اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى

Immunology and Infection
 

Summary

هنا، وقد عرضنا أساليب للكشف عن الأجسام المضادة البشرية جزيرة ليلى باستخدام فحوصات اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة). يمكن توسيع البروتوكول، المستخدمة للتنبؤ بمرض السكري من النوع 1، عند الكشف عن الأجسام المضادة لأمراض المناعة الذاتية الأخرى.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إبراز جزيرة الأجسام المضادة المرتبطة بداء السكري من النوع 1 (T1D) يقود الطريق إلى المشروع وردع هذا المرض في عموم السكان. مقايسة مسافنة رواية مقايسة مرحلة السوائل نونراديواكتيفي للأجسام المضادة جزيرة ليلى مع ارتفاع حساسية وخصوصية من الحالية 'الذهب' القياسية الملزمة راديو المقايسة (المكتب الإقليمي لأفريقيا). مسافنة فحوصات أكثر دقة تحديد بداية T1D بريسيمبتوماتيك بالتمييز بين الأجسام المضادة عالية الخطورة، وتقارب عالية من الأجسام المضادة منخفضة المخاطر، والنسب المنخفضة التي تم إنشاؤها في المكتب، وفحوصات الممتز التقليدية المرتبطة بالانزيم (إليزا ). هو المسمى مستضد البروتين المستخدمة في هذا التحليل القامة مع سالفو، العلامة والبيوتين، على التوالي. كل فحص الأجسام مسافنة يستخدم بروتين مستضد معين يحتاج خطوة تحسين قبل أن يمكن استخدامه للتطبيقات المختبرية. هذه الخطوة حيوية لا سيما في تحديد المتطلبات لعلاج حمض المصل وتركيزات نسب المستضدات المختلفة اثنين يحمل سالفو، العلامة والبيوتين. للقيام التحليل، التقاط المصل عينات مختلطة مع سالفو-العلامة-مترافق وبيوتينيلاتيد البروتين مستضد في حل الفوسفات مخزنة (PBS)، الذي يحتوي على 5% ألبومين المصل البقري (BSA). وبعد ذلك، المحتضنة العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في نفس اليوم، أعد مع المخزن المؤقت لمانع صفيحة streptavidin المغلفة والمحتضنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. اليوم الثاني، تغسل لوحة ستريبتافيدين ونقل الخليط مصل مستضد على اللوحة. وضع اللوحة على شاكر لوحة وحدده بسرعة منخفضة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1. وفي وقت لاحق، اللوحة يتم غسلها مرة أخرى، ويتم إضافة المخزن المؤقت للقارئ. ثم تحسب على الجهاز القارئ لوحة اللوحة. يتم نقل النتائج من خلال مؤشر، والذي يتم إنشاؤه من عينات مصلية الداخلية التحكم القياسية الإيجابية والسلبية.

Introduction

تم إنشاء نظام تصنيف مرحلي الأخيرة للمساعدة في تشخيص المراحل الأولية من T1D في المرضى. الكشف الدقيق للأجسام المضادة جزيرة البشرية تلعب دوراً هاما في تحديد والتدريج بريسيمبتوماتيك داء السكري نوع 1، كما يشير إلى وجود الأجسام المضادة جزيرة وجود المناعة الذاتية خلايا بيتا. المعدل في مرض السكري الذي يؤثر على المرضى من حدوث المناعة الذاتية β-الخلية الأولى لأعراض مرض، المرتبطة بعدد ونوع من الأجسام المضادة جزيرة ليلى، هو متغير2،3.

سن الدراسة الأجسام وعيار وتقارب من جزيرة ليلى الأجسام المضادة يمكن أن تؤثر على معدل الانتقال إلى أعراض النوع 1 السكري4،5،،من67،8 ،،من910. مؤخرا، نمواً مسافنة فحوصات قد صودق على نطاق واسع، قد أظهرت زيادة الحساسية، وهي أكثر خاصة بالمرض10،11،،من1213. تعزيز هذه الاختبارات في التنبؤ والتدريج من خطر مرض السكري من خلال سابق كشف الأجسام المضادة في جزيرة ليلى. أنها أدق علامة البدء في جزيرة ليلى المناعة الذاتية وتجاهل إشارات تقارب منخفضة ومنخفضة المخاطر غير ذات صلة بمرض السكري.

في مقايسة القامة، الأجسام المضادة في المصل، إذا كانت موجودة، سد مستضد سالفو-العلامة-مترافق للمستضد القبض على بيوتينيلاتيد في مرحلة السائل. بعد سد، اشتعلت في المرحلة الصلبة رابط البيوتين والكشف عنها من خلال القامة بواسطة سالفو علامة على لوحة streptavidin المغلفة (الشكل 1).

وتستخدم أساسا في هذا الاستعراض، فحوصات يصدرون جسم واحد مع الأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى. بإيجاز، متعدد جسم ستناقش فحوصات استناداً إلى فحوصات مسافنة واحد. يمكن استخدام التحليل متعدد لتحديد متعددة، ما يصل إلى 10، الأجسام المضادة داخل واحد أيضا، باستخدام 15 ميليلتر من المصل. يمكن استخدام هذا التحليل إنتاجية عالية بسيطة الشاشة، في نفس الوقت، متعددة الأجسام المضادة لأمراض المناعة الذاتية ذات الصلة متعددة بين عامة السكان.

Protocol

1. إعداد المخزن المؤقت

  1. وسم المخزن المؤقت (2 x PBS، الأس الهيدروجيني 7.9): 400 مل من الماء المقطر (دد) منزوع، إضافة 100 مل من 10 x PBS، ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.9 مع هيدروكسيد الصوديوم.
  2. 3 مم بيوتين: حل 1 ملغ بيوتين في 588 ميليلتر من وسم المخزن المؤقت.
  3. 3 مم من سالفو، العلامة: نمول 150 حل سالفو-العلامة في 50 ميليلتر من وسم المخزن المؤقت.
  4. مستضد المخزن المؤقت (5% جيش صرب البوسنة): في 500 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، أضف 25 جرام من ألبومين المصل البقري (BSA).
  5. إعداد حل حامض الخليك 0.5 متر.
  6. م 1.0 من HCl تريس المخزن المؤقت pH 9.0: تحضير 1 م تريس-HCl المخزن المؤقت، وضبط الأس الهيدروجيني إلى 9.0 مع HCl.
  7. طلاء المخزن المؤقت (3% بمانع): في 500 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، إضافة 15 غم مانع أ
  8. المخزن المؤقت للغسيل (0.05% 20 توين، ببست): 5000 مل من برنامج تلفزيوني 1 x، إضافة 2.5 مل من 20 توين.
  9. قراءة المخزن المؤقت (2 × قراءة المخزن المؤقت تي مع السطح): في 500 مل من الماء DD، إضافة 500 مل 4 × قراءة المخزن المؤقت تي مع الفاعل بالسطح (جدول المواد).
  10. تخزين البيوتين وسالفو، العلامة في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: كل الحلول البيوتين وسالفو، العلامة ينبغي إعداد طازجة دائماً قبل إجراء وضع العلامات.

2. قم بتسمية أوتوانتيجين جزيرة البشرية مع البيوتين وسالفو-الوسم

ملاحظة: يوصي بتركيزات عالية من مستضد، ≥0.5 mg/mL، لفعل التوسيم أكثر كفاءة.

  1. تحديد نسبة المولى أوتوانتيجين جزيرة البشرية البيوتين وسالفو، العلامة.
    1. الحصول على عدد مستضد المولى بقسمة وزن مستضد الوزن الجزيئي.
    2. استخدام المولى نسبة 1:5 للمستضد مع الوزن الجزيئي الأصغر (دي وان زيرو دينار كويتي)، ونسبة 01:20 للمستضد مع الوزن الجزيئي أكبر المولى (> 50 دينار كويتي).
    3. حساب الحجم البيوتين أو العلامة سالفو بقسمة عدد المولى تركيزه.
  2. مزيج أوتوانتيجين جزيرة البشرية مع البيوتين أو العلامة سالفو مع المولى نسبة 1:5.
    ملاحظة: ينبغي تبادل البروتين في نظم المخزن المؤقت تريس أو جليكاين إلى 2 × المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني مع الأس الهيدروجيني 7.9 تدور التحجيم باستخدام عمود.
  3. منذ البيوتين وسالفو، العلامة حساسة للضوء، تغطية أنابيب التفاعل مع رقائق الألومنيوم. تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 1.
  4. أثناء الاحتضان، رئيس الوزراء عمود الدوران بالاستغناء عن 2 × المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني في العمود ثلاث مرات. الطرد المركزي الحل في 1000 غ س لمدة 2 دقيقة كل مرة.
    ملاحظة: حاليا رد وصفها، من خلال سد، ما زالت تحدث ويحتاج إلى وقفه.
  5. وقف رد الفعل وضع العلامات بتنقية أوتوانتيجين المسمى جزيرة البشرية. لتنقية، تمرير أوتوانتيجين عن طريق عمود الدوران والطرد المركزي العمود في 1000 غ س ل 2 دقيقة.
  6. تحديد تركيز مستضد المسمى (ميكروغرام/ميليلتر) باستخدام كمية البروتين مستضد والحجم النهائي.
    ملاحظة: تقريبا، سيكون هناك استبقاء 90-95 ٪ من مستضد المسمى بعد اجتياز كل عمود الدوران.
  7. قاسمة المسمى مستضد المسمى مستضد ومخزن في-80 درجة مئوية.

3-تحديد أفضل التركيزات والنسب المستضدات المسمى اثنين للفحص (الفحص المدقق المجلس)

  1. إعداد عينات مصلية اثنين، أحدهما إيجابي عالية وواحدة سلبية، مع إجمالي حجم 200 ميليلتر لكل.
  2. الكوة ميليلتر 4 من المصل وإضافة 1 x برنامج تلفزيوني حتى تصبح وحدة التخزين النهائي 20 ميليلتر كل بئر لصفيحة بكر 96-جيدا. استخدام نصف صفيحة للعينة إيجابية عالية، والنصف الآخر للعينة سلبية، كما هو مبين في الشكل 2 ألف.
  3. إضافة 10 ميليلتر من البيوتين و 10 ميليلتر من العلامة سالفو المسمى مستضد وإجراء تخفيف المسلسل لمولدات مختلفة المسمى اثنين، كما هو مبين في الشكل 2 ألف. تشغيل إضعاف تسلسلي أفقي مستضد المسمى واحد وإضعاف مسلسل عمودي للمستضد تسمية أخرى.
  4. مواصلة بقية الخطوات المقايسة الموصوفة في 5.3 إلى 9.1.
  5. حساب نسبة الإشارات الصادرة من العينة إيجابية عالية ضد كل من الإشارات المناظرة من العينة سلبية هو مبين في الشكل 2.
  6. تحديد تركيزات أفضل البيوتين وسالفو، العلامة المسمى المستضدات بتحديد نقطة بأعلى أو بالقرب من أعلى نسبة من الإيجابية إلى السلبية. النظر في الإشارات الخلفية منخفضة من العينة سلبية لتحديد النسبة.
    ملاحظة: يتضمن المقايسة يوم 1 الخطوة 4 إلى الخطوة 6.

4-إعداد المخزن المؤقت Antigen باستخدام تركيز الصحيح البيوتين/سالفو-العلامة المسمى مستضد

  1. حدد تركيز رشيداً لكل مستضد استناداً إلى فحص المجلس مدقق.
  2. إعداد 3 مل من محلول مستضد كل لوح، استخدام تركيز رشيداً البيوتين/سالفو-العلامة المسمى مستضد مستضد المخزن المؤقت.

5-احتضان عينات المصل مع مستضد المسمى

ملاحظة: هناك البروتوكولين في هذا القسم، وواحد بدون علاج حمض المصل وواحدة مع معاملة حمض المصل. جزيرة جميع الأجسام فحوصات ما عدا الإنزيم الأكاديمية استخدام بروتوكول العادية دون علاج حمض المصل من الخطوات 5.1 إلى 5.5، حين المقايسة الأكاديمية يتخطى هذه الخطوات ويستخدم بروتوكول مع معاملة حمض المصل من الخطوات 5.6 إلى 5.9.

  1. الكوة ميليلتر 4 من المصل وإضافة 1 x برنامج تلفزيوني حتى تصبح وحدة التخزين النهائي 20 ميليلتر كل بئر لصفيحة بكر 96-جيدا.
  2. إضافة 20 ميليلتر من الحل المسمى مستضد كل بئر.
  3. تغطية لوحة بكر مع ختم إحباط لتجنب الضوء.
  4. وضع اللوحة على شاكر (سرعة منخفضة) على RT ح 2.
  5. وضع اللوحة في الثلاجة 4 درجات مئوية واحتضان بين عشية وضحاها (ح 18-24).
    ملاحظة: يهدف البروتوكول التالية خطوات من 5.6 إلى 5.9 فقط للمقايسة الأكاديمية الدولية وفحوصات الأجسام الأخرى تخطي هذه الخطوات.
  6. ميكس 15 ميليلتر من المصل مع 18 ميليلتر من حمض الخليك 0.5 M لكل عينة المصل. احتضان هذا الخليط في RT لمدة 45 دقيقة.
  7. إعداد الحل مستضد مع تركيز رشيداً البيوتين وسالفو-العلامة المسمى مستضد، استناداً إلى فحص المجلس مدقق، استخدام مستضد المخزن المؤقت. في كل حسنا، المسمى الكوة ميليلتر 35 مستضد المخزن المؤقت، الذي يحتوي على البيوتين وسالفو، العلامة مستضد، في لوحة بكر جديدة.
  8. قبل الانتهاء من الخطوة حضانة (الخطوة 5، 6) 45 دقيقة، إضافة ميليلتر 8.3 م 1 تريس pH 9.0 المخزن المؤقت إلى جانب كل بئر على لوحة مستضد (الخطوة 5، 6). من المهم للحد من الاختلاط بين المخزن المؤقت تريس و antigen. على الفور نقل 25 ميليلتر من المصل، الذي تعامل مع حمض, في الخطوة 5، 6، في كل بئر وتحرض الحل. تغطية لوحة بكر مع ختم إحباط لتجنب الضوء.
  9. وضع اللوحة شاكر (سرعة منخفضة) في RT 2 حاء وضعت اللوحة في الثلاجة 4 درجات مئوية وتسمح لوحة لاحتضان بين عشية وضحاها (ح 18-24).

6-إعداد لوحة ستريبتافيدين

  1. صفيحة ستريبتافيدين من الثلاجة 4 درجات مئوية وتسمح لوحة للحضور إلى الرايت
  2. بمجرد اللوحة ستريبتافيدين في الرايت، إضافة 150 ميليلتر من 3% بمانع لكل بئر.
  3. تغطية لوحة بكر مع ختم إحباط.
  4. احتضان اللوحة في الثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ويتضمن المقايسة يوم 2 7 الخطوة إلى الخطوة 9.

7-نقل المصل/مستضد يفقس إلى لوحة ستريبتافيدين

  1. وفي اليوم التالي إخراج لوحة ستريبتافيدين من الثلاجة وتجاهل المخزن المؤقت من اللوحة. بعض المناشف الورقية الجافة المبينة في الجدول، وانقر فوق اللوحة رأسا على عقب حتى يكون هناك أي مخزن مؤقت أكبر داخل الآبار.
  2. ملء لوحة streptavidin فارغة مع 150 ميليلتر من ببست كل بئر وتجاهل ببست من لوحة لإجمالي يغسل ثلاث.
  3. نقل 30 ميليلتر من المصل/مستضد يفقس الواحدة وكذلك في لوحة ستريبتافيدين.
  4. وتغطي اللوحة بإحباط لتجنب الضوء. هز اللوحة، في إعداد منخفض، على RT ح 1.

8-أغسل اللوحة وإضافة المخزن المؤقت للقراءة

  1. تجاهل يفقس من اللوحة. إضافة 150 ميليلتر من ببست كل بئر وتجاهل ببست من لوحة لما مجموعة ثلاث يغسل.
  2. بعد الغسيل، إضافة 150 ميليلتر كل من المخزن المؤقت للقراءة جيدا.
    ملاحظة: من المهم منع فقاعات الهواء في الحل لأن هذا سوف يؤثر على كيفية قراءة اللوحة على جهاز قارئ لوحة.

9-قراءة اللوحة وتحليل البيانات

  1. عد لوحة على الجهاز القارئ لوحة. يتم عرض القيم جسم كالتهم في الثانية (CPS).
  2. أنقل مستويات الأجسام المضادة الواردة من جهاز قارئ لوحة كمؤشر نسبي. حساب المؤشر من المعادلة التالية:
    مؤشر القيمة = [CPS (عينة)-CPS (مراقبة سلبية)]/[CPS (مراقبة إيجابية)-CPS (مراقبة سلبية)].
  3. تحديد الأجسام المضادة إيجابية وسلبية نتائج استخدام وقف إنتاج المواد الانشطارية للايجابية، تعريف استناداً إلى النسبة المئوية 99 من 100 مواضيع مراقبة صحية (الأفراد غير السكري دون أي أمراض المناعة الذاتية المعروفة والذين لديهم لا تاريخ عائلي من مرض السكري).

Representative Results

يعرض الرقم 2 رقعة الداما. ويتضح أن 250 نانوغرام/ملليلتر من البيوتين و 250 نانوغرام/مليلتر من العلامة سالفو مستضد المسمى هي الأكثر عقلانية التركيزات المستخدمة في فحص النظر في الإشارات من عينة مراقبة إيجابية عالية، وعينه مراقبة سلبية كخلفية للمقايسة، ونسبة الإيجابية للإشارات السلبية. مع التركيزات الأمثل لهذه المستضدات المسمى اثنين، أنجز المقايسة مع عينات المصل من 100 مريض تم تشخيصها حديثا مع T1D وضوابط صحية 100. قيمة مؤشر 0.023 عرف أنه وقف المقايسة للايجابية. وهذا يمثل 85% حساسية في خصوصية المرضى و 99 ٪ في صحة عناصر التحكم باستخدام جهاز الاستقبال العاملة المميزة (ROC) المنحنى المبين في الشكل 3 ألف. الفحص للعينات غير معروف أجرى مع الداخلية إيجابيات ارتفاع قياسي، وايجابيات منخفضة، وعينات المراقبة السلبية. يتم إظهار نتائج التهم، النيابة العامة في الجدول 2 أ. يعني يسلط الضوء على مجلة الأحوال الشخصية ضوابط الإيجابية العالية والمنخفضة باللون الأحمر، 17903 [(19940+15866)/2] و [(857+820) 839/2]، وهي أبرز عناصر سلبية باللون الأخضر، [(170+165) 168/2]. ويحسب الرقم القياسي لعينات غير معروفة قبل "(CPSعينة-168)/(17903-168)." ويبين الجدول 2 باء قيم الفهرس المحسوب لجميع العينات. قيم الفهرس التي أكبر من 0.023 مكتوبة باللون الأحمر، المقابلة للقيم CPS أيضا مكتوب باللون الأحمر في الجدول 2 ألف. سيتم تعريف هذه القيم كالنتائج الإيجابية التي أكبر من99 المئوية للسكان مراقبة صحية . عندما يستخدم بتركيز مستضد غير عقلانية، التحليل سيكون لها خلفية عالية، كما هو مبين في الجدول 2 جيم وسيفتقد مستويات منخفضة من الأجسام المضادة إيجابية مثل القيم A2، A5، D1 و H4 وأبرزت باللون الرمادي في 2D الجدول.

Figure 1
الشكل 1 : التوضيح لالتقاط لوحة الثنائي التكافؤ في مقايسة القامة-الأكاديمية واحد. الأجسام جزيرة ليلى في الجسور المصل سالفو العلامة مترافق مستضد للمستضد التقاط بيوتينيلاتيد، التي يتم التقاطها في المرحلة الصلبة على اللوحة المغلفة ستريبتافيدين. الكشف عن القبض على لوحة علامة سالفو مستضد مترافق يتحقق من خلال القامة. وقد تم تعديل هذا الرقم من يو، وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : منحنى ROC لتحديد وقف الإيجابية المقايسة. واختير المئينال 99 من خصوصية المقابلة لحساسية 85% ويتم تمثيلها كقيمة فهرس 0.023. هذا الحد الأعلى للمقايسة مأخوذة من 100 ضوابط صحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : مثال مصل الإنسان العادي حجب إشارات القامة-الأكاديمية- ج: الإشارات من فحوصات القامة-الأكاديمية مع جسم [مونوكلونل] الأنسولين (موآب) منعت جذريا بإضافة مصل الدم البشري الطبيعي. عند مقارنة موآب في برنامج تلفزيوني، والإشارة أعيدت جزئيا عندما كان يعامل المصل البشري مع حمض. باء: إشارات من مقايسة القامة-الأكاديمية مع 4 المريض الأمصال تعززت إلى حد كبير مع حمض العلاج. وقد تم تعديل هذا الرقم من يو، وآخرون. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : التوضيح للمقايسة "مسافنة موتيبليكس". جسم مضاد-مستضد مجمعات تتشكل في المرحلة السائل مع linkers محددة. يتم ضبط النفس مجمعات جسم مضاد-مستضد-رابط محددة على كل من الرابط-المواقع المحددة في نفس جيدا. الجهاز قارئ لوحة قادرة على التمييز بين الإشارات من مصادر مختلفة من البقع ويعطي النيابة العامة التهم على 10 قنوات مختلفة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: الفحص المدقق المجلس يحدد التركيزات والنسب من البيوتين وسالفو، العلامة المسمى المستضدات. ج: CPS الخام التهم للوحة المجلس مدقق مع ارتفاع إيجابي المصل في النصف من لوحة وسلبي المصل على النصف الآخر. وقد تضعف تركيز مستضد بيوتينيلاتيد أفقياً في سلسلة وقد تضعف تركيز سالفو-العلامة المسمى مستضد عمودياً في سلسلة. باء: قيم نسبة من التهم CPS من المصل إيجابية عالية ضد كل من هذه التهم CPS المقابلة من المصل السلبية. تمثل الآبار أبرز الأصفر أفضل نسبة من الإيجابية إلى السلبية في "الفريق باء." يتوافق مع هذه النسبة إلى 250 نانوغرام/مليلتر البيوتين و 250 نانوغرام/مليلتر سالفو، العلامة المسمى مستضد تركيزات في الفريق A مع حصيلة CPS مقبول منخفض للمصل السلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

Table 2
الجدول 2: تحليل لنتائج المقايسة. ج: CPS الخام حساب من لوحة المقايسة مع عناصر إيجابية عالية ومنخفضة قياسية أبرز عناصر سلبية قياسية أبرزت باللون الأخضر والأحمر. تم تكرار كل عينة في المقايسة. B: وحسبت قيم الفهرس، كما هو موضح في البروتوكول المقايسة. كان تعريف أية قيمة الفهرس الذي كان أكبر من 0.023 كنتيجة إيجابية، وأبرزت باللون الأحمر. C: CPS الخام حساب من لوحة المقايسة مع نفس مجموعة من العينات عندما كان يستخدم بتركيز مستضد غير عقلانية. وادي هذا إلى خلفية عالية وبعض إيجابيات منخفضة عادة الكشف، كما هو مبين في "لوحة ب"، تم تحويلها إلى السلبيات، أبرزت في الرمادي في لوحة دال الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

Discussion

جزيرة ليلى الأجسام المضادة حاليا المؤشرات الحيوية الأكثر موثوقية للمناعة الذاتية لداء السكري من النوع 1. وضع علامة على بداية جزيرة محددة المناعة الذاتية، وتحديد مخاطر المرض العلني. تم التحقق من مقايسة القامة، لجزيرة ليلى الأجسام المضادة، على نطاق واسع في عدة وطنية ودولية نوع 1 مرض السكري التجارب السريرية. المقايسة أظهرت زيادة الحساسية والدقة مقارنة بالحالية 'الذهب' المكتب القياسية. أظهرت المقايسة مسافنة ميزته متفوقة لخصوصية المرض أعلى النسب العالية تميز والأجسام المضادة جزيرة شديدة الخطورة من إشارات منخفضة المخاطر، والنسب المنخفضة التي تم إنشاؤها بواسطة المكتب الإقليمي لأفريقيا. هذا هو لاحظت خاصة في المواضيع هم فقط من جزيرة واحدة الأجسام الإيجابية، وحققت تقدما ابدأ داء السكري نوع 1. معظم هذه النسب المنخفضة الأجسام المضادة وجد أنها فقدت أثناء متابعة اختبار القيام به في غضون أشهر إلى سنة، يتصرف بوصفه 'عابرة إيجابية.' كما سبق أن الافتراض، هذه النسب منخفضة 'واحد' الأجسام المضادة قد نتجت عن التحصين مع جزيء تحسن. بينما تقارب أعلى، نتيجة ارتفاع الأجسام المضادة جزيرة المخاطر التحصين مع المستضدات جزيرة ليلى نفسها. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات الممنوعين قد أثبتت قدرتها على تسبق وقت 'السيرولوجي' من فحوصات ملزمة الإذاعة القياسية الحالية (المكتب الإقليمي لأفريقيا) قبل سنوات في الأطفال مع ما قبل السكري، الذين قد اتبعت لمرض السكري السريري من الولادة. التجارب سريرية دولية جارية، "المحددات البيئية السكري" في الشباب (تيدي)، يعتمد على كشف دقيق لتحديد توقيت وظهور الأجسام جزيرة الأولى 'السيرولوجي' وضع علامة على البداية من جزيرة ليلى المناعة الذاتية وتحديد المشغلات البيئية. سبب المحتمل لزيادة الحساسية في مقايسة القامة أن يلتقط الفحص جميع فئات الغلوبولين المناعي: IgG، IgM، إيغا، أو فريق الخبراء الحكومي الدولي، بدلاً من التقليدية المكتب الإقليمي لأفريقيا أو أليسا التي تعتمد فقط على الكشف عن مفتش.

يبدو الربط من الأجسام المضادة للمستضد في فحوصات القامة، لبعض الأجسام المضادة خاصة مثل الأكاديمية، تكون أعاقت ببعض المكونات الموجودة في مصل الدم البشري الطبيعي. لإزالة أو تحرير هذا التثبيط، كانت معاملة حمض عينات المصل اللازم القيام به قبل المصل كان المحتضنة مع مستضد. كما هو موضح فيالشكل 5]، الأكاديمية مسافنة المقايسة، تعززت إلى حد كبير أنشطة ربط الماوس الأنسولين [مونوكلونل] جسم والأجسام المضادة في مصل المرضى مع antigen. عادة يتم تطبيق التحمض عينات المصل، استخدامها في فحوصات الأجسام المضادة، أن تنأى بالمجمعات منضم موجود مسبقاً. الآلية وراء كيف أعاقت في عينات مصل الدم البشري إشارات الأكاديمية وصدر عن التحميض للمصل غير معروف، ولكن قد استخدمت هذا الأسلوب في غيرها يصدرون على أساس فحوصات14،15.

وفي بعض الحالات، عندما وصف الجزيئات، البيوتين أو سالفو، العلامة، بوسيتيونسينسيدي وضع العلامات من جزيئات البروتين مستضد في، أو قريبة جداً من الرئيسية [ابيتوبس] جسم الملزمة، التي قد تتداخل مع نشاط ملزم للأجسام المضادة. وهذا سوف يقلل من حساسية الفحص ويمكن هدم تماما في التحليل. لوصف الإجراءات الروتينية، تعظيم أو التشبع هو المطلوب لكل جزيء البروتين مستضد لتوليد النشاط الحد الأقصى أو إشارة كل جزيء المسمى بتعظيم قدرات وضع العلامات لكل موقف ممكن وضع العلامات. العلامات غير المشبعة يجب تنفيذها من خلال تخفيض نسبة المولى لوصف جزيئات (البيوتين وسالفو، العلامة) للبروتين مستضد إذا وضع العلامات على antigen يصبح سببا ممكناً لانقطاع النشاط ملزمة جسم. [ابيتوبس] الرئيسية يمكن أن تكون أفضل المحجوزة وتوقف النشاط ملزمة جسم يمكن الإفراج عن استخدام استراتيجية التوسيم غير المشبعة في معظم الحالات.

ينبغي أن تتضمن كل مقايسة قياسية عالية الإيجابية والسلبية رقابة داخلية لحساب الرقم القياسي لعينات غير معروفة. عنصر تحكم إيجابية منخفضة قرب الحد الأعلى للمقايسة للضوابط العادية من المهم أن تشمل رصد حساسية المقايسة. ينبغي أن يبقى المختبر مختبرين ما يكفي من عناصر التحكم القياسية الإيجابية والسلبية للاستخدام على المدى الطويل وينبغي تخزين جميع مختبرين في-20 درجة مئوية. لفحص الجودة، يجب أن يتم تشغيل الاختبارات في التكرارات لكل عينة وكل نتيجة إيجابية ينبغي التأكد منه بتكرار النموذج في مقايسة منفصلة. مقايسة ثالثة ضروري عند المقايسة توكيدي الثاني لا يتفق مع الفحص الأولى ونتائج فحوصات اثنين، الذي يوافق (على سبيل المثال.، +، + أو-،-)، سوف يتم التحديد النهائي لنتيجة إيجابية أو سلبية.

لتعيين لواحدة مسافنة فحوصات منهاج العمل، يمكن توسيعها مقايسة متعدد عند من هذه. في نفس الوقت فإنه يمكن تحديد الأجسام المضادة مختلفة تصل إلى 10 في بئر واحدة واحدة مع كمية صغيرة من المصل. الأجسام المضادة جزيرة الأربعة بما في ذلك الأكاديمية، غادة وألف-2 أ ZnT8A حاليا مساوية في الأهمية للتنبؤ بالمخاطر للتقدم إلى T1D في كلا أقارب مرضى T1D والسكان بصفة عامة. الأساليب المستخدمة لفحص هذه الأجسام المضادة 4 باستخدام قياسات الأجسام واحد الحالية شاقة وغير كفؤة، خاصة بالنسبة لفحص السكان الواسعة النطاق. الأهم من ذلك، يصل إلى 40 في المائة من المرضى الذين يعانون من T1D لها شرط الذاتية إضافية16،17،18. ولسوء الحظ، هناك لا توجد أداة سهلة وغير مكلفة للشاشة لهذه الشروط. والرزن مسافنة متعدد ليس فقط قادرة على الجمع بين 4 فحوصات الأجسام الجزيرة الرئيسية الحالية في أحد، ولكن هي أيضا قادرة على مواصلة الجمع بين فحوصات الأجسام أكثر من أمراض المناعة الذاتية الأخرى ذات الصلة. وهذا يجعل من الممكن القيام بكفاءة عالية الإنتاجية الكشف عن أمراض المناعة الذاتية متعددة في وقت واحد في السكان الواسعة النطاق. في مقايسة مسافنة متعدد، كما هو موضح فيالشكل 6]، كل مجمع جسم مضاد-مستضد شكلت في السوائل-المرحلة سيتم ضبط النفس إلى بقعة محددة رابط مصدر في نفس جيدا. استقبال الإشارات على جهاز قارئ لوحة غير قادرة على التعرف على الإشارات الواردة من مصادر مختلفة 10 من البقع. بيد أن البقع مع إشارة عالية للغاية يمكن توليد خلفية مقايسة عالية وتتسبب في حدوث تداخل للبقع المجاورة عن طريق عبر الحديث. ولهذا السبب، ينبغي أن تكون إشارات الحد الأعلى لكل فحص الأجسام محدودة من 20,000 أقل من التهم الموجهة إليه. في تجربتنا، ينبغي أن توضع الأجسام المضادة مع الخلفيات أقل بعيداً نسبيا من تلك البقع بعد التهم أعلى عند تصميم خريطة موضعية. لدراسات طويلة الأمد باستخدام فحوصات مسافنة متعدد، من المستحسن أن تستخدم رابط نفس للمقايسة الأجسام نفسها للحفاظ على تناسق في التحليل.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح DK32083، 2-SRA-2015-51-Q-R منحة JDRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38, (10), 1964-1974 (2015).
  2. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358, (9277), 221-229 (2001).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383, (9911), 69-82 (2014).
  4. Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 , (5), 808-813 (2015).
  5. Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58, (5), 980-987 (2015).
  6. Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53, (2), 384-392 (2004).
  7. Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 , (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
  8. Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 , (6), 1397-1399 (2011).
  9. Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 , (4), 589-597 (2004).
  10. Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36, (8), 2266-2270 (2013).
  11. Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 , (1), 179-186 (2012).
  12. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 , (12), 4174-4178 (2013).
  13. Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
  14. Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, (2), 92-97 (2010).
  15. Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355, (1-2), 21-28 (2010).
  16. Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28, (4), 850-855 (2005).
  17. Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34, (5), 1211-1213 (2011).
  18. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65, (7), 235-247 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics