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초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

Biochemistry

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Summary

미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)을 생산할 수 있는 여러 종속 플 라빈 효소 포함. 선생님을 모니터링 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 릴리스 원치 않는 측 반응 때문에 도전 이다. 우리 정화 flavoenzymes 고 미 판 fluorometry를 사용 하 여 선생님 자료에 대 한 기본 속도의 직접 평가 대 한 쉽고, 싼 방법 제시.

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Mailloux, R. J., Young, A., O'Brien, M., Gill, R. M. Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases. J. Vis. Exp. (132), e56975, doi:10.3791/56975 (2018).

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Abstract

그것은 알려졌다 미토 콘 드리 아 반응성 산소 종 (선생님)의 최대 12 효소 소스 포함 될 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분 플 라빈 종속 된 호흡 단지 등 초과 (2O●-), 과산화 수소 (H2O2)의 혼합물을 생성 하는 dehydrogenases. 고립 된 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트의 선생님 생산 잠재력의 정확한 정량화의 항 산화 방어 시스템 측면 또한 O2●/H2O2를 형성 하는 존재 인 전하실 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 생체를 중단 시킬 수 있는 일반적인 반응 억제제의 사용 또한 생산의 다른 사이트에서 선생님 자료를 변경 하 여 측정을 손상 수 있습니다. 여기, 우리는 정화 플 라빈에 연결 된 dehydrogenases에 의해 H2O2 릴리스 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 생산의 동시 측정을 위한 쉬운 방법 제시. 여기 우리의 목적을 위해 순화 된 pyruvate 효소 복합물 (PDHC)와 α ketoglutarate 효소 복잡 한 (KGDHC) 돼지 심장 근원의 예제로 사용 했습니다. 이 메서드는 네이티브 H2O2 릴리스 요금 생산의 개별 사이트의 정확한 측정을 위해 선생님과 항 산화 시스템의 다른 잠재적인 소스를 제거 하 여 수 있습니다. 또한,이 메서드는 H2O2 출시와 효소 활동, 효과의 심사 및 선생님 생산 억제제의 선택 간의 관계의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 전반적으로,이 접근의 네이티브 선생님 릴리스 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육 섬유 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 효소의 심층 평가 대 한 수 있습니다.

Introduction

영양소 대사의 궁극적인 목표는 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 만드는 것입니다. 포유류 세포에서이 미토 콘 드리 아, 탄소에 ATP에 저장 된 에너지를 변환 하는 더블 membraned 세포에서에서 발생 합니다. ATP의 생산에는 탄소는 두 명의 전자 사업자, NADH, 플 라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FADH2)1을 형성 하는 미토 콘 드리 아에 의해 combusted 때 시작 됩니다. NADH와 FADH2 는 다음 산화 다 소 단위 호흡기 복합물에 의해 I 및 II, 각각, 그리고 자유 전자는 터미널 전자 수락자 분자 산소 (O2) 복잡 한 41에 ferried. 열역학으로 호의 베푸는 "내리막" 전송 전자의 O2 는 체인의 끝에는 양성자의 수출에는 intermembrane에 결합 I, III, 및 IV 단지에 의해 공간. 이 양성자 (양성자 동기 힘), 임시 형태의 ATP2를 만들기 위해 복잡 한 V에 의해 도청 깁스 자유 에너지의 막 횡단 전기 그라디언트를 만듭니다. 미토 콘 드리 아에서 전자 이동 반응은 ATP 생산을 완벽 하 게 결합 하지. Krebs 사이클 및 호흡기 체인에 여러 지점에서 전자 중간 형태로 선생님3O2 작용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아에서 생성 된 가장 생물학적으로 관련 선생님은 O2●- H2O2. O2●- 종종 간주 됩니다 미토 콘 드리 아에 의해 형성 된 근 선생님, 비록 그것은 생산의 관련 된 자유 O2●- 및 H2O2의 혼합물 형성 분명 지금 보 플 라빈의 급진적인 화학 그룹4,5. 높은 수준에서 선생님 위험할 수 있습니다, 손상 산화 조6의 결과로 세포 기능에 필요한 생물 학적 성분. 그러나, 낮은 금액에서 미토 콘 드리 아 선생님 중요 한 신호 전달 기능을 성취 한다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아에서 H2O2 릴리스 T-세포 활성화, 스트레스 신호 (예를들면, Nrf2 신호 통로의 유도), 세포 증식 및 분화, 유도 제어에 연루 되어 있다 인슐린 신호 릴리스, 그리고 동작7먹이. 상당한 진행 선생님의 신호 전달 기능을 이해 했다. 그러나, 중요 한 질문은 여전히 남아 있다 관계는 미토 콘 드리 아 효소 역할을 가장 중요 한 소스 및 생산 제어 하는 방법은.

선생님 자료 생산의 사이트에 의해 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다: 1)는 전자 기증의 농도 사이트, 2) 전자 기부 사이트, 3)에 대 한 액세스 산소, 4) 고 농도의 산화 상태 그리고 산화 기판3, 의 종류 8 , 9. 미토 콘 드리 아에서 다른 같은 NADH 및 막 잠재적인 힘의 농도 또한 선생님 생산8,10영향 요인. 예를 들어 O2●-/ H2O2 생산 순화 PDHC 또는 KGDHC의 속도 증가 증가 NADH 가용성5,11. 이 시나리오에서 전자는 흐르는 거꾸로 NADH에서 PDHC 또는 KGDHC, O2●-/ H2O2 생산12에 대 한 사이트의 E3 소 단위에 유행 센터. 마찬가지로, 나드+ 의 KGDHC12에서 선생님 방출 감소 반대의 효과 있다. 따라서, 제어 항목 또는 선생님의 사이트에서 전자의 출구는 얼마나 많은 O2●-/ H2O2 를 형성 변경할 수 있습니다. 예를 들어, PDHC 또는 KGDHC CPI-613, 리 포 산, 결과 거의 90%에 감소 O2●-/ H2O2 생산13아날로그와 E2 소 단위를 차단 합니다. 와 화학 S glutathionylation 촉매, diamide disulfiram, O2●-/H2O2 에 의해 생산 PDHC 또는 KGDHC E에 glutathione의 활용을 통해 거의 폐지는 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 2 소 단위14. PDHC 및 KGDHC의 E2 소 단위를 통해 전자의 흐름 차단에 대 한 트레이드 오프는 (예를 들어, 복잡 한 III) 전자 수송 사슬에 의해 선생님 형성 감소는 NADH 생산 감소 이다. 이 또한 전자 수송 사슬에 의해 ATP 출력을 줄일 수 있습니다. 전반적으로, 선생님 생산의 사이트에 전자 항목을 차단 하는 것은 O2●-/ H2O2 생산을 제어 하는 매우 효과적인 수단 수 있습니다.

미토 콘 드리 아에는 최대 12 잠재적인 O2●-/ H2O2 소스6포함할 수 있습니다. 이러한 사이트의 대부분은 포함 하는 플 라빈 효소 O2●- 및 H2O2의 혼합물을 생성 하는. 다른 기판 및 억제제 조합을의 사용의 호흡기 단지 및 미토 콘 드리 아 dehydrogenases 역할 고용량 O2●-/ H2O2 에 사이트를 형성 하는 식별에 대 한 허용 다른 조직3. PDHC 및 KGDHC 높은 용량 O2●-/ H2O2 근육과 간 미토 콘 드리 아13,15발광 사이트 역할을 보여왔다. 그러나, 몇 가지 문제가 남아 O2●-/ H2O2 다른 기판 및 억제제 조합에 있는 미토 콘 드리 아에 영향 개별 사이트의 잠재적인 형성의 시험에 관한 효소의 활동입니다. 이것은 원치 않는 쪽 반응 (예를 들어, O2●-/ H2O2 의 효소 이외의 사이트의 형성)의 존재로 인해 오염 생 영양분 (예를 들어,지방산 산) 또는 세포 (예:, peroxisomes 또한 O2●/H2O2를 형성), 그리고 선택도, 부족 억제제의 사용 및/또는 완전히 선생님 생산을 억제 하지 않는 화합물의 사용. 특정 억제제 또한 미토 콘 드리 아 생체 및 전자 흐름의 방향을 변경할 수 있습니다 그리고이 선생님 자료 생산의 다른 사이트에서 변경 하 고 결과 혼동 한다. 절대 릴리스에 대 한 O2●/H2O2 미토 콘 드리 아에서 개별 사이트에서 요금은 또한 O2●- 및 H2O2 의 높은 농도 때문에 계량 하기 어려운 행렬 및 intermembrane 공간에서 효소를 제거합니다. 따라서, O2●-/ H2O2 릴리스 측정을 방해할 수 있는 모든 경쟁 반응의 제거 때 유용할 수 있습니다 식별 하는 고용량 O2●-/H2O2 사이트를 형성.

여기, 우리는 정화 플 라빈 종속 dehydrogenases에 의해 O2●-/ H2O2 생산과 NADH 형성의 동시 시험을 허용 하는 간단한 방법 제시. 정제 효소를 사용 하 여 원치 않는 선생님 측 반응 형성 및 효소 저하 선생님 제거할 수 있습니다 네이티브 O2●-/ H2O2 생산 속도의 개별 flavoenzymes에 대 한 보다 정확한 측정을 위한 수 있도록. 이 메서드는 O2●-/ H2O2 O2●-/H2O 화면 잠재적인 사이트별 억제제 또는 다른 정화 dehydrogenases의 능력을 형성을 직접 비교를 사용할 수 있습니다. 2 출시입니다. 마지막으로, O2●/H2O2 와 NADH 생산을 동시에 측정의 효소 활동, 선생님 자료 용량 관계의 실시간 평가 대 한 수 있습니다.

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Protocol

1. 화학 물질 고 정화 효소

  1. 다음과 같은 재료를 조달: PDHC 및 KGDHC 돼지 심장 근원 (또는 다른 정화 미토 콘 드 리아 flavoenzyme); H2O2 (30% 솔루션), pyruvate, α ketoglutarate 나드+, NADH, CoASH, 티 아민 파이 인산 (TPP), 마 니 톨, HEPES, 자당, EGTA, 3-메 틸-2-옥 valeric 산 (KMV), superoxide dismutase (잔디), 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), 10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 시 약 (AUR), 그리고 CPI-613.

2. 분석 결과 및 시 약 준비 계획

  1. 96 잘 접시에 표 1 에 따라 분석 결과를 설정 합니다.
    참고: 각 반응에 대 한 전체 볼륨은 200 µ L. 주식 농도의 시 약 20 µ L 추가 되도록 조정 하는 각 음에. 그러면 공동 인자와 잘 분석 결과 시작 하기 전에 각 반응에 기판의 급속 한 추가.
  2. 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 1mm EGTA, 및 20 mM HEPES (HCl로 pH 7.4)를 포함 하는 반응 버퍼를 준비 합니다.
    참고:이 다른 정제 효소의 물리적 특성에 따라 변경할 수 있습니다.
  3. 효소 활동 분석 실험14,,1617 를 사용 하 여 오염 또는 immunoblot에 의해 순화 KGDHC 또는 PDHC를 검사 또는 Coomassie 얼룩5.
  4. 표 1에서 작업 솔루션 농도 의하여 반응 버퍼에 모든 시 약을 준비 합니다.
  5. 모든 시 약 1 mL-20 ° c.에 aliquots로 저장 자동 산화 및 반복된 동결-해 동 자발적인 저하를 방지 하기 위해 100 µ L aliquots에서 pyruvate 및 α ketoglutarate-80 ° C에서 저장 합니다.
  6. DMSO의 1 mL에 마스터 재고 AUR 시 약을 준비 하 고 반응 버퍼에서 100 µ M을 희석. 스토어 빛 으로부터 보호입니다.
    참고: 여기, 100 µ M 작업 솔루션은 2 ~ 3 주마다 신선한 고 빛 으로부터 보호.

3. 분석 결과 서식 파일 설정

  1. 듀얼 측정 기능으로 단색 microplate 리더에 분석 결과 절차를 설정 합니다.
  2. "프로토콜"을 선택 하 여 읽기 프로시저를 정의 합니다. 그런 다음 "프로시저"를 클릭 합니다.
  3. 25 ° c (그림 1A) "온도"를 설정 합니다.
  4. (그림 1A) 읽기 조건을 설정할 "운동 시작"을 클릭 합니다. 시간 및 읽기 간격/실험의 수를 설정 합니다.
  5. 클릭 "읽기" (그림 1B).
    참고: 샘플 최고의 위치에서 읽는 50의 이득. 시간: 5 분, 간격 30-s 읽기. 채널 1: Resorufin 형광-여기/방출 = 565 nm:600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 채널 2: NADH autofluorescence-여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
  6. "읽기", 웰 스 모니터 (예를 들어, a 1-a 4와 B1 B4)을 선택 합니다.
  7. "키네틱 끝"을 선택 합니다.

4. 표준 곡선

  1. 시 약을 해 동 하 고 필요할 때까지 얼음에 저장 합니다.
  2. NADH 표준 곡선 (그림 2A)
    1. 반응 버퍼에 0.5-10 m m의 농도 범위에서 NADH에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다.
    2. 180 µ L 반응 버퍼를 포함 하는 웰 스 솔루션 집중 작업 각 NADH에서 20 µ L aliquots를 추가 합니다. 각 NADH의 최종 농도 잘는 0.05-1 m m.
    3. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 376 nm:450 nm, 20의 파장 폭 = nm.
      참고:이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.
  3. AUR 표준 곡선 (그림 2B)
    1. 반응 버퍼; 과산화 수소의 작업 주식 준비 사진 농도 범위 200-4000 nM에서.
    2. 각 잘에 반응 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
    3. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 U/mL, 우물에 최종 농도 = 3 U/mL =) 20, 잔디의 µ L (재고 농도 일 250 U/mL, 우물에 최종 농도 = 25 U/mL =), 그리고 AUR의 20 µ L (재고 농도 작업 = 100 µ M 잘에서 최종 농도 = 10 µ M) 각 잘 포함 반응 버퍼를.
    4. 잘 포함 하는 버퍼 및 분석 실험 시 약 각을 재고 솔루션 작업 각 H2O2 의 20 µ L를 추가 합니다. 최종 반응 볼륨 200 µ L 이며 각 우물에서 H2O2 의 최종 농도 20-400 nM 이다.
    5. 25 ° c.에서 플레이트 리더에서 1 분에 대 한 번호판을 품 어
    6. "읽기"를 클릭 하 고 설정 여기/방출 = 565 nm/600 nm의 파장 폭 13.5 nm. 이 읽기 전용 끝점-운동 매개 변수는 필요 하지 않습니다.

5. O2 ●/H2 O2 릴리스 및 KGDHC 및 PDHC에 의해 NADH 생산 측정

  1. 다른 시 약의 추가의 순서에 대 한 표 1 를 참조 하 여 각 볼륨과 각 작업 솔루션의 농도 추가 잘.
  2. 각 잘에 반응 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 분석 실험 KMV 또는 CPI-613를 사용 하 여, 각 음을 버퍼의 20 µ L를 추가 합니다.
  3. PDHC 또는 KGDHC의 20 µ L를 추가 (1 U/mL, 잘 당 최종 농도의 작업 사진 = 0.1 U/mL)을 각 영역.
  4. 2 분 동안 25 ° C에서 PDHC 및 KGDHC를 품 어.
  5. KMV의 20 µ L을 추가 (작업 사진 = 100 mM, 최종 농도 = 10 m m) 또는 CPI-613의 20 µ L (재고 농도 작업 = 1.5 m m, 최종 농도 = 150 µ M) (표 2).
    참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
  6. 25 ° c.에 1 분 동안 품 어
    참고:이 단계는 억제제는 분석에 사용 하지 않는 경우 제외할 수 있습니다.
  7. HRP의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 30 단위/mL, 우물에 최종 농도 = = 3 단위/mL) 및 잔디의 20 µ L (재고 농도 일 250 단위/mL, 우물에 최종 농도 = 25 단위/mL =) 각 잘 하.
  8. 코엔자임 A의 20 µ L을 추가 (재고 농도 작업 = 1mm, 최종 농도 = 0.1 m m), 20 TPP의 µ L (재고 농도 작업 = 3 mM, 최종 농도 = 0.3 m m), 고 나드+ 의 20 µ L (재고 농도 작업 = 10 m m, 최종 농도 = 1 m m) 각 w 내 말이 맞지.
  9. 보호 은박지 덮 음에서 AUR 시 약을 제거 하 고 추가 20 µ L 각 잘.
  10. Pyruvate의 20 µ L 추가 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m) PDHC 및 α ketoglutarate 웰 스 (재고 농도 1-100 m m, 분석 실험에 대 한 최종 농도에서 배열 작업 = 0.1-10 m m)를 KGDHC를 포함 하는 우물.
  11. 클릭 "읽기" 운동 측정을 시작 합니다.

6. 데이터 분석

  1. 키보드에서 'CTRL' 버튼 누른 1 (그림 3A) 채널에 해당 하는 모든 운동 측정을 포함 한 그래프를 생성 하는 우물을 클릭 합니다.
  2. 상대 형광 단위 (RFU) (그림 3B) 다른 시간 지점에서 측정에 대 한 원시 값에 대해 오른쪽 상단에 있는 보기 아이콘에 "데이터"를 클릭 합니다.
  3. 분석 (표 3)에 대 한 값을 내보냅니다.
  4. "그래프" 드롭 다운 메뉴 오른쪽 상단에 (그림 3B) 형광 채널 2와 관련 된 RFU 값에 액세스 하려면 클릭 합니다.
  5. 채널 2 단계 6.1 6.3 반복 합니다.

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Representative Results

그림 3A 순화 KGDHC에 의해 H2O2 와 NADH 생산의 동시 측정 하는 동안 수집 된 RFU에 대 한 대표적인 추적을 제공 합니다. 각 시간 간격에 대 한 원시 RFU 데이터는 그림 3B에서 묘사 된다. 원시 RFU 데이터 분석에 대 한 다음 내보내집니다. 그림 2에 제시 하는 표준 곡선에서 추정 하 여 NADH와 H2O2 5 분 동안 각 측정 간격에서 형성의 절대 금액을 확인할 수 있습니다. 이 계산의 예는 표 3에서 제공 됩니다. 에 의해 형성 된 NADH와 H2O2 의 양을 일단 KGDHC 또는 다른 간격 PDHC 결정, 값이 복사 되 고 추가 분석을 위해 그래프/통계 소프트웨어에 입력. 사용 하 여 XY 그래프 유형 분석, NADH (µmol) 및 H2O2 (pmol) KGDHC 또는 PDHC에 의해 형성 된 양의 시간 (그림 4A)의 기능으로 그릴 수 있습니다. 이러한 값을 사용 하 여 기판 산화 동안 NADH와 H2O2 형성의 속도 또한 계산할 수 있습니다. 그림 4B에서 같이, KGDHC 및 PDHC NADH와 H2O2 기능 형성 측면에서 다른 특성을 표시 합니다.

일단 그것은 설립 되었습니다는 KGDHC와 PDHC는 효소 활성 및 NADH와 H2O2 형성을 동시에 추적할 수 있습니다, 선생님 속성 놓고 효소 활동 측정 될 수 있다. 우리는 이후 그들은 매우 기본적인 구조에 동종 선생님 생산5에 대 한 대용량 사이트에 문서화 되어 KGDHC 및 PDHC를 비교 하기로 결정 했습니다. 그림 5 그림 6 기질 농도에 NADH와 H2O2 생산의 종속성을 보여 줍니다. PDHC은 NADH와 H2O2 생산의 0.1-0.5에서 최대에 도달 속도와 기판의 낮은 금액으로 쉽게 포화 mM pyruvate. KGDHC, 다른 한편으로, α ketoglutarate (그림 5) 증가 함께 생산 NADH와 H2O2 에 증분 증가 표시 합니다. 이 KGDHC 및 PDHC, 비록 높은 동종 기본 구조에는 얼마나 많은 기판 최대한 선생님 릴리스를 유도 하는 데 필요한 측면에서 다른 키네틱 속성을 보여 줍니다. 그림 5 KGDHC에서 H2O2 릴리스 NADH 생산 및 기판 여부와 강하게 연결 보여 줍니다. 다른 PDHC에는 동일한 운동 특성이 없습니다. KGDHC와 PDHC 또한 NADH 및 O2●-/ H2O2 때 나드+ 농도 변화 능력을 형성 (그림 6)의 측면에서 다.

여 NADH와 H2O2의 동시 측정, 선생님 생산을 위한 잠재적인 사이트 억제제 상영 될 수 있습니다. 이 H2O2 릴리스의 최대한 억제를 유도 하는 데 필요한 억제제의 양을 확인할 수 있습니다. 또한, 동시에 NADH 생산을 측정 하 여 억제제 행동 뿐만 아니라 선생님의 소스 사이트 확인할 수 있습니다. 이전 연구 KMV, α ketoglutarate 아날로그 이다 KGDHC (≥ 90% 억제)13,15에서 선생님 방출 억제에 매우 효과적으로 나타났습니다. 우리는 또한 CPI-613, PDHC 및 KGDHC, E2 소 단위의 dihydrolipoamide를 차단 하는 리 포 산 아날로그 또한 어느 복잡 한 여 선생님 자료를 억제 수 있습니다 보였다 ~ 9013,14. KMV와 CPI-613에 대 한 행동의 사이트는 그림 7에 나와 있습니다. CPI-613 황 분자를 포함 하 고 그것은 따라서 권고 그 thiol 풍부한 감소 시키는 대리인 (dithiothreitol; DTT) 또는 단백질 (알 부 민) 절차13에서 생략 됩니다. 그림 7 에서는 KMV와 CPI-613 NADH와 H2O2 로 KGDHC 제한에 매우 효과적인 둘을 다 보여 줍니다. 마찬가지로, CPI-613 PDHC (그림 7)에서 H2O2 릴리스를 완전히 없 앴 다. 이러한 결과 KMV CPI-613 H2O2 출시에 대 한 매우 효과적인 억제제 및 따라서 고립 된 미토 콘 드리 아와 실험에 적용할 수 있습니다 보여줍니다. 이후 효과의 직접 평가 및 정화 플 라빈 포함 된 dehydrogenases에 다른 억제제의 선택에 대 한 수 있도록 같은 화면 다른 잠재적인 선생님 형성 효소에 대 한 매우 유익한 것입니다. NADH의 동시 측정은 또한 복잡 한 효소 내 선생님의 잠재적인 소스의 예비 식별을 허용의 이점이 있다. 그림 7 매우 PDHC 하 동종은 KGDHC에 대 한 촉매 메커니즘의 묘사를 제공 합니다. 관찰을 KMV와 CPI-613, E1 과 E2 소 단위 KGDHC의 차단, 거의 완전 하 게 폐지 H2O2 와 NADH 생산, E3 소 단위, 가능성이 유행, 선생님 소스 인지 확인 18. CPI-613 PDHC H2O2 릴리스에 대 한 원리 사이트 E3 소 단위18는 확인에 비슷한 효과 발휘. 유사한 접근은 다른 dehydrogenases에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 복잡 한 효소의 다른 부분을 통해 전자의 흐름을 차단 하는 저 해제의 식별을 해야 합니다.

Figure 1
그림 1 : 분석 결과 설치에 대 한 대표적인 스크린 샷. (A) NADH 및 resorufin 형광에 변화의 운동 측정에 대 한 설정 절차의 묘사. (B) 분석 결과 대 한 형광 매개 변수를 설정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : NADH 및 resorufin 형광에 대 한 대표적인 표준 곡선. 커브는 NADH 및 O2●-/ H2O2 생산의 속도 추정 활용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 원시 RFU 데이터에 대 한 대표적인 추적 수집 분석 결과 중. (A) 분석 결과 중 읽기 각 잘 곡선. 플레이트 보기 곡선 CTL 버튼에 각 잘 읽어을 클릭 하 여 생성 됩니다. (B) 데이터 내보내기에 대 한 데이터 대표 RFU 값이 포함 된 테이블을 생성 보기 아래 클릭. 스프레드시트 내보내기 단추 다음 원시 결과 내보내려면 클릭 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 직접 H2 의 비교 O 2 그리고 KGDHC와 PDHC의 NADH 형성 속도. KGDHC와 PDHC의 잠재적인 형성 NADH와 H2O2 의 (A) 동시 측정. (B) H2O2 와 KGDHC와 PDHC에 의해 NADH 형성의 속도의 계산. 두 포함 하는 플 라빈 효소 NADH 및 선생님 생산의 직접 비교 KGDHC 더 많은 H2O2 의 높은 효소 용량에 관련 되어 생성 하는 방법을 보여 줍니다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : H의 동시 측정 2 O 2 와 NADH 형성 하는 KGDHC 및 PDHC에 의해 요금 다른 기질 농도 산화. 형광의 변화는 최종 기질 농도 0 mM에서 10 mm 다양 했다를 제외 하 고 이전에 설명 된 대로 측정 되었다. 이 접근은 KGDHC 및 PDHC 운동 속성에 H2O2 출시의 종속성을 확인 사용 되었다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : KGDHC 및 PDHC는 또한 다른 H2 을 표시 O 2 와 NADH 속성 형성 때 나드 + 레벨 변경 됩니다. 나드+ 의 최종 농도가 1 m m 0에서 다양 했다를 제외 하 고 이전에 설명 된 대로 변경 형광에서 측정 되었다. 이 접근은 KGDHC 및 PDHC 운동 속성에 H2O2 출시의 종속성을 확인 사용 되었다. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : NADH와 H2 에 대 한 다른 사이트 억제제의 상영 O 2 생산. (A) 다이어그램 KGDHC와 액션 KMV와 CPI-613의 사이트에 대 한 촉매 주기를 묘사. Note PDHC 동종 촉매 사이클은 제외 하 고는 KMV pyruvate 바인딩 사이트에 대 한 경쟁 하지 않습니다. E1: pyruvate 또는 α ketoglutarate 효소, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide 효소. (B) 효과 KMV와 KGDHC와 PDHC에 의해 생산 NADH와 H2O2 에 CPI-613. 샘플 KMV (10mm) 또는 CPI-613 preincubated 했다 (150 µ M) 및 다음 NADH와 H2O2 생산에 대 한 분석. n = 4, ± SEM. 의미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 약 작업 사진 농도 잘 추가 볼륨 최종 농도에 잘
KGDHC 또는 PDHC 1 단위/mL 20 Μ L 0.1 단위/mL
Superoxide dismutase 단위/250ml 20 Μ L 25 단위/mL
양 고추냉이 과산화 효소 30 단위/mL 20 Μ L 3 단위/mL
티 아민 파이 인산 3 m m 20 Μ L 0.3 m m
보 효소 A 1mm 20 Μ L 0.1 m m
나드+ 10 m m 20 Μ L 1mm
10-아 세 틸-3, 7-dihydroxyphenoxazine 100 Μ M 20 Μ L 10 Μ M
기판 1-100 mM 20 Μ L 0.1-10 mM

표 1: 기본 프로토콜의 예는 O의 측정에 대 한 설정 2 - /H 2 O 2 고 순화 된 PDH 또는 KGDH NADH 생산. 20 µ L 각 시 약의 각 잘 하 고 마지막에 추가 됩니다 이후 볼륨/반응 200 µ L, 각 시 약의 최종 농도 10 배 재고 농도 보다는 더 적은 이다 (예를 들어, 반응 혼합물에 있는 나드+ 의 최종 농도 1 m m ). Note 시 약 테이블에서 순서에서 잘에 추가 되어야 한다.

억제제 대상
3-메 틸-2-옥 valeric 산 KGDHC의 소 단위 E1
CPI-613 Oxo 산 dehydrogenases의 e 2 소 단위

표 2: 저 해제 및 그들의 목표의 목록. 행동의 사이트는 그림 8에 그려져 있습니다.

NADH autofluorescence
PDHC KGDHC
시간 T ° 376,450 A 1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0: 00시 04분 24.4 99 99 91 88 85 82 58 88
0: 00시 34분 24.4 128 107 99 108 81 80 77 78
0: 01시 04분 24.4 124 128 117 139 97 88 97 76
0: 01시 34분 24.4 146 142 129 132 91 97 84 78
0: 02시 04분 24.4 161 153 148 146 90 107 95 88
0: 02시 34분 24.4 171 160 156 145 97 103 111 122
0: 03시 04분 24.4 176 176 161 169 109 120 99 116
0: 03시 34분 24.4 186 180 179 167 118 123 121 119
0: 04시 04분 24.4 201 182 187 183 127 124 119 131
0: 04시 34분 24.4 225 190 195 186 136 143 124 132
0: 05시 04분 24.4 227 227 203 197 115 143 121 143
Resorufin 형광
PDHC KGDHC
시간 T ° 565,600 A 1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
0: 00시 24.4 204 178 169 152 148 113 107 90
0: 00시 30분 24.4 224 188 167 152 144 116 124 112
0: 01시 24.4 212 186 178 161 153 114 122 120
0: 01시 30분 24.4 212 188 165 164 160 132 127 116
0: 02시 24.4 222 203 190 169 154 128 133 127
0: 02시 30분 24.4 217 198 193 179 165 129 147 130
0: 03시 24.4 223 218 202 179 183 142 145 137
0: 03시 30분 24.4 239 223 208 188 179 150 155 148
0: 04시 24.4 236 219 202 183 180 163 156 153
0: 04시 30분 24.4 249 220 214 177 199 149 150 167
0: 05시 24.4 251 232 225 196 211 170 169 161

표 3: 실험의 집합에서 수집 된 결과 스프레드시트 보기. 실험에서 생성 된 원시 RFU 값 추가 분석을 위해 스프레드시트 내보내집니다. 실험 이전에 생성 하는 표준 곡선을 사용 하 여 스프레드시트에 NADH와 H2O2 생산의 비율을 계산할 수 있습니다.

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Discussion

이 프로토콜은 이후 유리, 1) 그것은 어떤 경쟁 반응을 방해할 수 있는 그렇지 않으면 H2O2 감지 (, 항 산화 시스템 또는 기타 소스 선생님의), 2를 제거)의 기본 속도의 직접 평가 제공 선생님 분리를 포함 하는 플 라빈 미토 콘 드리 아 효소, 3) 원시의 비교를 허용 한다 선생님 릴리스 2의 속도 또는 더 정화 플 라빈 기반 dehydrogenases, 4) 선생님과 효소 활동, 및 5의 속도의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다) 선생님 자료에 대 한 선택적 경쟁력 억제제의 수 있습니다. 우리의 그룹 및 다른 사람 사용이 메서드 이전 간행물 allosteric 여 선생님의 규칙을 검사와 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 근육14,16, 산화 환 원 신호 메커니즘 실시 전에 실험 17,,1920.

수정 및 문제 해결:

이 절차는 거의 모든 교육 기관에서 기본 장비를 사용할 수를 사용합니다. 접근 저렴 한 비용 또한 이며 다양 한 공급 업체를 통해 사용할 수 있는 일반적인 화학 물질을 사용 하 여. 비록, 우리는 기본적인 반응 버퍼 자당, HEPES, 마 니 톨, 및 EGTA 구성 된 대부분의 응용 프로그램에서 잘 작동 나타났습니다 버퍼 구성 효소 특성-에 따라 달라질 수 있습니다. Resorufin 형광에 대 한 원시 값은 일반적으로 약 0.1 U/mL를 희석 하는 효소를 방출 하는 선생님에 대 한 50-500 RFU. 값이 높을수록 RFU AUR 시 빛 또는 반복된 동결-해 동에 노출으로 인해 자동 산화 되었습니다 나타낼 수 있습니다. 따라서, AUR 작업 솔루션 대체 되어야 한다 정기적으로 (사용 주파수)에 따라 2 ~ 3 주마다. 효소 준비 또는 변성 불순물 정상 선생님 및 NADH 수치 보다 낮은 될 수 있습니다. 효소 순도 젤 전기 이동 법에 의해 정기적으로 모니터링 해야 합니다. 운동 속성 (킬로미터 및 기판에 대 한 브이 맥스와 나드+) 또한 있어야 구입 또는 효소의 정화 후 즉시 평가 하 고 다음 정기적으로 그 후 모니터링. 분석 결과에 사용 된 시 약의 대부분 안정 되며 여러 freeze-thaw 주기를 받게 될 수 있습니다. Pyruvate와 α ketoglutarate 자동 산화를 피하기 위해-80 ° C에서 100 µ L의 aliquots에 저장 되어야 합니다. O2●-/H2O2 에 PDHC 및 KGDHC (잠재적으로 다른 flavoenzymes) 급진적인 형성17통해 직접 형성 이후 DTT 같은 감소 시키는 대리인을 사용 하지 마십시오. 37 ° C에서 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, 우리의 그룹 25 ° C에서 이러한 실험 보다 일관성 있는 데이터를 제공 하기 위한 이상적입니다 발견 했다.

기술의 한계:

이 기술은와 관련 된 하나의 주요 장애물은 정화 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 효소에 대 한 액세스. 여기,이 기술은 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 dehydrogenases의 선생님 자료 용량 및 효소 활동을 직접 비교를 사용할 수 있습니다 입증 상용 KGDHC 및 PDHC를 사용 우리. 그러나, 대부분 선생님 포함 하는 플 라빈 효소를 생산 하지 상업적으로 사용할 수 있으며 실험실에서 정화 해야 합니다. 이 막이이 효소의 일부 고려 도전적 일 수 있다 바운드 또는 미토 콘 드리 아 내 막에 흡수. 선생님을 생성 하는 막 도약 포함 하는 플 라빈 효소의 성공적인 정화에 대 한 새로운 프로토콜 지금 사용할 수 있습니다. 이 포함 복합 정화 방법 나, 복잡 한 II 및 sn-글리세롤-3-인산 효소21,,2223. 따라서 나열 된 선생님 발전기의 대부분 상업적으로 사용할 수 없습니다, 비록 프로토콜 존재 그들의 격리 및 정화. 순화 플 라빈 기반 효소를 사용 하 여 수집 결과의 생리 적인 관련성 한계 이기도 합니다. 따라서, 정제 효소와 함께 수집 결과 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 permeabilized 직물을 사용 하 여 분석 실험과 따라 되어야 합니다. 5 별도 연구는 KGDHC 및 PDHC14,,1617,19,20여 선생님 출시의 규칙에 대 한 메커니즘을 조사 하이 접근을 사용. 예비 선생님 버전 제어에서 산화 환 원 스위치의 역할에 대 한 결과 처음 순화 KGDHC 및 PDHC를 사용 하 여 테스트 하 고 다음 규칙에 대 한 메커니즘 간 및 심장 미토 콘 드리 아 근육 섬유14, 분석 추가 되었다 16,,1720.

기존의 방법에 관하여 의미:

선생님을 측정 자료 미토 콘 드리 아에서 생산의 개별 사이트에서 O2●-/ H2O2 와 항 산화 시스템 그렇지 않으면 이어질 수 있습니다 생산 경쟁 측 반응의 존재로 인해 도전적 일 수 있다 네이티브의 과소입니다. 잠재적인 막 또한 다양 한 사이트에서 선생님 릴리스 요금을 변경할 수 있습니다 그리고 억제제를 사용 하 여 O2●-/ H2O2 형성 측정을 혼동 하는 전자 흐름을 변경할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 동시에 O2●-/ H2O2 와 효소 활동의 기본 속도 사이의 관계를 평가 하는 동안 개별 효소에서 선생님 자료 용량의 직접 평가 가능 이 저렴 한 방법은 미토 콘 드리 아, 세포, 또는 조직 보다 정교한 실험을 실시 하기 전에 개별 플 라빈 포함 된 미토 콘 드리 아 효소에 대 한 네이티브 선생님 출시 요금 비교 하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 여기에 소개 하는 방법은 미리 화면 효과 고립 된 미토 콘 드리 아와 분석을 실시 하기 전에 선생님 릴리스에 대 한 억제제의 선택도를 활용할 수 있습니다.

미래의 응용 프로그램:

여기에 소개 하는 메서드는 PDHC 및 KGDHC14,,1617,19,20선생님 자료 제어를 조사 하기 위한 5 개의 별도 연구에 사용 되었습니다. 이러한 연구에서 억제제 상영 했다 고 선생님 놓고 NADH 생산 속도 정화 효소를 사용 하 여 평가 했다. 정제 효소와 함께 수집 된 결과 다음 고립 된 미토 콘 드리 아를 사용 하 여 확인 했다 고 근육 섬유14,,1617,20permeabilized. 따라서,이 메서드는 네이티브 선생님 릴리스 요금 미토 콘 드리 아, 세포, 근육 섬유에서 공부 하기 위한 미래 연구의 숫자에 적용할 수 있습니다.

프로토콜에 중요 한 단계:

효소 순도 및 키네틱 속성 정기적으로 모니터링 될 해야 합니다. AUR 재고 시 작업 또한 자주 교체 합니다. 이렇게 하면 수집 된 결과 일치. 시 약의 추가의 순서는 성공적인 실험 (표 1)을 실행 하기 위한 중요 한입니다. 억제제는 선생님 출시의 최대 억제를 유도 하는 데 필요한 농도 결정 하기 위해 적정 한다. 이 연구에서 우리는 10mm KMV 선택 150 µ m CPI-613 이후 우리가 이전이 농도 KGDHC 및 PDHC13선생님 릴리스의 최대한 억제 유도 결정 했다.

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Disclosures

공개는 아무 상관이 있다.

Acknowledgments

이 작품은 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 투자 되었다. 동영상 제작 교육 및 학습 (CITL) 뉴펀들랜드 메모리얼 대학에 혁신을 위한 센터와 공동으로 실시 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pyruvate dehydrogenase complex SIGMA P7032-10UN purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex SIGMA K1502-20UN purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution SIGMA HX0640-5 reagent, standard curves
NAD+ SIGMA N0632-1G reagent, activity/ROS release assay
NADH SIGMA N4505-100MG reagent, standard curves
pyruvate SIGMA P2256-5G reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate SIGMA 75892-25G reagent, activity/ROS release assay
CoASH SIGMA C3019-25MG reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate SIGMA C8754-1G reagent, activity/ROS release assay
mannitol SIGMA M4125-100G buffer component
Hepes SIGMA H3375-25G buffer component
sucrose SIGMA S7903-250G buffer component
EGTA SIGMA E3889-10G buffer component
KMV SIGMA 198978-5G reagent, ROS release inhibitor
CPI-613 Santa Cruz sc-482709 reagent, ROS release inhibitor
SOD SIGMA S9697-15KU reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase SIGMA P8375-1KU reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red Thermofisher A36006 reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader BioTek Instruments microplate reader for assays
Gen5 software BioTek Instruments software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism Graphpad software software, data analysis
Microsoft EXCEL Microsoft software, data analysis

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References

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