werd geoptimaliseerd en geschikt voor de analyse van kleine aantallen HSCs (500-15.000 cellen). Fenotypische HSCs werden gezuiverd, nauwkeurig geteld en direct lysed in Laemmli monster buffer. Lysates met gelijke aantallen cellen werden geanalyseerd door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina), en de vlek was bereide en verwerkte na standaard Westelijke Bevlekkende Protocollen. Met behulp van dit protocol, 2.000-5.000 HSCs kan routinematig worden geanalyseerd, en in sommige gevallen kunnen gegevens worden verkregen uit zo weinig als 500 cellen, in vergelijking met de cellen van de 20.000 tot 40.000 gemeld in de meeste publicaties. Dit protocol gelden over het algemeen andere hematopoietische cellen en maakt de routinematige analyse van kleine aantallen cellen met behulp van standaard laboratorium procedures.

Introduction

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zichzelf vernieuwende cellen die aanleiding tot alle bloed geslachten geven kunnen. Ze zijn relatief zeldzaam cellen in het beenmerg, waardoor biochemische analysen moeilijk. Benaderingen die geschikt zijn voor het analyseren van zeldzame cellen, zoals de stroom cytometry, zijn uiterst nuttig voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van cel oppervlakte markeringen en intracellulaire eiwitten. Echter, de analyse van intracellulaire eiwitten vereist het gebruik van cel permeabilization procedures antilichaam-toegang inschakelen, en niet alle cel oppervlakte epitopes overleven deze procedures1,2. Bovendien antilichamen die onderscheid tussen verschillende isoforms of decolleté eiwitproducten maken zijn vaak niet beschikbaar voor stroom cytometry en daarom onderzoekers nog steeds rekenen op Western blots voor bepaalde soorten analyses.

Westelijke vlekkenanalyse van cel lysates is een routineprocedure in de meeste laboratoria. Cellen onder inheemse voorwaarden die de epitopes van cel-oppervlakte molecules bewaren kunnen worden gezuiverd, en cel lysates kan vervolgens worden voorbereid en geanalyseerd. De analyse van eiwitten in zeldzame primaire cel populaties door Western blot kunt echter verplicht stellen grote aantallen dieren om voldoende cellen euthanizing. Door kleine aanpassingen aan de verschillende stappen, was een conventionele westelijke bevlekkende protocol kundig voor speurder eiwitten in relatief kleine aantallen HSCs (500-15.000, afhankelijk van de proteïne van belang). De aanpassingen omvatten nauwkeurig tellen de cellen, zorgvuldig hanteren de cel pellet, vermindering van de overdracht van cellen tussen buizen tot een minimum beperken van het verlies van de cel, en een bepaald aantal cellen met een geconcentreerde laden lysing buffer met proteasoom en phosphatase inhibitors. Vele gepubliceerde rapporten omvatten Western blots verkregen met 20.000 of meer HSCs3,4,5,6,7; deze eenvoudige procedure zal het verminderen van het aantal cellen en proefdieren nodig voor de productie van gelijkwaardige gegevens door tussen 4 en 40-voudige. Het protocol is ontworpen voor het normaliseren van resultaten op basis van de per cel, in plaats van aan een interne controle. Hierdoor kan de detectie van algemene verlagingen eiwitniveaus die worden over het hoofd gezien kunnen als gegevens worden genormaliseerd naar een interne controle. Het belang van normalisatie op basis van de per cel werd beschreven voor de analyse van gen expressie gegevens8, en hetzelfde principe geldt voor het kwantificeren van de eiwitten door westelijke vlek. Dit geoptimaliseerd protocol moet zinvol zijn voor iedereen die voor het analyseren van kleine aantallen cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele dierlijke gebruik en zorg richtsnoeren. De procedure werd ontwikkeld voor de analyse van lymfkliertest hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSCs en HPs), maar kan worden aangepast voor de analyse van andere cel populaties.

1. Stroom Cytometry Isolatievan lymfkliertest HSCs en HPs

  1. Oogst lymfkliertest beenmergcellen zoals beschreven in de literatuur6.
    Opmerking: In de gegevens in Figuur 1 en Figuur 2, beenmerg werd geoogst van C57BL/6J muizen.
  2. Uitvoert afkomst uitputting van beenmergcellen met behulp van een muis lineage uitputting kit, na instructies van de fabrikant.
  3. Incubeer de cellen met antistoffen tegen de cel oppervlakte markers van belang als beschreven7. In de experimenten weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2, worden antilichamen tegen Sca-1, Kit, Flt3 en geslacht (Lin) markeringen Mac1 Gr1, CD3e, B220 en Ter119 gebruikt.
  4. Sorteren van 2.000-20,000 Lin- Sca1+Kit+ Flt3- cellen (HSCs) of Lin-Sca1-Kit+ cellen (HPs) 1,5 mL Eppendorf buizen met 0,1 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderen serum (FBS).
    Opmerking: Voor de gegevensset die wordt getoond in Figuur 1 en Figuur 2, cellen wordt gesorteerd met behulp van een Flow Cytometer met een mondstuk 70 µM. Het maximale collectie volume is 1,4 mL.

2. de monstervoorbereiding

Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang. Het monster zorgvuldig worden verwerkt. Bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Wees zeer voorzichtig niet te verstoren, de cel-pellet.

  1. Centrifuge de 1,5 mL tubes met gesorteerde cellen in een swingende emmer rotor bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min. verwijderen alle maar ongeveer 100 µL van het supernatans dat uit de cel pellet heel voorzichtig met behulp van een pipet en een 20 µL Pipetteer tip. De pellet niet storen.
    1. Als het monster minder dan 5000 cellen bevat, en het totale volume van de gesorteerde steekproef lager dan 0,2 mL is, overbrengen in de cellen eerst laag bindende 0,2 mL PCR buizen voor centrifugeren.
    2. Als monster minder dan 5000 cellen bevat en volume meer dan 0,2 mL is, draaien de cellen naar beneden met een centrifuge bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min, en verwijdert alle maar 200 µL van het supernatans. Resuspendeer de Ingehuld cellen in de resterende 200 µL van supernatans, vervolgens de cellen overbrengen in de 0,2 mL PCR buizen en spin naar beneden weer. Verwijder alle maar 20-30 µL van de pellet na de tweede spin en resuspendeer de cellen.
  2. Resuspendeer de cellen in de bovenstaande links in de buis. Zo nodig typt u extra PBS in 2% FBS/PBS (u kunt ook 2% bovien serumalbumine (BSA) / PBS, of PBS alleen) tot een verwachte concentratie 5 x104 tot 5 x 105 cellen/mL.
    Opmerking: Gebruik de cel telt verzameld door cytometry te schatten van het volume dat wordt gebruikt om op te schorten van cellen.
  3. Gebruik 2-5 µL van het opnieuw gesuspendeerde cellen om te bepalen van de concentratie van een nauwkeurige cel met behulp van een geautomatiseerde cel teller (na instructies van de fabrikant) of een hemocytometer-9.
  4. Breng een hoeveelheid opnieuw zwevende cellen met het gewenste aantal cellen nieuwe 1,5 mL buizen. Voor het experiment in Figuur 1, werden 2000, 1000, 500 HSCs of HPs overgedragen. Het gewenste aantal cellen afhankelijk van de sterkte van het signaal verkregen door westelijke vlek en empirisch wordt bepaald. Met behulp van een 20 µL of 100 µL Eppendorf Pipetteer tip overdraagt.
  5. Centrifugeer de cellen in een swingende rotor van de emmer bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min.
  6. Voor het genereren van 100 x stamoplossingen, ontbinden proteasoom en phosphatase inhibitors in DMSO volgens de instructies van de fabrikant.
  7. 2 x Laemmli monster buffer voor te bereiden door de 4 x Laemmli monster buffer geleverd door de fabrikant met een equivalente hoeveelheid gedestilleerd water verdunnen. Het toevoegen van een passend bedrag van de 100 x voorraad van proteasoom en fosfatase remmers te verkrijgen van een eindconcentratie van 2 x remmers in 2 x Laemmli monster buffer.
    Nota: De 2 x Laemmli monster buffer kan op voorhand worden gemaakt, maar het proteasoom en phosphatase inhibitors moeten worden toegevoegd onmiddellijk voordat het toevoegen van de 2 x Laemmli monster buffer (plus remmers) naar de cel pellet om lyse de cellen, zoals beschreven in de volgende stap.
  8. Zorgvuldig verwijderen van een deel van het supernatans van de cel pellet, en naar het supernatant resterende in de buis met de cel pellet, voeg een gelijk volume 2 x Laemmli monster buffer plus proteasoom en phosphatase inhibitors om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer.
    Opmerking: bijvoorbeeld, als u transfer 2.000 cellen in een totaal volume van 20 µL van een buis in stap 2.5, na centrifugeren van de cellen (stap 2.6), moet u 18 µL van het supernatans verwijderen uit de pellet, en naar de 2 µL van het supernatans dat is overgebleven Voeg een gelijk volume (2 µL) 2 x Laemmli monster buffer om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer.
  9. Resuspendeer de pellet voor het genereren van de lysate zo spoedig mogelijk. Op dit punt, de monsters kunnen onmiddellijk worden electrophoresed door SDS-pagina gelen, of kan worden module in vloeistof N2 bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. elektroforese

  1. Verwarm de lysates in een blok van warmte bij 95 ° C of in kokend water gedurende 5 minuten.
  2. 1-40 µL van het (met van 500 tot 20.000 cel equivalenten) lysates electrophorese door SDS-pagina gelen op 100V met behulp van standaard protocollen10.
    Opmerking: Het volume van lysate geladen in de gel wordt bepaald door het aantal cellen die nodig zijn voor het genereren van het wenselijk signaal en zal afhangen van de overvloed van de proteïne van belang, en de kwaliteit van het antilichaam. De gegevens in Figuur 1 werden verkregen met 2.000, 1000 en 500 cel equivalenten van lysate. De breedte van de put moet worden in het bereik van 3 mm tot 1,5 mm. 1,5 mm tanden kunnen worden gesneden uit een commercieel beschikbare kam met brede tanden met behulp van schaar.

4. overdracht en blokkeren

Opmerking: Voer een westelijke vlek na standaardprotocollen11. De stappen worden hier kort beschreven:

  1. Voorbehandeling een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan met methanol voor 10 s, dan wassen het membraan kort met gedestilleerd water.
  2. Het eiwit van de SDS-pagina gel overbrengen naar de membraan volgens de instructies in de handleiding geleverd door de fabrikant van het apparaat van de overdracht.
  3. Na overdracht, het blokkeren van het membraan met 2 mL bovien serumalbumine (BSA) van 5% in PBST (PBS met 0,1% Tween) overnachting bij 4 ° C na standaardprotocollen11.

5. antilichaam Labeling

  1. Incubeer het membraan met antilichamen op een shaker's nachts bij 4 ° C met behulp van antilichaam verdunningen aanbevolen door de leverancier.
    Opmerking: In de tabel van materialen, antistoffen, die we hebben gevalideerd voor HPs, HSCs en de bijbehorende antilichaam verdunningen, worden weergegeven. Het antilichaam labelen met behulp van standaardprocedures8uitvoeren

6. detectie

  1. Wassen het membraan 3 keer, 5 min. voor elke wassen in PBST bij kamertemperatuur.
  2. Laat het membraan met 2 mL Verbeterde Chemiluminescentie buffer voor 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken. Detecteren van de signalen met behulp van een imaging systeem na de fabrikant instructies of autoradiografie film en film processor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve resultaten uit 500-2000 zuivere HSCs en HPs worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Het signaal van de β-actine in Figuur 1 uit zo weinig als 500 HSCs kan worden herkend en HPs gezuiverd uit het beenmerg van een muis. Merk op dat het laden van de lysates in 1,5 mm wells geproduceerd een veel sterker signaal van 500 HPs dan laden in 3.0 mm wells. Figuur 2 is een westelijke vlek van EIF4G en de phosphorylation van Rps6 (p-Rps6), die beide zijn betrokken bij de regulering van eiwit vertaling12, in HSCs, en in HPs met en zonder stimulatie door stamcel factor (SCF) in vitro.

Figure 1
Figuur 1: westelijke vlek voor β-actine uitgevoerd met lysates van RattenUitrustingen HSCs en HPs. HSCs waren gesorteerd van lineage uitgeput lymfkliertest beenmergcellen als Lin-Sca1+Kit+ Flt3- cellen en HPs waren Lin-Sca1-Kit+. Lysates bereid uit verschillende aantallen cellen werden electrophoresed door een 12% SDS-pagina gel bereid mini glazen platen met 1 mm afstandhouders. De vlek was gesondeerd met antilichaam aan β-actine. De vlek toont de vergelijkende β-actine signalen van 500 tot 2.000 HPs wanneer de lysates zijn geladen in 1,5 mm wells (banen 4-6) in vergelijking tot 3 mm wells (banen 1 - 2). Lysates vanaf 2.000 naar 500 cellen werden geladen op rijstroken 7 tot en met 9. M, gewicht van moleculaire merkers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: westelijke vlekkenanalyse of vers geïsoleerde HSCs, HPs gestimuleerd in vitro met de cytokine stamcel Factor (SCF). HPs werden gezuiverd door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS), gecentrifugeerd, geresuspendeerde in 2% FBS/PBS, geteld, vervolgens opgesplitst in twee buizen. De HPs in de eerste buis werden gestimuleerd met SCF (10 ng/mL) gedurende 5 minuten bij 37 ° C (+ SCF), en HPs in de tweede buis werden gekweekt voor 5 min in de afwezigheid van SCF (-SCF). De cellen werden dan gecentrifugeerd en de cel pellet lysed met Laemmli monster buffer. HSCs werden gezuiverd en rechtstreeks lysed met Laemmli monster buffer zonder kweken. De lysates werden geladen in 1,5 mm wells en electrophoresed door middel van 12% SDS-pagina gelen. De vlek is ontwikkeld met antilichamen tegen rek activerende factor 4G (EIF4G), β-actine en gefosforyleerd kleine ribosoom subeenheid S6 (p-Rps6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Westelijke bevlekken is een gemeenschappelijke techniek voor het opsporen van specifieke proteïnen en de activering van signaalroutes in weefsels of cellen. Door de invoering van kleine aanpassingen aan een veelgebruikte procedure, konden we 15 verschillende eiwitten (Tabel of Materials) routinematig detecteren in 15.000 HSCs, en in sommige gevallen in zo weinig als 500 HSCs. The most kritische stappen in dit protocol zijn: 1) nauwkeurig de cellen tellen, 2) het aantal overdrachten tussen buizen minimaliseren en 3) het lysing van cellen rechtstreeks met Laemmli monster buffer. Toen de cel pellet met Laemmli monster buffer lysing, vonden we dat in plaats van verwijderen van het supernatans van de cel pellet en opnieuw schorten in Laemmli monster Buffer, als we in plaats daarvan een klein volume van het supernatans dat links in de buis en toegevoegd een equivalent volume van 2 x Laemmli monster Buffer, kunnen we voorkomen dat cel verlies. Centrifugeren van de cellen in een swingende emmer rotor daalde ook het risico van verlies van de cel. Vermindering van de breedte van de put door te korten op de kam tanden verbeterd de gevoeligheid van detectie.

Met deze eenvoudige aanpassingen in de procedure konden wij krijgen reproduceerbare resultaten gelijkwaardig zijn aan die in gepubliceerde documenten dat 10 - 20 keer meer cellen3,4,5,6, had gebruikt 7. verdere, de vlekken kunnen worden gestript voor opnieuw bevlekken na standaardprocedures13, verhogen van de hoeveelheid informatie die kan worden verkregen van een klein aantal cellen. De mogelijkheid om te detecteren van eiwitten van belang zal worden beperkt door de kwaliteit van het antilichaam en de overvloed van eiwit. Deze gewijzigde techniek moet sterk verminderen van het aantal dieren nodig eiwit om gegevens te verkrijgen van zeldzame cel populaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren.

Acknowledgments

National Institutes of Health verlenen R01 CA149976 (N.A.S) dit werk ondersteund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175, (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30, (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509, (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148, (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122, (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30, (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151, (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics