Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nous présentons un protocole visant à enquêter sur les biomarqueurs d’expression ARNm de cellules dérivées de périoste (PDC) induites par la vitamine C (vitamine C) et 1, 25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont présentes dans divers tissus et peuvent être différenciés dans nombreux types de cellules, y compris les ostéoblastes. Parmi les sources dentaires de MSCs, le périoste est un tissu facile d’accès, ce qui a été identifié pour contenir les MSCs dans la couche de cambium. Toutefois, cette source n'a pas encore été largement étudiée.

Vitamine D3 et 1,25-(OH)2D3 ont été démontrés pour stimuler la différenciation in vitro de MSCs en ostéoblastes. En outre, vitamine C facilite la croissance cellulaire osseuse et de la formation de collagène. Cependant, aucune étude n’a encore étudié les effets de la vitamine D3 et la vitamine C sur MSCs.

Nous présentons ici une méthode permettant d’isoler les MSCs du périoste alvéolaire humaine et examiner l’hypothèse que 1,25-(OH)2D3 pourraient exercer un effet ostéo-inducteurs sur ces cellules. Nous avons également enquêter sur la présence de MSCs dans le périoste alvéolaire humaine et évaluer la prolifération et l’adhérence de cellules souches. Pour évaluer la capacité de la vitamine C (sous forme de contrôle) et de diverses concentrations de 1,25-(OH)2D3 (1010, 109, 108et 107 M) pour influer sur les biomarqueurs d’ARNm clés dans MSCs ARNm isolés de la phosphatase alcaline (ALP), OS sialoprotéine osseuse (BSP), liaison de base le facteur alpha-1 (CBFA1), collagène-1 et ostéocalcine (OCN) sont mesurés à l’aide de la PCR en temps réel (RT-PCR).

Introduction

Bien que les nombreuses techniques pertinents ont été développés ces dernières années, os des restes de reconstruction limité par des contraintes multiples et estimer que l’étendue de la nécessaire reconstruction est souvent impossible. Augmentation des tissus-dur est requis pour atteindre les objectifs esthétiques et fonctionnels en plus un taux de réussite à long terme favorable. Méthodes couramment utilisées pour ces procédures comprennent une greffe osseuse autogène et allogène, xénogreffe et alloplastique une greffe osseuse. Parmi les différents types de greffe osseuse, greffe osseuse autogène est considérés comme les plus efficaces. Cependant, morbidité site donneur, vascularisation compromise et de disponibilité limitée de tissus1 ont été des inconvénients majeurs pour une greffe osseuse autogène. En outre, la greffe osseuse allogénique et xénogreffes ont été associés à la transmission de la maladie. Actuellement, les greffons osseux synthétiques sont largement utilisés pour résoudre ces problèmes. Cependant, avec leur manque de potentiel ostéogénique, résultats cliniques varient considérablement. Des matériaux tels que la cellulose sont associés aux fluctuations de volume, infection et un manque de force.

Augmentation osseuse à l’aide de génie tissulaire a suscité un vif intérêt. Dans cette technique, cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement utilisées pour promouvoir la différenciation ostéoblastique, qui sont ensuite repiqués sur le site de la perte osseuse pour réaliser la réparation osseuse. Cette procédure est actuellement appliquée en thérapie cellulaire. Réalisation de reconstruction osseuse par l’extraction d’une quantité limitée de tissus est plus simple et moins invasive par rapport aux autres méthodes.

Le rôle potentiel de MSCs comme un outil pour des thérapies à base cellulaire visant à régénération dentaire est un intérêt émergent entre les divers groupes de recherche. Des études ont confirmé que MSCs peuvent différencier les types de tissus : la moelle osseuse, membrane adipeuse, synovial, pericyte, l’OS trabéculaire, cordon ombilical humain et tissus dentaires2,3. Les sources communes de MSCs comprennent la moelle osseuse, tissu adipeux et les tissus dentaires. Comparé avec MSCs provenant du tissu adipeux et de la moelle osseuse, les avantages des cellules souches dentaires sont un accès facile et une morbidité moindre après la récolte. Par rapport aux cellules souches embryonnaires, MSCs provenant de tissus dentaires apparaissent nonimmunogenic et ne sont pas associées à des préoccupations éthiques complexes3.

En 2006, la société internationale de thérapie cellulaire recommandé d’utiliser les normes suivantes pour identifier les MSCs : tout d’abord, MSCs doivent être capables d’y attacher au plastique. Deuxièmement, MSCs doivent être positive pour les antigènes de surface CD105 CD73 et CD90 et négative pour les marqueurs pour les monocytes, macrophages et cellules B en plus des antigènes hématopoïétiques CD45 et CD344. Comme un critère final, MSCs doivent être en mesure de différencier en trois types de cellules dans des conditions normales de la différenciation in vitro : les ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes,4. A ce jour, six types de cellules souches dentaires humaines ont été isolés et caractérisés. Le premier type a été isolé à partir de tissu humain pulp, appelée pulpe dentaire postnatal cellules souches5. Par la suite, trois autres types de MSCs dentaires ont été isolés et caractérisés : cellules souches provenant de dents caduques exfoliée6, le ligament alvéolo-dentaire7et la papille apicale8. Plus récemment, de dérivés de follicule dentaire9, de dérivés de tissus gingivaux10, bourgeon dentaire tige cells(DBSCs)11et kyste périapical MSCs (hPCy-MSCs)12 ont également été identifiés.

Château Friedenstein fut le premier à définir MSCs13. MSCs présentent une prolifération haute potentielle et peuvent être manipulés pour différencier avant d’être transplanté, qui suggère qu’ils sont des candidats idéaux pour des procédures régénératrices10.

Bien que la plupart des études utilisent la moelle osseuse comme une source de cellules souches, cellules dérivées de périoste (PDC) ont également été récemment utilisé14. Le périoste est plus facilement accessible que ce qui est de la moelle osseuse. Par conséquent, dans cette technique, nous utilisons périoste alvéolaire pour éliminer le besoin pour les incisions supplémentaires pendant la chirurgie et à réduire la morbidité post-opératoires chez les patients. Le périoste est un tissu conjonctif qui forme la paroi extérieure des os longs et se compose de deux couches distinctes : la couche fibreuse externe composé de fibroblastes, collagène et fibres élastiques15et la couche intérieure riche en cellules cambium en contact direct avec la surface osseuse. La couche de cambium abrite une population de cellules mixtes, principalement les fibroblastes16, ostéoblastes17, péricytes18et une sous-population critique identifié sous MSCs19,20,21. La plupart des études ont rapporté que PDC est comparables, voire supérieurs, à des cellules souches issues de la moelle osseuse (BMSC) en os de guérison et de régénération22,23,24. Le périoste est facilement accessible et expositions excellente efficacité régénératrice. Cependant, peu d’études ont porté sur le périoste25,26,27.

Concernant la réparation osseuse, la pratique clinique actuelle implique la transplantation de cellules progénitrices périostique amplifié dans les échafaudages favorables. Des études récentes ont mis l’accent sur l’acquisition de cellules souches dans des régions défectueuses et utilisant des cellules souches pour la régénération de tissu20. Dentistes a également anticipent l’application future de la régénération osseuse parodontale en traitements parodontaux et implants dentaires. Au sujet du site donneur, le périoste peut être facilement récolté par les chirurgiens dentistes généraux. Cela se compare favorablement contre les cellules stromales de la moelle, comme le périoste sont accessibles au cours de la chirurgie buccale systématique. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’établir un protocole pour la récolte de PDC et d’évaluer la morphologie, la viabilité et la prolifération des cellules souches humaines périoste.

Métabolites de la vitamine D affectent l’in vivo minérale de l’OS équilibre dynamique. Une étude a indiqué que 24R,25-(OH)2D3 forme active de vitamine D est essentielle à la différenciation ostéoblastique des humains MSCs (CSM)28. L’homéostasie osseuse et la réparation sont réglementés par un réseau de vitamine D3 métabolites, dont 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) est la plus biologiquement active et pertinente dans la régulation de la santé des os. Vitamine D3 est essentiel pour la calcification29. Dans une étude sur des souris de Kunming blanc 2-d-ancien, les corps embryoïdes chez les souris ont indiqué que les suppléments de vitamine C et de vitamine D de promouvoir efficacement la différenciation des ostéoblastes dérivés ESC30. Parmi ses autres activités biologiques, 1,25-(OH)2D3 stimule la différenciation in vitro des CSM d’ostéoblastes, qui peuvent être surveillés basées sur l’augmentation dans l’activité de l’enzyme phosphatase alcaline (ALP) ou le gène de l’OCN expression.

Peu d’études ont détecté une relation dose-effet des traitements combinés avec la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 aux humains PDC en mettant l’accent sur l’ingénierie tissulaire osseuse. Par conséquent, dans cette étude, nous examinons les concentrations optimales pour un traitement simple ou combiné de 1,25-(OH)2D3 et vitamine C pour induire la différenciation ostéogénique du PDC humaine. Ce protocole vise à déterminer si une population de cellules isolée du périoste alvéolaire dentaire contient des cellules avec un phénotype MSC et de savoir si ces cellules peuvent être élargis dans la culture (in vitro) et différenciées pour former le tissu désiré . En outre, nous évaluons la capacité de PDC à se différencier en ostéocytes, les chondrocytes et les adipocytes. La deuxième partie de l’étude évalue les effets de la vitamine C et de 1010, 109, 108et 107 M 1,25-(OH)2D3 sur l’activité ostéogénique du PDC. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer les fonctions de la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 au cours de la différenciation ostéoblastique des PDC par activité de l’ALP et pro-ostéogénique gènes, tels que de l’ALP, collagène-1, OCN, BSP et CBFA1. En outre, cette étude détermine les conditions optimales ostéo-inducteurs pour PDC humain basé sur ces résultats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le protocole de l’étude a été approuvé par le Conseil institutionnel d’examen de Chang Gung Memorial Hospital. Tous les participants eu consentement éclairé.

1. préparation du tissu

  1. Récolter les tissus périostique de patients au cours de la chirurgie dentaire (Figure 1). Après réflexion de Rabat sous anesthésie locale, prenez un morceau de tissu du périoste de l’os alvéolaire, à l’aide d’un séparateur périostique31.
  2. Après la récolte, rangez les tranches de tissus périostique d’environ 5 mm x 2 mm dans de Dulbecco tamponné phosphate salin (SPD) avec 300 U/mL de pénicilline et 300 mg/mL de streptomycine. Transférer les tissus au laboratoire dans les 24 heures.
  3. Émincer les fragments de tissus périoste alvéolaire avec scalpels jusqu'à ce que bien hachées et de conserver les échantillons dans un milieu passage 0 (composé de 300 U/mL de pénicilline et de 300 mg/mL de streptomycine, α-MEM et 5 % sérum de veau fœtal [BF]) mis en culture dans un incubateur à 37 ° C avec air humidifié (5 % de dioxyde de carbone). Dans l’incubateur, préparer un bassin d’eau pour maintenir l’humidité.
  4. Changer le support après 3 jours et deux fois par semaine par la suite.
  5. Lorsque les cellules ont atteint préconfluence (80 %), libérer les cellules adhérentes avec 200 µL de 0,25 % de trypsine dans l’incubateur (37 ° C) pendant 3 min et ensuite utiliser 4,5 mL de milieu pour mettre fin à la réaction.
  6. Les cellules à nouveau dans un milieu frais passage 1 sur plaque (α-MEM, 10 % FBS, 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine 100 μg/mL). La plaque est de 5 × 103 cellules (comme comptées par un hémocytomètre).
  7. Effectuer chaque passage ultérieur après que les cellules atteindre 80 % confluence31.
    Remarque : Au début, le milieu sera rouge orange. Après environ trois jours, la couleur moyenne doit passer à une teinte jaunâtre. Le temps de doublement des cellules est d’environ 30 à 40 h, qui ont besoin de 7 jours pour 3 à 5 générations.
  8. Culture du PDC isolé en α-MEM additionné de 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2).
  9. Observer la croissance cellulaire par jour et remplacer le milieu de croissance deux fois par semaine. Utiliser des cellules de la troisième à cinquième-génération pour toutes les autres expériences.

2. cytométrie en flux

  1. 1 × 106 cellules par l’intermédiaire de la digestion trypsique de récolte :
    1. Ajouter 200 µL de 0,25 % de trypsine. Après 3 min, utiliser 4,5 mL de milieu de culture contenant FBS pour mettre fin à la réaction de la trypsine et collecter par centrifugation (1500 tr/min, 5 min, 22 ° C).
    2. Laver les granules cellulaires trois fois à l’aide de 1 x DPBS. Remettre en suspension les cellules dans 200 µL 1 x tampon perméabilisation. Compter les cellules avec un hémocytomètre.
  2. Examiner les marqueurs de surface exprimées exprimés de la PDC à écoulement cytometry (fluorescence-lancée de cellules tri)32. Utiliser des anticorps monoclonaux (ACM) contre CD19 (isothiocyanate de fluorescéine (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (phycoérythrine [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) et HLA-DR (FITC)32.
    1. Ajouter les anticorps pour les échantillons et de la culture dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.
    2. Laver les cellules avec 1 x DPBS trois fois.
    3. Fixer les cellules à l’aide de 2 % de formaldéhyde et aller de l’avant avec écoulement cytometry analyse32.

3. fixation et viabilité avec ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques différenciation de cellules

Induire la différenciation dans les cellules en ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques lignages en cultivant des cellules périostique dans tous trois passages sur six plats avec les médias de différenciation spécifique.

  1. Pour une différenciation ostéogénique, culture des cellules en α-MEM à une densité de 5000 cellules par puits sur plaques 6 puits culture.
    1. Sur la réalisation de confluence de 80 %, de la culture des cellules dans des milieux contenant 5 %, α-MEM FBS, β-glycérophosphate (10 mM), 10−7 M dexaméthasone (0,1 mM) et 5 mL d’acide ascorbique (100 uM). Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.
    2. Modifier les médias deux fois par semaine.
    3. Après 4 semaines, évaluer le potentiel des cellules à se différencier en une lignée ostéogénique par coloration des cellules à l’aide d’un test de von Kossa, qui distingue la présence de dépôts calcifiés dans une culture33.
      1. Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Moins de 30 min, ajouter 5 % de nitrate d’argent et de traiter sous lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h à température ambiante.
      2. Ajouter 5 % Na2donc4 quatre fois, permettant à 3 min de chaque réaction. Enfin, laver les cellules deux fois avec de l’eau distillée.
        NOTE : Von Kossa coloration est une réaction de précipitation où les ions d’argent et de phosphate réagissent en présence de matières acides ; Cette technique de coloration n’est pas spécifique au calcium. Dans cette étude, lorsque les cellules étudiées ont été traités avec la solution de nitrate d’argent, calcium — qui est réduite par la forte lumière UV — a été remplacé par l’argent, qui est devenue visible comme argent métallique.
  2. Pour la différenciation adipocytaire, la culture des cellules à une densité de 5000 cellules par puits sur des plaques de culture de six puits contenant des α-MEM.
    1. Sur la réalisation de confluence de 80 %, de la culture des cellules dans un milieu contenant des α-MEM, 5 % FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (100 mg/mL), 1 % de pénicilline, 10−6 M dexaméthasone (1 mM), l’insuline (5 mg/mL) et l’indométhacine (60 mM).
    2. Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.
    3. Après 6 à 9 semaines, utiliser huile O rouge pour colorer les cellules et de mettre en évidence les baisses de lipides, déterminant ainsi la présence de différenciation adipocytaire33:
      1. Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Moins de 30 min, détachant les cellules contenant 0,5 % d’huile rouge O à température ambiante pendant 10 min et puis laver les cellules trois fois avec de l’isopropanol 60 % pendant 3 min chaque fois ; Enfin, laver les cellules avec de l’eau distillée.
        Remarque : L’huile rouge O est un colorant diazoïque (liposolubles) de lysochrome utilisé pour la coloration des lipides neutres, principalement des esters de triacylglycérols, lipoprotéines et cholestérol. La teinture se dissout dans les gouttelettes de lipides dans la cellule, en tournant les gouttelettes lipidiques rouge.
  3. Pour la différenciation des chondrocytes, cellules de culture sur plaques 6 puits culture avec chaque cupule contenant 5000 cellules.
    1. Ajouter une différenciation moyenne contenant α-MEM, 5 % FBS, 10−7 M dexaméthasone (0,1 mM), le pyruvate de sodium (100 µg/mL), insuline-transferrine-sélénium-A (1 × STI), facteur de croissance transformant-β (10 ng/mL) et 5 mL d’acide ascorbique (100 µM).
    2. Le contrôle négatif dans les médias consistant α-MEM et 5 % de la culture FBS.
    3. Après 4 à 5 semaines, utiliser une coloration pour mettre en évidence les polysaccharides acides, tels que les glycosaminoglycanes ou certains types de mucopolysaccharides, dans le cartilage des cellules pour déterminer la présence de chondrocytes différenciation33bleu Alcian.
      1. Ajouter 10 % de formol pour la fixation. Dans les 30 minutes, ajouter 3 % d’acide acétique et laisser 2 min pour la réaction. Par la suite, laver à l’eau distillée trois fois, ajouter 1 % bleu Alcian 8GX incubé pendant 30 min et puis laver à l’eau distillée. Enfin, ajouter l’acide acétique à 3 % et lavage pendant 3 min et puis laver à l’eau distillée pour finir.
        NOTE : Les parties de la cellule qui tachent plus précisément par ce colorant devient bleu à bleu-vert après coloration et sont appelés « alcianophilic ».

4. effets des 25-dihydroxyvitamine D3 (1,25-(OH)2D3) sur l’ostéogenèse

  1. Diviser le P3 à P5 PDC en six groupes et culture sur plaques 6 puits avec différents milieux de culture :
  2. groupe négatif (α-MEM et 5 % FBS) ;
  3. Groupe de la vitamine C (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C) ;
  4. et 10−7 M 1,25-(OH)2D3 groupe (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Ajouter 2 mL de milieu dans un incubateur (37 ° C) dans chaque puits et modifier le milieu deux fois chaque semaine.

5. reverse Transcription/Quantitative PCR en temps réel

  1. Après 7 jours de différenciation ostéoblastique, isoler l’ARN total sur la glace en utilisant un réactif commercial (voir Table des matières) :
    1. Ajouter 1 mL de réactif de l’isolement dans chaque puits. Ajouter 200 µL de bromochloropropane et laisser pendant 10 min générer des couches RNA et puis centrifuger à 10 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C.
    2. Après centrifugation, ajouter 500 µL de propanol-2 à 500 µL du surnageant contenant RNA. Précipiter l’ARN sur la glace et laisser 15 min pour la réaction.
    3. Après l’intervention, centrifuger à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C, après quoi l’ARN se trouve au fond du tube. Par la suite, retirez le surnageant à l’aide de 1 mL d’alcool à 75 % pour le lavage et centrifuger à 7 500 tr/min pendant 8 min à 4 ° C.
    4. Retirez le surnageant et utiliser une pompe à vide pour produire l’ARN à partir du fond du liquide. Récupérer l’eau.
  2. Marche arrière transcrire l’ARN (1 μg) à l’aide de myéloblastose aviaire virus la transcriptase inverse. Définir la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de fonctionner à 25 ° C pendant 10 min, suivie de 50 ° C à 60 min, puis 85 ° C pendant 5 min, avant de finalement conserver à 4 ° C.
  3. Synthétiser les premier-brin d’ADN complémentaire (ADNc). Effectuer la PCR quantitative (qPCR) utilisant 5 μL de 01:10 dilué cDNA. Conduite de RT-PCR quantitative (qRT-PCR) en utilisant des amorces pour ALP, BSP, OCN, CBFA1 et collagène-1.
    Remarque : Pour éviter toute contamination de l’ADN par les signaux, les séquences avant et arrière de chaque amorce ont été conçus sur exons distinctes.
  4. Effectuer qPCR en utilisant un maître de PCR commercial mélanger (voir Table des matières) conformément aux instructions du fabricant. Définir le thermocycleur à 50 ° C pour 2 min suivie de 95 ° C pendant 10 min et puis 40 cycles chacun à 95 ° C pendant 15 s suivie de 60 ° C pendant 60 s.
    Remarque : Le protocole SYBR nécessite également une étape de courbe de fonte, exécutée à 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, puis à 95 ° C pendant 15 s.
  5. Normaliser les valeurs de seuil de cycle pour ALP, BSP, CBFA1, collagène-1 et OCN à celui du ménage gène GAPDH. 34
  6. Paires d’amorces sont énumérés dans la Table des matières.

6. alcaline Phosphatase activité

  1. Évaluer l’activité enzymatique ALP des cellules à l’aide de la technique décrite précédemment35, qui convertit le p- nitrophényl phosphate de p- nitrophénol ; p- nitrophényl phosphate est un substrat de phosphatase qui vire au jaune quand déphosphorylé par ALP, tel que déterminé à une longueur d’onde de 405 nm. Normaliser le total p- nitrophénol formé basé sur les protéines totales, tel que déterminé par l’analyse de Bradford.
  2. Comparer les activités de l’ALP du contrôle (α-MEM, 5 % FBS), vitamine C (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM, 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM et 10−7 M dexaméthasone + 10−8 M 1,25-(OH)2D3) et vitamine C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5 % FBS, β-glycérophosphate de 10 mM, 10−7 M dexaméthasone + 100 uM vitamine C +1,25-(OH)2D3) groupes après la semaine 1, 2, 3 et 4, de la culture.
  3. Effectuez une procédure d’extraction de protéine sur la glace :
    1. Grattez les cellules des plaques 6 puits et ajouter 50 µL de tampon de lyse. Par la suite, placer les cellules sur la glace pendant 30 min détruire les cellules et libérer la protéine.
    2. Après 30 min, centrifuger à 13000 tr/min à 4 ° C pendant 15 minutes. Après centrifugation, extraire le surnageant pour le stockage et l’utiliser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pour tous les dosages quantitatifs, les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (SD). Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de Student t-test. Au total, 34 échantillons ont été obtenus avec un âge moyen de participants de 48,1 ± 12,3 y. onze de ces échantillons provenaient de patients de sexe masculin et 23 de patientes. Vingt-huit échantillons ont été prélevés les régions molaires et 6 par les régions antérieures ; 26 ont été extraites de la maxille et 8 de la mandibule. La durée moyenne entre le soin dentaire et de la culture était 0,5 ± 0,1 h. Des 34 échantillons étudiés, 20 a avec succès fourni colonies MSC, avec un taux de réussite de l’isolement de 58,8 %. Pas de différences significatives ont été observées dans les paramètres entre l’avec succès et la PDC en vain isolés (âge moyen : 48,8 ± 13,0 contre 47,1 ± 11,5 ans, sexe : 7 hommes [35 %] vs 4 hommes (28,6 %), emplacement : 15 des régions molaires [75 %] vs 13 [92,9 %] et 15 de le maxillaire [75 %] vs 11 (78,6 %), respectivement).

Isolement et la morphologie des cellules : ostéogénique, chondrogéniques et la différenciation adipocytaire

Jours 1-9, PDC formée de colonies et grappes sphériques. La plupart des cellules présentaient une apparence de broche et étaient homogènes sous un microscope à contraste de phase (Figure 2). Après 14 jours de culture, la morphologie des cellules est apparu fusiforme tel qu’observé au microscope à contraste de phase. À la suite les cellules de première génération, les cellules ne sont plus a grandi en grappes mais exposées prolifération généralisée et uniforme.

Les CSM étaient fusiforme avec des procédés irréguliers et fermement attaché à la boîte de Petri après 1-3 jours de culture primaire (Figure 2 a). La culture initiale exposé petit, autour de cellules et les cellules fusiformes au microscope optique. Les cellules cultivées présentaient une forme homogène, fibroblastes comme axe du premier passage (Figure 2 a). L’étude de la différenciation a révélé que le PDC pourrait être subpassaged et différenciées in vitro en ostéoblastes (Figure 2 b), les chondrocytes (Figure 2c) et les adipocytes (Figure 2d).

À la fin de la différenciation ostéogénique, von Kossa coloration indique la présence de dépôts de calcium et de la différenciation ostéogénique (Figure 2 b). Ces résultats indiquent fortement que parmi les populations de cellules périostique, cellules progénitrices présentent la possibilité de se différencier en cellules ostéogéniques.

Pour évaluer la production des protéoglycanes, teinté de bleu Alcian a été utilisée comme indicateur pour déterminer la présence de la différenciation des chondrocytes (Figure 2c). Les cellules différencient avec succès en chondrocytes. Ces résultats suggèrent que, parmi les populations de cellules périostique, cellules progénitrices présentent la possibilité de se différencier en cellules chondrogéniques.

Les cellules sont cultivées dans les médias spécifiques mentionnées précédemment pour déclencher la différenciation adipocytaire. Après 8 semaines, huile rouge Qu'o a été utilisé pour détecter l’existence des lipides intracellulaires. Suivant coloration, intracellulaire graisse microscopique baisses ont été observées dans les cinq échantillons différenciées (Figure 2d).

Cytométrie marqueur de surface expression pour PDC

Un dosage de cytométrie en flux a été réalisé pour confirmer l’expression du marqueur de surface mésenchymateuse sur la surface des cellules. MSC marqueurs CD73 CD90, STRO-1 et CD44 étaient fortement positives dans le PDC, tandis que les marqueurs de la lignée hématopoïétique CD19, CD34, CD45 et HLA-DR étaient négatifs.

Effets de divers vitamine D 3 concentration sur l’ostéogenèse

Bien que les résultats ont confirmé les effets positifs de 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) sur l’activité ostéogénique, des différences statistiquement significatives ont été observées que chez certains des changements dans les expressions de l’ARNm de l’ostéogénique pli enzymes. Cette analyse pourrait avoir été biaisée par les valeurs élevées de la SD, qui peuvent être attribuées à l’écarts individuels entre les hôtes.

Expression de l’ARN messager de la phosphatase alcaline

Les changements de pli dans l’expression de l’ARNm de ALP après 1 semaine de la culture était 7.43 (SD = 3.96) dans le groupe de la vitamine C et 7.15 (SD = 4.88), 9 h 30 (SD = 5.63), 12.92 (SD = 7,95) et 6,60 (SD = 6.33) dans les 1010, 109, 108 et 107 M 1,25-(OH)2D3 groupes, respectivement (Figure 4 a). Les niveaux d’expression de mRNA d’alpage de la vitamine C, 108 M 1,25-(OH)2D3et 109 M 1,25-(OH)2D3 groupes ont été significativement plus élevée (p < 0,05) que ceux des autres groupes, ce qui indique a augmenté l’expression de l’ARNm de l’ALP dans ces groupes. La commande a été réglée à la valeur 1. Cette étude ont révélé les augmentations suivantes de pli dans les expressions de l’ARNm de l’ALP : 7.43-fold dans le groupe de la vitamine C ; 9.30-Fold dans le groupe3 de 109 M 1,25-(OH)2D ; et 12.92-fold dans le groupe 108 M 1,25-(OH)2D3 .

Bien qu’un plus grand changement de pli dans les expressions de l’ARNm de l’ALP a été observé dans le groupe 108 M 1,25-(OH)2D3 , pas de différences statistiquement significatives ont été observées concernant ces niveaux d’expression entre ce groupe et le négatifs et les groupes de vitamine C (p = 0,20 et p = 0,52, respectivement).

ALP est un bon indicateur pour déterminer la différenciation ostéogénique précoce des cellules. ALP a également sert une ectoenzyme pour la dégradation du pyrophosphate inorganique et libère phosphate au cours de la minéralisation,36. Le PDC traitée avec la vitamine C et 108 et 109 M 1,25-(OH)2D3 présentaient des différences significatives par rapport à ceux des autres groupes (Figure 4 a).

Expression de l’ARN messager de la sialoprotéine osseuse

Les changements de pli dans les expressions de l’ARNm de la BSP après 1 semaine de culture étaient 3.21 (SD = 1.20) et 4.18 (SD = 2,55), 10,34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23.44) et 5,24 (SD = 3,54) la vitamine C et les 1010, 109, 108 et 107 M 1,25-(OH)2D3 groupes, respectivement (Figure 4 b). Les expressions de l’ARNm de la BSP étaient plus élevées dans le groupe 108 M 1,25-(OH)2D3 , mais avec aucune signification statistique par rapport avec les expressions correspondantes dans les autres groupes.

Les expressions de BSP ARNm de la vitamine C et de 1010 M 1,25-(OH)2D3 groupes ont été significativement plus élevée (p < 0,05) que celles des autres groupes, ce qui indique que la vitamine C et 1010 M 1,25-(OH) 2 D3 promus expression BSP. La commande a été réglée à une valeur de 1. La vitamine C et 1010 M 1,25-(OH)2D3 groupes présentaient une augmentation de 3.21 et 4.18 fois dans les expressions de l’ARNm de la BSP, respectivement. Les 109 M et 108 M 1,25-(OH)2D3 groupes présentaient des expressions BSP ARNm plus élevées que les autres groupes de ne. Les 109 et 108 M 1,25-(OH)2D3 groupes montrent une augmentation de 10.34 et 24.91 fois dans les expressions de l’ARNm de la BSP, respectivement, mais cette augmentation n’était pas statistiquement significative (p) > 0,05). Une explication possible est que les cellules souches ne sont pas tous issus du même participant. Ainsi, les différences de potentiel pourraient avoir augmenté la SD et affecté les résultats statistiques.

Expression de l’ARN messager de CBFA1

Les changements de pli dans les expressions CBFA1 ARNm après 1 semaine de culture étaient 0,96 (SD = 0,10) et 0,90 (SD = 0,26), 1.01 (SD = 0,25), 1,31 (SD = 0,32) et 1.12 (SD = 0,35) dans la vitamine C et de 1010, de 109, de 108 et 107 M 1,25-(OH)2D3 groupes, respectivement (Figure 4C). Le groupe de3 en2D 108 M 1,25-(OH) exposé les expressions CBFA1 ARNm supérieures. Aucune modifications marquées ont été observées dans les expressions de gènes CBFA1 ARNm dans les groupes de traitement ou dans le groupe témoin. En outre, aucune augmentation significative a été observée dans l’expression des marqueurs ADN messagère après l’ajout de vitamine C ou 1,25-(OH)2D3. En outre, aucune différences intergroupes significatives ont été observées.

Expression de l’ARN messager de collagène-1

Les changements de pli dans l’expression de l’ARNm du collagène-1 après 1 semaine de culture étaient 0,98 (SD = 0,17) et 0,85 (SD = 0,16), 1.05 (SD = 0,16), 1,52 (SD = 0,36) et 1,01 (SD = 0,33) la vitamine C et les 1010, 109, 108 et 107 M 1,25-(OH)2D3 groupes, respectivement (Figure 4D). Les expressions d’ARNm de collagène-1 étaient plus élevées dans le groupe 108 M 1,25-(OH)2D3 , mais sans différence statistiquement significative par rapport avec les expressions correspondantes dans les autres groupes.

Les 108 M 1,25-(OH)2D3 lots témoins présentaient des différences statistiquement significatives dans leurs résultats (p < 0,05). La commande a été réglée à une valeur de 1. On observe une 1.52-fold augmentation dans les expressions d’ARNm de collagène-1. Les 1010 M 1,25-(OH)2D3 et 108 M 1,25-(OH)2D3 groupes ont montré des différences significatives dans leurs résultats (p < 0,05).

Expression de l’ARN messager de ostéocalcine

Les changements de pli dans les expressions de l’OCN ARNm après 1 semaine de culture étaient 0,60 (SD = 0,1) et 0,78 (SD = 0,18), 1,13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59) et 1,61 (SD = 0,73) dans la vitamine C et de 1010, de 109, de 108 et 107 M 1,25-(OH)2D3 groupes, respectivement (Figure 4e). Les expressions de l’ARNm de l’OCN étaient plus élevées dans le groupe 108 M 1,25-(OH)2D3 , mais sans différence statistiquement significative par rapport avec les expressions correspondantes dans les autres groupes.

Aucune augmentation significative a été observée dans les expressions des marqueurs OCN ARNm après l’ajout de vitamine C ou 1,25-(OH)2D3. Cependant, les expressions de l’ARNm de l’OCN diminue après traitement à la vitamine C. La commande a été réglée à la valeur 1. Les expressions OCN basales ont montré une diminution significative de le 0.6-fold (p < 0,05) durant la différenciation ostéoblastique. L’ARNm de l’OCN expressions étaient significativement plus élevée (p < 0,001) dans les cellules cultivées à 108 M 1,25-(OH)2D3 que dans les expressions correspondantes des autres groupes, qui présentaient un pli moyen augmenter de 2.59. Toutefois, ces résultats n’étaient pas statistiquement significatives (p > 0,05). Une explication possible est que les cellules souches ne sont pas tous issus du même participant ; ainsi, les différences de potentiel pourraient avoir augmenté la SD et affecté les résultats statistiques.

Analyse d’activité ALP

Une étude antérieure a montré que 1,25-(OH)2D3 est le plus efficace à une concentration de 108 M ; par conséquent, 108 M a été utilisé dans le groupe test pour comparer la capacité ostéogénique 1,25-(OH)2D3 avec celle du négatif, vitamine C, vitamine C + 1,25-(OH)2groupes de3 D. La capacité ostéogénique a été exprimée par l’activité de l’ALP. Après 1 semaine de culture (Figure 5 a), les changements de pli en activité ALP étaient de 1,00 (SD = 0,00), 1,92 (SD = 0,89), 3,77 (SD = 1,66) et 1,46 (SD = 0,49) dans la négative, C, D et C + D, respectivement. Parmi tous les groupes, les différences statistiquement significatives ont été observées seulement entre les groupes D et négatif (p = 0,03 ; Figure 5 a). Après 2 semaines de culture, les changements de pli en activité ALP (Figure 5 b) étaient de 1,00 (SD = 0,00), 2.32 (SD = 1,68), 4,98 (SD = 3.02) et 4,86 (SD = 2,73) dans la négative, C, D et C + D, respectivement. Aucune différence statistiquement significative ont été observés dans les groupes. Après 3 semaines de culture, les changements de pli en activité ALP (Figure 5C) étaient de 1,00 (SD = 0,00), 2.93 (SD = 2.15), 5,76 (SD = 3.60) et 5,61 (SD = 3,88) dans la négative, C, D et C + D, respectivement. Encore une fois, aucune différence statistiquement significative ont été observés dans les groupes (Figure 5C). Après 4 semaines de culture, les changements de pli en activité ALP (Figure 5 d) étaient de 1,00 (SD = 0,00), 2,83 (SD = 1,97), 3,79 (SD = 0,77) et 4.24 (SD = 2,87) dans la négative, C, D et C + D, respectivement. Ici, les groupes D et négatif présentaient des différences statistiquement significatives (p = 0,00 ; D de la figure 5).

Dans 1 semaine, seulement le 108 M 1,25-(OH)2D3 groupe présentait des différences significatives par rapport au groupe témoin (p = 0,03). Dans 2 semaine, les 108 M 1,25-(OH)2D3 et vitamine C groupes présentaient des différences significatives par rapport au groupe témoin (p = 0.0498). Dans la semaine 3, aucun des groupes ont montré des différences significatives par rapport au groupe témoin. En 4 semaines, le groupe de3 en2D 108 M 1,25-(OH) expose des différences significatives par rapport au groupe témoin. Il a indiqué que 108 M 1,25-(OH)2D3 promu l’activité ALP.

En bref, les 108 M 1,25-(OH)2D3 groupe exposé a augmenté ALP et expression de l’ARNm collagène-1 ; le groupe de la vitamine C exposé ALP sensiblement renforcée et expression de l’ARNm de la BSP ; et le groupe 109 M 1,25-(OH)2D3 présentait significativement meilleure expression de l’ARNm de l’ALP. Dans 1 semaine, augmentation de l’activité ALP a été observée dans les groupes de3 2D Vitamine C et 1,25-(OH), mais sans différence statistiquement significative comparée avec les niveaux d’expression correspondante dans les autres groupes. De 2 semaines à 4, vitamine C et 1,25-(OH)2D3 groupes présentaient des résultats similaires. Par conséquent, ces résultats pourraient élucider pas clairement les effets synergiques de vitamine C et 1,25-(OH)2D3 sur la différenciation ostéogénique des cellules (activité ALP).

Figure 1
Figure 1 : périoste alvéolaire humaine. Périostique tissus ont été prélevés au cours de la chirurgie dentaire. L’astérisque désigne l’emplacement du périoste alvéolaire.

Figure 2
Figure 2 : étude de la différenciation. Les CSM étaient fusiforme avec des procédés irréguliers et fermement attaché à la boîte de Petri après 1-3 jours de culture primaire (A; l’astérisque désigne l’emplacement de la cellule souche mésenchymateuse). Conditions in vitro culture, les CSM ont été subpassaged et se différencient en ostéoblastes (B, l’astérisque noir indique la zone tachée par von Kossa), chondrocytes (C, l’astérisque bleu indique la zone tachée par Bleu Alcian) et les adipocytes (D, l’astérisque rose indique la zone tachée par huile O rouge). La figure 2 est réutilisée de Biomedical Research International, Volume 2016, Article ID 352956125. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : cytométrie en flux. Marqueurs de surface exprimées par MSCs étaient CD73 (65,2 %), CD90 (75,6 %), STRO-1 (65,2 %) et CD44 (88,1 %) mais pas de CD45 (1,34 %), CD34 (1,61 %), CD19 (2,18 %), ou HLA-DR (2,20 %). « % » dans le chiffre dénote un rapport positif. Le groupe de contrôle (α-MEM et 5 % SVF) est représenté par la ligne rouge. Le groupe expérimental est représenté par la ligne bleue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : expressions de mRNA. expressions de l’ARNm de différenciation ostéoblastique pour 1 semaine. BSP ALP (B) (A), (C) CBFA1, (D) COL-I et OCN (E). p < 0,05 est *, p < 0,01 est **, p < 0,001 est ***. Le changement de pli de mRNA est par opposition à contrôle (α-MEM et 5 % FBS). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : activité de la phosphatase alcaline. Activité de la phosphatase alcaline dosage de différenciation ostéoblastique pour (A) semaine 1, semaine (B) 2, (C) semaine 3 et 4 de la semaine (D). p < 0,05 est *, p < 0,01 est **, p < 0,001 est ***. Le changement de pli est par opposition à contrôle (α-MEM, 5 % FBS). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Une modalité thérapeutique développée récemment, à savoir les tissus techniques entraînant MSCs, offre de nombreux avantages. MSCs, qui sont présents dans plusieurs types de tissus, sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en divers tissus mésodermiques fonctionnelle des cellules37 et autres cellules comme les ostéoblastes.

Le périoste sert une niche de cellules progénitrices et comme un approvisionnement riche vascularisation de l’OS, il enveloppe38. Dans notre étude, les échantillons étudiés 34, 20 conduit avec succès des colonies MSC, avec un taux de réussite de l’isolement de 58,8 %. MSCs dérivés le périoste ont été sélectionnés dans cette étude basée sur leur prolifération et les capacités de différenciation ostéogénique. Le taux de prolifération des cellules périostique était beaucoup plus élevé que celui des cellules stromales de la moelle osseuse22. Quant à la capacité ostéogène du périoste, Ousual24 a soutenu que la capacité ostéogène du périoste dérivées de cellules souches (EMSP) était inférieure à celle du BMSC. Cependant, Yoshimura a attesté que la capacité ostéogénique des EMSP a surpassé celle de BMSC39. Hayashi et al. démontré que périostique MSCs adultes comme des candidats idéaux pour de régénération tissulaire osseuse24. En outre, périostique MSCs adultes sont considérés utiles à raccourcir la période de culture cellulaire, réduisant ainsi les coûts et le risque de contamination,22. Selon les témoignages, vieillissement affecte également l’activité mitogène des cellules ostéo40. Une étude a rapporté 1,25-(OH)2D3 induit une plus grande stimulation in vitro la différenciation ostéoblastique au CSM de jeunes participants (à 65 ans < y)41. La présente étude a comporté l’utilisation de cellules périostique provenant de jeunes adultes (âgées de 65 ans < y). D’autres études sont nécessaires afin de comparer la capacité de régénération osseuse de cellules périostique entre petits et grands donateurs.

Dans cette étude, une population de cellules a été isolée basé sur sa propriété de plastique adhésif, tel que décrit par Friedenstein et coll.. 13. le PDC récoltées ici ont adhéré à la plastique de culture de cellules. Les marqueurs d’esenchymal (73 CD, CD 90, STRO-1 et CD 44) des antigènes de surface de ces cellules de cultures primaires exposé expressions significatives. En outre, les marqueurs hématopoïétiques (CD 45, CD 34, CD 19 et HLA-DR) étaient absents, indiquant que les cellules cultivées étaient d’origine mésenchymateuse. La différenciation adipocytaire, chondrogéniques et ostéogénique de la PDC peut être induite à l’aide de médias de différenciation spécifique, comme décrit dans d’autres études évaluant des échantillons obtenus à partir de tissus et moelle osseuse gingivale42. Les résultats de cette étude se conformer aux normes minimales pour la définition phénotypique et fonctionnelle des humains MSCs acceptée par la société internationale de thérapie cellulaire4. Dans la présente étude, les MSCs du périoste humaine ont été isolés et élargis, qui a révélé des caractéristiques semblables à celles décrites généralement du BMSC.

Études ont proposé que la dexaméthasone, ascorbate et β-glycérophosphate causent BMSC subir une différenciation ostéogénique43. Une autre étude a démontré que 1α, 25-dihydroxyvitamine D3 (1,25-(OH)2D3) en combinaison avec l’acide ascorbique promu cellules souches différenciation44. Par conséquent, dexaméthasone, ascorbate et β-glycérophosphate ont été ajoutés dans cette étude pour promouvoir la différenciation des cellules souches. Les tendances observées étaient similaires dans tous les échantillons de patients cellule trois. Dans cette étude, MSCs ont été correctement identifiées dans le périoste alvéolaire avec un taux d’isolement de 58,8 %. Aucune différence statistiquement significative ont été observés dans le taux de réussite en ce qui concerne l’âge, le sexe et emplacement.

La présente étude expérimentale a étudié deux substances, à savoir 1,25-(OH)2D3 et vitamine C, qui peuvent stimuler la différenciation ostéogénique de cellules souches. Une étude de 200845 a indiqué que 1,25-(OH)2D3 est essentiel pour le métabolisme osseux et l’homéostasie du calcium et affecte le système cardio-vasculaire grâce à des mécanismes qui doit encore être pleinement compris. Dans une précédente étude46, 1,25-(OH)2D3 stimule la différenciation in vitro des MSCs humaines en ostéoblastes. La capacité de 1,25-(OH)2D3 d’induire BMSC indifférencié à se différencier en cellules ostéoblastes in vitro a été démontrée dans plusieurs études explorant divers systèmes46. Certaines études ont également démontré que, lorsque ajouté à des cultures de cellules semblables à des ostéoblastes, 1,25-(OH)2D3 inhibe la prolifération cellulaire, mais augmente l’expression de marqueurs ostéoblastique comme ALP, ostéopontine, OCN et matrix Gla protéine47,48. Une étude précédente avaient noté que 1,25-(OH)2D3 généralement inhibe la prolifération cellulaire et induit de différenciation ostéoblastique49. Une étude in vitro réalisée sur des cellules a indiqué que 1,25-(OH)2D3 peut favoriser les premiers stades de l’osteoblastogenèse9. En outre, une autre étude in vitro a suggéré que, pour MSCs,1,25-(OH) tôt ou tard2D3 peut stimuler des marqueurs de différenciation ostéogénique, y compris de l’ALP, ostéopontine, BSP et l’OCN43.

Les deux OCN — considéré comme responsable du contrôle de la synthèse de la matrice — et collagène 1 a 1 — la protéine la plus abondante matrice — sont OS acides essentiels, protéines de la matrice qui jouent un rôle essentiel dans la synthèse de la matrice. En outre, ils sont caractéristiques ostéoblastes matures de formatrices de matrice. 50 une étude précédente avaient noté que 1,25-(OH)2D3 traitement stimulée par une augmentation de collagène 1 a 1 expression mais pas CBFA1 ou ALP gene expression34. Quotes-parts de gènes impliqués dans la différenciation ostéoblastique ont révélé que 1,25-(OH)2D3 traitement augmenté l’expression de l’OCN51,52,53. Dans notre étude, les résultats ont montré que 1,25-(OH)2D3 exerce des effets positifs sur l’activité ostéogénique. Comparativement aux autres groupes, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 a démontré une augmentation expression de l’ARNm de l’ALP, BSP, CBFA1, roc et Col1. Parmi ceux-ci, les résultats pour ALP et Col1 a atteint une importance statistique. Par conséquent, des conditions optimales ont été obtenues en utilisant 10−8 M 1,25-(OH)2D3. expression de l’ARNm de la BSP dans le 10−10 M 1,25-(OH)2D3 groupe a augmenté significativement (p < 0,05). Cependant, aucune différence statistiquement significative ont été observés dans les pli des changements dans les expressions de l’ARNm de CBFA1 et OCN. Lorsque vous examinez l’ARNm du gène, les résultats de l’expérience indiquent in vitro la différenciation ostéogénique. Se fondant sur ces constatations, l’ostéogenèse observée par la négative, vitamine C, 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 groupes et a été plus faible que celle en 10−8 M 1,25-(OH)2D3 groupe. Ces résultats ont conduit à la spéculation que 1,25-(OH)2D3 nombres premiers PDC de régulariser les protéines de la matrice requis pour la minéralisation (collagène 1 a 1).

Une étude précédente a ROC comme une cible privilégiée des 1,25-(OH)2D3, qui augmente de façon marquée OCN expression52. Dépôt de l’OCN peut être considéré comme un marqueur de différenciation ostéogénique du PDC. En outre, expression de l’OCN a été évaluée comme un fin marqueur ostéogénique54. OCN est un marqueur fiable pour OS formation et ostéogenèse55. Donc, expression OCN est généralement liée à la capacité de minéralisation des cellules. OCN est un biomarqueur sensible des ostéoblastes matures. Pour une comparaison ostéogénique in vitro , expression de l’ARNm de l’OCN nettement élevée a été observée dans le groupe3 10−8 en2D M 1,25-(OH).

Une étude a montré que l’activité de l’ALP a été inhibée en transformant le facteur de croissance bêta (0,1 à 10 ng/mL) et promue avec 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Ces résultats impliquent que 10−8 M 1,25-(OH)2D3 favorise le développement de maturation osseuse et de cellules souches. Activité ALP aux concentrations observées optimales de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 qui a été comparée à la concentration de vitamine c. Le PDC exprime l’activité ALP. En outre, l’ajout de 1,25-(OH)2D3 augmente l’activité de l’ALP et promu la différenciation ostéoblastique dans le PDC. Dans tous les trois paramètres, vitamine C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3et vitamine C + 10−8 M 1,25-(OH)2D3 a augmenté l’activité ALP à 1 semaines (Figure 4 a), 2 (Figure 4 b), 3 ( Figure 4C) et 4 (Figure 4D) plusieurs fois par rapport à celle du groupe témoin négatif. Dans les semaines 1 et 4, activité ALP a augmenté considérablement dans le groupe 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . Dans 2 semaine, activité ALP a augmenté significativement dans la vitamine C et 10−8 M 1,25-(OH)2D3 groupes.

Grâce à une étude comparative des différents MSCs humaines au passage 3, Sakaguchi et al. 56 a trouvé que les BMSC et ces sociétés possèdent des capacités ostéogéniques similaires. Par conséquent, la période de culture cellulaire peut probablement être raccourcie en utilisant des cellules périoste, qui à son tour réduirait le risque de contamination et le coût. L’utilisation de CSM passage précoce évite les effets sénescentes de l’expansion dans la culture. Ousual et Yoshimura utilisé MSCs au passage 3 et repiquages pour 2 semaines sous des conditions de la différenciation ostéogénique35. Donc le temps de passage devraient être considéré lorsqu’on compare les activités cellulaires des diverses sources de cellules. Dans cette étude, PDC de troisième génération ont été utilisés parce que le potentiel ostéogénique des cellules souches des générations ultérieures de PDC est inférieur à celle des cellules souches du PDC de troisième génération.

Lorsqu’il est cultivé dans un milieu de sérum humain, périoste des cellules souches peut non seulement conserver leur forme, mais peut également fixer, maintenir l’activité et atteindre la croissance cellulaire. En résumé, selon ces résultats, PDC humains possède la capacité de survivre, se multiplient et se différencient en la lignée ostéogénique in vitro, qui est crucial dans l’évaluation de l’efficacité in vivo. Le périoste est riche en MSCs et convient donc pour l’ingénierie tissulaire. Le périoste a obtenu de la gencive présente moins de complications. Par conséquent, l’os alvéolaire est considéré comme un site donneur idéal. Les résultats démontrent clairement la possibilité d’isoler MSCs de périoste de même et de réaliser leur différenciation en ostéoblastes, les chondrocytes et les adipocytes. Dans cette étude, les effets de la vitamine C sur le potentiel ostéogénique du PDC ont été comparées avec celles de 1,25-(OH)2D3 à différentes concentrations. La concentration plus efficace était de 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Le 10−8 M 1,25-(OH)2D3 traitement tout au long de la période de culture est une méthode efficace et économique d’induire la différenciation ostéogénique en PDC. En conclusion, la vitamine C et 1,25-(OH)2D3 promouvoir la différenciation ostéogénique du PDC. Toutefois, ceux-ci ne présentaient aucun effet synergique important dans les résultats de l’activité ALP. Compte tenu de la taille de l’échantillon, échantillons supplémentaires sont nécessaires pour une évaluation plus poussée. Ainsi, PDC, cultivées dans des conditions ostéogéniques pourrait être utile pour l’ingénierie tissulaire osseuse et offrent l’avantage d’une prolifération cellulaire plus élevée.

Les étapes critiques du présent protocole comprennent des étapes 1.2 et 1.3 (commencer la procédure de la culture dans les 24 heures de la récolte et par la suite un entretien adéquat). Contamination du tissu doit être évitée et l’utilisation d’une technique aseptique est obligatoire. Une des limites du présent protocole sont que, par rapport à l’approvisionnement en cellules souches de la moelle osseuse ou de tissu adipeux, approvisionnement en cellules souches du tissu dentaire est limitée en ce qui concerne le faible nombre de cellules qui peuvent être obtenues par le biais de cette technique.

L’identification et la caractérisation des cellules souches périostique peuvent fournir des informations précieuses concernant les fonctions et le potentiel de régénération de ce tissu, mais aussi son applicabilité en thérapie régénérative. Une condition optimale a été obtenue à l’aide de 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Par conséquent, le traitement de la PDC avec 10−8 M 1,25-(OH)2D3 favorise la différenciation ostéogénique. Futures études devraient examiner l’application in vivo des 10−8 M 1,25-(OH)2D3 pour l’ingénierie tissulaire osseuse efficace et économique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

L’Institutional Review Board a approuvé le protocole d’étude pour clinique recherche de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 4728B-101 et 103-4223C). Cette étude a été financée par Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 et NMRPG3C0151). Ce manuscrit a été édité par Wallace édition académique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9, (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53, (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27, (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122, (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65, (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics