人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ビタミン C (ビタミン C)、1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D [1,25-(OH)2D3] による骨膜由来細胞 (Pdc) の mRNA 発現バイオ マーカーを調査するためのプロトコルを提案します。また、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する Pdc の能力を評価します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

間葉系幹細胞 (MSCs) は、さまざまな組織に存在しており、骨芽細胞を含む、多くの種類の細胞に分化することができます。MSCs の歯ソース、骨膜は簡単にアクセスできる組織、形成層に MSCs を識別されています。ただし、このソースないまだ広く研究されています。

ビタミン D3と 1,25-(OH)2D3 の in vitro分化 MSCs の骨芽細胞を刺激するために実証されています。さらに、ビタミン C は、コラーゲン形成、骨細胞の成長を促進します。ただし、研究はまだ MSCs に及ぼすビタミン D3とビタミン C を検討しています。

ここで、ひと歯槽骨膜から MSCs を分離する方法を提案する 1,25-(OH)2D3可能性がありますこれらの細胞の骨効果を発揮するという仮説を調べると。また人間の歯槽骨膜で MSCs の有無を調査し、幹細胞の接着・増殖を評価します。評価するためにビタミン C (コントロール) としての能力と 1,25-(OH)2D3 (1010、109108、107 M) の濃度を変更するキーの mRNA のバイオ マーカーアルカリホスファターゼ (ALP) の分離の MSCs mRNA 発現骨シアロタンパク質 (BSP)、コア結合因子 α-1 (CBFA1) コラーゲン-1、オステオカルシン (OCN) は、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) を使用して測定されます。

Introduction

多数の関連する技術は、近年開発されている、骨の再建のまま複数の制約によって制限され、必要な再構築の範囲はしばしば不可能を推定します。硬組織増強が有利な長期的な成功率に加えて機能と審美性の目標を達成するために必要です。自家および同種骨移植術、xenografting、および alloplastic 骨移植、そのようなプロシージャのために一般的に使用されるメソッドが含まれます。各種骨移植の中では、自家骨移植が最も効果的なと見なされます。しかし、ドナー サイト罹患率、危険にさらされた血管と組織の限られた可用性1自家骨移植のための主要な欠点をされています。さらに、同種骨移植、異種移植片は病気の感染に関連付けられています。現在、人工骨移植、広くこれらの問題を解決する使用されます。ただし、骨の可能性の欠如と臨床転帰は広く変わることが。セルロースなどの材料、量の変動、感染症、強度の不足と関連付けられます。

組織工学による骨増生は、かなりの関心を生成しています。この手法は、間葉系幹細胞 (MSCs) 最初される骨芽細胞分化を促進するために、骨修復を達成するために骨の損失のサイトに移植します。この手順は、細胞療法に現在適用されます。組織の限られた量を抽出することにより, 顎骨の再建を達成して簡単です低侵襲他の方法と比較しています。

MSCs の歯科再生を目指した細胞ベースの治療のためのツールとしての潜在的な役割は、様々 な研究グループの新たな関心です。MSCs が組織の次の種類から区別することができる研究を確認した: 骨髄、脂肪、滑膜、周皮細胞、骨、ひと臍帯、歯の組織2,3。MSCs の一般的な原因は、歯の組織、脂肪組織、骨髄に含まれます。歯科幹細胞の利点が収穫後に簡単なアクセシビリティと少ない罹患率を脂肪組織、骨髄由来 MSCs と比べると。胚性幹細胞と比べると、歯の組織に由来する MSCs は nonimmunogenic 表示され、複雑な倫理的な問題3に関連付けられていません。

2006 年、細胞療法の国際社会を MSCs を識別するために次の基準を使用してお勧めします: 最初に、MSCs はプラスチックにアタッチできる必要があります。第二に、MSCs は CD105、CD73、CD90 の表面抗原に陽性で造血抗原 CD45 と CD344に加えて B 細胞、マクロファージ、単球のマーカーに否定的な必要があります。最終的な基準として MSCs は細胞の in vitro分化の標準的な条件下での次の 3 種類に区別することがある必要があります: 骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞の4。日には、6 種類歯科幹細胞の分離され特徴します。最初のタイプは、ひと歯髄組織から分離され、生後歯髄幹細胞5と呼ばれます。その後、歯科の MSCs の新たに 3 種類が分離され特徴: 剥離乳歯67歯根や頂乳頭8から幹細胞。最近では、根尖嚢胞 MSCs (hPCy-MSCs)12歯科芽茎 cells(DBSCs)11歯肉組織由来10歯科卵胞由来9も同定されています。

エアフルトは、MSCs13を定義する第 1 だった。MSCs は潜在的な高い増殖を展示し、移植前に区別するために操作することができます再生手順10に適していることを示唆しています。

また骨膜由来細胞 (Pdc)、されているほとんどの研究は、幹細胞の供給源として骨髄を使用して、最近14を使用します。骨膜、骨髄よりもより簡単にアクセスできます。したがって、この手法では、私たちは手術中に追加切開の必要性を除去するために、患者の術後合併症を減らすために歯槽骨膜を使用します。長骨の外のライニングを形成し、2 つの異なるレイヤーで構成されて結合組織である骨膜: 線維芽細胞、コラーゲンや弾性線維の15と直接接触して内部の細胞豊富な形成層から成る外層の線維性骨の表面。形成層を含む混合セル人口16主に線維芽細胞、骨芽細胞17、ペリサイト18、および MSCs19,20,21として識別される重要な個体。における骨髄由来幹細胞 (bMSCs) に優れた骨治癒と再生の22,23,24なかったら Pdc が匹敵する、ほとんどの研究を報告しています。骨膜は簡単にアクセスできる、優れた再生効果を展示します。ただし、いくつかの研究は骨膜25,26,27に焦点を当てています。

骨修復に関する現在の臨床実習には支援足場内増幅骨膜前駆細胞の移植が含まれます。最近の研究は、欠陥のある領域における幹細胞の獲得と組織再生20の前駆細胞を用いた焦点を当てています。歯科医は、歯周治療、歯科インプラント歯周骨再生の将来のアプリケーションも予測します。ドナー サイトに関する骨膜が一般的な歯科医によって簡単に収穫できます。骨膜は、ルーチンの口腔外科手術中にアクセスできるように、これは骨髄間質細胞に対して遜色します。したがって、本研究の目的は、Pdc を収穫するためのプロトコルを確立し、評価形態、添付ファイル、実行可能性、および人間の骨膜幹細胞の増殖です。

ビタミン D 代謝物生体内で骨塩量動的平衡に影響を与えます。1 つの研究は、24R,25-(OH)2D3活性型ビタミン D は人間の MSCs (hMSCs)28の骨芽細胞の分化に不可欠な報告。骨ホメオスタシスと修理は、どの 1,25-(OH) の2D3 (カルシトリ オール) は最も生物学的活性と骨の健康の制御に関連する、ビタミン D3代謝のネットワークによって規制されています。ビタミン D3石灰化29に不可欠です。2 d 旧昆明白いマウスを使用して 1 つの研究では、マウスの胚様体は、ビタミン C とビタミン D のサプリメントが効果的に30ESC 由来の骨芽細胞の分化を促進示されます。その他の生物学的活動の中で 1,25-(OH)2D3は hMSCs アルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性または OCN 遺伝子の増加に基づいて監視できる芽を生体外で分化を刺激します。式です。

ほとんどの研究は、骨ティッシュ エンジニア リングの特定焦点との人間の Pdc でビタミン C と 1,25-(OH) の2D3との組み合わせ治療の用量-反応関係が します。したがって、本研究で我々 は 1,25-(OH)2D3の単一または複合治療の至適濃度と人間の Pdc の骨分化誘導のためのビタミン C を調べます。このプロトコルの目的は歯科歯槽骨膜由来細胞集団に MSC の表現型とこれらの細胞の (体外) 文化の展開し、目的の組織を形成する区別されるかどうかのセルが含まれているかどうかを決定する、します。.また、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する Pdc の能力を評価します。研究の 2 番目の部分は、Pdc の骨の活性に及ぼすビタミン C と 1010、109、108、107 M 1,25-(OH)2D3を評価します。本研究の主な目的は ALP 活性と、アルプなど、プロによる骨の遺伝子によって Pdc の骨芽細胞の分化にビタミン C と 1,25-(OH)2D3の機能を評価するために、コラーゲン 1、OCN、BSP、および CBFA1。さらに、本研究は、これらの調査結果に基づいて人間の Pdc の最適な骨の条件を決定します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

研究プロトコルは、制度検討委員会の長庚記念病院が承認されました。すべての参加者には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。

1. ティッシュの準備

  1. 歯科手術 (図 1) 中に患者から骨膜の組織を収穫します。局所麻酔下フラップ反射後、歯槽骨骨膜区切り31を使用してから骨膜組織の部分を取る。
  2. 収穫後ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 300 U/mL のペニシリンとストレプトマイシンの 300 mg/mL に約 5 mm × 2 mm の骨膜の組織スライスを格納します。24 時間以内に検査室に組織を転送します。
  3. メスもみじん切りし、通過 0 の培地 (ペニシリンの 300 U/mL と 300 mg/mL ストレプトマイシン、α-MEM、5% ウシ胎児血清 [FB] で構成) で、37 ° C でインキュベーターで培養でサンプルを維持と歯槽骨膜組織片をみじん切り加湿空気 (5% 二酸化炭素)。、インキュベーターの湿度を維持するために水鉢を準備します。
  4. 3 日後、週に 2 回は、媒体を変更します。
  5. セル subconfluence (80%) に達している、3 min のためのインキュベーター (37 ° C) で 0.25% トリプシン 200 μ L で付着性のセルを解放し、反応を終了する媒体の 4.5 mL を使用してください。
  6. 再び新鮮な通路 1 培地で細胞をプレート (α-MEM、10 %fbs、100 単位/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 100 μ g/mL)。プレートは 5 × 103細胞 (診断によって数えられる) ようです。
  7. セル達成 80% 合流31後、各後続の通路を実行します。
    注: 初めに、媒体になりますオレンジ、赤。約 3 日間後中の色が黄色がかった色合いに変わります。細胞の倍加時間は約 30-40 h、3-5 世代のための 7 日間を必要とするであります。
  8. 文化 α MEM で分離された Pdc は、FBS、ペニシリン、100 U/mL と 100 mg/mL (37 ° C、5% CO2) インキュベーターのストレプトマイシンの 10% を補充しました。
  9. 細胞の成長を毎日観察し、週 2 回成長培地を置き換えます。第 3-第五世代細胞を使用して、すべてのそれ以上の実験のため。

2. フローサイトメトリー

  1. トリプシンの消化力によって収穫 1 × 106セル:
    1. 0.25% トリプシン 200 μ L を追加します。3 分後に、トリプシンの反応を終了し、遠心分離 (1500 rpm、5 分、22 ° C) を通じて収集 FBS を含む培養液 4.5 mL を使用します。
    2. 3 回使用して 1 x DPBS 細胞ペレットを洗浄します。200 μ L 1 x透過バッファーに細胞を再懸濁します。診断とセルをカウントします。
  2. 流れ cytometry (蛍光活性化細胞ソーティング)32を介して Pdc の表現表現の表面マーカーを調べます。CD19 に対するモノクローナル抗体 (MAb) を使用 (かに (FITC))、CD34 (FITC)、CD44 (フィコエ リスリン [PE])、CD45 (FITC)、CD73 (PE)、CD90 (アロフィコシアニン [APC])、CD146 (PE)、STRO-1 (アレックス)、および HLA-DR (FITC)32
    1. サンプルと文化 4 ° C、30 分で暗闇の中に抗体を追加します。
    2. 3 回 1 x DPBS で血球を洗浄します。
    3. 2% のホルムアルデヒドを使用してセルを修正、流れフローサイトメトリー分析32に進みます。

3. 添付ファイルと生存率と骨、脂肪細胞、軟骨細胞分化を細胞します。

細胞の分化を誘導する骨、脂肪細胞と分化メディアで 6 ウェル プレートにすべて 3 通路で骨膜細胞を培養による軟骨細胞系列。

  1. Osteogenic 微分のため α-MEM 6 ウェル培養皿の上でよくあたり 5000 セルの密度での細胞を培養します。
    1. 80% の合流点を達成すること、5% α-MEM 培地で細胞の培養 FBS、β-グリセロリン酸 (10 mM)、10−7 M デキサメタゾン (0.1 mM)、アスコルビン酸 5 ml (100 uM)。Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    2. 週 2 回メディアを変更します。
    3. 4 週間後文化33石灰質堆積物の存在を区別するコッサ アッセイを用いた細胞によって骨系統に分化する細胞の潜在性を評価します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内 5% 硝酸銀を追加し、室温で 1 時間の紫外線 (UV) 光の下で治療します。
      2. 4 4 回 5% ナ2を追加、各反作用のための 3 分を許可します。最後に、蒸留水で 2 回細胞を洗浄します。
        注: コッサ染色は、銀イオンとリン酸が酸性物質の存在下で反応する沈殿物の反作用この染色法はカルシウムに固有ではありません。今回、調査の細胞はカルシウム硝酸銀溶液で扱われたとき-強い紫外線を低減-取替えられた銀は、金属銀として見えるようになった。
  2. 脂肪細胞分化の α MEM を含む 6 ウェル培養皿の上でよくあたり 5000 セルの密度での細胞を培養します。
    1. 80% の合流点を達成すること、α MEM, 5 %fbs、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (100 mg/mL), 1% ペニシリンを含んでいる媒体で細胞の培養 10− 6 M デキサメタゾン (1 mM)、インスリン (5 mg/mL)、インドメタシン (60 mM)。
    2. Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    3. 6-9 週間後使用オイル赤 O の細胞を染色し、脂質低下、脂肪細胞分化33の存在を決定します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内で染色 0.5% セル オイル赤 O の 10 分間室温で、毎回 3 回 3 分間 60% イソプロパノールとセルを洗い流し最後に、蒸留水と細胞を洗浄します。
        注: オイル赤い O 中性脂質の染色に使用する lysochrome (脂溶性) ジアゾ染料主にトリアシルグリセ ロール、リポ蛋白質とコレステロールのエステル。染料は、脂肪滴を赤く、細胞における脂質に溶解します。
  3. 軟骨細胞分化、それぞれ 6 ウェル培養皿で培養細胞も 5000 を含んでいるセルです。
    1. 分化中含まれている α-MEM、5 %fbs、10−7 M デキサメタゾン (0.1 mM)、ピルビン酸ナトリウム (100 μ g/mL)、インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレン-A (1 × ITS)、変形成長因子 β (10 ng/mL) とアスコルビン酸 (100 μ M) の 5 mL 追加します。
    2. Α MEM と 5% で構成されるメディアのネガティブ コントロールを文化政府短期証券。
    3. 4-5 週間後アルシアン ブルー染色グリコサミノグリカンなど軟骨細胞分化33の存在を決定する細胞の軟骨のムコ多糖の種類によって、酸性多糖類を強調するを使用します。
      1. 10% ホルマリン固定を追加します。30 分以内 3% 酢酸を追加し、反応を 2 分します。その後、蒸留水で 3 回洗浄 30 分インキュベート 1% アルシアン ブルー 8GX を追加し、その後、蒸留水で洗います。最後に、3% 酢酸と 3 分間洗浄を追加し、その後、仕上げに精製水で洗ってください。
        注: 具体的に青緑の青くなるこの色素によって染色するセルの部分染色後、"alcianophilic"と呼ばれる

4. 25-ジヒドロキシ D3 (1,25-(OH)2D3) の骨形成に及ぼす影響

  1. P5 Pdc に P3 を分割、六つのグループと様々 な文化のメディアと 6 ウェル プレートの文化。
  2. 負の群 (α MEM と 5 %fbs);
  3. ビタミン C 群 (α MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、および 10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C);
  4. 10−7 M 1,25-(OH)2D の3グループ (α MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸と 10−7 M デキサメタゾン + 10−7 M 1,25-(OH)2D3)。
  5. 培地 2 mL を各ウェルにインキュベーター (37 ° C) に追加し、変更の媒体毎週二回。

5. 転写/量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応の逆します。

  1. 骨芽細胞分化の 7 d の後商業試薬を使用して、氷の上の総 RNA を分離 (材料の表を参照してください)。
    1. 各ウェルに分離試薬 1 mL を追加します。Bromochloropropane の 200 μ L を追加し、層状 RNA を生成する 10 分間のままに、4 ° C で 15 分間 10,000 rpm で遠心分離
    2. 遠心分離の後上澄み含む RNA の 500 μ L に 2-プロパノールを 500 μ l 添加を追加します。氷の上の RNA を沈殿させ、反応のための 15 分ができます。
    3. 手順の後、RNA が管の下部に位置して、4 ° C で 15 分間 12,000 rpm で遠心分離機します。その後、洗浄のための 75% のアルコール 1 mL を使用して上澄みを除去し、4 ° C で 8 分 7,500 rpm で遠心
    4. 上澄みを除去し、液体の底から RNA を生成する真空濃縮を使用します。水で回復します。
  2. 逆転写 RNA (1 μ g) 鳥 myeloblastosis ウイルス逆転写酵素を使用しています。最後に 4 ° C で維持する前に、60 分とし、5 分間 85 ° C、ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 次に 50 ° C 10 分の 25 ° c を実行するに設定します。
  3. 最初繊維の相補的 DNA (cDNA) を合成します。5 を使用して量的な PCR (qPCR) を実行 1:10 の μ L 希釈 cDNA。定量的 RT-PCR (qRT PCR) を行う ALP、BSP や OCN、CBFA1、コラーゲン 1 のプライマーを使用して。
    注: 信号によって DNA の汚染を防止するため各プライマーの前方および逆シーケンス異なるエクソンに設計されていた。
  4. 商業 PCR マスターを使用して、qPCR を実行 (材料の表を参照) をミックス メーカーの指示に従い。2 分後 10 分 95 ° C として 40 サイクル各 15 95 ° C で 50 ° C で熱 cycler 設定 s に続いて 60 ° C、60 s。
    注: SYBR プロトコルも必要があります 15 95 ° C で実行され溶解曲線ステージ s、60 ° C、60 s、し、95 ° C、15 s。
  5. アルプ、BSP、CBFA1、サイクルのしきい値値を正規化し、コラーゲン 1 およびハウスキーピング遺伝子 GAPDH の OCN。34
  6. プライマーの材料表のとおりです。

6. アルカリホスファターゼ活性

  1. P- ニトロフェノール; p- ニトロフェニル リン酸に変換します以前記載した技術35を使用して細胞の ALP 酵素活性を評価します。p- ニトロフェニル リン酸は、405 nm 波長に決定、alp 企業様が脱燐酸化と黄色に変わり、アルカリホスファターゼ基質です。合計を正規化p- ニトロフェノール形成総蛋白に基づいてブラッドフォードの試金によって決定されます。
  2. コントロールの ALP 活性の比較 (α-MEM、5 %fbs)、ビタミン C (α-MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C)、1,25-(OH)2D3 (α MEM, 5 %fbs, 10 mM の β-グリセロリン酸と 10−7 Mデキサメタゾン + 10− 8 M 1,25-(OH)2D3) とビタミン C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM、5 %fbs、10 mM の β-グリセロリン酸、10−7 M デキサメタゾン + 100 uM ビタミン C +1,25-(OH)2D3)文化の 1、2、3、および 4 週間後グループ。
  3. 氷の上のタンパク質抽出プロシージャを実行します。
    1. 6 ウェルから細胞をこすり、換散バッファーの 50 μ L を追加します。その後、細胞を破壊し、蛋白質を無料で 30 分間氷の上のセルを配置します。
    2. 30 分後、4 ° C 15 分で 13000 rpm で遠心分離機します。遠心分離の後ストレージの上澄みを抽出し、使用します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

すべての定量的アッセイ用データは、平均 ± 標準偏差 (SD) として掲載されています。すべての統計解析を行いスチューデントのt-テストします。合計で 34 採取参加者平均年齢 48.1 ± 12.3 y イレブンのこれらのサンプルは男性患者と女性患者から 23 から得られました。臼歯部領域と前方の領域から 6 から 20-8 採取26 は、上顎骨や下顎骨から 8 から得られました。歯科治療と文化までの平均期間は 0.5 ± 0.1 h だった34 調査サンプルの 20 は正常に分離を成功させる率 58.8%、MSC のコロニーをもたらした。間のパラメーターのいずれかで有意な差は認められなかった、正常に、不運にも孤立した Pdc (平均年齢: 47.1 ± 11.5 y、セックス対 48.8 ± 13.0: 場所 [28.6%]、男性 4 対 7 男性 [35%]: 臼歯対 13 [92.9%]、[75%] から 15 と 15 から11 [78.6%] 対 [75%] 上顎それぞれ)。

細胞分離および形態: 骨、軟骨、脂肪細胞分化

1-9 の頃から Pdc は、植民地と球状クラスターを形成しました。ほとんどの細胞スピンドル外観を展示、一様位相差顕微鏡 (図 2)。文化の 14 d の後細胞の形態は紡錘状位相差顕微鏡下で観察すると登場。次の世代の細胞不要になった細胞はクラスターで育ったが、広範囲で均一な拡散を展示します。

MSCs 紡錘状の不規則なプロセスと、初代培養 (図 2 a) の 1-3 d の後培養皿にしっかりと接続されています。初期の文化展示小さな細胞と紡錘形細胞光学顕微鏡の下でラウンド。培養細胞 (図 2 a) の最初の通路から均質な線維芽細胞のような紡錘形を展示しました。分化の研究では、Pdc が subpassaged 可能性があり、骨芽細胞 (図 2 b)、(図 2 c)、軟骨細胞、脂肪細胞 (図 2 d)の in vitro分化を明らかにしました。

Osteogenic 微分末コッサ染色はカルシウム沈着し、骨分化誘導 (図 2 b) の存在を示した。これらの結果は強く骨膜細胞集団間で前駆細胞が骨形成系細胞に分化する可能性を有していることを示した。

プロテオグリカンの生産を評価するためにアルシアン ブルー染色は軟骨分化 (図 2 c) の存在を決定するための指標として使用されました。セルは正常に軟骨細胞に分化。骨膜細胞集団間で前駆細胞は軟骨細胞に分化する可能性を有していることが示唆されました。

細胞は脂肪細胞分化をトリガーする前述のように特定のメディアで培養しました。8 週間後にオイルの赤 O だった細胞内脂質の存在を検出するために使用を実行します。次の染色、細胞内微細な脂肪滴 5 分化のサンプル (図 2 d) で観察されました。

Pdc のフローサイトメトリーによる表面マーカー発現解析

細胞の表面に間葉系の表面マーカーの発現を確認するためのフローサイトメトリーアッセイを行った。MSC マーカー CD44 STRO-1、CD90 CD73 は CD19、CD34、CD45、HLA-DR 造血系統マーカーは陰性であったに対し、Pdc で強く陽性であった。

様々 なビタミン D の効果3骨の濃度

結果は、貪食の 1,25-(OH)2D3 (カルシトリ オール) の肯定的な効果を確認、骨の mRNA 発現のフォールドの変更のいくつかの間でのみ有意差が観察されました。酵素。この分析は、ホスト間で個々 の偏差に帰することができる高い SD 値によってバイアスされている可能性があります。

アルカリホスファターゼのメッセンジャー RNA 発現

ALP 7.43 文化の 1 週間後の mRNA 発現のフォールドの変更 (SD = 3.96) ビタミン C グループで 7.15 (SD = 4.88)、9.30 (SD = 5.63)、12.92 (SD = 7.95) と 6.60 (SD = 6.33) 1010、109、108、107 M 1,25-(OH)2D3グループ、それぞれ (図 4 a)。ビタミン C、108 M 1,25-(OH)2D3、および 109 M 1,25-(OH)2D3グループで ALP の mRNA 発現レベルよりも有意に高かった (p < 0.05) をいたこれらの他のグループは、これらのグループで ALP mRNA 発現の増加を示します。コントロールは、値を 1 に設定されました。ALP mRNA 発現の次の倍増加が本研究で認められた: 7.43-fold ビタミン C 群;9.30-fold 109 M 1,25-(OH)2D3グループで12.92-fold と 108 M 1,25-(OH)2D3グループで。

この層の間のこれらの表現レベルについて統計的に有意な差は認められなかったが ALP mRNA 発現のフォールドの変更をよりは、108 M 1,25-(OH)2D3グループで観察されたと負の値およびビタミン C グループ (p = 0.20 とpそれぞれ 0.52 を =)。

ALP は、初期細胞の骨分化作用を決定するための強力な指標です。ALP はまた無機ピロリン酸の分解の ectoenzyme として機能し、鉱化作用36中にリン酸を解放します。Pdc は、ビタミン C と扱われ、108と 109 M 1,25-(OH)2D3展示他のグループ (図 4 a) からのそれらと比較すると有意な差。

骨シアロタンパク質のメッセンジャー RNA 発現

文化の 1 週間後 BSP の mRNA の表現でフォールドの変更された 3.21 (SD = 1.20) と 4.18 (SD = 2.55)、10.34 (SD = 10.31) 24.91、(SD = 23.44) と 5.24 (SD = 3.54) ビタミン C と 1010、109、108、107 M 1,25-(OH)2D3グループ、それぞれ (図 4 b)。BSP mRNA 式は 108 M の 1,25-(OH) の2D の3グループが高かったが、他のグループ内の対応する式と比較して統計的意味がないと。

ビタミン C と 1010 M 1,25-(OH)2D3グループで BSP mRNA 発現が有意に高かった (p < 0.05) に比べてビタミン C や 1010 M を示す、他のグループの 1,25-(OH)23 D は、BSP 式を推進しました。コントロールは、1 の値に設定されました。ビタミン C と 1010 M 1,25-(OH)2D3グループそれぞれ 3.21 4.18 倍の BSP mRNA 発現の増加を展示しました。109 M と 108 M 1,25-(OH)2D3グループ、他のグループよりも上位の BSP mRNA 発現を出展しました。109と 108 M 1,25-(OH)2D3グループはそれぞれ、10.34 24.91 倍の BSP mRNA 発現の増加を展示したが、この増加は統計的に有意な (p ではないです。> 0.05)。可能な説明は、幹細胞はなかった同じ参加者から得られるすべて。したがって、潜在的な違いは SD を増加している可能性があります、したがって統計的結果を影響を受けます。

CBFA1 のメッセンジャー RNA 発現

文化の 1 週間後 CBFA1 mRNA 発現のフォールドの変更された 0.96 (SD = 0.10) と 0.90 (SD = 0.26)、1.01 (SD = 0.25)、1.31 (SD = 0.32) と 1.12 (SD = 0.35) ビタミン C と 1010、109108、107 M 1,25-(OH)2D3グループ、それぞれ (図 4 c)。108 M 1,25-(OH)2D3グループは高い CBFA1 の mRNA 発現を出展しました。CBFA1 mRNA 発現治療群または対照群で著明な変化は認められなかった。さらに、大幅な増加が認められなかったビタミン C や 1,25-(OH) の2D3の付加の後の mRNA のマーカーの表現で。さらに、集団間に有意差は認められなかった。

メッセンジャー RNA 発現コラーゲン 1

文化の 1 週間後のコラーゲン 1 mRNA 発現のフォールドの変更された 0.98 (SD = 0.17) 0.85 (SD = 0.16)、1.05 (SD = 0.16)、1.52 (SD = 0.36)、1.01 と (SD = 0.33) ビタミン C と 1010、109、108、107 M 1,25-(OH)2D3グループ、それぞれ (図 4 d)。コラーゲン 1 mRNA 発現が高かった 108 M 1,25-(OH)2D3グループが他のグループ内の対応する式と比較して統計学的に有意差。

108 M 1,25-(OH)2D3グループとコントロール グループの結果 (p < 0.05) に統計的有意差を出展しました。コントロールは、1 の値に設定されました。コラーゲン 1 mRNA 発現の 1.52-fold 増加が観察されました。1010 M 1,25-(OH)2D3と 108 M 1,25-(OH)2D3グループ (p < 0.05) 結果に有意な差を出展しました。

伝令 RNA の発現オステオカルシン

文化の 1 週間後 OCN mRNA 発現のフォールドの変更された 0.60 (SD = 0.1) と 0.78 (SD = 0.18)、1.13 (SD = 0.55)、2.59 (SD = 1.59)、1.61 と (SD = 0.73) ビタミン C と 1010、109108、107 M 1,25-(OH)2D3グループ、それぞれ (図 4e)。OCN の mRNA 発現が高かった 108 M 1,25-(OH)2D3グループが他のグループ内の対応する式と比較して統計学的に有意差。

有意な増加が認められなかった OCN mRNA のマーカーの表現でビタミン C や 1,25-(OH) の2D3の付加の後で。ただし、ビタミン C 治療後 OCN の mRNA 発現が減少しました。コントロールは、値を 1 に設定されました。基底の OCN 式は、骨芽細胞の分化 (p < 0.05) 0.6-fold 低下を展示しました。表現が有意に高かった (p < 0.001) 108 M 1,25-(OH)2D3で培養した細胞よりも対応する式で平均フォールドを展示した他のグループの OCN mRNA の増加します。2.59。 ただし、これらの結果がでませんでした (p > 0.05)。可能な説明は、幹細胞はなかったことすべての同じの参加者から得られました。したがって、潜在的な違いは SD を増加している可能性があります、したがって統計的結果を影響を受けます。

ALP 活性測定法

以前の研究実証その 1,25-(OH)2D3 108 M の濃度で最も効果的ですしたがって、108 M は負の 1,25-(OH)2D3の骨力、ビタミン C およびビタミン C + 1,25-(OH)2D3グループを比較するテスト グループで使用されました。骨の能力は、ALP 活性で表現しました。文化 (図 5 a) の 1 週間後 ALP 活性のフォールドの変更された 1.00 (SD = 0.00)、1.92 (SD = 0.89)、3.77 (SD = 1.66)、1.46 と (SD = 0.49) で負、C、D、および C + D、それぞれ。D および否定的なグループの間すべてのグループ間で統計的に有意な差が認められただけ (p = 0.03;図 5 a)。培養 2 週間後、alp (図 5 b) のフォールドの変更された 1.00 (SD = 0.00)、2.32 (SD = 1.68)、4.98 (SD = 3.02) と 4.86 (SD = 2.73) 負、C、D、および C + D でそれぞれ。任意のグループに有意差は認められなかった.文化の 3 週間後 alp (図 5 c) でフォールドの変更された 1.00 (SD = 0.00)、2.93 (SD 2.15)、5.76 (SD = 3.60)、および 5.61 メガ (SD = 3.88) 負、C、D、および C + D でそれぞれ。もう一度、グループ (図 5 c) のいずれかで統計的に有意な差は認められなかった。文化の 4 週間後 alp (図 5 d) のフォールドの変更された 1.00 (SD = 0.00)、2.83 (SD = 1.97)、3.79 (SD = 0.77) と 4.24 (SD = 2.87) で負、C、D、および C + D、それぞれ。ここでは、D と負のグループ展示に有意差 (p = 0.00;図 5 d)。

週 1 で 108 M 1,25-(OH)2D3グループのみ展示コントロール群と比較して有意差 (p = 0.03)。週 2 で 108 M 1,25-(OH)2D3とビタミン C グループ展示コントロール群と比較して有意差 (p = 0.0498)。週 3 のグループのどれもはコントロール群と比較して有意差を展示しました。週 4 で 108 M 1,25-(OH)2D3グループは対照群と比較して有意差を展示しました。これは、108 M 1,25-(OH)2D3昇格 ALP 活性を示した。

簡単に言えば、108 M 1,25-(OH)2D3グループ展示増加 ALP とコラーゲン 1 mRNA 発現;ビタミン C 群を大幅に強化された ALP 展示と BSP mRNA 発現;109 M 1,25-(OH)2D3グループが大幅に強化された ALP 発現を展示します。週 1、ビタミン C と 1,25-(OH) の2D3グループが他のグループに対応する表現のレベルと比較して統計学的に有意差 ALP 活性の増加が観察されました。4 週 2 日からビタミン C と 1,25-(OH)2D3グループは、同様の結果を展示しました。したがって、これらの結果はことができる (alp) 細胞の骨分化誘導のビタミン C と 1,25-(OH)2D3の相乗効果を明らかないです。

Figure 1
図 1: 人間の歯槽骨膜。骨膜の組織は、口腔外科の間に収穫されました。アスタリスクは、歯槽骨膜の場所を表します。

Figure 2
図 2: 分化研究。MSCs 紡錘状の不規則なプロセスと、初代培養の 1-3 d の後培養皿にしっかりと接続されている (A; アスタリスクの間葉系幹細胞の場所)。MSCsの in vitroの培養条件下で subpassaged、骨芽細胞へと分化 (B黒印はコッサ染色領域)、軟骨細胞 (C、青色のアスタリスクを示す染色領域アルシアン ブルー) と脂肪細胞 (D、ピンクのアスタリスクは、染色領域を示しますオイル赤い O)。図 2は、生物医学研究国際、ボリューム 2016年、記事 ID 352956125から再利用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: フローサイトメトリーします。表面マーカー MSCs によって表現された CD73 (65.2%)、CD90 (75.6%)、STRO 1 (65.2%) と CD44 (88.1%) ない CD45 が (1.34%)、CD34 (1.61%)、CD19 (2.18%)、または HLA-DR (2.20%)。「%」の図では、陽性率を示します。コントロールのグループ (α MEM と 5 %fbs) 赤い線で表されます。実験グループは、青線で表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: mRNA 発現。第 1 週の骨芽細胞分化の mRNA の表現。(A) (B) の高峰 BSP, CBFA1 (C), (D) コル-、および (E) OCN。p < 0.05 が *、 p < 0.01 は* *、p < 0.001 は * * *。MRNA のフォールドの変更は制御対 (α MEM と 5 %fbs)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: アルカリフォスファターゼ。アルカリ性ホスファターゼ活性は 3、および第 4 週 (D) (A) の骨芽細胞分化の第 1 週、第 2 週 (B)、(C) 週に試金します。p < 0.05 は、 *、p < 0.01 は * *、 p < 0.001 は * * *。フォールドの変更は制御対 (α-MEM、5 %fbs)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

最近開発された治療法、すなわち組織の必然的には、工学的には、多数の利点があります。組織のいくつかの種類に含まれる MSCs は、さまざまな機能の中胚葉性組織細胞37に区別することができる多能性細胞、骨芽細胞など他のセルです。

前駆細胞のためのニッチとして骨膜と骨の豊富な血管の供給としてそれは38を包み込みます。34 調査サンプルの私たちの研究では 20 正常に分離を成功させる率 58.8%、MSC のコロニーが得られました。MSCs 骨膜由来は本研究で増殖、骨分化能力に基づいて選ばれました。骨髄間質細胞22より骨膜由来細胞の増殖率が高かった。骨膜の骨形成系の能力については、Ousual24は、BMSCs の骨膜由来幹細胞 (PMSCs) の骨形成促進能力が劣ったと主張しました。しかし、吉村は PMSCs の骨の能力が BMSCs39のそれを上回ることを証明しました。林。骨組織再生24のための理想的な候補者として骨膜アダルト MSCs を示した。また、骨膜のアダルト MSCs と見なされます細胞培養期間の短縮に有用なコストと汚染22のリスクの両方を減らします。報道によると、高齢化も40骨原性細胞の細胞増殖活性に影響します。1,25-(OH)2D3誘導の hMSCs 若い参加者 (高齢者 < 65 y)41からの培養骨芽細胞分化の刺激度の高い研究が報告されました。本研究には、若い大人 (高齢者 < 65 y) から得られる骨膜細胞の使用が関与しています。さらなる研究は、老いも若きドナー間骨膜由来細胞の骨再生能力を比較する必要があります。

本研究では細胞集団が分離されたそのプラスチック付着特性に基づくエアフルトによる記述で。13。 ここで収穫、Pdc 携帯文化プラスチックに付着。これらの初代培養細胞の表面抗原の esenchymal マーカー (73 CD、CD 90、STRO-1、および CD 44) は、重要な表現を展示しました。さらに、造血のマーカー (CD 45、CD 34、CD 19、および HLA-DR) は不在、培養細胞は、間葉系の起源を示すだった。Pdc の骨、軟骨、脂肪細胞の分化は、歯肉組織と骨髄42から得られたサンプルの評価他の調査で説明されているように特定の分化のメディアを使用して誘導でした。本研究の結果は、細胞療法4国際社会によって受け入れられる人間の MSCs の表現型および機能定義の最小基準を遵守します。本研究では人間の骨膜から MSCs が分離・拡大、通常 BMSCs の説明したような特性を明らかにしました。

研究は、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸による骨分化43を受ける BMSCs を引き起こすことを提案しています。別の調査では、アスコルビン酸推進幹細胞分化44との組み合わせで、1 α, 25-ジヒドロキシ D3 (1,25-(OH)2D3) を示した。したがって、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸は、この研究で幹細胞の分化を促進するために追加されました。観察されるパターン 3 つの患者の細胞サンプルに類似していた。本研究では、MSCs が正常に歯槽骨膜から 58.8% の分離率で識別されます。年齢・性別・場所に関して成功率で統計的に有意な差は認められなかった。

実験的検討した 2 つの物質、すなわち 1,25-(OH)2D3とビタミン C、どちらが幹細胞の骨分化を刺激します。2008 研究45 1,25-(OH)2D3骨代謝とカルシウムの恒常性のため非常に重要です、まだ完全に理解するためのメカニズムを通じて心血管系に影響を与えることを示した。別前研究46, 1,25-(OH)2D3は骨芽細胞の人間の in vitro分化を刺激しました。未分化 BMSCs培養骨芽細胞様細胞への分化誘導を誘導する 1,25-(OH)2D3の能力は、様々 なシステム46を探索するいくつかの研究で実証されています。骨芽細胞様細胞の培養に追加、1,25-(OH)2D3細胞増殖を抑制するが ALP、オステオポンチン、OCN、マトリックス Gla など骨芽細胞マーカーの発現を増加させるいくつかの調査は示したもタンパク質47,48。以前の研究報告 1,25-(OH)2D3は通常細胞の増殖を抑制して49骨芽細胞分化を誘導します。1 つは、体外のマウス細胞で行わ研究 1,25-(OH)2D3が osteoblastogenesis9の初期段階を促進することが示されています。さらに、別の in vitro研究は、初期および後期の MSCs,1,25-(OH) に、2D3が ALP、オステオポンチン、BSP、および OCN43を含む骨分化マーカーを刺激できる提案しました。

両方の OCN-マトリックス合成の制御に責任がある考慮 — とコラーゲン 1A1-最も豊富なマトリックス蛋白質 — が重要な酸性骨マトリックスの合成に重要な役割を果たす基質タンパク質。さらに、特徴的な成熟したマトリックス形成骨芽細胞です。50前の調査報告増加コラーゲン 1A1 式がない CBFA1 や ALP 遺伝子式341,25-(OH)2D3治療を刺激しています。骨芽細胞の分化に関与する遺伝子の評価は、1,25-(OH)2D3治療が OCN51,52,53発現を増加したことを明らかにしました。本研究の結果は、1,25-(OH)2D3貪食に肯定的な効果を発揮します。他のグループと比較して、10− 8 M 1,25-(OH)2D3は、ALP、BSP、CBFA1、OCN、Col1 の mRNA 発現の増加を示した。これらのうち、ALP、Col1 の結果は統計的有意性を達した。したがって、10− 8 M 1,25-(OH)2D3を使用する場合、最適の条件が得られました。10− 10 M 1,25-(OH)2D3グループで有意に増加した (p < 0.05) mRNA 発現、BSP。ただし、CBFA1 と OCN の mRNA 発現のフォールドの変更で統計的に有意な差は認められなかった。遺伝子の mRNA の発現を確認するとき、実験の結果は体外培養を示されます。これらの知見は、骨形成の負の観察に基づいてビタミン C と 10− 10、10− 9、10−7 M 1,25-(OH)2D3グループは 10− 8 M 1,25-(OH)23 D に弱いものグループ。これらの結果は、鉱化作用 (コラーゲン 1A1) に必要なマトリックス蛋白質 1,25-(OH)2D3が骨折で Pdc を素数憶測につながった。

以前の研究は、1,25-(OH)2D3OCN 式52を著しく高めたの標的として OCN を報告しました。OCN 蒸着は、Pdc の骨分化誘導のためのマーカーとして見なすことができます。また、OCN 式は遅い骨マーカー54として評価されています。OCN は、骨形成と骨55の信頼できるマーカーです。したがって、OCN 式一般に細胞の無機化能力に関連します。OCN は、成熟した骨芽細胞の敏感なマーカーです。比較のため、培養骨 10− 8 M 1,25-(OH)2D3グループ著しく上昇 OCN mRNA 発現が観察されました。

ALP 活性がトランスフォーミング増殖因子 β (0.1-10 ng/mL) によって阻害され、1,25-(OH)2D3促進された 1 つの研究で示された (50 nM)46。その 10− 8 M 1,25-(OH)2D3幹細胞の成熟や骨の開発を促進することが示唆されました。ビタミン c の対応する濃度で 10− 8 M 1,25-(OH)2D3の最適な観測された濃度で ALP 活性を比較しました。Pdc は、ALP 活性を示した。また、1,25-(OH)2D3添加は ALP 活性し、Pdc の骨芽細胞分化を促進します。すべての 3 つの設定、ビタミン C、10− 8 M 1,25-(OH)2D3、およびビタミン C + 10− 8 M 1,25-(OH)2D で3週間 1 (図 4 a)、2 (図 4 b)、3 (の ALP 活性を増加図 4 c)、および 4 (図 4 d) 陰性対照群と比較していくつかの倍で。週 1 と 4 は、ALP 活性は 10− 8 M 1,25-(OH)2D3グループで大幅に増加。週 2 で ALP 活性はビタミン C と 10− 8 M 1,25-(OH)2D3グループで大幅に増加。

通路 3、様々 な人間の MSCs の比較研究を通じて坂口56は、BMSCs と PMSCs が骨と同様の能力を有していることを発見しました。したがって、細胞培養期間は順番、コストと汚染のリスクを減らすこと骨膜細胞を用いた短縮可能性が高い。早期成立 hMSCs の使用は、文化の拡張の老化の影響を回避できます。Ousual と吉村、2 週間培養条件35通路 3 と継 MSCs を使用しました。そのため、様々 な細胞源の細胞の活動を比較するときは、通過時間を考慮する必要があります。本研究では第三世代 Pdc は Pdc の後の世代の幹細胞の骨形成促進の可能性は第三世代 Pdc の幹細胞のそれよりも低いので、使用されました。

ひと血清培地で培養した場合骨膜幹細胞だけでなく、形を保ってができます添付、活動を維持、細胞の成長を達成するため。要約すると、これらの結果に基づき、人間 Pdc は存続し、増殖、分化骨系統、体外体内の有効性の評価に重要である機能を所有しています。MSCs で骨膜、組織工学用に最適です。歯肉から得られる骨膜は、少ない合併症を引き起こします。したがって、歯槽骨は、理想的なドナーサイトと見なされます。結果は明らかに同様に骨膜から MSCs を分離し、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化を達成するための可能性を示した。本研究では Pdc の骨電位に及ぼすビタミン C はさまざまな濃度で 1,25-(OH)2D3と比較しました。最も効果的な濃度は 10− 8 M 1,25-(OH)2D3だった培養期間を通して 10− 8 M 1,25-(OH)2D3治療 Pdc による骨分化を誘導する効果的かつ経済的な方法であった。結論としては、ビタミン C と 1,25-(OH)2D3 Pdc の骨分化を促進します。ただし、これらは ALP 活性の結果に有意な相乗効果を起こしません。小さなサンプル サイズを考慮した追加のサンプルは、さらなる評価のため必要があります。したがって、骨条件で培養した Pdc 可能性があります骨の組織工学に有用である、高い細胞拡散の利点を提供します。

このプロトコルの重要なステップは、1.2 と 1.3 の手順を含める (収穫後 24 時間以内培養プロシージャを開始、その後適切なメンテナンス)。組織の汚染を避けるべきし、無菌技術の使用は必須です。このプロトコルの制限の 1 つは、骨髄や脂肪組織から幹細胞をソースと比較して、このテクニックを通して得ることができる細胞数が少ないに制限が歯牙組織からの幹細胞を調達します。

同定と骨膜幹細胞の解析機能と再生療法の適用と同様に、この組織の再生の可能性に関する貴重な情報を提供できます。最適な条件は、10− 8 M 1,25-(OH)2D3を使用して得られました。したがって、10− 8 M 1,25-(OH)2D3と Pdc の治療は、骨分化を促進します。将来の研究は、10− 8 M 1,25-(OH)2D3のための効果的かつ経済的な骨再生の生体内でアプリケーションを調べる必要があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

研究プロトコルは、臨床研究の長庚記念病院 (IRB99 1828B、100 3019 C、99 3814B、102-1619 C、101-4728B、および 103-4223 C) の制度上の審査委員会によって承認されました。本研究は、長庚記念病院 (CMRPG392071、CMRPG3A1141、CMRPG3A1142、および NMRPG3C0151) によって支えられました。この原稿は、ウォレス学術編集することによって編集されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9, (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53, (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27, (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122, (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65, (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics