Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Developmental Biology
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

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Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).

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Abstract

Fortschritte in der 3D Culture der intestinalen Gewebe durch Biopsie gewonnen oder aus pluripotenten Stammzellen über gezielte Differenzierung generiert haben dazu geführt, dass anspruchsvolle in-vitro- Modelle der Darmschleimhaut. Nutzt diese aufstrebenden Modellsysteme erfordert Anpassung der Werkzeuge und Techniken für 2D Kultur-Systeme und Tiere entwickelt. Hier beschreiben wir eine Technik zur Messung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen in Echtzeit. Dies geschieht durch Mikroinjektion von Eindringmittel beschriftet Dextran und Bildgebung auf einem inversen Mikroskop mit Epifluorescent Filter ausgestattet. Echtzeit-Messung der Durchlässigkeit Barriere im Darm Organellen erleichtert die Generation der hochauflösenden Zeitdaten im menschlichen Darm Epithelgewebe, obwohl diese Technik auch auf festen Timepoint imaging Ansätze angewendet werden kann. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität nach Exposition gegenüber pharmakologische Agenten, Bakterienprodukte oder Giftstoffe oder lebenden Mikroorganismen. Mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls dient auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion der intestinalen Organellen und Benutzer können beschließen, dieses Protokoll durch zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion zu ergänzen.

Introduction

Das Darmepithel bildet eine selektive Barriere, die den gerichteten Transport von Nährstoffen, H2O, Ionen und Abfallprodukte vermittelt bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Diffusion-vermittelten Austausch von andere Partikel zwischen Lumen und der mesenchymale Gewebe oder Blut Versorgung1,2. Die unspezifische Durchlässigkeit der intestinalen epithelialen Barriere galt lange Zeit einen wichtigen funktionelle Parameter in Gesundheit und Krankheit3,4,5,6, das spiegelt die Rate der Verbreitung von kleinen Molekülen über das Epithel über den parazellulär Platz. Messung der epitheliale Barriere Permeabilität kann durchgeführt werden, Tiermodelle7 und in menschlichen Patienten8 durch die Einnahme von Lactulose, hat keine spezifischen Transporter in den Magen-Darm-Trakt und die anschließende Sammlung und Messung von Lactulose Konzentrationen im peripheren Blut. Alternative eingenommen Marker der Barrierefunktion wie Eindringmittel beschrifteten Kohlenhydrate sind auch verfügbar9,10. Dieser Ansatz wurde angepasst für intestinale epitheliale Zellkulturen auf Transwell unterstützt11, einen vereinfachten Ansatz, ermöglicht eine bessere Kontrolle der experimentellen aber auch als schlechter Prädiktor für in Vivo kritisiert worden, angebaut Durchlässigkeit aufgrund des Fehlens von differenzierten epithelialen Subtypen und Gewebe Struktur12. Mit Kammern stellen einen weiteren Ansatz dar und ermöglichen die Messung der epitheliale Barriere-Funktion im ganzen Darmschleimhaut Ex Vivo13. Anwendung dieser Technik wird häufig durch Gewebe Verfügbarkeit und Zustand13,14begrenzt. Daher sind neue Methoden, die Reproduzierbarkeit und Durchsatz mit physiologische Relevanz Gleichgewicht notwendig.

Jüngste Entwicklungen in in-vitro- Organogenese führten zu die Annahme von 3D Gewebekultur Modellsysteme als eine anspruchsvolle Plattform für Rekapitulation der Dynamik von komplexen Gewebe15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Vor allem menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) abgeleitet menschlichen Darm Organellen (Chios)19,24 entstanden als reproduzierbar und experimentell gefügig Modellsystem für die Untersuchung von Host-mikrobielle Wechselwirkungen und epitheliale Barriere Dynamik25,26,27,28. In ähnlicher Weise menschliche Gewebe-abgeleitete Organellen (auch bekannt als Enteroids) können aus einem einfachen Biopsie-Verfahren abgeleitet werden und können als gefügig System verwendet werden, um die menschliche Physiologie und Krankheit15,29,30studieren. Mikroinjektion der menschliche Darm Organellen ermöglicht die Lieferung von experimentellen Verbindungen25 oder Mikroben25,31,32,33 , die apikale epithelialen live Oberfläche des organoide Lumen. Leslie und Huang Et al. 25 angepasst vor kurzem diese Technik zur Messung der Barriere Permeabilität in Chios mit Fluorescein erfolgt (FITC) Dextran nach Exposition gegenüber bakteriellen Toxinen beschriftet mikroinjiziert.

Dieses Protokoll dient als Leitfaden für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Chios hPSC abgeleitet und Gewebe abgeleitet Chios mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit geringfügigen Änderungen kann es auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion von Chios mit experimentellen Verbindungen dienen. Benutzer können dieses Protokoll mit zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion ergänzen.

Protocol

Normal, wurden verstorbenen Organspender durch das Geschenk des Lebens, Michigan anonymisierte menschlichen Erwachsenen Darmgewebe entnommen. Humanen Zelllinie H9 (NIH Register #0062) wurde vom Forschungsinstitut WiCell erhalten. Alle menschlichen Gewebe verwendet in dieser Arbeit wurde von nicht-lebenden Spendern erhalten, wurde de-identifiziert und wurde mit Zustimmung von der University of Michigan IRB (Protokoll Nr. HUM00093465 und HUM00105750) durchgeführt.

1. Microinjector-Setup

  1. Erhalten Sie die Materialien, die in Materialien Tabelleaufgeführt.
  2. Legen Sie Mikromanipulator, sezierenden Umfang und Lichtquelle in der Biosicherheit Kabinett. Die Mikroinjektion Setup mit 70 % Ethanol oder andere Desinfektionsmittel vor dem experimentellen Gebrauch zu reinigen. Vermeiden Sie längeren Exposition gegenüber Desinfektionsmitteln, enthalten Bleichmittel, die Mikroinjektion Ausrüstung korrodieren kann.
    Hinweis: Ein Beispiel für eine komplette Microinjector-Baugruppe ist in Abbildung 1gezeigt.
  3. Positionieren Sie den sezierenden Umfang, so dass das Okular über den Zugang Port in der Abschirmung für die Biosicherheit Schrank genutzt werden kann.
    1. Alternativ verwenden Sie einen sauberen Werkbank mit positiven Luftführung anstelle eines Biosafety Schrank mit Mikroskop-Access-Points.
  4. Montieren Sie der Mikromanipulator auf der rechten Seite des Mikroskops entsprechend den Anweisungen des Herstellers und so stellen Sie ein, dass die Steuerelemente und leicht angepasst werden können. Der Mikromanipulator sollte auf einer Eisenplatte montiert oder sonst stabilisiert.
    Hinweis: Linkshänder sollten die Mikromanipulator auf der linken Seite des Bereichs sezierenden platzieren.
  5. Befestigen Sie die Halterung Mikropipette zum Mikromanipulator Arm und verbinden Sie die analoge Schläuche durch die Mikropipette Halter einlegen.
  6. Füllen Sie die Spritze, 10 mL Glas mit ca. 5-7 mL sterilem Mineralöl.
  7. Schließen Sie die 10 mL Glasspritze gefüllt mit Mineralöl zum offenen Ende des analogen Schläuche mit Luer-Lock-Mechanismus. Legen Sie auf der linken Seite des Bereichs sezierenden der Glasspritze gegenüber dem Mikromanipulator.
  8. Drücken Sie vorsichtig die Spritze, Mineral-Öl durch den Schlauch schieben. Spülen Sie ca. 10 Tropfen Mineralöl von der Spitze des Inhabers Mikropipette und in eine Petrischale oder ähnliche Behälter sammeln Sie und entsorgen.
    Hinweis: Diese Schritt entfernt alle Luft aus dem Schlauch und sollte vor jeder Mikroinjektion durchgeführt werden.

2. Vorbereitung für die Mikroinjektion

  1. 24 h vor der Mikroinjektion:
    1. Bereiten Sie FITC-Dextran-Lösung durch erneute Aussetzung FITC-Dextran in einer Konzentration von 2 mg/mL in sterilen PBS oder Kochsalzlösung vor. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von > 250 µL.
      Hinweis: Höhere oder niedrigere Konzentrationen von FITC-Dextran verwendet werden, angefangen bei ca. 0,1 - 10 mg/mL. Passen Sie die Konzentration der FITC-Dextran flussabwärts der imaging-Anwendung entsprechend an.
    2. Setup organoide Kulturen auf Glasobjektträger Kammer 4 oder 8-Brunnen oder anderen Kulturgefäß geeignet für Mikroskopie, mit Leben bis zu 4-6 Chios pro Bohrloch, eingebettet in 50 µL Zelle Matrixlösung und kultiviert in EGF, Birne und R-Spondin (ENR) Wachstumsfaktor Medien 19 ,24. Achten Sie darauf, die Organellen gleichmäßig (ca. 5 mm Abstand) Raum, um zu vermeiden, mehrere Chios in einem einzelnen mikroskopischen Feld während bildgebende Analyse in Echtzeit erfassen. Eine vollständige Anleitung zur HIO finden Sie unter Kultur und Wartung McCraken Et al. 24.
      Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit Stammzellen abgeleitete Chios entwickelt und die repräsentativen Ergebnisse (siehe unten) zeigen die Verwendung dieses Modells Gewebekultur. Allerdings ist das gleiche Protokoll Gewebe abgeleitet intestinalen epithelialen Organellen15,29leicht angepasst. Chios Gewebe abgeleitet sind in der Regel kleiner als PSC abgeleitet Chios und das Fehlen der unterstützenden mesenchymalen basolateralen Zelle Struktur15,29,30. Mikroinjektion von Gewebe abgeleitet Chios könnt erfordern ein höheres Maß an technischen Fähigkeiten und erleben. Der Grad an dem epitheliale Barriere Permeabilität Daten Gewebe abgeleitet Chios mit hPSC abgeleitet Chios korrelieren können ist nicht bekannt.
    3. Inkubieren Sie Chios in eine Standardzelle Kultur Inkubator an 42 ° C und 5 % CO2 vor der Mikroinjektion.
  2. Schalten Sie 30 Minuten vor der Mikroinjektion, die Biosicherheit Kabinett und heben Sie das Glas Schild auf die optimale Arbeitshöhe.
  3. Entfernen Sie alle unnötigen Gegenstände aus der Biosicherheit Kabinett. Unordnung erhöht das Risiko von Leckagen oder andere Unfälle bei Arbeiten in Räumen engen.
  4. Sprühen Sie und reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70 % Ethanol oder andere Desinfektionsmittel. Wischen Sie mit einem Papiertuch.
  5. Überprüfen Sie die Ebene von Mineralöl in das Glasspritze an der Microinjector befestigt. Ist weniger als 3 mL Mineralöl verbleibenden, Schrauben Sie die Spritze und Nachfüllen Sie innerhalb der Biosicherheits Kabinett, achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Füllen Sie nicht mehr als 7 mL.
  6. Schalten Sie die Lampe, sezierenden Rahmen zu beleuchten. Passen Sie das Okular für individuellen Komfort.
  7. Der Mikromanipulator auf der rechten Seite des Bereichs sezierenden zu positionieren. Der Mikromanipulator auf einer Eisenplatte mit einem Magnetstativ zu sichern. Wechseln Sie die Magnetstativ auf OFF stellen, passen die Position der Mikromanipulator und sichern den Stand auf der Eisenplatte indem die Magnetstativ auf die ON-Position.
  8. Microcapillary installation
    1. Abrufen einer einzigen 1 mm Glas Filament aus dem Vorratsbehälter des Herstellers.
    2. Legen Sie das Glas Filament durch das Zentrum der Kupfer Heizwendel der Mikropipette Puller.
      Hinweis: Siehe Abbildung 2 eine Anleitung zur Vorbereitung des Mikropipette Abziehers.
    3. Positionieren Sie das Filament so, dass das Kupfer Heizregister etwa in der Mitte der Glas-Filament ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Puller zwei nutzbare Mikroinjektion Nadeln aus jedem Glas Filament erzeugt.
    4. Sichern Sie das Glas Filament mit, die die Klammern durch das Anziehen der Spitze zuerst, Klemmen Sie dafür sorgen, dass das Glas Filament innerhalb der gekerbten Hain zu Bruch zu verhindern gesichert ist.
    5. Erweitern Sie die Puller Arm auf seine maximale vertikale Position vor dem Anziehen der unteren Klemme.
      Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig. Voll die Puller Arm Strecken wird in unregelmäßigen Trennung der beiden Abschnitte des Heizfadens Glas Nichtbeachtung.
    6. Überprüfen Sie die Einstellungen für die Heizung und ziehen Mechanismus.
Wählen Sie Heat #1 mit dem Knebel (990) und ziehen an 059 (Abbildung 2).
  • Schalten Sie das Gerät mit der On/Off-Schalter.
  • Schließen Sie die schützende Plexiglas Schild und drücken Sie die PULL-Taste an der unteren rechten Fläche von den Abzieher. Die Kupferspirale beginnt zu heizen und leuchtend Orange leuchtet. Die Temperatur steigt, startet das Glas Filament zu dehnen und schließlich zu trennen. Bei der Trennung der beiden Enden des Fadens Glas schaltet sich das Instrument nach unten.
    Hinweis: Die Kupferspirale bleibt für einige Minuten extrem heiß. Gezogenem Glas Filament wird als ein "Microcapillary" von diesem Punkt vorwärts im Protokoll bezeichnet.
  • Dabei darauf achten, berühren Sie die Kupferspirale, ein Glas Mikrokapillaren zu entfernen. Die Microcapillary sollte eine sehr feine Spitze haben. Microcapillary mit Latex oder Nitril-Handschuhe sorgfältig zu behandeln und unverzüglich an das Biosafety-Kabinett, enthält das Microinjector Setup.
    Hinweis: Die Glas-Microcapillary ist extrem scharf und sehr zerbrechlich. Mit Vorsicht handhaben.
  • Lösen Sie die Endkappe des Mikromanipulator Arm. Legen Sie das stumpfe Ende zog Microcapillary in das offene Ende des Inhabers Mikropipette und schieben Sie es nach innen bis er stoppt.
  • Sichern Sie das stumpfe Ende der Microcapillary mit dem Mikromanipulator Arm durch die Endkappe wieder anziehen.
    Hinweis: Bei der Installation der Microcapillary auf die Mikroinjektion System um zu vermeiden, berühren die geschärfte Ende kümmern. Dadurch verringert sich die Möglichkeit einer Kontamination und die feine Spitze für die Mikroinjektion bewahren. Nicht richtig die Microcapillary gesichert führt zu Instabilität oder Bruch des Heizfadens Glas während der Mikroinjektion.
  • Öffnen Sie die Spitze des Glas-Microcapillary. Während der Zubereitung von gezogenem Glas Microcapillary schmilzt die Spitze des Punktes wahrscheinlich so das Spitze Ende des Microcapillary zu versiegeln. Um diese Blockade zu entfernen:
    1. Positionieren Sie der Mikromanipulator so, dass die Microcapillary nach unten auf die Glas-Bühne des Bereichs sezierenden gerichtet ist, ohne diese Oberfläche zu berühren.
    2. Eine sterile Kunststoffoberfläche zu finden (die Unterseite der Platte Deckel Kultur funktioniert perfekt) und legen Sie es auf den Mikroskoptisch direkt unterhalb der Microcapillary Nadel auf der Bühne des Bereichs sezierenden.
    3. Zentrieren Sie die Spitze des Microcapillary unter den Anzeigebereich und sicherzustellen Sie, dass es sichtbar, beim Blick durch das Okular des Mikroskops unter 1,5 X Vergrößerung ist.
    4. Mit den Steuerelementen Mikromanipulator Mikromanipulator Arm langsam vorwärts und Microcapillary in Richtung der sterile Kunststoff Kultur Deckel, bis die Spitze kaum die Kunststoffoberfläche und die Spitze der Microcapillary berührt losreißt.
      Hinweis: Ziel für die kleinste mögliche Pause, die Strömung von der Glas-Filament ermöglicht, um die Schäden an den HIO während Mikroinjektion zu minimieren.
    5. Sichern Sie die Microcapillary aus der sterilen Fläche um die Möglichkeit der versehentlichen Bruch bevor Sie fortfahren zu minimieren.
    6. Überprüfen Sie die Microcapillary für Durchfluss durch Niederdrücken der Glasspritze, Mineral-Öl durch den Schlauch schieben. Wenn das Ende der Microcapillary geöffnet wurde, sehen Sie eine kleine Tröpfchen von Mineralöl nach wenigen Sekunden von der Spitze der Microcapillary entstehen. Wenn dies nicht der Fall, wiederholen Sie den vorherigen Schritt und testen Sie erneut.
  • (3) sterile Mikroinjektion

    Hinweis: Sobald die Microcapillary vorbereitet, installiert, und getestet wurde, beginnen microinjecting Chios. Abbildung 3 zeigt ein Gewebe abgeleitet HIO, die erfolgreich injiziert worden mit FITC-Dextran.

    1. Füllen Sie die Microcapillary mit dem Injektionsmaterial. Tauchen Sie die Spitze des Glas-Microcapillary in der FITC-Dextran Injektion Suspension, dabei darauf achten, nicht zu unterbrechen die Spitze des Microcapillary gegen die Seiten oder Boden des Röhrchens. Sobald die Spitze der Microcapillary in die Lösung eingetaucht ist, ziehen Sie zurück die Mineralöl-Spritze ca. 10 µL der FITC-Dextran-Suspension in der Microcapillary zu ziehen.
      Hinweis: Es wird empfohlen, 1,5 mL bzw. 0,5 mL Röhrchen für die Injektion Lösungen/Kulturen zu verwenden, da diese am leichtesten zugänglich zu den installierten Microcapillary werden. Alternativ Injektion, die Lösungen gezogen werden können, von einem sterile Petrischale oder sterilen Parafilm, die Kleie Verletzungsgefahr verringern kann, indem begrenzt die Notwendigkeit eine Röhre in unmittelbarer Nähe zu den Microcapillary. Wenn die Federung hochviskosen ist oder ist die Eröffnung der Microcapillary sehr klein ist, dauert es möglicherweise einige Sekunde, um die Microcapillary zu füllen. Ziehen Sie Mikroinjektion Suspensionen nicht in den Kunststoff Mikroinjektion Schlauch, da dies das gesamte Mikroinjektion System verunreinigen kann.
    2. Stoppen der Microcapillary zu füllen, wenn die Mikroinjektion Suspension 90 % der Länge des Glas-Microcapillary gefüllt. Drücken Sie die Spritze leicht vor die Mikroinjektion Lösung um sicherzustellen, dass die Spitze der Microcapillary keine Luft enthält die Microcapillary entziehen.
      Hinweis: Ergibt die Prüfung der Microcapillary Luft, entleeren und wieder füllen.
    3. Entfernen Sie HIO Kultur Chicoréeblätter vom Zelle Kultur Inkubator und Transfer auf die Biosicherheit Schrank mit den Microinjector.
    4. Entfernen Sie den Deckel von der HIO-Kultur-Platte innerhalb der Biosicherheit Kabinett und zentrieren Sie die erste Bohrung auf den Mikroskoptisch zu, so dass es deutlich sichtbar durch das Okular des Bereichs mit der niedrigsten Vergrößerungseinstellung.
    5. Mikromanipulator Arm drehen, so dass die Microcapillary in die HIO Kultur gut schräg nach unten gerichtet ist > 45° im Verhältnis zu den Mikroskoptisch. Dies geschieht am einfachsten durch manuelles Drehen der Mikromanipulator Armpaket auf der horizontalen Achse an der Stelle, wo die horizontale Mikromanipulator Armauflage der Standfuß trifft, da die feinen Steuerelemente (schwarze Zifferblätter) verfügen über eine begrenzte Anzahl von Bewegung. Positionieren Sie die Spitze des Microcapillary über die erste Kultur auch in ca. 1 cm über der Oberfläche des Mediums (Abb. 3A). Abbildung 3 bzeigt ein repräsentatives Bild demonstriert Mikroinjektion der intestinalen epithelialen Organellen Gewebe abgeleitet.
    6. Überprüfen Sie, dass die Spitze der Glas-Faden und die HIO(s) sind durch das Okular sichtbar. Bei Bedarf neu zu positionieren.
    7. Die Microcapillary durch Drehknopf die z-Achse im Uhrzeigersinn langsam voraus.
      Hinweis: Beurteilung der Position der Microcapillary Spitze, erfordert vor allem die Tiefe, Übung. Als die Spitze die Oberfläche der Medien verletzt, bemerken Sie eine leichte optische Verzerrung der Microcapillary Spitze.
    Gehen Sie vorsichtig von diesem Punkt brechen die Microcapillary gegen die Unterseite der Platte Kultur oder die Chios zu beschädigen zu vermeiden.
  • Durchbohren der HIO mit Microcapillary Spitze. Die äußere Oberfläche der HIO wird leicht drücken, wie der Microcapillary beginnt, Druck auszuüben und erscheint wieder in Form, wie die Spitze dringt in das Lumen. Es möglicherweise schwierig, die Spitze des Microcapillary innerhalb der HIO Lumen zu identifizieren. Passen Sie die Beleuchtung oder Vergrößerung Einstellungen des Bereichs sezierenden, wenn es Schwierigkeiten der Microcapillary zu sehen.
  • Entfernen Sie Hände aus dem Mikromanipulator Steuerelemente, wenn die Microcapillary mit der Spitze des Microcapillary nahe dem Zentrum der HIO richtig positioniert ist.
  • Drücken Sie die Mineralöl-Spritze leicht um die Mikroinjektion Lösung aus der Microcapillary und in das Lumen HIO zu drücken. Die HIO kann leicht erweitert, um das Volumen der Injektion aufzunehmen.
    Hinweis: darauf achten Sie, um zu vermeiden, Überfüllen der HIO als organoide platzen dadurch. Als Faustregel gilt bedeutet sichtbare Erweiterung der HIO-Volumen ist es Zeit aufzuhören. Das mittlere Volumen der Reife HIO Lumen ist ungefähr 1 µL, aber erheblich variieren. Automatisierte Spritze Pumpen anstelle einer manuellen Spritze verwendet werden können, um feine Steuerung des injizierten Volumens ermöglichen.
  • Ziehen Sie die Microcapillary aus der HIO mit dem z-Achsen-Steuerung und Position über der Oberfläche des Mediums.
  • Mit der Microcapillary über die Medien zu vermeiden Unfallschäden an die Chios beim Manövrieren und injizieren in ähnlicher Weise positioniert, das nächste Ziel der HIO bewegen (siehe Schritte 3.6-3.11).
    1. Füllen Sie die Microcapillary mit dem oben beschriebenen Ansatz.
      Hinweis: Wenn die Spitze zu jedem Zeitpunkt während der Mikroinjektion bricht, nicht versuchen Sie weiterhin Injektionen. Ändern Sie die Spitze gemäß den Anweisungen unten.
  • Ändern Sie die Microcapillary zwischen den Behandlungen oder bei Bruch. Lösen Sie die Klemme am Ende des Arms Mikromanipulator und entfernen Sie die Microcapillary aus der Mikropipette Halter.
    Vorsicht: Berühren Sie nicht die Microcapillary in der Nähe von der vordersten Front. Die feine Spitze der Microcapillary ist extrem scharf und wird leicht durchstechen, Handschuhe und Haut. Seien Sie vorsichtig und beachten Sie alle Bewegungen, die Handhabung der Microcapillary mit dem Manipulator nur und nie du Hände zwischen dem Punkt der Microcapillary und der HIO-Kulturen. Suchen Sie medizinische Behandlung sofort bei einem Nadelstich aus einer Microcapillary, Krankheitserreger oder Giftstoffe enthalten.
    Hinweis: In einigen Fällen kann es schwierig zu erfolgreichen HIO Mikroinjektion visuell bestätigen sein. Die Sichtbarkeit des klaren Mikroinjektion Suspensionen kann durch Verwendung des Zusatzes von höheren Konzentrationen von FITC-Dextran verbessert.
  • (4) pharmakologische Behandlung von Chios

    1. Verbindungen an der apikalen Epithel geliefert testen, in sterilen PBS enthaltend 2 mg/mL FITC-Dextran Aufschwemmen und microinject in das Lumen der HIO wie oben (Abschnitt 3) angegeben. Aufschwemmen Sie für die repräsentative Experiment Clostridium Difficile Toxin TDCA bei 12,8 ng/µL in PBS mit FITC-Dextran.
    2. Um Verbindungen an der basolateralen Fach geliefert zu testen, ersetzen Sie die externe Kultur Medien mit neuen Medien mit 2 mM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA)(positive control), PBS Fahrzeug allein (negativ-Kontrolle ), oder andere experimentelle Verbindung nach Mikroinjektion der FITC-Dextran.
      Hinweis: Dosierung und Zeitpunkt der Anwendung der pharmakologische Substanzen, Toxine oder andere Substanzen variieren je nach der experimentellen Frage.

    5. live Imaging von mikroinjiziert Organellen

    1. Live imaging unmittelbar folgenden Mikroinjektion zu beginnen. Übertragen Sie die Kultur-Platten zu einem fluoreszierenden Mikroskop verfügt über eine feuchte Kammer gepflegt bei 37 ° C und 21 % O2 und 5 % CO2 mit einer automatisierten live Cell imaging-System. Schließen Sie die Klimakammer und starten Sie den imaging-Prozess zu.
    2. Die Bildanalyse-Software (z. B. SoftWoRx) vom Desktop aus zu starten. Klicken Sie auf "Datei" und wählen Sie "Acquire (Resolve 3D)" der Bildgebung und Mikroskop-Steuersoftware zu initialisieren.
    3. FITC Erregung/Emission soll (475 nm Anregung/523 nm Emission), legen Sie die Sendeleistung auf 5 %, und das Objektiv 4 X. Legen Sie die Belichtungszeit auf 0,025 ms (Abb. 4A).
      Hinweis: Belichtungszeit sollte abwechslungsreich sein, um die Stärke der das Fluoreszenzsignal zu entsprechen. Im Allgemeinen wird die FITC Fluoreszenzsignal nur abnehmen. Daher sollten um maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten, die anfängliche Belichtungszeiten angepasst werden, dass die aufgezeichneten Fluoreszenzsignal nur unter dem Sättigungspunkt der Kamera und imaging-Software ist.
    4. Finden Sie die Chios bei 4 X Vergrößerung mit dem digital-Controller mit dem Mikroskop verbunden. Zentrieren Sie die HIO innerhalb der Betrachtung Bereich (Abb. 4A).
    5. Klicken Sie auf "Ansicht" auf der Symbolleiste und wählen Sie "Punkt-Liste", ein neues Fenster zu offenbaren. Klicken Sie auf "Markieren Sie Punkt" um die aktuelle Position der Bühne in der Liste (Abbildung 4A) zu speichern.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5, bis die Positionen der alle Chios aufgenommen wurde. Mit einem Editor oder digitale Aufzeichnung, notieren Sie sich die eindeutige ID-Nummer zugewiesen, jeder programmierten Mikroskopie-Position und den Bildern an dieser Position. Die Bilddateien werden mit dieser ID-Nummer versehen und es wird wichtig sein, Bild-ID-Nummern mit spezifischen Chios und Behandlungen zuordnen, nachdem Datenerhebung abgeschlossen ist.
    7. Um automatisierte Bildsammlung einzurichten, klicken Sie auf "Datei" und dann "Experiment" in der Symbolleiste. Das Experiment mit dem Datum oder einen anderen eindeutigen Namen zu nennen.
    8. Legen Sie die Parameter für Bildersammlung, indem die Option Registerkarten durchgehen, wie in Abbildung 4 bdargestellt.
      1. Entfernen Sie das Häkchen "Z-Schnitt" unter dem Reiter "Schneiden".
      2. Geben Sie unter dem Reiter "Kanäle" die Parameter aus dem oberen linken "Resolve 3D"-Fenster. Um Zeit zu sparen, wird die erste Zeile automatisch aufgefüllt, wenn das Kontrollkästchen auf der linken Seite aktiviert.
      3. Unter dem Reiter "Zeitraffer", aktivieren Sie das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung "Zeitraffer" und geben Sie das Zeitintervall zwischen den Bildern in der Zeile mit der Bezeichnung "Zeitraffer" und die Gesamtdauer des Experiments in der Zeile mit der Bezeichnung "Total Time". Die Software berechnet automatisch die Anzahl der Zeitpunkte.
      4. Aktivieren Sie unter dem Reiter "Punkte" das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung "Besuchen Sie Point-Liste".
    Sie können auch manuell eingeben, die spezifische Punktnummern in das Experiment einbezogen werden, indem Sie in das Textfeld eingeben.
  • Ändern Sie nicht die Standard-Optionen unter den Registerkarten "Panels" oder "Aktionen".
  • Klicken Sie auf "Run" Registerkarte geben Sie das Datum des Experiments im Feld mit der Bezeichnung "Image-Datei-Namen" und legen Sie Speicherort unter "Einstellungen".
  • Klicken Sie auf den grünen Pfeil das Experiment-Makro ausführen. Ein Zeitraffer Zeitzähler wird die experimentelle Fortschritte verfolgen.
  • Am Ende von den geplanten zeitlichen Verlauf exportieren Sie und speichern Sie alle Bilddateien als 24-Bit RGB TIFF-Bilder (Abbildung 4).
    1. Wählen Sie auf der Symbolleiste Prozess gefolgt von Task-Generator.
    2. Fügen Sie Dateien im Menü Task Generator durch navigieren zu den Data-Ordner in 5,9 angegeben hinzu. Markieren Sie alle Dateien mit der Endung in ".dv" durch "*.dv" in der Eingabeaufforderung eingeben. Wählen Sie alle (Strg + A), und klicken Sie auf "Hinzufügen".
    3. Klicken Sie auf + unter dem Abschnitt mit der Bezeichnung "Aufgabe." Wählen Sie "Exportieren speichern unter..." und klicken Sie auf die Registerkarte "Optionen".
    4. Legen Sie "Format exportieren", "TIFF-Bilder" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Custom-Ausgabe-Ordner" hinzufügen. Dies ist der Ort, wo die TIFF-Bilder exportiert werden sollen. Wählen Sie 24-Bit RGB unter "TIFF Ausgabetyp aus", und klicken Sie auf "Fertig".
    5. Klicken Sie auf "Senden to Queue" um das Exportieren-Makro ausführen.
  • Kopieren Sie die TIFF-Bilder in 5.11 zu einem externen Treiber oder Server exportiert werden, wenn Sie die Post-Imaging-Analyse (Abschnitt 6) durchführen, auf einem anderen Computer.
    Hinweis: Die HIO Gewebe und Medien können gespeichert werden, für Histologie34, PCR-35), Western blot36oder andere nachgeschaltete Analyse.
  • 6. Post-imaging-Analyse

    1. Stellen Sie sicher, dass ImageJ37 installiert ist und ordnungsgemäß auf dem Computer für Analyse verwendet werden.
      Hinweis: Fidschi37 ist eine Alternative Verteilung des Programms Core ImageJ, das funktioniert gleichermaßen gut für diese Analyse.
    2. Starten Sie die Batch-Auswertung durch die ImageJ-Menü "Prozess" dann "Charge" und "Makro" auswählen.
    3. Setzen Sie die Eingabe in das Verzeichnis der TIFF-Bilder im Verlauf der experimentellen Zeit gesammelt. Öffnen Sie die "thesholdmeasure.ijm" ImageJ-Makro-Datei oder direkt kopieren/einfügen den Makrocode in das Fenster. Klicken Sie auf "Prozess" um mit der Bearbeitung der Dateien beginnen.
      Hinweis: Die minimale Schwelle Wert X (setThreshold(x,255);) einstellbar auf eine beliebige Anzahl 0 - 255 und sollte angepasst werden, um Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen. Werte < 100 empfohlen. Um den entsprechenden Schwellenwert empirisch zu ermitteln, führen Sie das bildgebende Makro auf ein einzelnes Bild, eine organoide ohne fluoreszierendes Signal darstellt. Die mittlere Intensität dieses Bildes kann als Leitfaden dienen, für die Festlegung der Schwellenwerts entsprechend. Für die repräsentative Analyse dargestellt wurde die Schwelle auf "42" festgelegt.
    4. ImageJ erzeugt eine große Tabelle mit Bereich alle Pixel in den Grenzbereich der Intensität und der Mittelwert, Median, Minimum und Maximum (Limit) Intensität Wert für den Bereich innerhalb der Grenzwerte für die Intensität. Speichern Sie dies als CSV oder XLS.
    5. Änderung in der Intensität im Laufe der Zeit durch die Manipulation der Datentabelle zum Ausführen der Berechnung unten in einer Tabelle39 berechnet werden kann oder kann werden automatisiert mit einer geeigneten Programmiersprache. Ein Beispielskript Analyse geschrieben in R 40 ist mit dieser Handschrift versehen.
      Hinweis: Für jede HIO relativen Fluoreszenzintensität kann quantifiziert werden als Equation 1 . Beseitigung Zeit 41 (t1/2) der FITC-Dextran in das Lumen HIO wurde wie folgt berechnet:
      1. Berechnen Sie zunächst, die "Area under the Curve" (AUC) von der Kurve beschreibt die relative Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit (t) als:
        Equation 2
      2. Dann berechnen die "Abfertigung" (Equation 3) Rate mit Verteilungsvolumen (Vd) definiert als 1 für die normierte Fluoreszenz bei t = 0:
        Equation 4
      3. Als nächstes definieren Sie die "Beseitigung Rate konstant" (Equation 5) als:
        Equation 6
      4. Und schließlich die "Beseitigung Zeit" berechnen (t1/2) als:
        Equation 7
        Die reduzierte Gleichung lautet somit:
        Equation 8

    Representative Results

    Chios wurden aus menschlicher pluripotenter Stammzellen differenziert und kultiviert in Zelle Matrixlösung wie zuvor beschrieben19,24. Nach 4 Wochen in Kultur hatte die Chios ausreichend erweitert, um für die Mikroinjektion zu ermöglichen. Chios wurden mit 4 kDa konjugiert FITC Dextran in PBS oder PBS mit Clostridium Difficile Toxin TDCA suspendiert mikroinjiziert. C. Difficile ist ein opportunistischer Magen-Darm-Erreger, das Toxin-vermittelte epitheliale Toxizität in Chios25aufweist. Als Positivkontrolle wurde die HIO Kulturmedien in einer Teilmenge von Chios injiziert mit PBS und FITC-Dextran EGTA hinzugefügt. EGTA ist ein Kalzium-Chelator, die schnelle de-Polymerisation der Aktin-Zytoskelett-42verursacht. FITC Fluoreszenz wurde auf dem live imaging Mikroskop innerhalb einer kontrollierten Klimakammer in Echtzeit überwacht und Aufnahmen wurden in 10-Minuten-Takt.

    Post-hoc-Analyse der Bilddaten ergab erhebliche Unterschiede in der Beibehaltung der FITC Fluoreszenz (Abbildung 5). Chios mit PBS injiziert erhalten fast alle das Fluoreszenzsignal bei t = 0, aber Chios, die auch mit TDCA von mit EGTA behandelt injiziert wurden eine erhebliche Abnahme der Fluoreszenz Intensität von 8 Stunden nach Mikroinjektion (Abbildung ausgestellt 5a). Imaging-Daten wurden für alle Chios zu allen Zeitpunkten eine hochauflösende Dataset repräsentiert die relative Änderung in Fluoreszenz Intensität im Laufe der Zeit in jeder Versuchsbedingung (Abb. 5 b) generieren quantifiziert. Unterschiede in der epithelialen Durchlässigkeit ausgewertet durch Berechnung der mittleren Beseitigung Zeit (t1/2 ) der FITC für jede Behandlungsgruppe (Tabelle 1) und vergleichen Unterschiede in t t1/2 mit der Student t-test. Kontrolle-behandelten Chios behielt die Mehrheit der FITC Fluoreszenzsignal für mehr als 16 Stunden (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandlung mit EGTA deutlich reduziert FITC-Dextran Beseitigung Zeit relativ zum Steuerelement Chios (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnisse25, Mikroinjektion TDCA deutlich erhöht epitheliale Barriere Permeabilität gegenüber Kontrollbehandlung (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). So sind externe (EGTA) und mikroinjiziert (TDCA) Verbindungen in der Lage, wesentliche Veränderungen in epitheliale Barriere Permeabilität in Chios induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Auswirkungen einer breiten Palette von pharmakologische Agenten, Metaboliten, Bakterienprodukte, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Verbindungen auf epitheliale Barriere-Funktion mit diesem Ansatz bewertet werden können.

    Behandlung Half-Life (h) SEM (h) Untere 95 % CI (h) Obermaterial 95 % CI (h) n
    Kontrolle 17.11. 0,3 16.45 Uhr 17,78 11
    EGTA 2,58 0,19 1,78 3.38 3
    TDCA 7.56 0,63 5,93 9.18 6

    Tabelle 1: meine Beseitigung Zeit (t1/2) FITC-Dextran in Chios mit EGTA oder TDCA behandelt. Einheiten sind Stunden Post-Mikroinjektion.

    Figure 1
    Abbildung 1: Grundlayout einer Microinjector und Mikromanipulator für HIO Mikroinjektion. Dieses Bild zeigt die komplette Ergänzung der Ausrüstung für die Durchführung der Mikroinjektion von Chios verwendet. Schlüsselkomponenten sind beschriftet und Bestellinformationen finden Sie in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2: Mikropipette Puller. Das Kupfer Heizung Spule Hc, Spannfinger c1, untere Klemme (c2), Abzieher Arm (Pa), Hitze Auswahl ein/aus (ht) sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Die richtige Einstellung für HEAT 1 und ziehen sind in roter Schrift gekennzeichnet. Der Inset zeigt eine richtig montierte Glas-Filament für Heizung bereit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3: repräsentative Bilder von einem Gewebe abgeleitet HIO injiziert mit FITC-Dextran. (A) Bild zeigt die Positionierung der Glas-Microcapillary kurz vor dem Einsetzen in die HIO und Mikroinjektion. (B) Hellfeld-Bild von einem Gewebe abgeleitet menschlichen Darm Organellen nach Mikroinjektion der FITC-Dextran. Beachten Sie, dass das Fluoreszenzsignal offensichtlich auch ohne die Verwendung eines bestimmten Filter-Sets ist. Diese Färbung hilft Mikroinjektion Präzision. 3 X Vergrößerung Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4: Live-imaging Workflow. (A) Screenshot zeigt die notwendigen Schritte zur Mikroskop parametrisieren, die Chios auf der Folie zu finden und speichern Sie die Position der Bühne für jede HIO, abgebildet werden. (B) Pre-Imaging-Einstellungen für die Erfassung des FITC-Kanals in regelmäßigen Abständen an die Positionen jeweils angegeben in A. (C) Post-Imaging-Export von Daten im DV-Format Dateien als TIFF-Bilder mit einem TIFF-Bild pro HIO pro Zeitpunkt.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5: repräsentative Ergebnisse. (A) Stammzellen abgeleitet menschlichen Darm Organellen (HIO) mit 2 mg/mL FITC-Dextran mikroinjiziert (4 kDa) für 20 Stunden abgebildet. Chios wurden auch mit PBS (Kontrolle) oder Clostridium Difficile Toxin TDCA mikroinjiziert (12,8 ng/µL) oder mit 2 mM EGTA, um die externe Kultur Medien hinzugefügt behandelt. 4 X Vergrößerung. (B) Grundstück mittlere normalisierte FITC-Intensität im Laufe der Zeit in Chios behandelt mit PBS (Kontrolle), TDCA oder EGTA. Fehlerbalken darzustellen S.E.M und n = 11 Chios (Control), 3 Chios (EGTA), 6 Chios (TDCA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Discussion

    Dieses Protokoll stellt eine allgemeine Methode für die Mikroinjektion von Chios hPSC abgeleitet und Darm Organellen Gewebe abgeleitet und die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit. Wir haben auch unser Ansatz zur Analyse und Interpretation der Daten generiert, mit Hilfe dieser Methoden gezeigt. Angesichts der wachsenden Annahme Darm Organellen Modellsysteme16,20,21,28 und das langjährige Interesse an Darmbarriere Durchlässigkeit als physiologisch relevanten funktionellen Ergebnis3,4,5,6, erwarten wir, dass andere auf diesem Gebiet tätig werden können anwenden und auf diese Methoden aufbauen.

    Es gibt mehrere Schritte, die für die Anwendung dieser Technik entscheidend sind. Zugang zu qualitativ hochwertigen hPSC- oder Gewebe abgeleiteten HIO Gewebe vor umfangreiche Experimente mit Mikroinjektion geschaffen werden sollte. HIO Makrostruktur möglicherweise heterogen, mit Variationen in Größe und Form, obwohl Gewebe Identität und zellulären Morphologie ist sehr reproduzierbar, bei der Verwendung von etablierten Methodik um Chios24zu generieren. Sphärische Chios, bestehend aus einer einzigen halbtransparenten Lumen und messen ca. 1 mm im Durchmesser sind ideal für Mikroinjektion und Messung der luminalen Fluoreszenz in Echtzeit. In einigen Fällen fehl, Mikroinjektion zu einem Zusammenbruch der HIO oder offensichtliche Undichtigkeit des injizierten Materials. Gescheiterten Chios können die Kultur gut Ermessen des Benutzers mithilfe einer standard Mikropipette entnommen werden. Auswahl von Chios für Mikroinjektion und Bildgebung der Objektive auf einer imaging Plattform berücksichtigen. Im Allgemeinen 2-4 X Objektive sind ideal für die Erfassung der kompletten HIO Fluoreszenzsignal, obwohl ein 10 X-Objektiv verwendet werden kann, wenn low-Power-Objektive nicht verfügbar sind oder die verfügbaren Chios sind < 1 mm im Durchmesser. Imaging-Software darf für die automatisierte Erfassung von fluoreszierenden Bilder an definierten Stellen im Laufe der Zeit.

    Mehrere Änderungen dieses Protokolls sind möglich, um die experimentellen Anforderungen anzupassen. Zum Beispiel die Ergebnisse der Barriere Funktionstests der Molekülgröße der Verbindungen im Einsatz43 abhängig gemacht werden und es kann zweckmäßig sein, Dextran-Vorbereitungen von unterschiedlichem Molekulargewicht zu testen. Darüber hinaus kann Hellfeld Bildgebung zusätzlich Fluoreszenz-Bildgebung als Indikator für die strukturelle Integrität der Gewebe25durchgeführt werden. Bei der Mikroinjektion von lebender Bakterien25,28,31,32,33,44ggf. Penicillin hinzufügen und Streptomycin oder Gentamicin HIO Kultur Medien vor oder nach Mikroinjektion. Außen an der Microcapillary wird bei der Befüllung mit der Bakterienkultur Aussetzung kontaminiert werden und dies kann den HIO Medien übertragen werden. Alternativ kann Mikroinjektion erfolgen auf Chios im extrazellulären Matrix (z. B. Matrigel) ohne Medien ausgesetzt die Medien hinzufügen, nachdem die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Dies kann Kontamination der extrazellulären Matrix und Außenseite der HIO einschränken. Bei der Planung von mikrobiellen Wachstums Assays es möglicherweise notwendig, Antibiotika in den Medien nach 1-2 h zu vermeiden, verlangsamt oder verhindert Wachstum von mikroinjiziert Organismen zu entfernen.

    Schließlich ist in der Erkenntnis, dass nicht alle Forscher auf Mikroskopie Ausrüstung geeignet für in-vitro- Bildgebung zugreifen können, es wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Anweisungen in diesem Protokoll für die Fluoreszenz Datenerhebung auf Bilder angewendet werden können an festen Zeitpunkten mit standard Epifluorescent Mikroskopie ohne automatische Bildaufnahme oder Umweltkontrolle. Beispiele dafür finden Sie in den Berichten von Leslie und Huang Et al. 25, die C. Difficile Toxin Aktivität im Darm Organellen hPSC abgeleitet und Karve und Pradan Et Al. untersuchten 44, die epitheliale Barriere Permeabilität in ähnlichen hPSC abgeleitet Darm Organellen mikroinjiziert mit live E. Coliuntersucht. Manuelle Bedienung der bildgebenden Geräten führen größere Variation und Schwierigkeiten bei der Normalisierung der Fluoreszenzsignal. Bei der Durchführung manueller Bildgebung der FITC-Dextran Chios injiziert unbedingt feste Vergrößerung, fluoreszierende Anregung Intensität und Belichtungszeiten während das Experiment nicht zu verfälschen die Fluoreszenz Intensität Messungen zu gewährleisten.

    Disclosures

    Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte offen zu legen.

    Acknowledgments

    Die Autoren möchten DRS. Stephanie Spohn und Basel Abuaita für viele nützliche Diskussionen über organoide Mikroinjektion danken. JRS wird vom Darm Stem Cell Consortium (U01DK103141), eine Kooperative Forschungsprojekt finanziert durch das National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK) und National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) unterstützt. JRS und VBY werden durch den Roman NIAID, Alternative Modellsysteme für enterischen Erkrankungen (NAMSED) Consortium (U19AI116482) unterstützt. DRH unterstützt die Mechanismen der mikrobiellen Pathogenese Training Zuschuss von National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIAID, T32AI007528) und der klinischen und translationalen Science Award an der Michigan-Institut für klinische und Gesundheit Forschung (UL1TR000433).

    Die komplette Datendateien und Daten-Analyse-Code verwendet in dieser Handschrift sind an https://github.com/hilldr/HIO_microinjection erhältlich.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
    Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
    Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
    Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBS Life Technologies 10010-023
    Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Manipulator Narshge UM-3C
    Micromanipulator Narshge UM-1PF
    Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
    Magnetic stand Narshge GJ-1
    Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
    Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
    CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
    EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
    Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
    FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
    Micropipette puller Sutter Instruments P-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
    Glass filaments WPI TW100F-4
    Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
    Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
    1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
    1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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