Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Biochemistry

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Summary

Ein standard Western Blot-Protokoll wurde für die Analyse möglichst wenige 500 Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen optimiert. Optimierung beinhaltet sorgfältige Handhabung von die Zellprobe, Begrenzung der Transfers zwischen Röhren und direkt Lyse der Zellen im Probenpuffer Laemmli.

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Cai, X., Zheng, Y., Speck, N. A. A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e56855, doi:10.3791/56855 (2018).

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Abstract

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selten, mit der Maus Knochenmark enthält nur ~ 25.000 phänotypischen lange term repopulating HSCs. Ein Western Blot Protokoll wurde optimiert und eignet sich für die Analyse einer kleinen Zahl von Hsz (500-15.000 Zellen). Phänotypische HSCs wurden gereinigt, genau gezählt und direkt in Laemmli Probenpuffer lysiert. Lysates mit gleicher Anzahl von Zellen analysiert wurden durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), und der Fleck war vorbereitet und nach standard Western Blot-Protokolle bearbeitet. Mithilfe dieses Protokolls 2.000-5.000 HSCs routinemäßig analysiert werden können, und in einigen Fällen Daten erhalten Sie von nur 500 Zellen, im Vergleich zu den 20.000 bis 40.000 Zellen in den meisten Publikationen berichtet. Dieses Protokoll sollte generell für andere hämatopoetischen Zellen, und ermöglicht die routinemäßige Analyse einer kleinen Zahl von Zellen unter Verwendung von standard-Labor-Verfahren.

Introduction

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selbst erneuernde Zellen, die zu allen Blut Linien führen können. Sie sind relativ seltene Zellen im Knochenmark, biochemische Analysen schwierig zu rendern. Geeignet für die Analyse von seltenen Zellen, wie Durchflusszytometrie, Ansätze wurden äußerst nützlich zur Quantifizierung der relativer Mengen der Zelle oberflächenmarker und intrazelluläre Proteine. Aber die Analyse von intrazellulären Proteinen erfordert den Einsatz von Zelle Permeabilisierung Verfahren zur Antikörper-Zugriff zu ermöglichen, und nicht alle Zelle Oberfläche Epitope überleben diese Verfahren1,2. Darüber hinaus Antikörper, die Unterscheidung zwischen verschiedenen Isoformen oder das Dekolleté Proteinprodukte sind oft nicht für Durchflusszytometrie zur Verfügung, und daher die Ermittler noch setzen auf Western Blots für bestimmte Arten von Analysen.

Western-Blot Analyse der Zelle Lysates ist ein Routineverfahren in den meisten Labors. Zellen können unter heimischen Bedingungen, die die Epitope der Zelle Oberfläche Moleküle zu bewahren gereinigt werden, und anschließend Zelle Lysates vorbereitet und analysiert werden können. Jedoch kann die Analyse von Proteinen in seltenen Primärzelle, die Populationen von Western blot erforderlich euthanizing große Zahl von Tieren genügend Zellen zu erhalten. Durch kleine Anpassungen in mehreren Schritten, konnte einen konventionellen westlichen befleckenden Protokoll Proteine in relativ kleinen Stückzahlen HSCs (500-15.000, abhängig von dem Protein des Interesses) zu erkennen. Die Anpassungen beinhalten genau zählen der Zellen, Umgang mit sorgfältig die Zelle Pellet, Reduzierung der Übertragung von Zellen zwischen Rohren Zellverlust, zu minimieren und Lyse einer definierten Anzahl von Zellen mit einer konzentrierten Belastung mit Proteasom Puffern und Phosphatase-Inhibitoren. Viele veröffentlichten Berichte enthalten Western Blots erhalten mit 20.000 oder mehr HSCs3,4,5,6,7; Dieses einfache Verfahren reduziert die Anzahl der Zellen und Versuchstiere erforderlich, um entsprechende Daten von zwischen 4 und 40 Falte zu produzieren. Das Protokoll soll Ergebnisse pro Zelle und nicht um eine interne Kontrolle zu normalisieren. Dies ermöglicht eine Erfassung der allgemeine Rückgang der Protein-Ebene, die übersehen werden können, wenn Daten in eine interne Kontrolle normalisiert werden. Die Bedeutung der Normalisierung auf einer Basis pro Zelle wurde für die Analyse von Gen Ausdruck Daten8beschrieben, und das gleiche Prinzip gilt für die Quantifizierung der Proteine durch Western-Blot. Dieses optimierte Protokoll sollte nützlich für alle, die zu geringe Anzahl Zellen analysieren.

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Protocol

Alle Verfahren müssen im Einklang mit institutionellen Tiernutzung und Pflege-Richtlinien durchgeführt werden. Das Verfahren wurde entwickelt für die Analyse von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs und HPs), aber für die Analyse von anderen Zellpopulationen angepasst werden kann.

1. Flow Cytometry Isolation der murinen HSCs und HPs

  1. Murine Knochenmarkzellen zu ernten, wie in der Literatur6beschrieben.
    Hinweis: In die in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellten Daten, Knochenmark von Mäusen C57BL/6J geerntet wurde.
  2. Führen Sie Linie Erschöpfung der Knochenmarkzellen mit einem Maus-Linie Erschöpfung Kit, nach den Anweisungen des Herstellers.
  3. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen die Zelle oberflächenmarker von Interesse wie beschrieben7. In den Experimenten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt werden Antikörper gegen Sca-1, Kit, Flt3 und Abstammung (Lin) Marker Mac1, Gr1, CD3e, B220 und Ter119 verwendet.
  4. Sortieren von 2.000-20.000 LinSca1++ Flt3 Kit Zellen (HSCs) oder LinSca1Kit+ Zellen (HPs) in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen mit 0,1 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % fetalen Rind Serum (FBS).
    Hinweis: Für die Daten, die in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt, wurden Zellen mit einem Flow Cytometer mit einer Düse 70 µM sortiert. Die maximale Auffangvolumen beträgt 1,4 mL.

2. die Probenvorbereitung

Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig. Die Probe sehr sorgfältig verarbeitet. Beim Entfernen des Überstands vorsichtig nicht zu stören das Pellet Zelle sein.

  1. Zentrifuge die 1,5 mL Röhrchen mit sortierten Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g, für 5 min. entfernen Sie alle, aber rund 100 µL des Überstands aus der Zelle pellet sehr sanft mit einer Pipette und ein 20 µL pipettieren Tipp. Stören Sie das Pellet nicht.
    1. Wenn die Probe weniger als 5.000 Zellen enthält, und das Gesamtvolumen der sortierte Probe weniger als 0,2 mL beträgt, übertragen Sie die Zellen zunächst auf geringe Bindung 0,2 mL PCR-Röhrchen vor der Zentrifugation.
    2. Wenn die Probe enthält weniger als 5.000 Zellen und Volumen beträgt mehr als 0,2 mL, die Zellen spin-down mit einer Zentrifuge bei 4 ° C, 500 X g für 5 min, und entfernen Sie alle 200 µL des Überstands. Wieder aussetzen der gebeizte Zellen in die restlichen 200 µL überstand, dann übertragen die Zellen, die 0,2 mL PCR-Röhrchen und spin-down wieder. Entfernen Sie alle aber 20-30 µL aus der Pellets nach der zweiten Runde und auszusetzen Sie Zellen wieder.
  2. Aufschwemmen der Zellen im linken überstand in die Röhre. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche PBS in 2 % FBS/PBS (Sie können auch 2 % Rinderserumalbumin (BSA) / PBS oder PBS allein) zu einer Konzentration von 5 X104 bis 5 x 105 Zellen/mL.
    Hinweis: Verwendung die Zelle zählt erfassten zytometrie einzuschätzen, das Volumen, um die Zellen zu unterbrechen.
  3. Verwenden Sie 2 bis 5 µL der neu suspendierten Zellen, um eine genaue Zellkonzentration mit einem automatisierten Zelle Zähler (nach Herstellerangaben) oder eine Hemocytometer9bestimmen.
  4. Ein Volumen von neu suspendierten Zellen, in denen die gewünschte Anzahl von Zellen, die neue 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Für das Experiment in Abbildung 1wurden 2.000, 1.000, 500 HSCs oder HPs übertragen. Die gewünschte Anzahl von Zellen hängt von der Stärke des Signals durch die Western-Blot und empirisch ermittelt. Führen Sie die Übertragung mit 20 µL oder 100 µL Eppendorf PIPETTENSPITZE.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen in eine schwingende Eimer-Rotor bei 4 ° C, 500 X g für 5 min.
  6. Um 100 x Stammlösungen zu generieren, lösen Sie Proteasom und Phosphatase Inhibitoren in DMSO nach den Anweisungen des Herstellers auf.
  7. Bereiten Sie 2 X Laemmli Probenpuffer durch die 4 X Laemmli Probenpuffer des Herstellers mit einer äquivalenten Menge an destilliertem Wasser verdünnen. Fügen Sie eine entsprechende Menge an die 100 X Aktien von Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren, eine Endkonzentration von 2 X Inhibitoren in 2 X Laemmli Probenpuffer zu erhalten.
    Hinweis: Die 2 X Laemmli Probenpuffer kann im Voraus gebucht werden, aber die Proteasom und Phosphatase-Inhibitoren sollte unmittelbar vor dem Hinzufügen der 2 X Laemmli Probenpuffer (plus Inhibitoren), die Zelle Pellet zur lyse der Zellen, wie beschrieben im folgenden Schritt hinzugefügt werden.
  8. Sorgfältig entfernen Sie einen Teil des Überstands aus der Zelle Pellet und der überstand noch in die Röhre mit der Pellet-Zelle, fügen Sie ein gleiches Volumen von 2 X Laemmli Probenpuffer plus Proteasom und Phosphatase-Hemmer, eine Endkonzentration von 500 zu erreichen Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer.
    Hinweis: zum Beispiel, wenn 2.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 20 µL zu übertragen, um ein Rohr in Schritt 2.5, nach dem Zentrifugieren der Zellen (Schritt 2.6) sollten Sie 18 µL des Überstands von Pellets, entfernen und 2 µL des Überstandes, die ausgeführt wird fügen Sie zum gleichen Volumen (2 µL hinzu) 2 x Laemmli Probenpuffer, eine Endkonzentration von 500 Zellen/µL in 1 X Laemmli Probenpuffer zu erreichen.
  9. Aufschwemmen der Pellet um so schnell wie möglich die lysate zu generieren. An dieser Stelle die Proben können sofort durch SDS-PAGE Gelen electrophoresed werden, oder kann Snap in Flüssigkeit N2 eingefroren und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.

(3) Elektrophorese

  1. Erhitzen Sie Lysates im Heizblock bei 95 ° C oder in kochendem Wasser für 5 Minuten.
  2. 1-40 µL der Lysates (mit von 500 bis 20.000 Zelle äquivalente) durch SDS-PAGE Gelen bei 100V mit Standardprotokollen10electrophorese.
    Hinweis: Das Volumen der lysate in das Gel geladen wird bestimmt durch die Anzahl der Zellen benötigt, um das wünschenswerte Signal zu erzeugen, und richtet sich nach der Fülle des Proteins des Interesses und der Qualität des Antikörpers. Die Daten in Abbildung 1 wurden mit 2.000, 1.000 und 500 Zelle äquivalente lysate erhalten. Die Breite des Brunnens sollte im Bereich von 3 mm bis 1,5 mm. 1,5 mm, die Zähne werden können aus einem handelsüblichen Kamm mit breiteren Zähnen mit einer Schere geschnitten werden.

4. transfer und blockieren

Hinweis: Führen Sie ein Western-Blot nach Standardprotokollen11. Die Schritte werden hier kurz beschrieben:

  1. Vorbehandeln einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit Methanol für 10 s, dann waschen die Membran kurz mit Wasser destilliertem.
  2. Übertragen Sie das Protein aus dem SDS-PAGE-Gel an die Membran nach den Anweisungen in der Bedienungsanleitung des Herstellers des Geräts übertragen.
  3. Nach der Übertragung, die Membran mit 2 mL 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBST blockieren (PBS mit 0,1 % Tween) über Nacht bei 4 ° C nach Standardprotokollen11.

5. Antikörper Labeling

  1. Inkubieren Sie die Membran mit Antikörpern auf einen Shaker über Nacht bei 4 ° C vom Hersteller empfohlene Antikörper-Verdünnungen verwenden.
    Hinweis: In der Tabelle der Materialien, sind Antikörper, die wir für HSCs und HPs und die entsprechenden Antikörper-Verdünnungen überprüft haben, angezeigt. Führen Sie die Antikörper Kennzeichnung mit Standardverfahren8.

6. Nachweis

  1. Waschen Sie die Membran 3 mal 5 min für jede Wäsche in PBST bei Raumtemperatur.
  2. Inkubieren Sie die Membran mit 2 mL verstärkte Chemilumineszenz-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur. Erkennen Sie die Signale mit Hilfe eines abbildenden Systems nach Anweisungen, oder Autoradiographie Film und Film-Prozessor des Herstellers.

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Representative Results

Repräsentative Ergebnisse von 500-2.000 gereinigten HSCs und HPs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Das β-Aktin-Signal in Abbildung 1 kann aus so wenig wie 500 HSCs erkannt werden und HPs gereinigt aus dem Knochenmark von einem einzigen Mausklick. Beachten Sie, dass die Lysates in 1,5 mm Brunnen laden ein viel stärkeres Signal von 500 HPs als laden in 3,0 mm Brunnen produziert. Abbildung 2 ist ein Western-Blot EIF4G und die Phosphorylierung des Rps6 (p-Rps6), beide sind beteiligt an der Regulation des Proteins Übersetzung12, HSCs, und Faktor in HPs mit und ohne Stimulation durch Stammzellen (SCF) in Vitro.

Figure 1
Abbildung 1: Western-Blot für β-Aktin durchgeführt mit Lysaten aus Murine HSCs und HPs. Hsz wurden als LinSca1 von Abstammung erschöpft murinen Knochenmarkzellen sortiert++ Flt3 Kit Zellen und HPs waren Sca1 LinKit+. Lysaten aus verschiedenen Anzahlen von Zellen vorbereitet wurden electrophoresed durch eine 12 % SDS-PAGE Gel Mini Glasplatten mit 1 mm spacer zubereitet. Der Fleck war mit Antikörper gegen β-Aktin sondiert. Der Fleck zeigt die vergleichende β-Aktin-Signale von 500 bis 2.000 HPs, wenn die Lysates in 1,5 mm Brunnen (Gassen 4-6) im Vergleich zu 3 mm Brunnen geladen wurden (Bahnen 1 - 2). Lysaten von 2.000 bis 500 Zellen wurden auf Bahnen 7 bis 9 geladen. M, Molekulargewicht Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Western-Blot Analyse der frisch isolierte HSCs und HPs stimuliert in Vitro mit Zytokin Stem Cell Factor (SCF). HPs waren durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) gereinigt, zentrifugiert, Nukleinsäuretablette in 2 % FBS/PBS, gezählt, dann in zwei Röhren aufgeteilt. Die HPs in der ersten Röhre mit SCF stimuliert wurden (10 ng/mL) für 5 min bei 37 ° C (+ SCF) und HPs in der zweiten Röhre für 5 min in der Abwesenheit des SCF kultiviert wurden (-SCF). Die Zellen wurden dann zentrifugiert und das Pellet Zelle lysiert mit Laemmli Probenpuffer. Hsz wurden gereinigt und direkt mit Laemmli Probenpuffer ohne Kultivierung lysiert. Die Lysates wurden in 1,5 mm Brunnen geladen und durch 12 % SDS-PAGE Gelen electrophoresed. Der Fleck wurde entwickelt mit Antikörpern gegen Dehnung auslösende Faktor 4G (EIF4G), β-Aktin und phosphorylierten kleinen Ribosomen-Untereinheit S6 (p-Rps6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Western Blot ist ein verbreitetes Verfahren zur Erkennung von spezifischen Proteinen und die Aktivierung der Signalwege in Geweben oder Zellen. Durch die Einführung von kleinen Anpassungen zu einem häufig verwendeten Verfahren, konnten wir routinemäßig 15 verschiedene Proteine (Table of Materials) in 15.000 HSCs und in einigen Fällen in so wenig wie 500 HSCs erkennen. The Most wichtige Schritte in diesem Protokoll sind: (1) genau zählen die Zellen, 2) minimieren die Anzahl der Transfers zwischen Röhren und 3) Lyse der Zellen direkt mit Laemmli Probenpuffer. Wenn die Zelle Pellet mit Laemmli Probenpuffer Lyse, fanden wir, dass anstatt Entfernen aller überstand von der Zelle Pellet und es erneut in Laemmli Probenpuffer auszusetzen, wenn wir stattdessen ein kleines Volumen überstand in das Rohr Links und ein Äquivalent Volumen von 2 x Laemmli Probenpuffer, könnte wir Zellverlust vermeiden. Zentrifugieren der Zellen in einem schwingenden Eimer Rotor verringert auch das Risiko des zellverlustes. Verringerung der Breite des Brunnens durch Trimmen der Kamm Zähne verbessert die Nachweisempfindlichkeit.

Mit diesen einfachen Anpassungen an die Prozedur konnten wir gleichwertig mit den in Veröffentlichungen reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, die 10 - 20 mal mehr Zellen3,4,5,6, verwendet hatte 7. Darüber hinaus können die Flecken entfernt werden, für das neu zu beflecken, Anschluss an standard-Verfahren13, Erhöhung der Menge an Informationen, die eine kleine Anzahl von Zellen entnommen werden kann. Die Fähigkeit zu interessierender Proteine erkennen wird durch die Qualität der Antikörper und die Protein-Fülle begrenzt. Diese modifizierte Technik sollte erheblich reduzieren die Zahl der Tiere notwendig, Protein Daten aus seltenen Zellpopulationen zu erhalten.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgments

National Institutes of Health gewähren R01 CA149976 (N.A.S) unterstützt diese Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500 SDS-PAGE
TEMED Fisher Scientific BP150-20 SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution Bio-Rad 1610158 SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8 TEKNOVA T1588 SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8 TEKNOVA T1068 SDS-PAGE
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-25 SDS-PAGE
mini-protean 3 comb Bio-Rad 1653360 SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658005EDU SDS-PAGE
Transfer System Bio-Rad 1704155EDU transfer
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052EDU electrophoresis
Imaging System Bio-Rad 1708195 signal detection
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747EDU sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer Bio-Rad 1610732EDU electrophoresis
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710EDU sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots Bio-Rad 1704272 transfer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs Gold Biotechnology GB-450-1 sample preparation
EIF4G Cell signaling 2469 WB antibody, validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
p-Rps6 Cell signaling 4858 WB antibody,validated in 1000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated) abcam ab49900 WB antibody,validated in 500 cells
antibody concentration: 1:5000
reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3 Abcam ab48394 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
S6 Cell Signaling 2317 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1 Cell Signaling 9644 WB antibody, validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1 Cell Signaling 2855 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2 Cell Signaling 4308 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90 Cell Signaling 4877 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN Cell Signaling 9188 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR Cell Signaling 2983 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR Cell Signaling 5536 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB Cell Signaling 4953 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa Cell Signaling 2535 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:1000
reference(figure): ref5 (FigS1)
actin Santa Cruz sc-47778 WB antibody,validated in 15000 cells
antibody concentration: 1:3000
reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse) Miltenyi Biotec 130-090-858 hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns Miltenyi Biotec 130-041-305 hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF PeproTech 250-03 phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody ThermoFisher A15423 cell sorting
anti-B220 ThermoFisher 48-0452-82 cell sorting
anti-CD3e ThermoFisher 48-0031-82 cell sorting
anti-Mac1 ThermoFisher 48-0112-82 cell sorting
anti-Gr1 ThermoFisher 48-5931-82 cell sorting
anti-Ter119 ThermoFisher 48-5921-82 cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers Bio-Rad 1653311 SDS-PAGE
BSA Research Products International A30075 membrane blocking
serum Atlanta Biologicals A12450 medium supplement
cell counter Invitrogen AMQAF1000 cell counting
hemocytometer ThermoFisher  S17040 cell counting
flim Denville Scientific E3012 signal detection
medical film processor Konica SRC-101A signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Therom Scientific 34096 signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) Beckman Coulter X-15R sample preparation
BLUEstain protein ladder Gold Biotechnology P007-500 electrophoresis
cell sorter BD FACSAria II sample preparation
Incublock Denville Scientific I0510 electrophoresis

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References

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