Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

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Neuroscience

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Summary

L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.

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Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (131), e57015, doi:10.3791/57015 (2018).

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Abstract

Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano Orchestra ritmiche uscite comportamentali e fisiologiche, coordinate con segnali ambientali, ad esempio cicli giorno/notte. L'orologio molecolare all'interno di ogni neurone di pacemaker genera i ritmi circadiani nell'espressione genica, che sottendono le funzioni neuronali ritmiche essenziali per il funzionamento del circuito. Indagine delle proprietà di singoli oscillatori molecolare in diverse sottoclassi di neuroni pacemaker e la loro interazione con la segnalazione di un neurone produce una migliore comprensione del circuito stimolatore cardiaco circadiano. Qui, presentiamo un approccio di time-lapse microscopia fluorescente sviluppato per monitorare l'orologio molecolare in neuroni di orologio di coltura della drosofila larvale cervello. Questo metodo permette la registrazione di multi-giorno dei ritmi di reporter circadiano fluorescenti geneticamente codificato a cella singola risoluzione. Questa configurazione può essere abbinata a manipolazioni farmacologiche per analizzare da vicino risposta in tempo reale dell'orologio molecolare di vari composti. Oltre i ritmi circadiani, questo metodo multiuso in combinazione con potenti tecniche genetiche di Drosophila offre la possibilità di studiare diversi processi neuronali o molecolari in tessuto cerebrale dal vivo.

Introduction

Orologi circadiani aiutano gli organismi ad adattarsi ai cambiamenti ambientali periodici generati dalla rotazione della terra 24 h. I cicli di feedback trascrizionale traslazionale interbloccata comunemente sono alla base di macchine molecolari della orologi circadiani attraverso specie1. Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano composto contenente orologio neuroni integra time-of-day informazioni veicolate dagli stimoli ambientali, come luce/buio (LD) e cicli di temperatura, di orchestrare i ritmi di una pletora di quotidiano fisiologico e processi comportamentali2,3. Il coordinamento dei ritmi molecolari con un neurone ingressi e uscite è di fondamentale importanza per il funzionamento del circuito circadiano ma resti solo parzialmente capiti.

In Drosophila, il nucleo dell'orologio molecolare, l'eterodimero/ciclo di CLOCK (CLK/CYC) attiva la trascrizione di periodo (a) e senza tempo (tim). TIM e PER formare un complesso ed entrare nel nucleo, dove inibiscono l'attività trascrizionale di CLK/CYC e di conseguenza la propria trascrizione. Post-trascrizionali e post-traduzionali regolamenti causano ritardi tra CLK/CYC-mediata trascrizione e repressione di PER / TIM, garantendo la generazione di circa 24-h oscillazioni molecolari1,3,4 . Circa 150 neuroni contenenti questi orologi molecolari forma un circuito per controllare il comportamento circadiano di adulto Vola5. Un molto più semplice ma completamente funzionale circadiano circuito composto da 3 gruppi di neuroni orologio - 5 neuroni laterale ventrale (LNvs; 4 PDF-positivi LNvs e un PDF-negativi LNv, vedi sotto), 2 dorsali del neurone 1s (DN1s) e 2 dorsale del neurone 2s (DN2s) - è presente nel larvale cervello6,7.

Il semplice circuito circadiano larvale offre un eccellente modello per studiare le interazioni tra la comunicazione inter-neuronale e l'orologio molecolare. Utilizzando il nostro reporter fluorescente recente sviluppato PER-TDT, che imita i livelli di PER proteina e la sua posizione subcellulare, abbiamo cercato di caratterizzare la dinamica del movimento a orologeria molecolare nei sottogruppi di neurone differenti dell'orologio nel circuito circadiano larvale 8. Inoltre, conoscendo il ruolo chiave del fattore di dispersione del pigmento di neuropeptide (PDF) prodotto da 4 LNvs nel regolare i ritmi circadiani a livello neuronale9,10,11, abbiamo voluto esaminare il diretto effetto di PDF sugli orologi molecolari. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo per monitorare l'espressione genica circadiana ritmi nel cervello larvale explant di più giorni mediante microscopia confocale a time-lapse. Il protocollo è stato anche adattato per i dosaggi farmacologici testare l'effetto di PDF o altri composti sul livello di PER-TDT. Così, l'adattamento è costituito da rendendo accessibile all'applicazione di droga la cultura di espianto del cervello, aumentando la risoluzione temporale e imaging per una durata più breve.

Ex vivo cultura del cervello di Drosophila di diversi stadi di sviluppo sono stati stabiliti in precedenza12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando che questi protocolli sono stati utilizzati per l'imaging di vari fenomeni biologici, alcuni di loro non sono compatibili con formazione immagine a risoluzione di singole cellule o non supportano la cultura per più di alcune ore. Metodi alternativi per eseguire imaging dal vivo a lungo termine dei neuroni circadiani in Drosophila includono bioluminescenza imaging molecolare ritmi19,20,21 e imaging di fluorescenza indicatore di calcio con foglio leggero microscopia22,23. Anche se imaging bioluminescenza può raggiungere la più alta risoluzione temporale e microscopia foglio leggero può essere adattabile per l'imaging in vivo , essi hanno limitati la risoluzione spaziale e richiedono sistemi di microscopia specializzati.

Il metodo qui descritto è su misura per visualizzare segnali fluorescenti nella cultura intero cervello a cella singola risoluzione di più giorni. Questo metodo facile e versatile può essere adattato ai cervelli volare adulto immagine coltivata e per gli esperimenti farmacologici studiare diversi problemi in neurobiologia della drosofila .

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Protocol

1. preparazione delle soluzioni madri sotto una cappa di cultura

  1. Preparare 400 mL di 1x Schneider mezzo attivo (SAM), ottimizzato per ex vivo cultura dei cervelli larvali (modificato da riferimento24,25) (tabella 1). Aliquota di 5 mL e flash congelamento in azoto liquido (LN2), conservare a - 80 ° C.
  2. Preparare soluzione salina dissecante (DSS): 1x diluendo 10 x soluzione madre (modificato dal riferimento26) (tabella 2).
  3. Aliquota fibrinogeno a 10 mg e conservare a 4 ° C per un uso singolo.
    Attenzione: Pesare fibrinogeno sotto flusso laminare, indossando guanti, come è dannoso.
  4. Preparare la soluzione di riserva della trombina a SAM (1500 NIH unità/mg) e aliquota a 10 µ l, flash congelare in LN2 e mantenere a-80 ° C.
    Attenzione: Indossare guanti durante la manipolazione della trombina come è dannoso.
  5. Soluzione di riserva aliquota di 100 x penicillina-streptomicina. Conservare a-20 ° C.
  6. Tagliare cerchi della membrana di politetrafluoroetilene (PTFE) (Vedi materiali tavolo) per le dimensioni che si inserisce all'interno di un piatto fondo di vetro. Sciacquarli in 70% EtOH e quindi in dH2O. sterilizzare in autoclave e a secco sotto flusso laminare con UV. Tenere in una capsula di Petri sterile. Uso singola.
    Nota: PTFE è una membrana flessibile porosa che permette lo scambio di gas e impedisce l'evaporazione durante la registrazione a lungo termine di mezzo.

2. Time-lapse microscopia Setup

Nota: Il seguente setup è per un microscopio confocale di tandem scanner invertito (Vedi materiali tavolo) dotato di uno scanner di risonanza (8.000 Hz). Il sistema comprende un rivelatore di foto-moltiplicatore altamente sensibile, che insieme con lo scanner risonante previene fototossicità e photobleaching. Temperatura e l'umidità sono controllate all'interno di una camera ambientale microscopio (Vedi Materiali tavolo) che copre la maggior parte del microscopio.

  1. Posto un palcoscenico-top umidostatica.
  2. Accendere i regolatori di temperatura e umidità per equilibrare la camera microscopio a 25 ° C e 80% di umidità.
  3. Per eseguire esperimenti in costante oscurità (DD), coprire la camera ambientale microscopio con un panno opaco (a meno che l'alloggiamento del microscopio è fatto di un materiale opaco).
  4. Se si utilizza un obiettivo a immersione in acqua, posizionare un distributore di Micro di immersione acqua sopra l'obiettivo e programmare un protocollo con il software Autoimmersion obiettivo Controller per erogare acqua a una velocità costante durante la formazione immagine di time-lapse.
    Nota: Obiettivi di immersione in acqua insieme a un distributore di acqua o asciutto dell'obiettivo sono raccomandati per l'imaging dal vivo a lungo termine, come altro tipo di mezzo immersione sarebbe asciugare.
  5. Collocare un supporto per piastra di Petri sul palco, all'interno della camera di umidità.
  6. Avviare il software di microscopio e selezionare la modalità scanner risonante dalla prima finestra di dialogo. Selezionare OK per inizializzare la fase quando richiesto. Vai alla scheda configurazione e alla configurazione di Hardware per accendere le linee laser pertinente.
  7. Vai alla scheda di acquisizione e al pannello di XY per selezionare la modalità bidirezionale e impostare immagine acquisizione parametri.
    Nota: L'installazione imaging descritto qui presentato (Figura 2, Figura 3 e Movie 1) è ottimizzato per osservare espressione circadiana di reporter fluorescenti specifici. I seguenti parametri sono stati scelti per soddisfare al meglio le nostre specifiche: 40 X acqua obiettivo a immersione, media di linea X 8 con 512 × 512 risoluzione dell'immagine. Per l'imaging multicolor, acquisizione di immagini sequenziali è necessaria quando la lunghezza d'onda di emissione di un fluoroforo e la lunghezza d'onda di eccitazione di sovrapposizione di un altro (qui, lunghezze d'onda di emissione di proteina fluorescente gialla (YFP) e sovrapposizione di eccitazione di pomodoro). Scegliere la modalità sequenza "in between"stack come è il più veloce e il movimento dei neuroni di orologio è trascurabile durante l'acquisizione di uno Z-stack. La microscopia impostazioni dovrebbero essere adattate per soddisfare l'obiettivo di ogni esperimento.

3. installazione della cultura Explant larvale cervello

Nota: L'intera procedura da dissezione all'incorporamento degli espianti di cervello richiede circa 30 min.

  1. Preparazione dei reagenti sotto una cappa di cultura.
    1. Scongelare una parte aliquota di trombina e conservare a temperatura ambiente fino alla fase di incorporamento (punto 3.3). Uso singola.
    2. Scongelare rapidamente un'aliquota di SAM a 37 ° C e tenere il ghiaccio per un singolo utilizzo.
    3. Aggiungere SAM ad un'aliquota di 10 mg di fibrinogeno a 10 mg/mL, flick delicatamente e incubare a 37 ° C per almeno 30 min e durante il passaggio di incorporamento (punto 3.3). Uso singola.
      Nota: Non Incubare la soluzione di fibrinogeno più di 2 h in quanto inizia a polimerizzare.
    4. Scongelare un'aliquota di 100 stock x penicillina-streptomicina. Preparare 2,5 mL di SAM che contiene 1 x penicillina-streptomicina (SAM/antibiotici). Conservare a temperatura ambiente.
      Nota: La Stock in archivio i rimanenti x 100 penicillina-streptomicina a 4 ° C fino a 1 mese.
    5. Preparare un'aliquota di 500 µ l da SAM rimanenti. Tenere il ghiaccio.
    6. Per l'imaging a lungo termine, applicare il grasso per vuoto in autoclave per la parte in plastica della parte inferiore del vetro piatto fondo (Figura 1A) e sterilizzare sotto flusso laminare con UV.
  2. Dissezione del cavo del nervo del sistema nervoso centrale e ventrali.
    1. Pulire il forcipe e 2 x tre-pozzo vetro piatti di dissezione con 70% EtOH. Versare 400 µ l di DSS in 4 pozzi e 400 µ l di SAM in un pozzetto. Tenere il ghiaccio.
    2. Scoop di Vola mezzo contenente larve e pick non vagare 3rd instar larve (L3) con il forcipe. Successivamente sciacquare 2 pozzi DSS-riempito. Tenerli nel pozzo pieno di DSS 3 ° sul ghiaccio che anestetizza le larve.
      Nota: L3 dura circa 2 giorni a 25 ° C. Per osservare il cervello in fisiologicamente rilevante lasso di tempo che abbiamo scelto di utilizzare non vagare larve L3. Altri sottogruppi dei neuroni di orologio, come l-LNvs e DN3s, iniziano a formarsi a vagare fase L3 ma non sono necessariamente in bicicletta ancora (dati non mostrati). Pertanto, anche se è possibile immagine Ciclismo orologio neuroni in questa fase (dati non mostrati), è importante distinguere attentamente i neuroni già funzionale orologio larvale in via di sviluppo a quelli per l'analisi dei dati. Non vagare L3 compaiono circa 4-4,5 giorni dopo uova a 25 ° C. Per utilizzare questo protocollo per studiare i ritmi circadiani, sincronizzare (trascinare) lo sviluppo larve in 12 h/12 h LD cicli a 25 ° C per 3 giorni prima di raccogliere le larve L3.
    3. Sezionare larvali cervelli con una pinzetta nel 4 ° DSS-riempito bene, che non è stato utilizzato per il risciacquo larve, utilizzando il metodo di dentro-fuori27.
      1. Brevemente, tagliare la larva in due, delicatamente pizzicare i ganci di bocca con un paio di pinze e arrotolare dentro-fuori la parete del corpo usando l'altra coppia di pinze, esponendo così il cervello. Gratis il cervello tagliando fuori tutti la trachea e i nervi che collegarlo al resto del corpo.
      2. Aspirare il cervello in circa 3 µ l di DSS con una pipetta di 20 µ l (pre-risciacquata con DSS) ed erogare nel pozzo pieno di SAM. Ripetere la procedura per fino a 7 cervelli.
        Nota: Dissezione dovrebbe essere eseguita su una superficie fredda per mantenere le larve anestetizzate e cervello refrigerati. Ad esempio, posizionare il piatto di dissezione su un blocco di raffreddamento collegato ad una pompa per far circolare acqua ghiaccio-refrigerati. La dissezione procedura prende ~ 30 s al cervello. È importante tenere i dischi immaginali occhio/antennali attaccati per il cervello e il midollo ventrale del nervo intatto. Strappare queste parti danneggia il cervello e ridurre la qualità della cultura. Inoltre, evitare di esporre i cervelli all'aria. Prima di aspirare il primo cervello, pipetta su e giù per il DSS contenenti parti delle larve dissecate, come esso previene i cervelli di attaccarsi alla parete della punta.
  3. Incorporamento di espianti di cervello in una matrice 3D e montaggio (~ 20 min).
    1. Immergere un cervello sezionato in soluzione di lavoro del fibrinogeno (concentrazione finale del fibrinogeno ~3.3 mg/mL, 10,5 µ l al cervello) come segue:
    2. Aspirare 3,5 µ l di SAM/antibiotici (con la stessa punta utilizzata nella sezione 3.2.3). Aspirare un cervello dissecato dalla dissezione fino la punta della pipetta stessa senza il mezzo di SAM/antibiotici nella punta di erogazione.
    3. Dispensare il cervello ed il mezzo sul coperchio di una scatola di Petri sterile. Aggiungere un altro 3,5 µ l di SAM/antibiotici e 3,5 µ l di soluzione di 10 mg/mL di caldo fibrinogeno/SAM sul menu contenente il cervello. Mescolare delicatamente la soluzione intorno al cervello di pipettaggio con una punta di pipetta 20 µ l.
      Nota: L'utilizzo di una pipetta, piuttosto che il forcipe in questo passaggio evita sottolineando il cervello.
    4. Prendere 2 µ l della soluzione di lavoro di fibrinogeno dal menu e applicare sul coprioggetto del vetro piatto fondo come un piccolo cerchio. Aggiungere 0,8 µ l della trombina e mescolare molto velocemente con un puntale. Il fibrinogeno viene convertito in fibrina e inizia a polimerizzare.
    5. Prendere il cervello che si siede del fibrinogeno soluzione (punto 3.3.1) tra un paio di pinze da lavoro e posizionarlo sulla matrice una volta una bianca matrice di fibrina è visibile. Orientare il lato anteriore del cervello verso il basso (per l'imaging orologio neuroni). Spingere verso il basso più vicino possibile al vetro di copertura. Coagulo di fibrina è composta di strati di fibrina. Selezionate un livello e piegarlo in cima il cervello con movimenti piccoli e delicati senza staccare la matrice.
      1. Ripetere 2-3 volte da diverse parti del coagulo per stabilizzare il cervello.
        Nota: Quando si maneggia il cervello con il forcipe, essere attenti a non asciugare o imporre uno stress fisico.
    6. Aggiungere 20 µ l di SAM/antibiotici in cima il cervello incorporato per fermare l'azione della trombina.
    7. Ripetere la procedura per montare i cervelli rimanenti. È possibile incorporare fino a 5 a 6 cervelli su un piatto fondo di vetro.
    8. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, è necessario aggiungere 600 µ l di SAM/antibiotici nel pozzo interno (la parte di vetro). Posizionare una membrana in PTFE pre-tagliata in cima il mezzo e bastone per il grasso per vuoto applicato sulla parte in plastica della parte inferiore (3.1.5) (Figura 1A).
    9. Per i dosaggi farmacologici, riempire il piatto con 2 mL di SAM/antibiotici (Figura 1B).
      Nota: È molto importante evitare l'evaporazione del fluido, come il osmolality del mezzo è fondamentale per la vitalità dei neuroni. Pertanto, per esperimenti a lungo termine di imaging, è necessario sigillare la piastra di coltura con membrana in PTFE. Mentre per gli esperimenti a breve termine, membrana di tenuta non è necessaria fino a quando il piatto è riempito con 2 mL di terreno e monitorato in una camera umidificata.

4. Time-lapse immagine acquisizione

  1. Mettete il piatto inferiore di vetro sul supporto di Petri all'interno della camera di umidità di palcoscenico-top.
  2. Vai al pannello di z-stack nella scheda Acquire e impostare i passaggi di z-sezione dal software microscopio (2 µm × ~ 40 negli esperimenti mostrato in Figura 2 e Figura 3 Movie 1). Impostare l'inizio di uno z-stack all'aereo più lontana il vetrino coprioggetto e alla fine sulla superficie del explant cervello, vicino il vetrino coprioggetti. Anche se i movimenti del cervello sono trascurabili, aggiungere z-sezioni extra all'inizio e alla fine dello z-stack.
  3. Vai a contrassegnare e trovare l'acquisizione di immagini multi-posizione di pannello e set-up. Con un obiettivo 40x, 1 emisfero del cervello può essere catturato all'interno di un campo di vista
  4. Vai a pannello di modalità di acquisizione e selezionare xyzt (z-stack di time-lapse). Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare i parametri di frequenza e intervallo di tempo preferito.
    Nota: Acquisire immagini time-lapse con la frequenza desiderata. Nota che a lungo termine dal vivo imaging (24-72 h) con intervallo di lasso di tempo inferiore a 2h tende a risultati in meno neuroni in bicicletta, probabilmente perché riduce la vitalità dei neuroni. Il volume di dati si espande come il tasso degli aumenti di acquisizione immagine, che rende la memorizzazione e l'analisi di dati più impegnativo.

5. pharmacological Treatment of espianti di cervello con Live Imaging a breve termine

Nota: La seguente procedura è essenzialmente la stessa di quella per l'imaging a lungo termine ma non necessita di una membrana in PTFE. Per evitare di esporre i cervelli luce blu quando la sostanza è aggiunta alla cultura, il microscopio deve essere posizionato in camera oscura con luce rossa.

  1. Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare l'intervallo di tempo desiderato e il numero di scansione per ottenere i dati della linea di base prima dell'applicazione del farmaco. Avviare la scansione.
  2. Dopo la linea di base la scansione è completata, sollevare la testa di scansione del sistema microscopio. Rimuovere il coperchio della centralina del palcoscenico-top umidità e con molta attenzione togliere il coperchio del vetro piatto fondo senza spostarlo.
  3. Se necessario, rimuovere la giusta quantità di terreno di coltura. Aggiungere la soluzione sperimentale nel mezzo e, con cura e molto delicatamente, mescolare con una pipetta Pasteur sterile senza toccare i cervello espianti.
    Nota: Per applicazione di vasca di PDF, utilizzare 2 µM PDF soluzione stock (nel 10% DMSO).
  4. Sostituire i coperchi di vetro piatto fondo camera umida e la testa di scansione. Se si utilizza, è possibile riposizionare il drappo nero opaco intorno alla camera di microscopio.
  5. Verifica se i cervelli sono alle loro posizioni originali in modalità scan in tempo reale. Regolare se necessario.
  6. Vai al pannello di acquisizione in tempo e impostare l'intervallo di tempo desiderato e il numero di scansione. Avviare la scansione.
    Nota: Qui abbiamo testato Time-lapse immagini acquisite ogni ora fino a 10 ore.

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Representative Results

Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi della registrazione a lungo termine di un reporter fluorescente circadiano in ex vivo larvale cervello cultura e i risultati di imaging dal vivo di applicazione bagno PDF sull'espressione di reporter.

Non vagare le larve L3 esprimendo l'orologio molecolare reporter PER-TDT e UAS-mCD8::YFP guidato da un conducente di neurone orologio Clk 856-gal4 (Figura 1) erano trascinato in LD. Brains erano dissecate e impostate per coltura a lungo termine durante l'ultimo luce, fase del ciclo LD solo previo la fase scura (Figura 1A e 2B). Time-lapse imaging è stata eseguita in DD e cervello espianti erano imaged ogni 2 h per 64 h. Un somma-stack contenente il neurone di interesse è stato creato e l'intensità media di fluorescenza della zona corrispondente al neurone è stata misurata dopo sfondo sottrazione8. Per determinare la ritmicità dell'espressione reporter, sia analisi spettrale massima entropia (MESA) e ispezione manuale erano usate8. Due DN2s che visualizzano i ritmi circadiani con un periodo di ~ 26 h nei livelli PER-TDT sono presentati qui (Figura 2A, 2C e Movie 1).

Utilizzando essenzialmente la stessa impostazione cultura (Figura 1B), è stato studiato l'effetto di neuropeptide PDF sull'espressione di PER-TDT. I cervelli delle larve non vagare dello stesso genotipo come descritto sopra sono stati sezionati a ZT1 (Zeitgeiber Time 1, 1 h dopo luci accese in LD) o ZT13 (1 h dopo luci spente). I flaconcini contenenti larve erano immediatamente refrigerati sul ghiaccio dopo tolto l'incubatrice. Al ZT13, le fiale erano anche avvolto nella carta stagnola per evitare l'esposizione di luce blu. La dissezione del cervello è stata effettuata sul ghiaccio e dissecati cervelli erano tenuti sul ghiaccio. Il cervello preso a ZT13 era coperti con carta stagnola quando possibile. Così, anche se questa procedura è stata eseguita in laboratorio illuminato con luce naturale, l'effetto di esposizione alla luce il metabolismo e la sintesi macromolecolare era minimo. I cervelli sono stati analizzati due volte con intervallo di 1 h per ottenere i dati di base. PDF o veicolo (DMSO) è stato aggiunto al terreno di coltura e time-lapse immagini sono state acquisite ogni 1h per successivi 6 h. TDT PER il profilo di espressione hanno mostrato un aumento di tempo-di-giorno-dipendente in intensità di fluorescenza su PDF oltre alle ZT13 nella LNvs e DN1s e per un in misura minore sul DN2s (Figura 3)8.

Questi risultati indicano che la tecnica di imaging e il metodo di cultura qui descritto abilitata la registrazione dei ritmi PER-TDT a cella singola risoluzione senza evidente deriva fototossicità, photobleaching o messa a fuoco.

Nota: Immagini sono stati analizzati ed elaborati utilizzando Fiji28. 10 deconvoluzione iterativa di X è stato effettuato con AutoQuant e Imaris. Derive minori nelle immagini time-lapse sono stati corretti con drift 3D corretto plugin di ImageJ.

Figure 1
Figura 1: anatomia dei neuroni di orologio nel cervello larvale L3 e installazione di cultura explant cervello. (A e B) Schemi di installazione di cultura il cervello per l'imaging a lungo termine (A) e per i dosaggi farmacologici con imaging a breve termine (B). In (A), grasso per vuoto (giallo) è stato applicato sulla parte in plastica del vetro piatto inferiore per fissare la membrana PTFE. (C) un'immagine rappresentativa di un cervello larvale L3 LD-trascinato a ZT2. L'espressione del reporter orologio molecolare PER-TDT (magenta) è visibile in neuroni di orologio, che sono classificati da UAS-mCD8::YFP(green) guidato da Clk 856-gal4. Ci sono 3 gruppi di neuroni differenziati orologio in L3: 5 LNvs (tra cui la 5a LNv, che non esprimono PDF), 2 DN1s e 2 DN2s, indicato da frecce bianche. Nota l'espressione di PER-TDT nei nuclei dei neuroni di orologio. Cellule di YFP-negativi PER-TDT-positive sono glia e altro sottogruppo dei neuroni di orologio che ancora stanno sviluppando. Barra della scala = 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: immagini di neuroni larvale orologio dal vivo risultati rappresentativi di lungo termine. Visualizzazione di DN2s dall'imaging di time-lapse a lungo termine di un cervello coltivato ingrandita (A) . Espianti di cervello sono stati preparati dalle larve L3 LD-trascinato sezionate a ZT11. Immagini sono state scattate ogni 2 h da CT17 (circadiano tempo 17, 5 h dopo soggettive luci spente in DD) per 64 h in DD. Merged immagini di PER-TDT (magenta) e UAS-mCD8::YFP guidato da Clk 856-gal4 (verde) sono a sinistra di ogni pannello e PER-TDT livelli rappresentati come Heatmap con sfumatura blu sono sulla destra. Barra della scala = 10 µm. Solo in rappresentazione di immagini elaborate con correzione 3D drift e una deconvoluzione iterativa di X 10. (B) Timing dell'esperimento. (C) il grafico che rappresenta l'intensità di fluorescenza relativa normalizzato a t = 0 di due DN2s (blu e rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risultati rappresentativi di vivere-imaging per esperimenti farmacologici. LD-trascinato larvali cervelli sono stati sezionati e montati in ZT1 o ZT13 e PDF (2 µM) o DMSO è stato applicato alle ZT2 o ZT14. Espressione PER-TDT in espianti di cervello è stata monitorata ogni ora da microscopia time-lapse. Intensità di fluorescenza media ± SEM normalizzato al valore all'inizio di imaging (corrispondente a ZT1 o ZT13) è mostrato. Le frecce rosse indicano il tempo di applicazione PDF o veicolo (ZT2 o ZT14). * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001 e * * * p < 0,0001 mediante ANOVA a due vie con correzione di Sidak per i confronti multipli. Un minimo di 32 LNvs, 18 DN1s e 16 DN2s sono stati analizzati per ogni punto dati. Questa figura è stata modificata da riferimento8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1
Movie 1: formazione immagine dal vivo a lungo termine dei neuroni di orologio DN2 larvale. Filmato time-lapse del cervello larvale coltivato sezionato a ZT11 ed imaged in DD. Magnified viste di DN2s in un singolo emisfero esprimendo PER-TDT e UAS-mCD8::YFP guidato da Clk 856-gal4 sono mostrate. Immagini sono state acquisite ogni 2 h per 64 h. PER-TDT (magenta) e YFP (verde) sono a sinistra e livelli PER-TDT, rappresentati come un heatmap (sfumatura blu) sono sulla destra. Barra della scala = 10 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Passaggi Reagenti Concentrazione
1. mescolare i reagenti. KH2PO4 4,18 mM
CaCl2 1,05 mM
MgSO4.7h2O 0,7 mM
NaCl 116 mM
NaHCO3 0,7 mg/ml
Glucosio 2 mg/ml
Trealosio 2 mg/ml
Acido α-chetoglutarico 0,35 mg/ml
Acido fumarico 60 μg/ml
Acido malico 0,6 mg/ml
Acido succinico 60 μg/ml
Estratto di lievito 2 mg/ml
FCS NON inattivati al calore 20%
dH2O, in autoclave
2. sterilizzare con filtro di 0,22 μm.
3. Incubare in un'incubatrice per colture cellulari a 25 ° C al buio per 72 h. incubatore deve essere privo di contaminazione batterica o fungina.
4. aggiungere i reagenti. Insulina 2 μg/ml
Bis-Tris-HCl pH 6.8, sterilizzare con filtro di 0,22 μm 5 mM
5. regolare il pH a 6,8-6,9. NaOH (10 N) ~ 8 gocce
6. sterilizzare con filtro di 0,22 μm.
7. aliquota a 5 ml di Flash congelare in LN2 Store a-80 ° C. Utilizzare entro 60 giorni.
Nota: Per grandi volumi, sterilizzare con filtro bottiglia superiore dal vuoto, in caso contrario utilizzare un filtro per siringa. Aliquote aperte in una cappa di cultura. Uso singola.

Tabella 1: preparazione del mezzo di SAM (1x) per la cultura del cervello di Drosophila . Medio-espianto del cervello di cultura. Ogni procedura deve essere eseguita in una cappa di cultura fatta eccezione per l'incubazione del mezzo.

Passaggi Reagenti Concentrazione
1. mescolare i reagenti. HEPES-KOH, pH 7.4 99 mM
NaCl 1,37 M
KCl 54 mM
NaH2PO4 1,7 mM
KH2PO4 2,2 mM
Glucosio 33 mM
Saccarosio 438 mM
autoclavato dH2O
2. sterilizzare con filtro di 0,45 μm.
3. Conservare a 4 ° C a 6 mesi.
Nota: Per uso sperimentale: diluire a 1x con autoclavato dH2O e sterilizzare con 0,45 μm filtro top bottiglia dal vuoto o con siringa filtro. Conservare a 4° C. Aperta in una cappa di cultura, uso multiplo.

Tabella 2: preparazione di DSS (10x). Soluzione fisiologica per sezionare il cervello di Drosophila . Preparare in una cappa di cultura.

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Discussion

Qui abbiamo descritto il metodo per lungo termine microscopia di fluorescenza time-lapse di cervelli larvale coltivate. Il successo di questo tipo di esperimenti dipende da molteplici fattori, come la salute della cultura, metodo per immobilizzazione del espianto del cervello, l'intensità di fluorescenza e rapporto segnale-rumore del reporter, temporale e risoluzione spaziale, e accessibilità per l'espianto. Questi fattori possono essere mutuamente esclusivi. Ad esempio, aumentando la frequenza time-lapse colpisce la salute della cultura, e l'immobilizzazione del explant cervello potrebbe impedire lo scambio di gas. Così, trovare una via di mezzo (scusate il bisticcio) per i fenomeni oggetto di studio è la chiave per un protocollo di successo. Il metodo qui descritto è ottimizzato per monitorare l'espressione di reporter fluorescenti circadiano nella scala delle ore ai giorni. È anche applicabile per studiare altri soggetti in neurobiologia di Drosophila come processi critici sono inalterati ed eseguiti con cura.

In questo protocollo, cervello espianti sono immobilizzati in un coagulo di fibrina, che crea una matrice 3D. Anche se esistono altri metodi per immobilizzazione, quali poli-lisina o laminina rivestimento di vetro di copertura, questi rallentare lo sviluppo di larvale cervelli29 e può quindi compromettere la loro robustezza fisiologico. Per sua natura, fibrina fornisce un'eccellente matrice che è abbastanza sciolto per consentire le sostanze nutritive di raggiungere l'espianto di cervello e abbastanza appiccicoso al cervello essere vicino al vetro di copertura senza schiacciamenti e16. A causa di questi vantaggi, metodo del coagulo di fibrina è stata impiegata in vari protocolli per la coltura cellulare e cervello explant cultura14,17,29,30,31,32 ,33,34. Si consiglia di utilizzare una matrice di fibrina 3D per cultura larvale cervello anche per esperimenti relativamente a breve termine che durano più di poche ore. Larvale cervello cultura senza matrix 3D dà risultati irregolari (dati non mostrati), probabilmente a causa della mancanza di supporto fisico richiesto per lo sviluppo di cervelli.

È importante osservare attentamente la morfologia del explant e le cellule nel tessuto prima e durante il time-lapse di formazione immagine per rilevare qualsiasi segno di afflizione. Negli esperimenti presentati qui, espressione di mCD8::YFP la membrana-limitano ha mostrato intatta morfologia dei neuroni e PER-TDT è stato rilevato nel citoplasma e nel nucleo, come previsto, indicando che l'espianto di cervello è rimasto vitale e sano in tutta la durata di formazione immagine. Rhythmicity circadiano è stato studiato per fino a 72 h, ma abbiamo osservato che il cervello espianti possono essere coltivate fino a 5 giorni senza compromettere l'integrità dei neuroni e il cervello (dati non mostrati). Se i neurites diventano dotty o il corpo cellulare dei neuroni burst, questi sono in genere segni di fototossicità e facilmente evitato adattando le impostazioni microscopio di conseguenza. Ad esempio, provare a ridurre il potere del laser aumentando la dimensione del foro stenopeico, guadagno intelligente e la finestra di rilevazione. Tuttavia, in generale, l'intensità di fluorescenza del reporter è il fattore limitante per l'ottenimento di immagini di buon rapporto segnale-rumore senza illuminazione laser ad alta intensità. Pertanto, il design del reporter, scelta fra il fluoroforo e il numero di copie del reporter sono le prime cose da considerare quando si risoluzione dei problemi di viabilità. (Nell'esperimento qui presentato, sono state utilizzate 4 copie del reporter di al-tdt .)

Altri segni di una cultura di cervello compromessa includono lo scoppio di un emisfero durante imaging time-lapse e movimento del liquido fuori l'espianto del cervello. Questo è probabilmente a causa di micro-forature causate durante la dissezione del cervello. Rimuovere i dischi immaginali attaccati al cervello larvale è la principale fonte di forature, pertanto consigliamo contro di esso.

Il vantaggio di formazione immagine di fluorescenza diretta e circadiano sopra formazione immagine bioluminescenza è l'elevata risoluzione spaziale. Inoltre, la facilità di utilizzo di markers cellulari insieme con il giornalista di ritmo facilita l'analisi delle specificità del tipo di cella. Al contrario, la bioluminescenza ha una risoluzione temporale superiore ed eccellente rapporto segnale-rumore19,20,21. Tuttavia, nel complesso numero di neuroni in bicicletta al cervello ripreso da bioluminescenza non è superiore rispetto al numero ottenuto con il nostro metodo8,19,21. Nella maggior parte dei casi, i ritmi dei reporter fluorescente rilevato con il nostro metodo sono sincronizzati all'interno dello stesso cluster di neuroni di orologio (Vedi Figura 2), come mostrato con bioluminescenza19. Sono state osservate differenze di fase tra i cluster di neurone orologio in entrambe la fluorescenza e bioluminescenza circadiano imaging8,19,21. Pertanto, sia le metodologie sono ugualmente valide nell'osservare i ritmi circadiani nei cervelli coltivati e la scelta tra fioritura e bioluminescenza dovrebbe essere fatta secondo l'obiettivo dello studio.

La principale difficoltà tecnica di questo metodo è nel passaggio incorporamento. Poiché il protocollo chiama per imaging confocale a scansione veloce con un microscopio invertito e dispersione della luce nel tessuto cerebrale riduce la rilevazione della fluorescenza soprattutto quando imaging profondità nel tessuto, espianti di cervello dovrebbero essere montati più vicino il vetro di copertura è possibile. Inoltre, la riproducibilità dei risultati di imaging dipende la consistenza delle z-posizioni dei neuroni di interessi. Pertanto, è importante orientare e montare cervelli sempre allo stesso modo, che richiede pratica. All'immagine di un neurone cluster situati in posizioni anatomicamente distinti, può essere richiesto di eseguire esperimenti separati con orientamento explant differenti del cervello. Esistono metodi alternativi per l'imaging dal vivo dei tessuti profondi che non necessitano di coltura del tessuto, come da foglio leggero microscopia e microscopia del due-fotone. Quest'ultimo è stato usato con successo per immagine circadiano dinamica del calcio in streaming in Drosophila cervelli22,23. Tuttavia, la microscopia foglio leggero ha una risoluzione spaziale inferiore rispetto la microscopia confocale e così la sua applicazione per l'imaging a cella singola risoluzione rimane una sfida.

In sintesi, questo protocollo combina un sistema di semplice cultura degli espianti di cervello larvale in condizioni che supportano l'acquisizione di immagini time-lapse di reporter fluorescenti nei giorni e analisi quantitativa dei ritmi biologici. Anche se ci sono alcune limitazioni, come discusso in precedenza, la metodologia può essere adattata ai giornalisti diversi immagine nel cervello di Drosophila larvale e adulto e ulteriormente modificata per aumentare sensibilità e risoluzione spaziale. Ad esempio, proiezioni axonal situato in profondità nel cervello o trasporto vescicolare può essere rilevabile combinando la nostra tecnica di coltura explant cervello con microscopia del due-fotone35. Che essendo detto, è ancora possibile eseguire live-imaging di organelli come mitocondri nel cervello adulto espianti usando questo protocollo (dati non mostrati). Abbiamo anche presentato la variazione di questo protocollo per vasca applicazione della soluzione sperimentale in dosaggi farmacologici. Uno potrebbe estendere questo protocollo per eseguire esperimenti di "pulse-chase" manualmente sostituendo il terreno di coltura per lavare fuori il farmaco o utilizzando una perfusione camera18,36.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Michael Rosbash per suo tutoraggio e supporto durante la fase iniziale dello sviluppo di questo metodo. Questo lavoro è stato finanziato dal programma JST PRESTO, la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 e 31003A_169548), il Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-Biomedical Research (13A39) e l'Università di Ginevra .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655 I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich 230391
NaCl Sigma-Aldrich S5886
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1000
Insulin Sigma-Aldrich I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
BIS-TRIS Sigma-Aldrich B4429
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T0167
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512
Fumaric acid Sigma-Aldrich F8509
α-Ketoglutaric acid Sigma-Aldrich K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened BioConcept Ltd. Amimed 2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4 E&K Scientific Products EK-654011
KCl Sigma-Aldrich P5405
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S5011
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Fibrinogen from bovine plasma Calbiochem (Merck) 341573-1GM CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T9549 CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH Chi Scientific custom made
Vaccum grease Sigma-Aldrich 18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes fisherscientific 08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm Millipore SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film Dupont 200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore SLGV033RS
Three-well glass dissection dish Any company
Fine forceps, size 5, Dumont Fine Science Tools 11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber Life Imaging Services The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller Life Imaging Services custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin ImageJ software
10x iterative deconvolution AutoQuant and Imaris software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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