人肺泡骨膜间充质干细胞的分离及维生素 D 对骨膜衍生细胞成骨活性的影响

Bioengineering

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Summary

本文提出了一种研究维生素 c (维生素 c) 和125二羟基维生素 D [125-(OH)2d3] 诱导的骨膜衍生细胞 (PDCs) mRNA 表达标志物的协议。此外, 我们评估 PDCs 的能力, 以分化为骨, 软骨细胞和脂肪。

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Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

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Abstract

间充质干细胞 (MSCs) 存在于各种组织中, 可分化为多种细胞类型, 包括成骨细胞。在骨髓间充质干细胞的牙科来源中, 骨膜是一种易于接触的组织, 被确定为包含层间的 mscs。然而, 这个来源还没有得到广泛的研究。

维生素 D3和 125-(OH)2D3已被证明可以刺激体外诱导干细胞分化为成骨细胞。此外, 维生素 C 有助于胶原蛋白的形成和骨骼细胞的生长。然而, 还没有研究维生素 D3和维生素 C 对 MSCs 的影响。

本文提出了一种从人肺泡骨膜中分离 MSCs 的方法, 并对 125-(OH)2D3可能对这些细胞施加骨诱导影响的假说进行了研究。我们还研究了骨髓间充质干细胞在人肺泡骨膜中的存在, 并评估了干细胞黏附和增殖。要评估维生素 C (作为控制) 和各种浓度的 125-(OH)2D3 (1010) 的能力, 109, 108, 107 M) 改变关键 mRNA 生物标志物采用实时聚合酶链反应 (rt-pcr) 测定了碱性磷酸酶、骨涎蛋白 (BSP)、核结合因子 alpha-1 (CBFA1)、collagen-1 和骨钙素 (OCN) 的分离 MSCs mRNA 表达。

Introduction

虽然近年来已开发了许多相关技术, 但骨重建仍然受到多种限制因素的限制, 估计必要重建的程度往往是不可能的。除了获得良好的长期成功率外, 还需要硬组织增强来实现审美和功能目标。这种手术常用的方法包括自体和同种异体骨移植、xenografting 和异体骨移植。在各种类型的骨移植中, 自体骨移植被认为是最有效的。然而, 供体部位的发病率, 受损的血管, 和有限的组织可用性,1一直是主要的缺点, 自生骨移植。另外, 同种异体骨移植和异基因移植也与疾病传播有关。目前, 人工骨移植广泛用于解决这些问题。然而, 由于缺乏成骨潜能, 临床结局也有很大差异。纤维素等材料与体积波动、感染和强度缺乏有关。

用组织工程学进行骨隆增引起了相当大的兴趣。在这种技术中, 骨髓间充质干细胞 (MSCs) 最初用于促进成骨细胞分化, 然后移植到骨质丢失部位以实现骨修复。本程序目前已应用于细胞治疗。与其他方法相比, 提取有限数量的组织来实现骨重建更简单、更少侵入。

MSCs 作为一种用于牙科再生的细胞疗法的工具的潜在作用, 是各研究小组日益关注的问题之一。研究证实, MSCs 可以区别于以下类型的组织: 骨髓, 脂肪, 滑膜, 周细胞, 小梁骨, 人脐带和牙科组织 2, 3.MSCs 的常见来源包括骨髓、脂肪组织和牙科组织。与脂肪组织和骨髓间的干细胞相比, 牙干细胞的优点是容易获得, 收获后发病率较低。与胚胎干细胞相比, 来自牙科组织的 MSCs 出现 nonimmunogenic, 与复杂的伦理问题没有关联3

在 2006年, 国际细胞治疗学会建议使用以下标准来识别 MSCs: 首先, mscs 必须能够附着在塑料上。其次, MSCs 必须是阳性的表面抗原 CD105, CD73, CD90 和阴性的标记, 单核, 巨噬细胞, 和 B 淋巴细胞除了造血抗原 CD45 和 CD344。作为最终标准, MSCs 必须能够在体外分化的标准条件下区分成以下三种类型的细胞: 成骨细胞、脂肪细胞和软骨组织4。迄今为止, 已有六种类型的人牙干细胞被分离和表征。第一种是从人牙髓组织中分离出来的, 称为产后牙髓干细胞5。随后, 三种其他类型的牙科干细胞被隔离并被描述为: 脱落的落叶牙齿的干细胞6、牙周韧带7和顶端的乳突8。最近, 牙科卵泡衍生的9, 牙龈组织衍生的10, 口腔芽干细胞 (DBSCs)11, 和根尖囊肿 mscs (hPCy-mscs)12也已确定。

Friedenstein 是第一个定义 MSCs13的。MSCs 具有很高的增殖潜能, 可以在移植前进行区分, 这表明它们是再生过程的理想候选者10

尽管大多数研究都用骨髓作为干细胞的来源, 但最近14也使用了骨膜衍生细胞 (PDCs)。骨膜比骨髓更容易接近。因此, 在这项技术中, 我们使用肺泡骨膜, 以消除在手术中需要额外的切口和减少手术发病率的病人。骨膜是形成长骨骼外衬的结缔组织, 包括两个不同的层: 由成纤维细胞、胶原蛋白和弹性纤维组成的外层纤维层15, 直接接触的内富细胞形成层骨表面。形成层包含混合细胞种群, 主要是成纤维细胞16, 成骨细胞17, 毛细血管18, 以及一个关键亚群, 确定为 MSCs19,20,21。大多数研究报告说, PDCs 是可比的, 如果不是优越, 骨髓源干细胞的骨骼愈合和再生22,23,24。骨膜容易接近, 具有良好的再生效果。然而, 很少有研究聚焦于骨膜252627

在骨修复方面, 目前的临床实践涉及在支持性支架内扩增的骨膜祖细胞移植。最近的研究重点是获取有缺陷区域的干细胞, 并使用祖细胞进行组织再生20。牙医还预测牙周骨再生在牙周治疗和牙种植体中的应用前景。对于供体部位, 骨膜可以很容易地收获一般牙科外科医生。这与骨髓基质细胞比较有利, 因为在常规的口腔手术中可以访问骨膜。因此, 本研究的目的是建立一个捕捞 PDCs 的协议, 并评估人骨膜干细胞的形态、附着性、活力和增殖。

维生素 D 代谢物影响体内骨-矿物质动态平衡。一项研究报告说, 24 r、25-(OH)2D3活性维生素 D 对人骨髓间充质干细胞 (hMSCs)28的成骨细胞分化至关重要。骨骼稳态和修复由维生素 D3代谢产物网络调节, 其中 125-(OH)2D3 (骨化三醇) 是最具生物学活性和相关的骨骼健康的调节。维生素 D3对于钙化29至关重要。在一项使用2维昆明白鼠的研究中, 小鼠的胚体显示维生素 C 和维生素 d 补充剂有效促进了 ESC 型成骨细胞30的分化。在它的其他生物活动中, 125-(OH)2D3刺激体外hMSCs 与成骨细胞的分化, 可以根据碱性磷酸酶 (磷酸) 酶活性或 OCN 基因的增加来监测。表达。

很少有研究发现, 与维生素 C 和 125-(OH)2D3的联合治疗在人类 PDCs 中的剂量反应关系, 特别注重骨组织工程。因此, 在本研究中, 我们检查 125-(OH)2D3和维生素 C 的单一或联合治疗的最佳浓度, 以诱导人 PDCs 的成骨分化。本议定书的目的是确定从牙槽骨膜中分离出来的细胞是否包含有 MSC 表型的细胞, 以及这些细胞是否可以在培养中被扩展 (体外) 并分化形成所需的组织。.此外, 我们评估 PDCs 的能力, 以分化为骨, 软骨细胞和脂肪。研究的第二部分评估维生素 C 和 1010的影响, 109, 108, 和 107 M 125-(OH)2D3 PDCs 的成骨活动。本研究的主要目的是评估维生素 C 和 125 (OH)2D3在 PDCs 的成骨细胞分化过程中的作用, 以及支持成骨细胞的基因, 如碱性磷酸酶、collagen-1、OCN、BSP 和 CBFA1。此外, 本研究根据这些结果确定了人类 PDCs 的最佳骨诱导条件。

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Protocol

该项研究协议获昌热心纪念医院机构评审委员会批准。所有与会者均提供书面知情同意。

1. 组织准备

  1. 在牙科手术中从病人身上收获骨膜组织 (图 1)。在局部麻醉下皮瓣反射后, 用骨膜分离器31从肺泡骨中取一块骨膜组织。
  2. 收割后, 将5毫米 x 2 毫米的骨膜组织切片贮存在 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 中, 300 毫升青霉素和300毫克/毫升链霉素。在24小时内将组织转移到实验室。
  3. 用手术刀将肺泡骨膜组织碎片切碎, 并保持0培养基中的样品 (由300毫升青霉素和300毫克/毫升的链霉素, α和5% 胎牛血清 [血清]) 在37摄氏度培养的孵化器湿润空气 (5% 二氧化碳)。在孵化器中, 准备一个水盆来保持湿度。
  4. 3天后, 每周两次改变培养基。
  5. 当细胞达到 subconfluence (80%), 释放黏附细胞与200µL 0.25% 胰蛋白酶在孵化器 (37 °c) 为3分钟, 然后使用4.5 毫升培养基终止反应。
  6. 在新鲜的通道1培养基 (α, 10% 血清, 100 单位/毫升青霉素, 100 微克/毫升链霉素) 再次板块细胞。板是 5 x 103单元格 (按 hemocytometer 计数)。
  7. 在单元格实现80% 汇流31之后, 执行每个后续通道。
    注: 在开始时, 培养基将为橙色红色。大约三天后, 中等颜色应该变成黄色的阴影。细胞的加倍时间大约 30–40 h, 需要7天为3–5世代。
  8. 培养分离的 PDCs 在α记忆补充与10% 个血清, 100 U/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素在孵化器 (37 °c, 5% CO2)。
  9. 每天观察细胞生长, 每周两次更换生长培养基。使用第三到第五代细胞进行所有进一步的实验。

2. 流式细胞仪

  1. 通过胰蛋白酶消化, 收获 1 x 106细胞:
    1. 添加200µL 0.25% 胰蛋白酶。3分钟后, 使用4.5 毫升含有血清的培养基来终止胰蛋白酶的反应, 通过离心 (1500 rpm, 5 分钟, 22 °c) 来收集。
    2. 用 1x DPBS 清洗细胞颗粒三次。并用重悬200µL 1x通透缓冲区中的单元格。用 hemocytometer 计数单元格。
  2. 通过流式细胞术 (荧光活化细胞排序)32检查 PDCs 表达的表达表面标记。使用单克隆抗体对 CD19 (异硫氰酸荧光素 (FITC)), CD34 (FITC)、CD44 (藻红蛋白 [pe])、CD45 (FITC)、CD73 (pe)、CD90 (复方阿司匹林 [APC])、CD146 (pe)、STRO-1 (亚历克斯) 和 HLA-DR (FITC) 32。
    1. 添加抗体的样本和文化在黑暗中的4°c 30 分钟。
    2. 用 1x DPBS 清洗细胞三次。
    3. 用2% 甲醛固定细胞, 进行流式细胞分析32

3. 细胞附着和活性与成骨、脂肪和软骨分化

通过在六-井板上用特异分化培养基培养三通道的骨膜细胞, 诱导细胞分化成成骨、脂肪和软骨血统。

  1. 为成骨分化, 在六-井培养板上, 在5000个细胞的密度下培养α-记忆细胞。
    1. 在达到80% 汇合, 培养细胞在媒介包含α记忆, 5% 血清, β甘油 (10 毫米), 10−7 M 地塞米松 (0.1 毫米) 和5毫升抗坏血酸 (100 uM)。培养由α和5% 血清组成的媒介中的阴性控制。
    2. 每周更改两次媒体。
    3. 4周后, 评估细胞的潜能, 通过使用冯科萨检测细胞来鉴别成骨性的血统, 这就区分了在文化33中钙化沉积的存在。
      1. 加10% 福尔马林固定。在30分钟内, 加入5% 硝酸银, 在室温下用紫外线 (紫外线) 照射1小时。
      2. 添加 5% Na2, 因此4四次, 每个反应允许3分钟。最后, 用蒸馏水冲洗细胞两次。
        注: 冯科萨染色是一种沉淀反应, 银离子和磷酸盐在酸性物质存在的情况下反应;这种染色技术不特定于钙。在这项研究中, 当被调查的细胞用硝酸银溶液处理时, 钙--由强的紫外光减少-被银替换, 变得可看见作为金属银。
  2. 对于脂肪分化, 培养细胞密度为5000细胞每井在六井培养板含有α。
    1. 在实现80% 汇流时, 培养细胞的培养基中含有α, 5%, 0.5 毫米3异丁基1甲基黄嘌呤 (100 毫克/毫升), 1% 青霉素,10 −6 M 地塞米松 (1 毫米), 胰岛素 (5 毫克/毫升) 和消炎痛 (60 毫米)。
    2. 培养由α和5% 血清组成的媒介中的阴性控制。
    3. 6–9周后, 使用油红色 O 染色细胞和突出脂滴, 从而确定存在的脂肪分化33:
      1. 加10% 福尔马林固定。在30分钟内, 用0.5% 油红色 O 在室温下染色10分钟, 然后每一次用60% 分异丙醇清洗细胞三次;最后, 用蒸馏水冲洗细胞。
        注: 油红色 O 是一种 lysochrome (脂溶性) 重氮染料, 用于染色中性脂, 主要是三酰甘油, 脂蛋白和胆固醇酯。染料溶解于细胞中的脂滴, 使脂滴变红。
  3. 对于软骨细胞分化, 在六井培养板上培养出每一个含5000细胞的井。
    1. 添加含有α-记忆的分化培养基, 5% 血清, 10−7 M 地塞米松 (0.1 毫米), 丙酮酸钠 (100 µg/毫升), 胰岛素转铁蛋白-硒 a (1 x 其), 转化生长因子β (10 ng/毫升) 和5毫升抗坏血酸 (100 µM)。
    2. 培养由α和5% 血清组成的媒介中的阴性控制。
    3. 第4-5 周后, 使用阿利新蓝染色突出酸性多糖, 如多糖或某些类型的粘多糖, 在细胞的软骨, 以确定存在软骨素分化 33.
      1. 加10% 福尔马林固定。在30分钟内, 加入3% 乙酸, 并允许2分钟的反应。随后, 用蒸馏水冲洗三次, 加1% 阿利新蓝8GX 孵化30分钟, 然后用蒸馏水冲洗。最后, 加入3% 醋酸, 清洗3分钟, 然后用蒸馏水冲洗完成。
        注意: 染色后, 特定染色的细胞部分会变成蓝绿色, 被称为 "alcianophilic"。

4. 25-羟维生素 D 3 (125-(OH) 2 D 3) 对成骨作用的影响

  1. 将 P3 P5 PDCs 分成六组, 并在6井板上培养不同的培养基:
  2. 阴性组 (α和5% 血清);
  3. 维生素 c 组 (α, 5% 血清, 10 毫米β甘油, 10−7 M 地塞米松 + 100 uM 维生素 c);
  4. 和 10−7 M 125-(OH)2D3组 (α记忆, 5% 血清, 10 毫米β甘油, 10−7 m 地塞米松 + 10−7 m 125-(oh)2D3)。
  5. 在每个井中添加2毫升培养基到一个孵化器 (37 °c), 并每星期更换一次培养基两次。

5. 反向转录/定量实时聚合酶链反应

  1. 在 7 d 的成骨细胞分化后, 使用商业试剂将总 RNA 分离到冰上 (参见材料表):
    1. 每井加1毫升隔离剂。添加200µL 的 bromochloropropane 和离开10分钟产生分层 RNA, 然后离心机在 1万 rpm 15 分钟在4°c。
    2. 离心后, 添加500µL 2 丙醇到500µL 的上清含 RNA。沉淀在冰上的 RNA, 并允许15分钟的反应。
    3. 在做法以后, 离心机在1.2万转每分钟15分钟在4°c, 在之后 RNA 位于管子的底部。随后, 使用1毫升75% 醇洗涤和离心机, 在4摄氏度的8分钟内, 取出上清液。
    4. 去掉上清, 用真空浓缩器从液体底部产生 RNA。用水恢复。
  2. 用禽 myeloblastosis 病毒逆转录酶反向转录 RNA (1 微克)。设置聚合酶链反应 (PCR) 跑在25°c 为10分钟跟随50°c 为60分钟和然后85°c 为5分钟, 在最后维护在4°c 之前。
  3. 合成一股互补 DNA (cDNA)。用 5 ul 1:10 稀释 cDNA 进行定量 PCR (qPCR)。用底漆为磷酸、BSP、OCN、CBFA1 和 collagen-1 进行定量 rt-pcr (qRT pcr)。
    注意: 为了避免信号的 DNA 污染, 在不同的外显子上设计了每个引物的正向和反向序列。
  4. 使用商业 PCR 主组合 (参见材料表) 按照制造商的说明执行 qPCR。设置热循环仪在50°c 为2分钟跟随95°c 10 分钟然后40个周期每个在95°c 十五年代跟随60°c 六十年代。
    注: SYBR 协议还需要一个熔化曲线阶段, 这是运行在95°c 十五年代, 60 °c 六十年代, 然后95°c 十五年代。
  5. 规范化的周期阈值的磷酸, BSP, CBFA1, collagen-1 和 OCN 的管家基因 GAPDH。34
  6. 底漆对在材料表中列出。

6. 碱性磷酸酶活性

  1. 使用前面描述的技术35来评估细胞的碱性酶活性, 该方法将p-硝基苯基磷酸盐转换为p-硝基苯酚;p-硝基苯基磷酸酯是一种磷酸酶基质, 它在去磷酸化时呈黄色, 以 405 nm 波长确定。根据布拉德福德检测确定的总蛋白, 对形成的总的p-硝基苯酚进行规范化。
  2. 比较磷酸酶活性的控制 (α, 5% 血清), 维生素 C (α-记忆, 5% 血清, 10 毫米β甘油, 10−7米地塞米松 + 100 uM 维生素 C), 125-(OH)2D3 (α记忆, 5% 血清, 10 毫米β甘油和 10−7 M地塞米松 + 10−8 M 125-(OH)2D3), 和维生素 c + 125-(OH)2D3 (α记忆, 5% 血清, 10 毫米β甘油, 10−7米地塞米松 + 100 uM 维生素 C + 125-(oh)2D3)组在1、2、3和4周的文化。
  3. 在冰上执行蛋白质提取过程:
    1. 从6井板上刮出细胞, 加入50µL 的溶解缓冲液。随后, 将细胞放在冰上30分钟, 以摧毁细胞并释放蛋白质。
    2. 30分钟后, 离心机在 13000 rpm 4 摄氏度, 15 分钟。离心后, 提取上清液进行贮存和使用。

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Representative Results

对于所有的定量分析, 这些数据被显示为平均的标准偏差 (SD)。所有统计分析都是使用学生的t测试进行的。共获得34份样本, 平均参加者年龄为 48.1, 12.3 y 十一的样本是从男性患者和23从女性患者获得的。从磨牙区和六的前区获得二十八份样品;26从上颌骨和8从下颌骨获得。平均期限在牙科做法和文化之间是 0.5, 0.1 h。在34份调查样本中, 20 成功地取得了 MSC 的菌落, 成功的隔离率为58.8%。成功与未成功分离的 PDCs 之间的任何参数均无显著差异 (平均年龄: 48.8 13.0 vs 47.1 @ 11.5 y, 性别: 7 人 [35%] vs 4 人 [28.6%], 位置:15 从摩尔地区 [75%] vs 13 [92.9%] 和15从上颌骨 [75%] vs 11 [78.6%]。

细胞分离与形态学: 成骨、软骨和脂肪分化

从1-9 天, PDCs 形成了殖民地和球形星团。大多数细胞在相对比显微镜下表现出纺锤体的外观, 并且是均匀的 (图 2)。经过 14 d 的培养, 细胞形态学出现纺锤形的观察下的相对比显微镜。继第一代细胞后, 细胞不再生长在星团中, 而是呈现出广泛而一致的增殖。

在 1-3 d 的主培养 (图 2a) 之后, MSCs 是纺锤形的, 不规则的过程和牢固地附着在培养皿上。最初的培养在光学显微镜下展示了小的圆形细胞和纺锤形细胞。培养出来的细胞从第一段 (图 2a) 中呈现出一个均匀的成纤维细胞状纺锤形。分化研究表明, PDCs 可以 subpassaged 和分化为成骨细胞 (图 2b), 软骨细胞 (图 2c) 和脂肪(图 2d)。

在成骨分化末期, 冯科萨染色表明存在钙沉积和成骨分化 (图 2b)。这些结果强烈表明, 在骨膜细胞群中, 祖细胞具有分化成成骨细胞的潜能。

为了评估软骨的生产, 阿利新蓝染色作为确定软骨细胞分化存在的指标 (图 2c)。细胞成功地被分化成软骨。这些结果表明, 在骨膜细胞群中, 祖细胞具有分化为软骨细胞的潜能。

细胞在先前提到的特定培养基中培养, 以触发脂肪分化。8周后, 用油红 O 检测细胞内脂质的存在。染色后, 在五个不同的样本中观察到细胞内显微脂肪滴 (图 2d)。

PDCs 的流细胞表面标记表达分析

采用流细胞法对细胞表面的间充质表面标记物的表达进行了验证。MSC 标记 CD73, CD90, STRO-1 和 CD44 在 PDCs 强烈阳性, 而造血谱系标记 CD19, CD34, CD45 和 HLA-DR 是阴性的。

各种维生素 D 的影响3骨浓度

虽然结果证实了 125-(OH)2D3 (骨化三醇) 对成骨活性的正效应, 但在成骨酶 mRNA 表达的某些褶皱变化中只观察到统计学上的显著差异。酶。这种分析可能是由高 SD 值引起的, 这可以归因于主机之间的个体偏差。

碱性磷酸酶的信使 RNA 表达

1周后, 在维生素 C 组和 7.15 (sd = 4.88) 中, 磷酸酶 mRNA 表达的褶皱变化为 7.43 (sd = 3.96), 9.30 (sd = 5.63), 12.92 (sd = 7.95), 6.60 (sd = 6.33) 在 1010, 109, 108和 107 M 125-(OH)2D3组分别 (图 4a)。维生素 C 中碱性磷酸酶的 mRNA表达水平, 108 M 125-(OH)2d3和 109 M 125-(oh)2D3组显著高于 (p < 0.05)那些在其他小组, 表明增加了碱性磷酸酶 mRNA 表达在这些小组。控件设置为值1。在本研究中观察到以下褶皱增加的碱性磷酸酶 mRNA 表达: 7.43 倍的维生素 C 组;9.30 倍于 109 M 125-(OH)2D3组;12.92 倍于 108 M 125-(OH)2D3组。

虽然在 108 M 125-(OH)2D3组中观察到了高山 mRNA 表达式的更大的褶皱变化, 但在这个组和阴性和维生素 C 组 (p = 0.20 和p = 0.52)。

碱性磷酸酶是测定细胞早期成骨分化的有力指标。碱性磷酸酶也作为 ectoenzyme 无机焦磷酸酯的降解, 在矿化过程中释放磷酸盐36。与其他组 (图 4a) 进行比较时, 使用维生素 C 和 108和 109 M 125-(OH)2D3的 PDCs 进行了显著差异。

骨涎蛋白的信使 RNA 表达

1周的培养后, BSP mRNA 表达的褶皱变化为 3.21 (sd = 1.20) 和 4.18 (sd = 2.55), 10.34 (sd = 10.31), 24.91 (sd = 23.44), 和 5.24 (sd = 3.54) 在维生素 C 和 1010, 109, 108和 107 M 125-(OH)2D3组分别 (图 4b)。BSP mRNA 表达式在 108 M 125-(OH)2D3组中较高, 但与其他组中的相应表达式相比没有统计学意义。

维生素 C 和 1010 M 125-(OH)2D3组的 BSP mRNA 表达式显著高于其他组 (p < 0.05), 指示维生素 C 和 1010 M 125-(OH)2D3提升了 BSP 表达式。控件的值设置为1。维生素 C 和 1010 M 125-(OH)2D3组分别显示了 BSP mRNA 表达式的3.21 和4.18 倍的增加。109 M 和 108 M 125-(OH)2D3组显示比其他组更高的 BSP mRNA 表达式。109和 108 M 125-(OH)2D3组分别显示了 BSP mRNA 表达式的10.34 和24.91 倍的增加, 但这种增加没有统计学意义 (p> 0.05)。一个可能的解释是, 干细胞不是全部从同一参与者获得的。因此, 潜在的差异可能增加了 SD, 从而影响了统计结果。

CBFA1 的信使 RNA 表达

1周后 CBFA1 mRNA 表达的褶皱变化为 0.96 (sd = 0.10) 和 0.90 (sd = 0.26), 1.01 (sd = 0.25), 1.31 (sd = 0.32), 和 1.12 (sd = 0.35) 在维生素 C 和 1010, 109, 108, 分别为 107 M 125-(OH)2D3组 (图 4c)。108 M 125-(OH)2D3组展示了更高的 CBFA1 mRNA 表达式。治疗组或对照组 CBFA1 mRNA 基因表达无明显变化。此外, 在添加维生素 C 或 125 (OH)2D3之后, mRNA 标记的表达没有显著增加。此外, 没有发现明显的团体差异。

collagen-1 的信使 RNA 表达

1周后 collagen-1 mRNA 表达的褶皱变化为 0.98 (sd = 0.17) 和 0.85 (sd = 0.16), 1.05 (sd = 0.16), 1.52 (sd = 0.36), 和 1.01 (sd = 0.33) 在维生素 C 和 1010, 109, 108和 107 M 125-(OH)2D3组分别 (图 4d)。collagen-1 mRNA 表达式在 108 M 125-(OH)2D3组中较高, 但与其他组中的相应表达式相比没有统计学意义的差异。

108 M 125-(OH)2D3和对照组在结果 (p < 0.05) 中表现出统计学上的显著差异。控件的值设置为1。观察到 collagen-1 mRNA 表达的1.52 倍增加。1010 M 125-(OH)2d3和 108 M 125-(oh)2D3组在其结果中表现出显著差异 (p < 0.05)。

信使 RNA 表达式骨钙

1周后 OCN mRNA 表达的褶皱变化为 0.60 (sd = 0.1) 和 0.78 (sd = 0.18), 1.13 (sd = 0.55), 2.59 (sd = 1.59), 和 1.61 (sd = 0.73) 在维生素 C 和 1010, 109, 108, 分别为 107 M 125-(OH)2D3组 (图 4e)。OCN mRNA 表达式在 108 M 125-(OH)2D3组中较高, 但与其他组中的相应表达式相比没有统计学意义的差异。

添加维生素 C 或 125 (OH)2D3后, OCN mRNA 标记的表达式没有显著增加。但维生素 C 治疗后 OCN mRNA 表达下降。控件设置为值1。在成骨细胞分化过程中, 基底 OCN 表达显著减少0.6 倍 (p < 0.05)。在 108 M 125-(OH)2D3中培养的细胞中, OCN mRNA 表达显著高于其他组的相应表达式 (p < 0.001), 显示平均褶皱增加2.59. 然而, 这些结果没有统计学意义 (p > 0.05)。一个可能的解释是, 干细胞并非全部从同一参与者获得;因此, 潜在的差异可能增加了 SD, 从而影响了统计结果。

碱性磷酸酶活性测定

前一项研究表明, 125-(OH)2D3最有效的浓度为 108 M;因此, 108 M 在测试组中使用, 以比较 125-(oh)2d3与阴性、维生素 c 和维生素 c + 125-(oh)2d3组的成骨能力。其成骨能力由碱性磷酸酶活性表达。在1周的区域性 (图 5a) 之后, 在阴性、c、D 和 c++ d 中, 碱性磷酸酶活性的褶皱变化为 1.00 (sd = 0.00)、1.92 (sd = 0.89)、3.77 (sd = 1.66) 和 1.46 (sd = 0.49)。在所有组中, 只有 D 和阴性组之间有统计学意义的差异 (p = 0.03;图 5a)。经过2周的文化, 在负值、c、D 和 c++ d 中, 在碱性磷酸酶活动 (图 5b) 中的褶皱变化分别为 1.00 (sd = 0.00)、2.32 (sd = 1.68)、4.98 (sd = 3.02) 和 4.86 (sd = 2.73)。无统计学意义的差异在任何组观察到。经过3周的文化, 在负值、c、D 和 c++ d 中, 在碱性磷酸酶活动 (图 5c) 中的褶皱变化分别为 1.00 (sd = 0.00)、2.93 (sd = 2.15)、5.76 (sd = 3.60) 和 5.61 (sd = 3.88)。同样, 在任何组中都没有观察到统计学上的显著差异 (图 5c)。经过4周的文化, 在负值、c、D 和 c++ d 中, 在碱性磷酸酶活动 (图 5d) 中的褶皱变化分别为 1.00 (sd = 0.00)、2.83 (sd = 1.97)、3.79 (sd = 0.77) 和 4.24 (sd = 2.87)。在这里, D 和阴性组表现出统计学上的显著差异 (p = 0.00;图 5d)。

在1周, 只有 108 M 125-(OH)2D3组与对照组相比有显著差异 (p = 0.03)。在2周, 108 M 125-(OH)2D3和维生素 C 组与对照组相比有显著差异 (p = 0.0498)。在3周, 与对照组相比, 没有一个组表现出显著的差异。在4周, 108 M 125-(OH)2D3组与对照组相比表现出显著差异。这表明 108 M 125-(OH)2D3促进了碱性磷酸酶活动。

简言之, 108 M 125-(OH)2D3组显示了增加的磷酸酶和 collagen-1 mRNA 表达;维生素 C 组显着增强的碱性磷酸酶和 BSP mRNA 表达;和 109 M 125-(OH)2D3组显示显著增强的磷酸酶 mRNA 表达式。在1周, 维生素 C 和 125-(OH)2D3组中的碱性磷酸酶活性增加, 但与其他组中相应的表达水平相比, 没有统计学意义的差异。从周2到 4, 维生素 C 和 125-(OH)2D3组显示了类似的结果。因此, 这些结果无法清楚地阐明维生素 C 和 125 (OH)2D3对细胞成骨分化的协同效应 (碱性磷酸酶活性)。

Figure 1
图 1: 人肺泡骨膜.在牙科手术中收获骨膜组织。星号表示肺泡骨膜的位置。

Figure 2
图 2: 差异化研究.在 1-3 d 的主培养 (A) 后, MSCs 是纺锤形的, 不规则的过程, 并牢固地附着在培养皿上; 星号表示间充质干细胞的位置。在体外培养条件下, MSCs 被 subpassaged 并分化成成骨细胞 (B, 黑色星号表示由冯科萨染色的区域), 软骨细胞 (C, 蓝色星号指示染色的区域阿利新蓝色) 和脂肪细胞 (D, 粉红色星号表示被油红色 O 染色的区域)。图 2从生物医学研究国际、卷2016、文章 ID 352956125中重用。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 流式细胞术.由 MSCs 表达的表面标记为 CD73 (65.2%)、CD90 (75.6%)、STRO-1 (65.2%) 和 CD44 (88.1%), 而不是 CD45 (1.34%)、CD34 (1.61%)、CD19 (2.18%) 或 HLA-DR (2.20%)。图中的 "%" 表示正比例。对照组 (α和5% 的血清) 由红线表示。实验组由蓝线表示。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: mRNA 表达式.1周成骨细胞分化的 mRNA 表达。(A) 阿尔卑斯 (B) BSP, (C) CBFA1, (D), 和 (E) OCN。p < 0.05 为 *, p < 0.01 为**, p < 0.001 为 **。mRNA 折叠变化是对控制 (α和5% 血清)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 碱性磷酸酶活性.碱性磷酸酶活性测定成骨细胞分化为 (A) 周 1, (B) 周 2, (C) 3 周, (D) 4 周。p < 0.05 是*, p < 0.01 是 **, p < 0.001 是 **。褶皱的变化是对控制 (α, 5% 血清)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

最近发展起来的治疗方式, 即组织工程所涉及的 MSCs, 有许多优点。MSCs 是存在于几种组织类型中的多能细胞, 可分化成多种功能性胚层组织细胞37和其他细胞, 如成骨体。

骨膜充当祖细胞的利基, 作为骨骼的丰富的血管供应, 它包裹着38。在我们的研究中, 34 份调查样本中, 20 成功地取得了 MSC 的菌落, 成功的隔离率为58.8%。本研究根据其增殖和成骨分化能力, 选择了从骨膜中提取的 MSCs。骨膜细胞的增殖率高于骨髓基质细胞22。关于骨膜的成骨能力, Ousual24争辩说, 骨膜源干细胞的成骨能力不如骨髓基质细胞。然而, 吉村证实, 保能的成骨能力优于骨髓基质干细胞39。林et。显示骨膜成人 MSCs 作为骨组织再生的理想候选者24。此外, 骨膜成体骨髓间充质干细胞被认为是有用的缩短细胞培养周期, 从而降低成本和风险的污染22。据报道, 衰老也影响骨细胞的有丝分裂活动40。一项研究报告 125-(OH)2D3诱导了较高程度的刺激体外成骨细胞分化 hMSCs 从年轻参与者 (年龄 < 65 y)41。本研究涉及使用从年轻成年人 (年龄 < 65 y) 获得的骨膜细胞。需要进一步的研究来比较老年和年轻献血者骨膜细胞的骨再生能力。

在本研究中, 根据 Friedenstein et al的描述, 细胞的数量被隔离在其塑料附着物的基础上。13. 这里收获的 PDCs 附着在细胞培养塑料上。这些主要培养细胞表面抗原的 esenchymal 标记 (cd 73、cd 90、STRO-1 和 cd 44) 表现出显著的表达。此外, 造血标记 (cd 45、cd 34、cd 19 和 HLA DR) 没有出现, 这表明培养的细胞是一种间充质的来源。PDCs 的成骨、软骨和脂肪分化可以通过特定的分化培养基诱导, 如其他研究, 评价从牙龈组织和骨髓中获得的样本42。本研究的结果符合国际细胞治疗学会所接受的人类 MSCs 的表型和功能定义的最低标准4。在本研究中, 人骨膜中的骨髓间充质干细胞被分离和扩展, 显示出类似于典型的骨髓基质干细胞的特征。

研究表明, 地塞米松、抗坏血酸和β-甘油导致骨髓基质干细胞接受成骨分化43。另一项研究表明, 1α, 25-羟维生素 D 3 (125-(OH) 2 D 3) 结合抗坏血酸促进干细胞分化 44. 因此, 本研究增加了地塞米松、抗坏血酸和β甘油, 促进了干细胞分化。在所有三例患者细胞样本中观察到的模式相似。本研究成功地从肺泡骨膜中分离出骨髓间充质干细胞, 隔离率为58.8%。在年龄、性别和地点方面, 成功率没有显著差异。

本实验研究了两种物质, 即 125-(OH)2D3和维生素 C, 两者都能刺激干细胞的成骨分化。2008研究45表明 125-(OH)2D3对骨代谢和钙稳态至关重要, 并通过尚未充分了解的机制影响心血管系统。在另一个以前的研究中46, 125-(OH)2D3刺激了的体外分化为成骨细胞。125-(OH)2D3诱导未分化骨髓基质干细胞分化成成骨样细胞的能力体外已在探索各种系统46的几项研究中得到证明。一些研究还表明, 当添加到成骨细胞的文化, 125-(OH)2D3抑制细胞增殖, 但增加成骨标记的表达, 如碱性磷酸酶, 骨桥蛋白, OCN 和基质玻璃蛋白质47,48。以前的研究报告, 125-(OH)2D3通常抑制细胞增殖和诱导成骨细胞分化49。对小鼠细胞进行的一项体外研究表明, 125-(OH)2D3可以促进 osteoblastogenesis9的早期阶段。另外, 另一种体外研究建议, 对于早期和晚期 MSCs, 125-(OH)2D3可以刺激成骨分化标记, 包括碱性磷酸酶、骨桥蛋白、BSP 和 OCN43

无论是 OCN 的控制矩阵合成-和胶原 1A1-最丰富的基质蛋白-是关键的酸性骨基质蛋白, 发挥重要作用, 在基质合成。此外, 它们还具有成熟的基质形成成骨细胞的特征。50以前的研究报告说, 125-(OH)2D3治疗刺激增加胶原1A1 表达, 但不 CBFA1 或高山基因表达34。对成骨细胞分化相关基因的评估显示, 125-(OH)2D3治疗增加了 OCN51,52,53的表达式。研究结果表明, 125-(OH)2D3对成骨活性有正向影响。与其他组相比, 10−8 M 125-(OH)2D3显示了更高的磷酸、BSP、CBFA1、OCN 和 Col1 mRNA 表达式。其中, 碱性磷酸酶和 Col1 的结果达到统计学意义。因此, 在使用 10−8 M 125-(OH)2D3时, 获得了最佳条件。10−10 M 125-(OH)2D3组中 BSP 的 mRNA 表达显著增加 (p < 0.05)。然而, 在 CBFA1 和 OCN mRNA 表达的褶皱变化中没有观察到统计学上的显著差异。在回顾基因 mRNA 表达时, 实验结果表明,体外成骨分化。根据这些发现, 成骨在阴性中观察到, 维生素 C 和 10−10, 10−9, 10−7 m 125-(oh)2D3组较弱于 10−8 m 125-(OH)2D3组。这些结果导致推测 125-(OH)2D3素数 PDCs 通过植入为矿化需要的基质蛋白质 (胶原蛋白 1A1)。

以前的研究报告 OCN 是 125-(OH)2D3的主要目标, OCN 表达式52显著增加。OCN 沉积可视为 PDCs 成骨分化的标志物。此外, OCN 表达式被评估为晚期成骨标记54。OCN 是骨形成和成骨的可靠标志物55。因此, OCN 表达一般与细胞的成矿能力有关。OCN 是成熟成骨细胞的敏感生物标志物。对于体外成骨比较, 在 10−8 M 125-(OH)2D3组中观察到明显升高的 OCN mRNA 表达。

一项研究表明, 碱性磷酸酶活性通过转化生长因子 beta (0.1-10 ng/毫升) 而被抑制, 并以 125-(OH)2D3 (50 nM)46的速度提升。这些结果意味着 10−8 M 125-(OH)2D3促进干细胞成熟和骨骼发育。10−8 M 125-(OH)2D3的最佳观察浓度的碱性磷酸酶活性与维生素 C 的相应浓度进行了比较。PDCs 表达了碱性磷酸酶的活性。此外, 125-(OH)2D3的添加增加了碱性磷酸酶活性, 促进了 PDCs 中成骨细胞的分化。在所有三设置中, 维生素 C、10−8 M 125-(OH)2D3, 和维他命 C + 10−8 M 125-(OH)2D3增加的磷酸酶活动在星期 1 (图 4a), 2 (图 4b), 3 (图 4c) 和 4 (图 4d) 与负控制组相比有好几倍。在周1和4中, 在 10−8 M 125-(OH)2D3组中, ALP 活动显著增加。在2周, 在维生素 C 和 10−8 M 125-(OH)2D3组中, 碱性磷酸酶活性显著增加。

通过对不同的人骨髓间充质干细胞的比较研究在通道 3, 坂口etal。56发现骨髓基质干细胞和私营军保, 具有相似的成骨能力。因此, 利用骨膜细胞可以缩短细胞培养周期, 进而降低成本和污染风险。早期通道 hMSCs 的使用避免了在文化中扩张的衰老效应。Ousual 和吉村在3和传代2周在成骨分化条件下使用 MSCs35。因此, 在比较各种细胞源的细胞活动时, 应考虑通道时间。本研究采用第三代 PDCs, 因为 PDCs 后代干细胞的成骨潜能低于第三代 PDCs 的干细胞。

骨膜干细胞在人体血清培养基中培养时, 不仅能保持其形状, 而且还能附着、维持活性, 实现细胞生长。总之, 根据这些结果, 人类 PDCs 具有生存、增殖和分化成成骨血统的能力在体外, 这是评估疗效在体内的关键。骨膜富含 MSCs, 因此适合组织工程。从牙龈得到的骨膜会造成更少的并发症。因此, 肺泡骨被认为是理想的供体部位。结果清楚地表明, 类似的分离干细胞的可能性, 从骨膜和实现他们分化成成骨细胞, 软骨细胞和脂肪。本研究将维生素 C 对 PDCs 成骨潜能的影响与不同浓度的 125-(OH)2D3进行比较。最有效的浓度为 10−8 M 125-(OH)2D3。在整个养殖期间, 10−8 M 125-(OH)2D3治疗是诱导 PDCs 成骨分化的一种有效和经济的方法。总之, 维生素 C 和 125 (OH)2D3促进 PDCs 的成骨分化。然而, 它们在碱性磷酸酶活性的结果中没有显著的协同作用。考虑到小样本的大小, 需要额外的样品来进行进一步的评估。因此, 在成骨条件下培养的 PDCs 可能对骨组织工程有帮助, 并提供了更高的细胞增殖优势。

本议定书的关键步骤包括步骤1.2 和 1.3 (在收获后24小时内启动培养程序, 并在此后进行适当的维护)。必须避免对组织的污染, 使用无菌技术是强制性的。该协议的一个局限性是, 与从骨髓或脂肪组织中寻找干细胞相比, 从牙科组织中获取干细胞的数量有限, 因为可以通过这种技术获得的细胞数目很少。

骨膜干细胞的鉴定和表征可以为该组织的功能和再生潜能提供有价值的信息, 以及它在再生治疗中的适用性。使用 10−8 M 125-(OH)2D3获得最佳条件。因此, 用 10−8 M 125-(OH)2D3 PDCs 的治疗, 促进成骨分化。未来的研究应该检查 10−8 M 125-(OH)2D3在体内应用, 以有效和经济的骨组织工程。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该项研究协议已获得长功夫纪念医院 (IRB99-1828B、100-3019C、99-3814B、102-1619C、101-4728B、103-4223C) 临床研究机构审查委员会批准。这项研究得到了长功夫纪念医院 (CMRPG392071、CMRPG3A1141、CMRPG3A1142 和 NMRPG3C0151) 的支持。这篇手稿是由华莱士的学术编辑编辑的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

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