Electrochemiluminescence анализов для человека островок аутоантител

Immunology and Infection
 

Summary

Здесь мы представили методы для обнаружения аутоантител человека островок с помощью electrochemiluminescence (ЭСЛ) анализов. Протокол, используемый для прогнозирования диабета 1 типа, может быть расширена после выявления аутоантител для других аутоиммунных заболеваний.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Выявлением островок аутоантител, связанные с сахарным диабетом 1 типа (T1D) ведет путь к проекту и сдерживания этого заболевания среди населения в целом. Роман пробирного ECL относится нерадиоактивных жидкой фазы для аутоантител островок с высокой чувствительностью и специфичностью, чем текущий «золото» стандартного радио привязки анализа (РБА). ECL анализов можно более точно определить начала presymptomatic T1D путем разграничения высокого риска, высокоспецифичных аутоантител от низкого риска, низкого сродства аутоантител, порожденных в РБАГ и обычных иммуноферментного анализа (ИФА ). Антигена протеина, используемые в этот assay ECL помечены сульфогруппу tag и биотин, соответственно. Калибровочных ECL аутоантител, использующий определенного антигена протеина потребностей шаг оптимизации, прежде чем он может использоваться для приложений Лаборатории. Этот шаг особенно важна при определении требований для сыворотки кислотных обработок, концентрации и соотношения двух различных антигенов, помечены сульфогруппу tag и биотин. Для выполнения анализа, сыворотки, пробы смешиваются с конъюгированных сульфогруппу тегов и биотинилированным захватить антиген белка в раствора фосфатного буфера (PBS), содержащая 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА). После этого Образцы инкубируют на ночь при 4 ° C. Тот же день, стрептавидина покрытием пластина подготовлен с буфером блокатор и инкубированы всю ночь при 4 ° C. На второй день мыть пластину стрептавидина и передачи сыворотки антиген смесь на плиту. Поместите пластины на пластину шейкер, установите его на низкой скорости и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Впоследствии пластины промывают снова, и читатель буфер добавляется. Пластины затем подсчитывается на компьютере читателя пластины. Результаты передаются через индекс, который генерируется из образцов сыворотки внутреннего Стандартный положительной и отрицательной контроля.

Introduction

Последние промежуточной системы классификации была создана для оказания помощи с диагнозом начальных этапов T1D больных. Точное определение человека островок аутоантител играет важную роль в выявлении и постановка presymptomatic тип 1 диабет, как наличие аутоантител островок указывает на присутствие β-клеток аутоиммунных заболеваний. Скорость, на которой диабет влияет на пациентов из первоначального возникновения β-клеток аутоиммунитета симптомом болезни, связанные с количество и тип островок аутоантител, является переменной2,3.

Возраст аутоантител сероконверсии, титр и близость островок аутоантител может повлиять на скорость прогрессирования симптоматическая тип 1 диабет4,5,6,7,8 ,9,10. Недавно развитые ECL анализов были тщательно проверены, продемонстрировали повышенная чувствительность и являются более конкретных заболеваний10,11,12,13. Эти анализы улучшения прогнозирования и постановка риска мочеизнурения через ранее обнаружения аутоантител островок. Они более точно отмечать начало островок аутоиммунных заболеваний и игнорировать сигналы низкого сродства и низкого риска, не имеющие отношения к диабета.

В assay ЭСЛ аутоантител в сыворотке, если он присутствует, мост сульфогруппу тег конъюгированных антиген антиген биотинилированным захвата в жидкой фазы. После моста, биотин компоновщик поймали в твердой фазе и обнаружен через ECL сульфогруппу метки на пластину стрептавидина покрытием (рис. 1).

В этом обзоре главным образом используются одного антитела ECL анализов с человека островок аутоантител. Вкратце мультиплексируются антитела, которые анализов на основе единого ECL анализов будет обсуждаться. Мультиплекс assay может использоваться для идентификации нескольких, до 10, аутоантител в пределах одного хорошо, с использованием 15 мкл сыворотки. Этот assay простой высокой пропускной способности может использоваться для экран, одновременно, несколько аутоантител для нескольких соответствующих аутоиммунных заболеваний среди населения в целом.

Protocol

1. буфер подготовка

  1. Маркировка буфера (2 x PBS, рН 7.9): 400 мл дистиллированной деионизированной воды (DD), добавить 100 мл 10 x PBS, Отрегулируйте пэ-аш до 7,9 с NaOH.
  2. 3 мм биотина: растворить 1 мг биотина в 588 мкл маркировки буфера.
  3. 3 мм сульфогруппу-Метки: растворить 150 нмоль сульфогруппу-тега в 50 мкл маркировки буфера.
  4. Антиген буфера (5% BSA): 500 мл ПБС, добавить 25 g бычьим сывороточным альбумином (БСА).
  5. Готовят раствор уксусной кислоты 0,5 М.
  6. 1,0 М трис-HCl буфере рН 9,0: подготовить 1 М трис-HCl буфере и скорректировать рН 9,0 с HCl.
  7. Буфер покрытия (3% Blocker A): 500 мл ПБС, добавить 15 g блокатор A.
  8. Отмывающий буфер (0,05% 20 анимации, PBST): 5000 мл ПБС, добавить 2,5 мл 20 анимации.
  9. Чтение буфера (2 x чтения буфера T с ПАВ): 500 мл воды DD, добавить 500 мл 4 x чтения буфера T с поверхностно-активных веществ (Таблица материалов).
  10. Храните в морозильной камере-20 ° C биотина и сульфогруппу тег.
    Примечание: Оба решения биотина и сульфогруппу тег должен всегда быть свежеприготовленные непосредственно перед процедурой маркировки.

2. этикетка человека островок аутоантиген с биотина и сульфогруппу тегов

Примечание: Высокая концентрация антигена, ≥0.5 мг/мл, рекомендуется для более эффективной обозначая реакции.

  1. Определите молярное соотношение человека островок аутоантиген, биотин и сульфогруппу тег.
    1. Получите номер Молярная антигена путем деления веса антигена, молекулярная масса.
    2. Используйте молярное соотношение 1:5 на антиген с молекулярной массой меньше (≤10 kd) и молярное соотношение 1:20 для антиген с молекулярной массой больше (> 50 kd).
    3. Рассчитайте объем биотина или сульфогруппу тегов путем деления его моляра на его концентрации.
  2. Смешайте человека островок аутоантиген с биотина или сульфогруппу тег с молярное соотношение 1:5.
    Примечание: Белка в системах буфера tris или глицин должны быть обменены 2 x PBS буфер с рН 7,9 с помощью калибровки спин столбец.
  3. Поскольку биотин и сульфогруппу тег светочувствительных, покрывают реакции трубы с алюминиевой фольгой. Инкубируйте реакции при комнатной температуре (RT) за 1 ч.
  4. Во время инкубации премьер столбце спин дозирования 2 x PBS буфера в столбце три раза. Центрифуга решение на 1000 x g на 2 мин каждый раз.
    Примечание: В настоящее время обозначая реакции, через мост, все еще происходит и должен быть остановлен.
  5. Остановите обозначая реакции, очищающая помечены человека островок аутоантиген. Для того чтобы очистить, проходят аутоантиген через колонку спин и центрифуги столбца на 1000 x g на 2 мин.
  6. Определение концентрации помечены антигена (мкг/мкл), используя количество антигена протеина и окончательный объем.
    Примечание: Примерно, будет 90-95% удержания помечены антигена после прохождения каждого столбца спина.
  7. Алиготе помечены антигена и хранить помечены антиген-80 ° c.

3. Определите лучшие концентрации и коэффициенты для двух помечены антигены для Assay (проверки Совет проба)

  1. Подготовка двух образцов сыворотки, одно высокое положительное и одно отрицательное, с общим объемом 200 мкл для каждого.
  2. Аликвота 4 мкл сыворотки и добавить ПБС, пока окончательный объем 20 мкл в колодец для 96-луночных ПЦР-планшете. Используйте половину пластины для высокий положительный пример и другая половина для отрицательных образца, как показано на рисунке 2А.
  3. Добавьте 10 мкл биотина и 10 мкл сульфогруппу тега помечены антигена и поведения серийных разведений для двух по-разному помечены антигены, как показано на рисунке 2А. Запустите горизонтальный серийный разрежения для одной меткой антигена и вертикальной серийный разрежения для других помечены антигена.
  4. Продолжить остальные пробирного, описанную в разделе 5.3 до 9.1.
  5. Рассчитайте соотношение сигналов от высокий положительный образец против каждого из соответствующих сигналов от негативных образца показано на рисунке 2B.
  6. Определить лучший концентрации для биотина и сульфогруппу тег помечены антигены, выбрав точку с высоким или вблизи высокий коэффициент позитивный, негативный. Рассмотрим низкой фонового сигнала от негативных образца для определения соотношения.
    Примечание: Assay день 1 включает в себя 4 шага к шагу 6.

4. Подготовьте антиген буфер с помощью правильной концентрации биотина/сульфогруппу тега помечены антигена

  1. Выбор рациональных концентрация каждого антигена, основанный на Пробирной платы проверки.
  2. Подготовка 3 мл раствора антигена на пластину, используя рациональные концентрация биотина/сульфогруппу тега помечены антигена антиген буфера.

5. Проинкубируйте образцы сыворотки с метками антигена

Примечание: Существует два протокола в этом разделе, без сыворотки кислотных обработок и один с кислотной обработки сыворотки. Все островок аутоантител анализов за исключением IAA пробирного используют регулярные протокол без сыворотки кислоты лечения от шагов 5.1 до 5,5, тогда как IAA пробирного пропускает эти шаги и использует протокол с кислотной обработки сыворотки от шагов 5,6 до 5,9.

  1. Аликвота 4 мкл сыворотки и добавить ПБС, пока окончательный объем 20 мкл в колодец для 96-луночных ПЦР-планшете.
  2. 20 мкл раствора помечены антигена на хорошо.
  3. Крышка ПЦР с сальниками фольгой, чтобы избежать свет.
  4. Установите пластину на шейкере (низкая скорость) в РТ за 2 ч.
  5. Установите пластину в холодильнике 4 ° C и инкубировать на ночь (18-24 ч).
    Примечание: Следующий протокол шагах от 5.6 до 5,9 предназначен только для IAA пробирного и других анализов аутоантител пропустить эти шаги.
  6. Смесь 15 мкл сыворотки с 18 мкл уксусной кислоты 0,5 М для каждого образца сыворотки. Инкубируйте эту смесь в РТ по 45 мин.
  7. Приготовляют раствор антигена с рациональной концентрации биотина и сульфогруппу тег помечены антигена, основанный на Пробирной платы проверки, используя буфер антигена. В каждом хорошо, аликвота 35 мкл буфера антигена, содержащие биотин и сульфогруппу тег помечены антигена, в новой ПЦР-планшете.
  8. До завершения этапа инкубации (шаг 5.6) 45 мин, мкл 8.3 1 М трис рН 9,0 буфер на стороне каждой скважины на пластину антигена (шаг 5.6). Важно ограничить смешивания между буфер Tris и антигена. Сразу передача 25 мкл сыворотки, которая рассматривается с кислотой, на шаге 5.6, в каждой скважине и агитировать решение. Крышка ПЦР с сальниками фольгой, чтобы избежать свет.
  9. Наденьте пластину шейкере (низкая скорость) в РТ за 2 ч. Установите пластину в холодильнике 4 ° C и позволяют пластину для инкубации на ночь (18-24 ч).

6. Подготовка стрептавидина пластины

  1. Возьмите тарелку стрептавидина от 4 ° C холодильник и позволяют пластину приехать в Таджикистан.
  2. После стрептавидина пластина на RT, добавьте 150 мкл 3% блокатор A каждой скважины.
  3. Крышка ПЦР с сальниками фольги.
  4. Инкубируйте пластину в холодильнике 4 ° C на ночь.
    Примечание: Пробирного день 2 включает в себя 7 шаг к шагу 9.

7. Передача сыворотка/антигена насиживает стрептавидина пластины

  1. На следующий день, взять стрептавидина пластина из холодильника и сбросить буфер от пластины. Изложены некоторые сухие бумажные полотенца на столе и коснитесь пластину вниз до тех пор, пока есть не более буфера внутри скважины.
  2. Заполните пустой стрептавидина пластины с 150 мкл PBST за хорошо и отказаться от PBST от пластины для в общей сложности три автомойки.
  3. Передачи 30 мкл сыворотка/антигена насиживает в колодец в пластину стрептавидина.
  4. Крышка с фольгой, чтобы избежать свет. Встряхните пластину, на низкое значение, в РТ за 1 час.

8. вымойте тарелку и добавьте буфер чтения

  1. Отменить насиживает от пластины. 150 мкл PBST в колодец и отказаться от PBST от пластины для в общей сложности три автомойки.
  2. После мытья, 150 мкл на хорошо чтения буфера.
    Примечание: Это важно для предотвращения пузырьков воздуха в решении, поскольку это повлияет, как пластины читается на компьютере читателя пластины.

9. чтение пластину и анализ данных

  1. Граф пластину на компьютере читателя пластины. Антитело значения отображаются в виде графов в секунду (CPS).
  2. Передайте уровни антител, полученный от компьютера читателя пластины как относительный индекс. Расчет индекса из следующего уравнения:
    Стоимость индекса = [CPS (образец) - CPS (отрицательный контроль)] / [CPS (положительный контроль) - CPS (отрицательный контроль)].
  3. Выявить антитела положительных и отрицательных результатов с использованием отсечения для позитивности, определены основанные на 99-й процентиль 100 здорового управления субъектов (не диабетиков лиц без каких-либо известных аутоиммунных заболеваний и которые не имеют семьи истории диабета).

Representative Results

Рисунок 2 показывает проверки Совет. Показано, что 250 нг/мл, биотина и 250 нг/мл сульфогруппу-тега помечены антигена являются наиболее рациональным концентрации, используемые в assay, считая сигналы от высокий положительный контроль образец, пример отрицательного контроля пробирного фон и соотношение позитивные, негативные сигналы. С оптимизированной концентрации этих двух помечены антигены проба была выполнена с образцов сыворотки от 100 недавно диагностированных пациентов с T1D и 100 здоровых элементов управления. Значение индекса 0,023 был определен как пробирного отсечения для положительности. Это представляет чувствительность 85% пациентов и 99% специфичности в здоровых элементов управления с помощью приемник операционной характеристика (ROC) показано на рисунке 3A. Assay для неизвестных образцов было проведено с внутреннего стандарта высокой срабатываний, низких положительных и отрицательных контрольных образцов. Результаты CPS отсчеты отображаются в таблица 2A. Значит, CPS высоких и низких положительных элементов, выделены красным цветом, 17903 [(19940+15866)/2] и 839 [(857+820)/2], и негативный контроль, выделены зеленым цветом, 168 [(170+165)/2]. Индекс для неизвестных образцов рассчитывается путем» (CPSобразца-168)/(17903-168).» Таблица 2B показывает значения расчетного показателя для всех образцов. Индекс значения, которые больше, чем 0,023 записываются в красном, соответствующие значениям CPS, также написан красным цветом в таблице 2A. Эти значения будут определяться как положительные результаты, которые больше чем 99ую персентиль населения здорового контроля. Когда концентрация нерациональным антиген используется, assay будет иметь высокий фон, как показано в таблице 2 C. Низкий уровень антител положительные будет не хватать как значения A2 и A5, D1, H4, выделены серым цветом в таблице 2D.

Figure 1
Рисунок 1 : Иллюстрации двухвалентные пластины захвата на одном ECL-IAA assay. Островок аутоантител в сыворотке мосты сульфогруппу тег конъюгированных антиген биотинилированным захвата антиген, который захватил в твердой фазе на пластину стрептавидина покрытием. Обнаружение пластина захватили сульфогруппу тег конъюгированных антигена осуществляется через ECL. Эта цифра была изменена с ю., и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : ROC кривой для определения светотеневой границы пробирного позитивность. 99-ую персентиль специфики соответствующих 85% чувствительность был выбран и представляется как значение индекса 0,023. Этот верхний предел проба была взята из 100 здоровых элементов управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Иллюстрации нормальной человеческой сыворотки, блокируют сигналы ECL-IAA. A: сигналы от ECL-IAA анализов с инсулина моноклональные антитела (Моава) резко были заблокированы путем добавления обычной человеческой сыворотки. При сравнении Моава в PBS, сигнал было частично восстановлено когда лечился сыворотку крови человека с кислотой. B: сигналы от ECL-IAA assay с 4 пациента sera были значительно повышена с кислотной обработки. Эта цифра была изменена с ю., и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Иллюстрации Mutiplex ECL assay. Комплексы антител антигена образуются в жидкость фазы с конкретными компоновщики. Конкретных комплексов антител антигена компоновщик сдержанно по каждому из конкретных компоновщик мест в то же хорошо. Машина пластины читатель способен различать сигналы от разных источников пятен и дает CPS рассчитывает на 10 различных каналов, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: Пробирной платы проверки определяет, концентрации и соотношения биотина и сульфогруппу тег помечены антигены. A: raw CPS подсчитывает для проверки Совет пластины с высоким позитивные сыворотки на половине пластины и отрицательные сыворотки на другой половине. Концентрация антигена биотинилированным был разведен горизонтально в серии и концентрация сульфогруппу тега помечены антигена был разведен вертикально в серии. B: соотношение значения CPS счетчики высокий положительный Сыворотка против каждой из их соответствующих счетчиков CPS от негативных сыворотки. Желтый подчеркнул скважин представляют собой наилучшее соотношение положительных к отрицательным в группе B. Это соотношение соответствует 250 нг/мл биотина и 250 нг/мл сульфогруппу тег помечены концентрации антигена в панели A с приемлемо низкой CPS счетчик для отрицательных сыворотки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблицы.

Table 2
Таблица 2: анализ результатов пробирного. A: raw CPS насчитывает от пробирного пластины с стандартным высоких и низких положительных элементов, выделены красным и стандартные негативный контроль, выделены зеленым цветом. Каждый образец был продублирован в assay. B: индекс значения были рассчитаны, как описано в протокол assay. Любое значение индекса, которое было больше, чем 0,023 был определен как положительный результат, выделены красным цветом. C: сырье CPS насчитывает от пробирного пластины с тем же набором образцов при концентрации нерациональным антиген. Это привело к высоким фона и некоторые низкой срабатываний обычно обнаруживается, как показано в группе B, были преобразованы в негативов, выделены серым цветом в панели D. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблицы.

Discussion

Островок аутоантител в настоящее время являются наиболее надежным биомаркеров для аутоиммунных заболеваний диабетом типа 1. Они Марк начала островок конкретных аутоиммунных заболеваний и определить риски явной болезни. ECL assay для островок аутоантител, широко протестирован в нескольких национальных и международных тип 1 диабета клинических испытаний. Assay показал, повышенная чувствительность и специфичность по сравнению с текущей «золото» Стандартный РБАГ. ECL assay показал его превосходное преимущество для более высоких характерности болезни взыскательные высокоспецифичные и риска островок аутоантител от низкого риска, низкого сродства сигналы, генерируемые РБА. Это особенно заметил по предметам, которые являются только один островок аутоантител позитивные и никогда не продвинулись на диабет типа 1. Большинство этих низкого сродства аутоантител были найдены, чтобы быть потеряны во время следить за тестирование сделано в течение месяцев, лет, ведут себя как «временных позитивных». Как ранее предположил, эти низкого сродства, которую «одиночных» аутоантител вероятно в результате иммунизации с молекулой cross-reactive. Хотя выше сродство выше риск островок аутоантител в результате иммунизации с антигенами островок, сами. Кроме того ЭСЛ анализы продемонстрировали способность осуществил время «сероконверсии» от текущего стандартного радио привязки анализов (РБА) по годам в детей с преддиабет, которые использовались для клинических диабет от рождения. Текущих международных клинических испытаний, экологические детерминанты диабета в молодых (Тедди), зависит от точного обнаружения для точного определения сроков и появление первых островок аутоантител «сероконверсии» в ознаменование начала островок аутоиммунные заболевания и выявления экологических триггеры. Возможная причина повышенной чувствительности в ECL assay является assay захватывает всех классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, или IgE, вместо традиционных РБА или ELISA, которые полагаются только на выявление IgG.

В ECL анализов, для некоторых конкретных аутоантител как IAA привязки аутоантител к антигену, как представляется, тормозится некоторых компонентов, присутствующих в нормальной человеческой сыворотки. Чтобы удалить или освободить это торможение, кислотная обработка образцов сыворотки было необходимо сделать, прежде чем сыворотка была инкубировали с антигеном. Как показано на [рисунке 5], ЭСЛ-IAA assay привязку деятельности моноклонального антитела мыши инсулина и аутоантител сыворотке крови пациентов с антигеном был значительно усовершенствован. Подкисление образцов сыворотки, используемых в антитела анализов, обычно применяется к отделить ранее существовавших привязанных комплексов. Механизм позади как IAA сигналы тормозится в образцах сыворотки крови человека и выпущенная подкисления сыворотки не известно, но этот метод был использован в других ECL на основе анализов14,15.

В нескольких случаях, когда маркировки молекул биотин или сульфогруппу тега, обозначая positionsinside антигена белковых молекул, на, или очень близко к ключевым epitopes антитела привязки, который может вмешиваться в действие привязки к антителам. Это позволит уменьшить чувствительность пробирного и может полностью разрушить assay. Для обычной процедуры маркировки максимизации или насыщенность желательно для каждой молекулы белка антигена для создания максимальной активности или сигнала на обозначенные молекулу путем максимального маркировки потенциала все возможные позиции маркировки. Ненасыщенных маркировки должны выполняться путем уменьшения молярное соотношение маркировки молекул (биотина и сульфогруппу тегов) для антигена протеина, если маркировка на антиген становится возможной причиной прерывания деятельности антитела binding. Майор epitopes могут быть лучше защищены и прерывания деятельности связывания антител может быть освобожден с помощью ненасыщенных маркировки стратегия в большинстве случаев.

Каждая проба должна включать внутренний стандарт высокие положительные и отрицательные контроль для расчетов индекса неизвестных образцов. Низкая положительный контроль вблизи верхнего предела пробирного обычных элементов управления важно включить мониторинг анализа чувствительности. Лаборатории должны держать достаточно аликвоты стандартных положительной и отрицательной контроля для длительного использования и все аликвоты должны храниться при температуре-20 ° C. Для анализа качества анализов должны запускаться в дубликаты для каждой выборки и каждый положительный результат должен быть подтвержден повторять образец в отдельном assay. Третья проба необходим, когда вторая подтверждающие assay не согласен с первой пробы и результаты двух анализов, которые соглашаются (например., +, + или-, -), будет окончательное определение положительный или отрицательный результат.

С платформой для одного ECL анализов мультиплексированных пробирного может быть расширена по от них. Одновременно он может определить до 10 разных аутоантител в одной одной скважины с небольшое количество сыворотки. В настоящее время четыре островок аутоантител, включая IAA, Гада, IA-2A и ZnT8A равны в важности прогнозирования риска прогрессии к T1D в обоих родственников больных с T1D и населения в целом. Методов, используемых для отбора этих 4 аутоантител, используя текущие измерения одного аутоантител трудоемким и неэффективным, особенно для больших масштабах населения скрининга. Важно отметить, что до 40% пациентов с T1D имеют дополнительное условие аутоиммунных16,17,18. К сожалению это не простой и недорогой инструмент для экрана для этих условий. Мультиплекс assay ECL способен не только объединения 4 текущих основных островок аутоантител анализов в один, но также способны далее объединить больше аутоантител анализов из других соответствующих аутоиммунных заболеваний. Это позволяет эффективно проводить высокой пропускной способности, скрининг на несколько аутоиммунных заболеваний одновременно в больших масштабах населения. В мультиплекс ECL assay как показано на [рисунке 6], каждый комплекс антител антигена, образованная в жидкость фаза будет удерживаться на место источника конкретных компоновщика в то же хорошо. Приемник сигнала на компьютере читателя пластины может распознать сигналы от 10 различных источников пятен. Однако пятна с чрезвычайно высокий сигнал может генерировать высокий пробирного фон и помехи соседних пятна через кросс talk. По этой причине верхний предел сигналов для калибровочных аутоантител должна быть ограничена менее 20 000 пунктам. По нашему опыту аутоантитела с нижнего стола следует относительно далеко от этих мест, имеющих выше пунктам, когда пятно карта предназначена. Для долгосрочных исследований с использованием мультиплексных ECL анализов рекомендуется использовать же компоновщик для assay же аутоантител держать assay последовательной.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH Грант DK32083, JDRF Грант 2-SRA-2015-51-Q-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38, (10), 1964-1974 (2015).
  2. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358, (9277), 221-229 (2001).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383, (9911), 69-82 (2014).
  4. Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 , (5), 808-813 (2015).
  5. Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58, (5), 980-987 (2015).
  6. Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53, (2), 384-392 (2004).
  7. Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 , (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
  8. Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 , (6), 1397-1399 (2011).
  9. Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 , (4), 589-597 (2004).
  10. Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36, (8), 2266-2270 (2013).
  11. Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 , (1), 179-186 (2012).
  12. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 , (12), 4174-4178 (2013).
  13. Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
  14. Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, (2), 92-97 (2010).
  15. Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355, (1-2), 21-28 (2010).
  16. Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28, (4), 850-855 (2005).
  17. Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34, (5), 1211-1213 (2011).
  18. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65, (7), 235-247 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics