एक इंजीनियर भाजित-रासायनिक TET2 एंजाइम inducible डीएनए Hydroxymethylation और Epigenetic remodeling के लिए

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

एक इंजीनियर विभाजन-TET2 एंजाइम (साइडर) स्तनधारी कोशिकाओं में रासायनिक inducible डीएनए hydroxymethylation और epigenetic remodeling के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं शुरू करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

डीएनए मिथाइल स्तनधारी जीनोम में एक स्थिर और heritable epigenetic संशोधन है और सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने के लिए जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में शामिल है । डीएनए मिथाइल के उलटा, या डीएनए में मिथाइल, dioxygenases के दस ग्यारह translocation (TET) प्रोटीन परिवार द्वारा मध्यस्थता है । हालांकि यह व्यापक रूप से सूचित किया गया है कि ंयायपालिका डीएनए मिथाइल और मिथाइल विकासात्मक दोषों और कैंसर के साथ जुड़े हैं, कैसे इन epigenetic परिवर्तन सीधे जीन अभिव्यक्ति या रोग प्रगति में बाद में बदलाव के लिए योगदान अस्पष्ट रहता है, मोटे तौर पर विश्वसनीय उपकरण की कमी के कारण को सही ढंग से जोड़ने या परिभाषित लौकिक और स्थानिक संकल्प में जीनोम में डीएनए संशोधनों को हटा दें । इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक विभाजन TET2 एंजाइम बस रसायनों को जोड़ने के द्वारा 5-methylcytosine (5mC) ऑक्सीकरण और स्तनधारी कोशिकाओं में epigenetic राज्यों के बाद remodeling के लौकिक नियंत्रण को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया । यहां, हम एक इंजीनियर विभाजन-TET2 एंजाइम के आधार पर एक रासायनिक-inducible epigenome remodeling उपकरण (साइडर), शुरू करने के लिए तरीकों का वर्णन स्तनधारी कोशिकाओं में और 5 के रासायनिक inducible उत्पादन को बढ़ाता-hydroxymethylcytosine (5hmC) के साथ immunostaining, फ्लो cytometry या एक डॉट-ब्लाट परख । यह केमिकल-inducible epigenome रिमॉडलिंग टूल जेनेटिक कोड में फेरबदल किए बिना सेलुलर सिस्टम को पूछताछ में व्यापक उपयोग के साथ-साथ विभिन्न जैविक प्रणालियों में epigenotype − phenotype संबंधों की जांच करने में भी मिलेगा ।

Introduction

डीएनए मिथाइल, अधिकांशतः 5-methylcytosine (5mC) बनाने के लिए cytosine की कार्बन 5 स्थिति को एक मिथाइल समूह के जोड़ को संदर्भित करता है, डीएनए मिथाइल-transferases (DNMTs) द्वारा catalyzed है । 5mC स्तनधारी जीनोम में एक प्रमुख epigenetic निशान के रूप में कार्य करता है कि अक्सर transcriptional दमन, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता और transposon मुंह1के लिए संकेत । डीएनए मिथाइल के उलटा होने से दस-elven translocation (TET) प्रोटीन परिवार की मध्यस्थता होती है. TET एंजाइमों का लोहा (II) और 2-oxoglutarate आश्रित dioxygenases जो 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxycytosine (5caC) के 5mC के परवर्ती ऑक्सीकरण उत्प्रेरित होते हैं । TET-मध्यस्थता 5mC ऑक्सीकरण स्तनधारी जीनोम पर epigenetic नियंत्रण की एक अतिरिक्त परत लगाता है । tet की खोज को लेकर epigenetic क्षेत्र में tet प्रोटीन और उनके प्रमुख उत्प्रेरक उत्पाद 5hmC के जैविक कार्यों का अनावरण करने में तीव्र रुचि छिड़ी हुई है. 5hmC न केवल एक मध्यवर्ती के दौरान TET-मध्यस्थता सक्रिय डीएनए2,3,4, लेकिन यह भी एक स्थिर epigenetic निशान के रूप में कार्य करता है5,6,7,8 . हालांकि डीएनए hydroxymethylation उच्च जीन अभिव्यक्ति और डीएनए hydroxymethylation में ंयायपालिका परिवर्तन के साथ संबंधित है कुछ मानव विकारों के साथ जुड़े रहे है9,10,11, कारण संबंध डीएनए और phenotypes पर epigenetic संशोधनों के बीच अक्सर स्थापित होने के लिए चुनौतीपूर्ण है, जो आंशिक रूप से विश्वसनीय उपकरण की कमी के लिए जिंमेदार सही ढंग से जोड़ने या हटाने के लिए परिभाषित लौकिक और स्थानिक में जीनोम में डीएनए संशोधनों को दूर किया जा सकता है रह संकल्प.

यहां हम एक रासायनिक inducible epigenome remodeling उपकरण (साइडर) के उपयोग के लिए डीएनए hydroxymethylation और जीन प्रतिलेखन के बीच कारण संबंधों के अध्ययन का सामना करना पड़ बाधा पर काबू पाने की रिपोर्ट । डिजाइन इस धारणा पर आधारित है कि TET2 (TET2CD) के उत्प्रेरक डोमेन दो निष्क्रिय टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है जब स्तनधारी कोशिकाओं और उसके एंजाइमी समारोह में व्यक्त एक रासायनिक inducible dimerization दृष्टिकोण लेने से बहाल किया जा सकता है ( चित्र 1a) । एक विभाजन-TET2CD प्रणाली स्थापित करने के लिए, हम TET2CD में छह साइटों का चयन किया, एक Cys-अमीर क्षेत्र और एक डबल-कतरा β-कुण्डल (DSBH) गुना, TET2-डीएनए परिसर की रिपोर्ट क्रिस्टल संरचना के आधार पर है कि एक कम जटिलता क्षेत्र की कमी का बना12। एक सिंथेटिक जीन एंकोडिंग rapamycin-inducible dimerization मॉड्यूल FK506 बंधन प्रोटीन 12 (FKBP12) और FKBP rapamycin बंधन डोमेन (FRB) के स्तनधारी लक्ष्य के rapamycin14,15, साथ में एक स्व-सट पेप्टाइड T2A पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम16,17, व्यक्तिगत रूप से TET2CD के भीतर चयनित विभाजित साइटों में सम्मिलित किया गया था । हमारे इंजीनियरिंग लक्ष् य के रूप में TET2 का चयन निं नलिखित बातों पर आधारित है । पहले, डीएनए hydroxymethylation में सहवर्ती कमी के साथ TET2 में दैहिक उत्परिवर्तनों अक्सर माइलॉयड विकारों और कैंसर10, जो संवेदनशील साइटों पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है के लिए टाल दिया सहित मानव विकारों में मनाया जाता है लन. दूसरा, TET2 उत्प्रेरक डोमेन का एक बड़ा अंश, विशेष रूप से कम जटिलता क्षेत्र, एंजाइमी समारोह के लिए औषधालय12, इस प्रकार हमें inducible epigenetic संशोधनों के लिए एक छोटे से विभाजित-TET2 शिल्प के लिए सक्षम करने के लिए । पर स्क्रीनिंग के बाद 15 निर्माण, एक निर्माण कि स्तनधारी प्रणाली में अपनी एंजाइमी गतिविधि के उच्चतम rapamycin-inducible बहाली का प्रदर्शन चुना और साइडर18के रूप में नामित किया गया था । हम वर्णन के साथ साथ mCherry के उपयोग के साथ साथ inducible डीएनए को प्राप्त करने के लिए hydroxymethylation और epigenetic rapamycin के साथ remodeling, और एक मॉडल सेलुलर प्रणाली 5hmC में एक साइडर मध्यस्थता HEK293T उत्पादन मान्य करने के लिए तीन तरीकों वर्तमान.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल कल्चर, प्लाज्मिड अभिकर्मक और केमिकल इंडक्शन

  1. संस्कृति एक अनुयाई सेल लाइन (जैसे, मानव भ्रूण गुर्दे HEK293T सेल) Dulbecco है संशोधित ईगल के माध्यम में (DMEM), 10% गर्मी के साथ पूरक-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन और streptomycin पर ३७ ° c के साथ 5% सह2.
  2. साइडर प्लाज्मिड के साथ Transfect कोशिकाओं ।
    1. अभिकर्मक से पहले कम 18 ज, बीज ०.३ x 106 कोशिकाओं में अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए 60-80% प्रवाह तक पहुंचने के लिए प्रति उपयुक्त DMEM के २.५ मिलीलीटर में ।
    2. पूर्व का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए अभिकर्मक एजेंट गर्म ।
    3. एक बाँझ ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम के २५० µ एल प्लेस ।
      नोट: यह राशि ८०% के साथ एक 6-अच्छी थाली के लिए सिलवाया है प्रवाह । यदि आवश्यक हो, आनुपातिक प्लेटें या कक्ष संख्याओं के आकार के अनुसार मध्यम मात्रा समायोजित करें ।
    4. प्लाज्मिड एंकोडिंग साइडर18 या TET2 के उत्प्रेरक डोमेन के २.५ µ g जोड़ें (सकारात्मक नियंत्रण के रूप में TET2CD)12,13 सीरम मुक्त माध्यम में और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    5. पतला डीएनए मिश्रण करने के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के ७.५ µ एल जोड़ें और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    6. 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन ।
    7. बदलें पूर्व मीडिया गर्म और मिश्रण बूंद कुओं को बुद्धिमान जोड़ने के लिए, और धीरे सेल संस्कृति थाली मिलाने के लिए समान रूप से अभिकर्मक रिएजेंट और डीएनए मिश्रण वितरित ।
    8. गर्मी कोशिकाओं और मिश्रण रात भर, और फिर ताजा पूरा DMEM के 2ml के साथ मीडिया युक्त अभिकर्मक रिएजेंट की जगह ।
  3. रासायनिक प्रेरण
    1. rapamycin स्टॉक के 2 मिमी पतला (DMSO में भंग) उचित पूर्ण माध्यम में 20 µ मीटर की एकाग्रता के लिए ।
    2. २०० एनएम के अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 2 मिलीलीटर मध्यम में बनाए रखा transfected कोशिकाओं को पतला rapamycin के 20 µ एल जोड़ें ।
      नोट: ४८ ज के लिए मशीन के बाद, कोशिकाओं 5hmC पीढ़ी या किसी अंय बहाव अनुप्रयोगों के ठहराव के लिए तैयार हैं । यदि आवश्यक हो, प्रेरण क्षमता आगे 5hmC ठहराव के लिए बाहर कोशिकाओं हर 3 ज लेने के रूप में नीचे वर्णित है और चित्रा 1में दिखाया द्वारा निगरानी की जा सकती है ।
    3. 5hmC प्रेरण दक्षता के बेहतर ठहराव के लिए, बीज अलग कुओं हर 3 घंटे कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए ।

2. Immunostaining द्वारा Rapamycin-प्रेरित 5hmC उत्पादन का ठहराव

  1. 5hmC इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग
    नोट: निर्धारण समाधान की पर्याप्त मात्रा जोड़ें, 4% paraformaldehyde से बना, 3 एन एचसीएल के साथ पंजाब में ०.२% surfactant (जैसे ट्राइटन एक्स-१००), प्लेट में सभी कोशिकाओं को कवर करने के लिए । उदाहरण के लिए, समाधान के ५०० µ l के लिए पर्याप्त होगा एक अच्छी तरह से एक 6-वेल प्लेट में. कमरे के तापमान पर सभी चरणों का पालन करें ।
    1. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, पंजाब में 4% paraformaldehyde परिवेश के तापमान पर 15 मिनट के लिए rapamycin-इलाज कोशिकाओं को जोड़ें । नियंत्रण समूह के लिए, rapamycin उपचार के बिना mCherry-साइडर एक्सप्रेस कोशिकाओं का उपयोग करें । आंदोलन न करें ।
      सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है । उपयुक्त सुरक्षा पहनें ।
    2. निर्धारण समाधान छोड़ें । permeabilize सेल झिल्ली के लिए 30 मिनट के लिए पंजाब में ०.२% surfactant के साथ स्थिर कोशिकाओं की मशीन ।
    3. permeabilization समाधान छोड़ें । permeabilized कोशिकाओं के लिए 3 एन एचसीएल जोड़ें और 15 मिनट के लिए गर्मी डीएनए स्वभाव के लिए ।
    4. hcl छोड़ें. १०० mM Tris-hcl बफर (ph ८.०) को कोशिकाओं के लिए 10 मिनट के लिए पीएच के बेअसर में जोड़ें ।
    5. सभी समाधान छोड़ें । 3-5 बार के लिए पंजाबियों के साथ अच्छी तरह से कोशिकाओं को धो लें । पंजाबियों को अच्छी तरह से निकालें ।
      नोट: हर धोने के कदम के लिए पंजाबियों की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें । उदाहरण के लिए, पंजाब के 1 मिलीलीटर 6-वेल प्लेट के लिए पर्याप्त है ।
    6. अवरुद्ध बफर जोड़कर ब्लॉक 1% BSA और surfactant के ०.०५% (जैसे 20 के बीच के रूप में) 1 एच के लिए के रूप में कोमल मिलाते हुए ।
    7. ब्लॉकिंग समाधान छोड़ें । कोशिकाओं को पतला 5hmC एंटीबॉडी (1:200) जोड़ें और कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए गर्मी ।
    8. 15 मिनट के लिए तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    9. एक पतला fluorophore जोड़ें (FITC)-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200) कोशिकाओं और 1 एच के लिए मशीन के लिए ।
    10. अवशिष्ट एंटीबॉडी हटाने के लिए तीन बार बड़े पैमाने पर पंजाब के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    11. जोड़ें २५० एनजी/एमएल के 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के लिए नाभिक दाग 5 min. धुंधला समाधान निकालें ।
    12. स्लाइड या कांच के नीचे फोकल इमेजिंग के लिए immunostained कोशिकाओं के साथ संस्कृति पकवान माउंट । चित्र 1bमें एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया था ।
  2. प्रवाह cytometry
    नोट: निंनलिखित धुंधला प्रक्रिया के लिए एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट का प्रयोग करें । आमतौर पर, १५० µ एल रिएजेंट के लिए पर्याप्त है प्रत्येक अच्छी तरह से ।
    1. FACS बफ़र में transfected और rapamycin-प्रेरित कक्षों को पुनः निलंबित करें (पंजाबियों के साथ 1% BSA, 2 mM EDTA) । नियंत्रण समूह के लिए, rapamycin उपचार के बिना साइडर-एक्सप्रेस कक्षों का उपयोग करें ।
    2. Fix और permeabilize चरण २.१ में वर्णित के रूप में कक्ष ।
    3. 10 मिनट के लिए डीएनए स्वभाव करने के लिए कोशिकाओं के लिए 2 एन एचसीएल जोड़ें ।
    4. HCl छोड़ें. बेअसर और चरण २.१ में वर्णित के रूप में कक्षों को अवरोधित करें ।
    5. कोशिकाओं को पतला विरोधी 5hmC एंटीबॉडी (1:200) जोड़ें और कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    6. FACS बफ़र वाले कक्षों को तीन बार धोएं । FACS बफ़र को अच्छी तरह से निकालें ।
    7. एक पतला fluorophore जोड़ें (FITC)-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) प्रतिदीप्ति के लिए सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) विश्लेषण, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन.
    8. FACS बफ़र वाले कक्षों को तीन बार धोएं ।
    9. नमूने FACS विश्लेषण के लिए तैयार हैं । चित्रा 1C-डीमें एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया ।

3. बिंदी-दाग परख 5hmC और 5-methylcytosine (5mC) मात्रा को बढ़ाता है

  1. एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर transfected और rapamycin प्रेरित कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए को अलग । नियंत्रण समूह के लिए, rapamycin उपचार के बिना साइडर-transfected कक्षों का उपयोग करें ।
  2. ८० ° c और डबल आसुत एच2हे में पूर्व सोख nitrocellulose झिल्ली को वैक्यूम ओवन गर्मी और फिर 6x खारा में सोडियम साइट्रेट (एसएससी) 10 मिनट के लिए बफर ।
  3. डीएनए की बराबर मात्रा के ६० µ एल लोड (कुल 2 µ g ते बफर में) एक ९६-well पीसीआर प्लेट के लिए । ते बफर के 30 µ एल जोड़ें (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०) बाकी कुओं के लिए ।
  4. पंक्ति 2 पर एक ही कॉलम की स्थिति के लिए 1 पंक्ति पर समाधान के 30 µ एल स्थानांतरित द्वारा ९६-अच्छी तरह से प्लेट पर खड़ी दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ । फिर से मिक्स और सीमा तक पहुंचने तक अनुवर्ती पंक्ति में कुओं के समाधान के 30 µ एल हस्तांतरण ।
पिछले 30 µ निकालें l
  • 1 मीटर NaOH और 10 मिमी EDTA के 20 µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से, प्लेट सील और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी पूरी तरह से डीएनए द्वैध स्वभाव ।
  • तुरंत बर्फ पर नमूने शांत और बर्फ के ५० µ l-ठंड 2 एम अमोनियम एसीटेट (पीएच ७.०) जोड़ें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    नोट: कदम 3.7-3.10 निर्वात का उपयोग शामिल है ।
  • पूर्व लथपथ झिल्ली के साथ डॉट दाग उपकरण को इकट्ठा करने और पूर्ण वैक्यूम का उपयोग कर अवशिष्ट बफर हटा दें ।
  • एक अच्छी तरह से डॉट दाग उपकरण के लिए एक बफर के २०० µ एल जोड़कर झिल्ली धो लो । ते बफ़र को निकालने के लिए वैक्यूम चालू करें ।
  • विकृत डीएनए लोड (पिछले कदम 3.1-3.6 में तैयार) डॉट दाग उपकरण के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए । समाधान निकालने के लिए वैक्यूम चालू करें ।
  • 2x एसएससी के २०० µ एल जोड़कर झिल्ली धोने और पूरी तरह से वैक्यूम का उपयोग अवशिष्ट समाधान को हटा दें ।
  • डॉट दाग उपकरण जुदा, बाहर झिल्ली ले और 2x एसएससी के 20 मिलीलीटर के साथ पूरी झिल्ली कुल्ला ।
  • हवा-20 मिनट के लिए झिल्ली सूखी ।
  • 2 एच के लिए निर्वात के तहत ८० डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेंकना ।
  • अवरुद्ध समाधान जोड़ें (5% TBST में दूध स्किम) के लिए झिल्ली और गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  • ब्लॉकिंग समाधान छोड़ें । एक पतला 5hmC जोड़ें (1:5000) या 5mC (1:1000) एंटीबॉडी झिल्ली के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  • TBST के साथ झिल्ली धो 10 मिनट के लिए तीन बार अवशिष्ट एंटीबॉडी को दूर करने के लिए । TBST को अच्छी तरह निकाल लें ।
  • एक एचआरपी जोड़ें-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1: विरोधी के लिए 10000-खरगोश एचआरपी (5hmC) या 1:3000 विरोधी माउस एचआरपी (5mC) के लिए) झिल्ली और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन के लिए ।
  • 10 मिनट के लिए तीन बार TBST के साथ झिल्ली धो लें ।
  • एक chemiluminescence डिटेक्टर का उपयोग 5hmC संकेतों के दृश्य के लिए झिल्ली के लिए ECL पश्चिमी सोख्ता सब्सट्रेट जोड़ें. चित्रा 1Eमें एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया ।
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    रासायनिक inducible 5mC-to-5hmC रूपांतरण एकल सेल स्तर पर immunostaining द्वारा मान्य किया जा सकता है, cytometry पर प्रवाह transfected विश्लेषण (mCherry पॉजिटिव) कोशिका आबादी, या एक अधिक मात्रात्मक डॉट-दाग परख के रूप में चित्रा 1में सचित्र । TET2, या TET2CD के उत्प्रेरक डोमेन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में अध्ययन भर में इस्तेमाल किया गया । 5hmC और क्रोमेटिन पहुंच में rapamycin-प्रेरित परिवर्तनों के जीनोम-वाइड मानचित्रण के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 18-20 देखें ।

    Figure 1
    चित्रा 1: साइडर-मध्यस्थता inducible डीएनए hydroxymethylation में HEK293T कोशिकाओं. (एक विभाजन TET2 एंजाइम के आधार पर एक रासायनिक-inducible epigenome रिमॉडलिंग (साइडर) उपकरण कीएक) डिजाइन । (ऊपरी पैनल) और (निचले पैनल) rapamycin उपचार (२०० एनएम) के बाद से पहले साइडर-mCherry व्यक्त HEK293T कोशिकाओं में () प्रतिनिधि immunostaining परिणाम. हरा, 5hmC, लाल, साइडर-mCherry, ब्लू, नाभिक के DAPI धुंधला । स्केल बार = 10 µm. (C) ठहराव की साइडिंग-मध्यस्थ 5hmC उत्पादन द्वारा प्रवाह cytometry विश्लेषण । HEK293T कोशिकाओं transfected के साइडर-mCherry के साथ TET2CD-mCherry (सकारात्मक नियंत्रण के रूप में) एक विरोधी 5hmc प्राथमिक एंटीबॉडी और एक FITC-लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग थे. केवल TET2 (mCherry) और 5hmC (FITC) डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को gated और संकेत दिया गया । (D) HEK293T कोशिकाओं में 5hmC के रासायनिक inducible उत्पादन का समय पाठ्यक्रम (२०० एनएम) rapamycin की साइडिंग के बाद प्रशासन या आहरण को व्यक्त करता है । n = 5, डेटा के रूप में दिखाया मतलब ± S.D. (E) डॉट-दाग परख HEK293T कोशिकाओं में 5hmC के स्तर में rapamycin-inducible परिवर्तन यों तो । HEK293T कोशिकाओं या तो एक साइडर या TET2CD निर्माण के साथ transfected थे । एक कृत्रिम oligonucleotide 5hmC की एक ज्ञात मात्रा के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण (शीर्ष पंक्ति) के रूप में उपयोग किया गया था । लोड हो रहा है ईथीलीन इनपुट डीएनए की कुल मात्रा के नीले दाग द्वारा कल्पना नियंत्रण नीचे पैनल में दिखाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    यहाँ हम एक इंजीनियर विभाजन का उपयोग सचित्र है-TET2 एंजाइम डीएनए hydroxymethylation के लौकिक नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए. 5-methycytosine dioxygenase के tet परिवार की खोज के बाद, कई अध्ययनों से tet प्रोटीन के जैविक कार्यों को समझने के लिए प्रदर्शन किया गया है और उनके प्रमुख उत्प्रेरक उत्पाद 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. तथापि, लौकिक और जीनोम में डीएनए संशोधनों पर सटीक नियंत्रण के लिए क्षेत्र के लिए एक मांग चुनौती हो रही है । हमारे साइडर प्रणाली के कुछ एक इंजीनियर इस तकनीकी अंतर को भरने एंजाइम को संशोधित डीएनए का उपयोग प्रणालियों में से एक है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल ज्यादातर मॉडल सेलुलर सिस्टम, जैसे मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T और हेला सेल लाइनों के लिए सिलवाया है । Rapamycin सांद्रता और उपचार के समय के लिए विभिंन प्रकार के सेल में इष्टतम प्रदर्शन को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । पता लगाने के लिए सबसे अच्छा 5hmC प्रेरण समय बिंदु, एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग, जैसा कि हम धारा 1.3.3 में वर्णित है, दृढ़ता से सिफारिश की है । transfected कोशिकाओं में 5hmC के इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग सबसे सुविधाजनक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक और अधिक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक डॉट दाग परख की सिफारिश की है, लेकिन यह अधिक श्रमसाध्य प्रक्रियाओं ले सकता है । डॉट दाग परख के लिए, इनपुट डीएनए की मात्रा अलग सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । एक सावधान अनुमापन प्रयोग 2 का उपयोग-अलग डीएनए लोड हो रहा है मात्रा के साथ सीरियल कमजोर पड़ने की सिफारिश की है ।

    साइडर प्रणाली मोटे तौर पर विभिन्न जैविक प्रणालियों में डीएनए hydroxymethylation और phenotypic परिवर्तन के बीच सहसंबंध टुकड़े करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नीचे सूचीबद्ध अनुकरणीय बहाव आवेदन या सवाल है कि साइडर प्रणाली के साथ संबोधित किया जा सकता है ।

    कैसे होगा TET-मध्यस्थता 5mC ऑक्सीकरण विभिन्न मॉडल सेलुलर प्रणाली में डीएनए मिथाइल परिदृश्य को बदलने? इससे अब rapamycin इलाज से पहले और बाद में डीएनए methylome और hydroxymethylome की तुलना करके आसानी से संबोधित किया जा सकता है । कैसे होगा DNA hydroxymethylation बदल क्रोमेटिन पहुंच और citrullinated संशोधन? एक ही सेल में ATAC-seq और चिप-seq परिणामों की तुलना से पहले और बाद में प्रशासन rapamycin जवाब बताएगा । चूंकि tet प्रोटीन कुछ खास प्रकार के कैंसर में दबी भूमिका निभाते हैं, इसलिए यह परीक्षण करना दिलचस्प होगा कि tet प्रोटीन और 5hmC उत्पादन की रासायनिक inducible बहाली ट्यूमर के विकास पर कैसे होगी । TET/5hmC की भूमिका को देखते हुए स्टेम सेल विभेद में, यह निर्धारित किया जा सकता है कि कैसे एक परिभाषित संक्रमणकालीन चरण में अस्थाई नियंत्रित 5hmC उत्पादन स्टेम सेल के विकास के दौरान वंश विनिर्देशन पर प्रभाव पड़ेगा ।

    इसके वर्तमान विन्यास में, साइडर प्रणाली केवल 5mc-टू-5hmC रूपांतरण के लिए वैश्विक रूप से प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आदर्श रूप में, साइडर एक उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 या उसके orthologues, जो loci विशिष्ट लक्ष्यीकरण और inducible के जीनोम में डीएनए मिथाइल संपादन सक्षम हो जाएगा के साथ जुड़े हो सकता है । इस तरह के सटीक रासायनिक inducible epigenome रिमॉडलिंग उपकरण व्यापक रूप से आनुवंशिक कोड को बदलने के बिना स्पष्ट रूप से स्तनधारियों में epigenotype-phenotype संबंधों की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

    Acknowledgments

    हम स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों (R01GM112003 YZ), वेल्च फाउंडेशन (BE-१९१३ को YZ), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-16-215-01 TBE को YZ), कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (RR140053 करने के लिए YH से वित्तीय सहायता का शुक्र है, RP170660 to YZ), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16IRG27250155 to YH), और जॉन एस डन फाउंडेशन सहयोगी अनुसंधान पुरस्कार कार्यक्रम ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6, (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152, (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19, (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30, (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115, (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506, (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20, (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139, (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7, (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109, (21.29), 1-9 (2015).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics