إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

وكثيراً ما يتم تغيير آليات جينية في الدبقي. ويمكن استخدام إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لدراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية في الدبقي التي تنتج عن التغييرات في هيستون التعديلات التي تنظم النسخ الكروماتين هيكل والجينات. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mendez, F. M., Núñez, F. J., Zorrilla-Veloz, R. I., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp. (131), e57016, doi:10.3791/57016 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن إشراك تعديلات جينية في التنمية والتقدم من الدبقي. التغييرات في مثلايشن وأسيتيليشن مروجين والمناطق التنظيمية المسرطنة والمكثفات الورم يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني وتلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لاورام الدماغ. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية (رقاقة) هو تقنية شعبية يتيح الكشف عن التعديلات أو غيرها من البروتينات أحكام ملزمة للحمض النووي. على النقيض من رقاقة cross-linked، في رقاقة الأصلي، لا تعامل الخلايا مع فورمالدهايد تساهمي ربط البروتين بالحمض النووي. وهذا مفيد لأنه في بعض الأحيان قد إصلاح crosslinking البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي فقط عابر وليس لها أهمية وظيفية في تنظيم الجينات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم رفع الأجسام المضادة عموما ضد الببتيدات غير المثبتة. لذلك، يتم زيادة خصوصية جسم في الشريحة الأصلية. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن رقاقة الأصلي لا ينطبق إلا على دراسة هيستونيس أو غيرها من البروتينات التي تربط محكم للحمض النووي. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ موريني.

Introduction

أحداث جينية متكررة في جليوماس، والمرجح أن تلعب دوراً مهما في نشوء المرض ورم. وفي الواقع، في طب الأطفال الدبقي عالية الجودة، الطفرات في الجينات ترميز المتغيرات هيستون H3.3 و H3.1 تحدث بشكل متكرر1. الطفرات تؤثر التعديلات هيستون وعواقب جينية رئيسية2،3. تحدث الطفرات المتكررة في إيسوسيتراتي نازعة الجينات 1/2 (IDH1/2)، طفرة التي تمنع هيستون تعتمد α-كجم والحمض النووي دي-ميثيلاسايس، والتعديلات الوراثية في المنظمين الكروماتين الأخرى مثل أتركس و DAXX في المراهقين إلى الطيف الكبار، 4. ولذلك، من الأهمية لدراسة كيفية تغيير الطفرات التي تؤثر على المنظمين جينية هيكل الكروماتين والتعديلات التنظيمية هستون، الذي، بدوره، أثرا محسوسا الترنسكربيتوم ورم الخلايا.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) أداة قوية تستخدم لتقييم أثر إدخال تعديلات جينية في الجينوم5،،من67. في رقاقة الأصلي، الكروماتين يهضم مع نوكلياسي ميكروكوككال (مناسى)، إيمونوبريسيبيتاتيد استخدام جسم مضاد المثارة ضد بروتين الفائدة، وثم هو تنقية الحمض النووي من مجمع الكروماتين إيمونوبريسيبيتاتيد6. خلايا غير ثابتة أثناء الإجراء حتى هذه التقنية قابلة للتطبيق لدراسة البروتينات التي تتفاعل محكم مع الحمض النووي6فقط. نظراً لغياب العابرة للربط الإيدز خصوصية جسم حيث عادة ما يتم رفع الأجسام المضادة ضد الببتيدات أو البروتينات غير المثبتة7. وبالإضافة إلى ذلك، أنه ليس هناك أي خطوة كروسلينكينج، وهذا يقلل من فرص تحديد التفاعلات عابر البروتين-الحمض النووي التي هي غير محددة ولا التنظيمية7،8. يمكن استخدام شرائح التعرف على إثراء التعديلات هستون في منطقة محددة بالجينوم. هنا، نحن بالتفصيل على بروتوكول لأداء رقاقة الأصلي في نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من وراثيا تصميم نماذج الماوس من الدبقي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميتشيغان.

1-جيل من ورم الدماغ NS واستزراع الظروف.

  1. إعداد متوسط الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) مع دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة/F12B27 الملحق (س 1)، N2 الملحق (س 1)، وكاشف مضادات الميكروبات. الملحق المتوسطة مجلس الأمن القومي اليوم للاستخدام مع الإنسان المؤتلف غشائي عامل النمو (مماثلة)، وعامل النمو الأساسية-تنتجها الخلايا الليفية (الأجيال) بتركيز نهائي من 20 نانوغرام/مليلتر كل.
  2. حمل ورم الدماغ في الماوس استخدام نظام ينقول النائمة التي يتم حقن البلازميدات ترميز المسرطنة أو شرنا استهداف الورم المكثفات في البطينين الأفقي للمواليد الجدد لتوليد أورام الدماغ عفوية9. حدد ماوس مع وجود ورم كبير، الذي يتأكد بتصوير الإضاءة الحيوية.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلاً حول بنيات "النظام ينقول الجمال النوم" وبلازميد المستخدمة في كالينيسكو et al. 9.
    1. الصورة في الفئران، حقن 100 ميليلتر من 30 ملغ/مل لوسيفرين حل إينترابيريتونيلي باستخدام إبرة قياس 26.
    2. 5 دقيقة بعد حقن لوسيفرين، تخدير الحيوان استخدام تشكيل غرفة تخدير مع تدفق الأوكسجين/isoflurane تعيين إلى إيسوفلوراني 2%.
    3. عندما يتم تخديره من الحيوانات (عادة ما تكون من 2-3 دقيقة)، ضع الحيوانات في دائرة الإضاءة الحيوية مع الأكسجين إيسوفلوراني تعيين إلى إيسوفلوراني 2%. إذا كانت الحيوانات تحت التخدير لمدة تزيد على 5 دقائق، استخدم مرهم العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    4. صورة الفئران باستخدام في فيفو بصري تصوير النظام مع المعلمات التالية: التعرض التلقائي، binning الكبيرة، والفتحة f = 1. المعلمة للنظر ورم كبير هو الإضاءة الحيوية > خ الفوتونات/s/سم26 10.
  3. Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من استنشاق isoflurane مخدر في دائرة مغلقة، تحقق برشة تو أنه تم تخديره من الحيوان، وقطع رأس الماوس.
  4. استخراج الدماغ وتشريح كما هو موضح سابقا في كالينيسكو et al. 9.
  5. وضع الدماغ في 10 سم طبق بيتري. استخدام الفلورية تشريح مجهر تعيين القناة الفلورسنت مناسب و 0.3 X التكبير، إذا كان الورم الناجم عن تعرب عن بروتين فلوري، خلاف ذلك تحديد كتلة الورم بالاختلافات في أنسجة اللون والملمس. استخدام المبضع، والملقط لفصل أنسجة الورم من الدماغ العادي.
  6. فرم الورم إلى قطع صغيرة في طبق بتري. مكان الورم تشريح في أنبوب 1.5 مل مع 300 ميليلتر من المتوسط القومي.
  7. استخدام مدقة بيليه بلاستيك القابل للتصرف الذي يناسب على جدران أنبوب ميكروسينتريفوجي المخروطية مجانسة الورم بلطف. أضف 1 مل من الخلية المفرزة المتوسطة واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام مدقة قد قتل بعض الخلايا. إذا أراد القارئ إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية، قد أغفل استخدام مدقة.
  8. تمرير تعليق خلية من الخطوة 1، 7 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وغسل المصفاة مع 25 مل متوسط القومي.
  9. الطرد المركزي من التعليق على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه إلى 6 مل متوسط القومي.
  10. لوحة تعليق خلية ورم من الخطوة 1، 9 إلى قارورة ثقافة T-25 والثقافة أنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع جو من 95% الهواء و 5% CO2. عادة بعد 3 أيام، سيكون هناك خليط من بعض الخلايا الميتة والخلايا التقيد بها وبعض الخلايا تشكيل NS التي تطفو في الأجل المتوسط.
  11. نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل وجمع الخلايا التي تنزل إلى أسفل باستخدام ميكروبيبيتي فقط وإعادة لوحة لهم على قارورة زراعة الأنسجة T-75.
  12. الحفاظ على الخلايا في كثافة عالية نسبيا (1-3 × 106 خلايا في T-25). مرور الخلايا عندما يكونون المتلاقية.
    ملاحظة: يتم تحديد كونفلوينسي بحجم مجالات. مراكز سوداء من مجالات كبيرة يعني أن هناك خلايا ميتة في المركز وتشير إلى أنه ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا فورا.
  13. إضافة عوامل النمو (basic-صندوق الأجيال القادمة؛ ولو 20 نانوغرام/مليلتر كل) كل ثلاثة أيام. تغيير المتوسط عندما تكون الخلايا غير روافد وبرتقالي فاتح يتحول المتوسط.
  14. لتغيير في المتوسط، جمع المتوسطة القديمة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه خلية في مجلس الأمن القومي المتوسطة وتستكمل مع مماثلة وصندوق الأجيال القادمة على التركيز المحدد في الخطوة 1، 1.
    ملاحظة: إذا كانت المجالات في منتصف-كونفلوينسي عالية، ولكن ليس على استعداد أن تكون باساجيد (حجم المجال صغير مع قطر < 100 ميكرومتر)، ثم يمكن تقسيم بيليه إلى قوارير اثنين.
  15. لمرور الخلايا، الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية واحتضان الخلايا في خلية مفرزة متوسطة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    1. إضافة 5 مل من محلول ملح متوازن لمفرزة تمييع المتوسطة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. صب المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 18 مل متوسط القومي وتقسيم التعليق على قدم المساواة إلى ثلاثة T-25 قوارير.
  16. لتجميد مختبرين للخلايا، فصل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1، 15، وتجميد الخلايا في مختبرين 1 مل من مصل البقر الجنين 90% مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يبرد ببطء الخلايا عن طريق وضع الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق، ثم حفظ الخلايا-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و-80 درجة مئوية لمدة يوم واحد. وفي اليوم التالي نقل الخلايا إلى حاوية تخزين نيتروجين سائل.

2-أصلي رقاقة

  1. إعداد الكروماتين
    1. وبعد إجراء تقييم NS المشتقة، الثقافة NS في T-75 في 15 مل متوسطة مجلس الأمن القومي في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة بمناخ من الهواء 95% و 5% CO2 حتى تصبح NS المتلاقية. لوح T-75 المتلاقية واحد سوف تسفر عن 3-5 × 106 خلايا.
    2. عندما تصبح الخلايا المتلاقية، الطرد المركزي NS على 300 غرام x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وإضافة 1 مل من الخلية تفكك المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمل 5 إضافة 5 كحد أدنى من المتوسط وحساب عدد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير10.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى 1 × 106 خلايا كل رد فعل إيمونوبريسيبيتيشن (IP). لاحظ أن عنصر تحكم مفتش أو المصل المناعي مسبقاً يجب أن يكون أيضا شملت11.
    3. الطرد المركزي NS في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحد في ز 300 x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وتعليق إعادة بيليه NS مع 1 مل من محلول ملح متوازن ونقل التعليق إلى منخفض البروتين ملزمة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
    4. NS أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 95 ميليلتر من الهضم المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم كاكل2، 0.2% أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين خماسي البروم ثنائي الفينيل) الواحدة 1 × 106 خلايا تستكمل بحوزتي مثبط كوكتيل بتركيز عال (1: 100). فورا بيبيت الخلايا أعلى وأسفل لمنع التثاقل وتجنب خلق أي فقاعات.
    5. ريسوسبيند مناسى في الجلسرين 50% لجعل الحل 1 ملغ/مل (1.15 وحدات/ميليلتر، المخزنة في-20 درجة مئوية) التي سوف يشار إليها باسم "س 1" الأوراق المالية. جعل "0.1 x" الأسهم بالقيام بتخفيف 1:9 ثانية مع والغليسيرول 50% (مثلاً.، 900 ميليلتر من "س 1" مناسى و 100 ميليلتر من الجلسرين 50%) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    6. مزيج 5 ميليلتر من "0.1 x" منسى و 145 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم. تبقى الإنزيم على الجليد من جميع الأوقات. إضافة 5 ميليلتر من منسى المخفف في المخزن المؤقت الهضم الواحدة 1 × 106 خلايا. نفض الغبار على أنبوب لخلط ووضع الأنبوب في كتلة 37 درجة مئوية للضبط 12 دقيقة عملية عينات واحد في وقت واحد لضمان وقت حضانة دقيقة من 12 دقيقة.
    7. إضافة 10 ميليلتر من 10 × "مناسى إيقاف المخزن المؤقت" (110 مم تريس-HCl، pH 8.0، يدتا 55 مم) الواحدة 1 × 106 خلايا. يجب الاحتفاظ بعينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا.
    8. إضافة ميليلتر 110 "من المخزن المؤقت x RIPA 2" (280 ملم كلوريد الصوديوم، الاثير أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين 1.8%، 0.2% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 0.2% Na-ديوكسيتشولاتي، 5 مم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)؛ المخزنة في 4 درجات مئوية) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل في تركيز عال (1: 100) الواحدة 1 × 106 خلايا. نفض الغبار على أنبوب للمزيج.
    9. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في [ميكروفوج] عند 4 درجة مئوية و 1700 خ زاي نقل المادة طافية في أنابيب جديدة عادية 1.5 مل ميكروسينتريفوجي (لم تعد منخفضة البروتين ملزمة ميكروسينتريفوجي الأنابيب اللازمة) وتخزينها على الجليد. تجاهل بيليه.
  2. إيمونوبريسيبيتيشن (IP)
    1. مزيج البروتين A والخرز المغناطيسي "ز البروتين" بنسبة 1:1. لكل من الملكية الفكرية، وإعداد 25 ميليلتر من الخرز.
    2. تغسل الخرز بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي (10 ملم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 1% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% نا-ديوكسيتشولاتي؛ المخزنة على 4 درجة مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000).
    3. استخدام مغناطيس للسماح بالخرز لفصل من الحل الغسيل وصب الحل الغسيل (حوالي 1 دقيقة). نفذ الخطوة يغسل مرتين.
    4. إعادة تعليق الخرز على وحدة التخزين الأصلية باستخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000).
    5. إذا كان ضروريا، وتمييع الكروماتين استخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000) حيث يكون لكل IP حجم 100-200 ميليلتر. حجز نسبة 10% حجم المستخدمة في مجال الملكية الفكرية الكروماتين للمدخلات.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا استخدمت 200 ميليلتر في مجال الملكية الفكرية، 20 ميليلتر من الكروماتين المخفف ينبغي أن تكون محفوظة للإدخال. لما مجموعة أربع IPs، ينبغي إضعاف حجم إجمالي الكروماتين إلى 820 ميليلتر.
    6. إعداد الإدخال. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، يدتا 1 مم) تستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) للإدخال واحتضان الإدخال في 55 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات 2.2.6-2.2.7 جنبا إلى جنب مع خطوات 2.3.4 و 2.4.1.
    7. تنقية الإدخال باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة والوتي في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
    8. قياس تركيز الإدخال باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي وتسجيل النتائج في دفتر الملاحظات. فارغة مع المخزن المؤقت شطف من كيت.
      ملاحظة: في نيوروسفيريس الماوس، استخدمنا حوالي 6 ميكروغرام من الحمض النووي لكل IP.
    9. تشغيل الإدخال على جل 1% أو تحميل 1 ميليلتر في "بيواناليزير الحمض النووي" استخدام الإعدادات القياسية. تخزين ما تبقى لاستخدامها كمدخلات في تطبيقات المتلقين للمعلومات.
    10. إضافة 10 ميليلتر بروتين غسلها A & ز الخرز المغناطيسي لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 1 في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 30 ميليلتر بروتين A & ز المغناطيسي الخرز لثلاثة من البرامج المتكاملة.
    11. وضع العينات في مغناطيس وتسمح الخرز لفصل. تقسيم الكروماتين بتحويل المبلغ الذي سبق تحديدها في أنبوب 1.5 مل جديدة.
    12. إضافة الجسم والتفاف القبعات مع الفيلم البارافين البلاستيك لتجنب التبخر. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: ينبغي تحديد تركيز تجريبيا في أعقاب توصيات الشركة المصنعة.
    13. في اليوم التالي، تدور الأنابيب استخدام أجهزة الطرد مركزي مصغرة في درجة حرارة الغرفة، 2000 س ز، ل 10 ق. ثم إضافة 10 ميليلتر من حبات لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 3 في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
  3. يغسل IP وهضم البروتين
    1. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية. كرر هذا يغسل تيب خمسة.
    2. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ليكل (250 ملم ليكل، 10 مم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 0.5% NP-40، 0.5% نا-ديوكسيتشولاتي؛ ومخزن في 4 درجات مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة المغناطيسي الوقوف وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
    3. إضافة 150 ميليلتر الباردة الشركة المصرية للاتصالات (لا مثبطات البروتياز) واحتضان العينة في 4 درجات مئوية مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
    4. بعد هذه الخطوة النهائية الغسيل، إعادة تعليق العينة في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) واحتضان العينة في 55 درجة مئوية ح 1.
  4. تنقية الحمض النووي ورقاقة الكمية Real-Time PCR (qPCR)
    1. تنقية إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR. بعد إضافة الحمض النووي ملزم العازلة من المجموعة لكل عينة، وضع الأنبوب على مغناطيس وانتظر حتى الخرز المغناطيسي الكلي، ثم نقل المادة طافية على العمود "تنظيف". اتبع إرشادات الشركة المصنعة والوت في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
    2. للتحقق من نجاح الملكية الفكرية، أداء قبكر. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تصمم كبسولة تفجير لمناطق السيطرة الإيجابية والسلبية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لعنوان IP يقوم ب H3K4me3 و H3K27me3، نماذج التالية يجب تشغيل على قبكر: H3K4me3، H3K27me3، ومفتش رقاقة الحمض النووي، إدخال الحمض النووي، وليس قالب تحكم (المجلس الوطني الانتقالي) باستخدام كبسولة تفجير للمناطق لإثراء مع H3K4me3 (مراقبة إيجابية) و المناطق إثراء مع H3K4me3 (مراقبة سلبية)؛ وبالمثل، ل H3K27me3.
    3. اتبع البروتوكولات القياسية لأداء قبكر12. بإيجاز، أداء قبكر استخدام مزيج الرئيسي الأخضر سيبر، 0.5 ميليلتر من 10 ميكرون العامل تركيز كل إلى الأمام وعكس التمهيدي وميليلتر 2 رقاقة أو إدخال الحمض النووي. قراءة لوحات باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي. وترد في الجدول 2تسلسل التمهيدي. تسلسلات التمهيدي جابده من هوانغ وآخرون. وكانت تستخدم13.
    4. تحليل بيانات الشريحة بالنسبة للمدخلات، أي في المئة إدخال أسلوب (% IP)14. حساب النسبة المئوية للإدخال باستخدام الصيغ التالية:
      تعديل الإدخال = ct يعني (مدخلات)-تسجيل2(مدافع)
      حيث مدافع هو عامل إضعاف للانطلاق بالإدخال و
      مدافع = الحجم الكلي للملكية الفكرية/حجم الإدخال
      % IP = 100 × 2 ^ (تعديل الإدخال-"الأشعة المقطعية" (IP))
      حيث Ct هو عامل العتبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد تمثيل تخطيطي للورم NS المتولدة من ورم الدماغ التي تكون فيها خلايا ورم المخ كاتوشكا إيجابية في الشكل 1. الرقم 2 تمثيل تخطيطي لتقنية شرائح كاملة. يظهر الشكل 3 نتائج تمثيلية للونين من ورم الدماغ NS يهضم مع مناسى ل 12 دقيقة، مما أسفر عن أغلبية مونو، دي-وثلاثي نوكليوسوميس. عقب رقاقة، يمكن أداؤها على الرقاقة قبكر وإدخال الحمض النووي عينات. ويبين الشكل 4 رقاقة qPCR بيانات تمثيلية من qPCR لنازعة جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات (جابده). جابده هو جين التدبير المنزلي المخصب مع H3K4me3، تعديل الذي يقترن بالنسخ النشطة. وتظهر النتائج أن جابده المخصب مع H3k4me3، وهي غير المخصب مع H3K27me3 الذي تعديل المرتبطة بمناطق الكروماتين مكبوتة.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي للورم NS المتولدة من ورم الدماغ إيجابية كاتوشكا. حقل مشرق والصورة الفلورية الدماغ حصادها من ماوس الذي وصل إلى مرحلة نقطة نهاية. منطقة الورم هو مرسوم بخط منقط وإيجابية بالنسبة للمراسل الفلورسنت، كاتوشكا. الورم ومن ثم معزولة ويتم جمع الأنسجة السرطانية في أنبوب 1.5 مل. ثم فصل الخلايا ومثقف في شكل NS المتوسطة وورم في مجلس الأمن القومي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تمثيل تخطيطي لسير العمل لرقاقة الأصلي- NS الورم مثقف وتوسيعها. يتم تنفيذ كل IP مع 1 × 106 خلايا. تم تجزئة الكروماتين استخدام عن طريق الهضم مناسى للحصول على مونو، دي-وثلاثي نوكليوسوميس. الكروماتين هو المحتضنة مع جسم محددة لتعديل هيستون أو البروتين مرتبطة بالحمض النووي للفائدة. مجمع الأضداد-الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد مع البروتين المغناطيسي الخرز A/G. وأخيراً، يهضم البروتين والحمض النووي هو تنقية للحصول على إلا الحمض النووي المخصب مع هستون تعديل أو البروتين مرتبطة بالحمض النووي للفائدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تفتت الكروماتين بمنسى. وكان أعد الكروماتين من ورم الدماغ NS بإضافة مناسى والحضانة عند 37 درجة مئوية للضبط 12 دقيقة "الحمض النووي الممثل" النتائج من تحليل بيواناليزير في نموذج الإدخال تدل على أن الأغلبية من الحمض النووي فقد تمت تجزئة في مونو-دي-وثلاثي نوكليوسوميس. 1 لين هو السلم في زوج قاعدي (BP). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: رقاقة الممثل qPCR البيانات المعروضة كإدخال النسبة المئوية- وأجرى قبكر مع مفتش، و H3K4me3، و H3K27me3 رقاقة الحمض النووي باستخدام كبسولة تفجير لنازعة جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات (جابده). وتبين النتائج الممثل أن جابده، جين التدبير المنزلي، هو إثراء فقط مع التعديل H3K4me3، المرتبطة بالنسخ النشطة، وليس بالتعديل H3K27me3، المرتبطة بالقمع الكروماتين. ويمثل هذا الرسم البياني نتائج التجارب البيولوجية اثنين تشغيل مع ثلاثة آبار نسخ متماثل كل. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجينات التمهيدي إلى الأمام عكس التمهيدي
جابده تككككتكككككتاتكاجتك جاكككجككتكاتتتتجاا

الجدول 1: تستخدم كبسولة تفجير لتجارب qPCR رقاقة. وترد في هذا الجدول التسلسل للإشعال المستخدمة جابده.

يعني الأشعة المقطعية (الإدخال) الانحراف المعياري إدخال المعدل
24.265 0.071 20.943
إدخال النسبة المئوية
عينة الخام يعني Ct الانحراف المعياري إدخال النسبة المئوية = 100 * 2 ^ (تعديل input-Ct(IP))
مفتش 32.23 0.112 0.04
H3K4me3 22.148 0.128 43.37
H3k27me3 32.79 0.519 0.027
المجلس الوطني الانتقالي غير محدد غير محدد غير محدد

الجدول 2: طريقة لتحليل qPCR رقاقة إدخال نموذج حساب نسبة. نموذج حساب نسبة المدخلات لرقاقة أداء بنسبة 10 في المائة ابتداء من المدخلات؛ مدافع = 10. وتوضح الأرقام في هذا الجدول القيم الأولية لتجربة بيولوجية واحدة مع 3 تكرار تشغيل آبار لكل عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول المعروضة هنا سوف تمكن المستخدم من أداء رقاقة الأصلي في NS المستمدة من أورام الدماغ المهندسة وراثيا. على النقيض من رقاقة العابرة للربط، يقتصر هذا البروتوكول لدراسة البروتينات التي تربط محكم مع الحمض النووي6. يمكن تعديل عدد الخلايا التي تستخدم عند الضرورة ويمكن الارتقاء بالبروتوكول. كنا 1 × 106 خلايا في مجال الملكية الفكرية، ومع ذلك، قد أيضا إجراء رقاقة الأصلي مع أقل قدر من 4 × 104 خلايا5. في هذا البروتوكول، قمنا بتحليل "الحمض النووي رقاقة" عبر قبكر؛ ومع ذلك، كما يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع تسلسل الجيل القادم لدراسة تفاعلات البروتين-الحمض النووي على مستوى واسع جينوم. لقد استخدمنا هذا البروتوكول رقاقة بنجاح لتحليل أثر المسرطنة الدبقي على ترسب التعديلات هيستون داخل مناطق محددة لجينوم خلايا الورم.

وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة عند أداء رقاقة الأصلي. أولاً، يجب أن تحدد شروط الهضم لكل نوع من أنواع الخلايا تجريبيا. يجب أن تكون أغلبية الكروماتين مونو-نوكليوسوميس (150 شركة بريتيش بتروليوم) مع بعض قمم دي وثلاثي نوكليوسومي (الشكل 3). نتائجنا البروتوكول في أكثر من 70% مونو-دي-أو قمم ثلاثي نوكليوسومي، ومع ذلك، يبقى بعض الحمض النووي عسر الهضم. إذا كان سيتم استخدام البروتوكول لرقاقة seq، سيلزم اتخاذ خطوات إضافية لإزالة عسر الهضم الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن كل دفعة من مناسى شراؤها قد تختلف في النشاط ومن ثم تتطلب التحسين لأحوال الهضم. ثانيا، وتتوقف نوعية شريحة عالية على خصوصية جسم المستخدمة11. يجب أن يكون جسم رقاقة عالية جودة مفاعليه عالية ضد الهدف المقصود وتفاعلية عبر منخفضة مع غيرها من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي أو إيقاف تعديلات هيستون الهدف11. لهذا السبب، نوصي باختبار خصوصية الأجسام المضادة باستخدام اختبار ملزمة ببتيد. المبادئ التوجيهية لترميز تشير إلى أنه ينبغي التقيد تخصيب عشرة إضعاف لتعديل الفائدة بالنسبة إلى التعديلات الأخرى11. من المهم أيضا القيام بالمراقبة اللازمة إيمونوبريسيبيشنز و أيوالمناعة قبل أو مراقبة مفتش. عندما يتم الوفاء بهذه الاعتبارات، البيانات رقاقة الأصلي طريقة موثوقة قوية لدراسة آليات جينية تخضع لتفاعلات البروتين-الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ قسم جراحة الأعصاب؛ ليا في "قلوب سعيدة"، ومؤسسة على الرغم من تشاد إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. R.I.Z.-V. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/منح نيجمس 5T34GM007821-37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2946-90004 bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated Fisher Scientific 13-100-676
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse
Calcium Chloride Aldrich 22350-6 buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack Diagenode B04000003 for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU Diagenode B05000001 rotator
DMEM/F-12 Gibco 11330-057 NSC component
Dynabeads Protein A Thermo Fisher Scientific 10001D protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G Thermo Fisher Scientific 10003D protein G magnetic beads
EGF PeproTech AF-100-15 prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E-4884 buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) Sigma E-4378 buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612 qPCR reagent
Fetal Bovine Serum Gibco 10437028 for freezing cells
FGF PeproTech 100-18b Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps Fine Science Tools 11008-13 for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade EMD- Millipore 356352
H3K4me3 Abcam Ab8580
H3K27me3 Millipore 07-449
HBSS Gibco 14175-103 balanced salt solution
Fluriso VETone 501017 inhalation anesthetic
Ivis Spectrum Perkin-Elmer 124262 in vivo optical imaging system
Hyqtase HyClon SV3003001 cell detachment media
Lithium Chloride Sigma L8895 buffer reagent
Low binding microtubes Corning Costar CLS3207 low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube Fisher 21-402-903 regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease Thermo Fisher Scientific, Affymetrix 70196Y each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2 Gibco 17502-048 NSC component
Normal Rabbit IgG Millipore 12-372
Normocin Invivogen NOL-36-063 anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630) Sigma 18896-50ML buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8340 aliquot and store at -20 °C.
Protinase K Sigma-Aldrich P2308 make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA purification kit
Scalpel Fine Science Tools 10007-16 for dissection of tumor
Sodium Chloride VWR 0241-5KG buffer reagent
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D670-25G buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS) Sigma L-4390 buffer reagent
Tris Base Thermo Fisher Scientific Bp152-1 buffer reagent
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP 151-500 polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge Fisherbrand 12-006-901 standard mini centrifuge
SZX16 microscope Olympus SZX16 flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block Applied Biosystems 4453535
Nanodrop One Thermo-Fisher Scientific ND-ONEC-W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482, (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3, (5), 512-519 (2013).
  3. Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24, (5), 660-672 (2013).
  4. Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy? Cancers (Basel). 5, (3), 1120-1139 (2013).
  5. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
  6. Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
  7. Turner, B. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. (2001).
  8. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  9. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
  10. Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, (9), 1813-1831 (2012).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, (2-3), 95-125 (2006).
  13. Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
  14. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics