一种基于流式细胞仪的检测方法, 用于识别破坏荧光标记的 CXC 趋化因子配体12到 CXC 趋性因子受体4的化合物

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

本文介绍了一种基于流式细胞术的细胞结合检测方法, 主要用作筛选工具, 用于识别抑制荧光标记为 CXC 趋化因子配体 12 (CXCL12) 的化合物对 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 的束缚。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

药物靶向 G 蛋白偶联受体 (受体) 是非常重要的人类健康, 因为功能失调的 GPCR 介导信号有助于许多疾病的进展。配体/受体对 CXC 趋化因子配体 12 (CXCL12)/CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 引起了重要的临床兴趣, 例如作为治疗癌症和炎症性疾病的潜在目标。因此, 小分子以及专门针对 CXCR4 和抑制受体功能的治疗性抗体被认为是宝贵的药理工具。本文介绍了一种基于流式细胞仪的细胞检测方法, 它可以识别出将 CXCL12 绑定到 CXCR4 的化合物 (例如,小分子)。从根本上说, 该检测依赖于固定量的荧光标记为 CXCL12, CXCR4 的自然趋化因子激动剂和未标记化合物之间的受体结合的竞争。因此, 本试验避免了放射性标记探针的不良使用。此外, 活细胞被用作受体 (CXCR4) 的来源, 而不是细胞膜的准备。这样就可以方便地将检测方法与平板格式进行调整, 从而提高了吞吐量。这种检测已被证明是一种有价值的通用药物发现检测, 以确定 CXCR4-targeting 化合物。该协议可能会适应其他受体, 至少如果荧光标记配体可用或可以生成。对于在激活这些受体时诱导的细胞内信号通路的先验知识是不需要的。

Introduction

G 蛋白耦合受体 (受体) 是细胞表面蛋白, 可由胞外配体 (例如,肽, 蛋白质激素, 胺) 激活, 从而调节许多生理和发育过程1。当激动剂占据其 GPCR 结合袋, 诱导构象变化的受体蛋白促进与细胞内受体相关的 heterotrimeric g 蛋白的结合, 由 gα-GDP 和 gβγ亚基组成。随后, gα亚基的 GDP 交换 GTP 导致 g 蛋白亚基 (gα-GTP 和 gβγ) 的离解, 进而将进一步启动下游信号通路23。当 gα-GTP 水解后, gα-GDP 和 Gβγ亚基的重新组合将 g 蛋白转换回休眠状态3,4。不同类型的 g 蛋白存在 (gs, g i/o,gq, g12/13), 这些分类基于序列相似性与 Gα亚基5。所有这些 G 蛋白诱导定义的细胞内信号通路的基础上的生物反应的受体活化。受体活化后, GPCR 激酶 (GRKs) phosphorylate 受体的细胞内尾部, 从而促进与β arrestins 的相互作用。这一过程导致 G 蛋白信号的终止, 受体脱敏和内部化6。β-arrestins 也是多分子复合体的一部分, 触发信号叶栅独立于 G 蛋白信号7

受体是治疗干预的最有效的分子靶点之一, 因为解除 GPCR 介导的信号, 例如由于受体基因或受体过度表达的功能增益突变, 导致许多人类疾病8。因此, 受体代表了制药行业调查的最重要的药物靶类之一8,9,10。临床相关 GPCR 的一个显著例子是 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4), 它可以由唯一的天然配体激活, CXC 趋化因子配体 12 (CXCL12)11。由于其作为人体免疫机能丧失病毒 1 (HIV-1) 进入和感染的主要联合受体在分化 4 (CD4) 阳性 T 淋巴细胞12中已确立的作用, CXCR4 首先被调查为抗病毒药物靶。CXCL12-CXCR4 在骨髓中的相互作用进一步调节茎和祖细胞的保留和归巢13。此外, 考虑到它参与癌症生物学的许多方面 (例如,肿瘤细胞存活, 转移, 肿瘤相关血管生成)14和其他一些人类疾病 (例如,炎症疾病)15, CXCR4作为药物发现的一个有希望的目标, 引起了极大的兴趣。AMD3100, 一个专门针对 CXCR4 的小分子, 最初被发现为抗 HIV 药物候选16 , 仍然是迄今为止17所描述的最有效的 CXCR4 拮抗剂之一。然而, 它作为抗病毒药物的发展已停止了18。目前该分子作为干细胞动员剂在治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者中的应用18。其他一些化学无关的小分子和生物制剂, 抑制 CXCR4 功能的不同效力被描述为19

受体结合方法是药理学中有价值的工具, 可以识别与 GPCR 直接作用的化合物 (例如,小分子)。为了进行具有约束力的研究, 不需要事先了解一个给定 GPCR 的胞内信号特性或功能。虽然这可以被认为是一个优势, 它意味着可以证明受体结合的化合物需要进一步的特点, 评估其潜在的竞赛或拮抗活性。这项活动可以用药理学或生物化验方法来评估, GPCR 正在研究中。依赖于它们的活动剖面, 受体结合分子可能会进化成为新的铅化合物, 用于研究前临床和临床研究。分子, 专门绑定到一个高亲和力的受体也可以作为支架, 以产生治疗或诊断工具, 例如通过 radiolabeling 他们为无创性的在体内成像肿瘤细胞20, 或作为潜在的有针对性地提供治疗方法的车辆21。在 CXCR4 的情况下, 肿瘤细胞的体内成像已经用老鼠模型证明了, 其中标记了 CXCR4-targeting 分子允许人类癌症的可视化20,22,23.

在本报告中, 我们描述了一项竞争结合试验的详细协议, 它能够识别直接干扰激动剂 (CXCL12) 与 CXCR4 结合的小分子和生物制剂。该检测的基本原理是在固定量的荧光标记配体之间的竞争 (CXCL12AF647, 参见材料和试剂表) 和未标记的化合物绑定到受体蛋白17,24. 然后用流式细胞仪分析标记配体与单细胞表达 CXCR4 的特异荧光信号。当未标记的小分子破坏 CXCL12AF647和 CXCR4 之间的交互时, 此荧光信号将会减少。该化验使用非操作的活细胞内在表达 CXCR4 (即, Jurkat 细胞)。因此, 不需要细胞膜的准备, 这使得化验方便, 快速, 并与增加的吞吐量兼容。由于使用了荧光标记配体, 放射性被避免。

由于 CXCL12 是 CXCR4 的自然激动剂, 因此干扰 CXCL12AF647绑定的小分子化合物很可能与 orthosteric 受体结合站点 (即,由自然激动剂)。如果它们不影响 CXCL12 的束缚, 那么与 orthosteric 结合部位地形不同的受体结合部位的分子将保持不被察觉。例如, 积极和消极的构调制器, 一个重要的和新兴的类别的 GPCR 靶向分子作用于构结合点25, 将有可能不会被拿起这个化验。此外, 是否有这种结合的检测功能的化合物, 作为受体拮抗剂或兴奋剂不能获得。因此, 需要对所鉴定的化合物进行其他药理学或功能受体相关化验。这些化验可能包括 (组合) 细胞荧光或基于发光的检测第二信使 (例如, Ca2 +, 循环腺苷磷酸 (阵营)), 表型或生物测定和β arrestin招聘分析的选择取决于研究中 GPCR 的具体信号特性。因此, 本文所描述的竞争性结合试验主要是一种初步筛选化验, 需要辅以其他细胞化验, 以使化合物具有受体结合效力的深入描述。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 细胞培养的维护

注: 1 和2所述的所有步骤均在层流柜的无菌条件下进行。

  1. 在37摄氏度和 5% CO2的 T75 培养瓶中生长细胞在一个湿润的孵化器。
    注: 在本试验中, 使用 Jurkat 细胞 (即,内在表达 CXCR417) 的人白血病 T 淋巴细胞细胞。CXCR4 在细胞表面的表达应通过流式细胞仪在细胞培养过程中进行评价。但是, 对流式细胞术和试剂的描述, 以确定细胞表面的受体表达水平, 但不属于本协议的范围, 但以前已经描述过17
  2. 让 Jurkat 细胞在悬浮中生长, 直到它们达到 80-85% 融合。在将细胞传代到新的烧瓶之前, 允许所有试剂达到室温 (RT)。
  3. 添加20毫升新鲜完整的生长培养基 (RPMI-1640 培养基, 10% 胎牛血清 (血清), 2 毫米谷氨酰胺) 到一个新的 T75 培养瓶。
  4. 添加5毫升的 Jurkat 细胞悬浮从原来的 T75 瓶 (包含25毫升细胞悬浮) 到新的 T75 培养瓶。孵育在37°c 和 5% CO2在一个湿润的孵化器。

2. 制备 CXCL12、化验缓冲器和 Jurkat 细胞进行竞争结合试验。

  1. 准备 CXCL12AF647 (20 µg/毫升) 的库存解决方案; 请参阅材料和试剂表) 溶解冻干试剂 (存储在-80 °c, 在黑暗中) 在超纯水补充 0.01% (容量/体积) 吐温20。存储单使用整除数从这个库存解决方案在-80 摄氏度, 保护免受光。
  2. 通过添加40毫升 HEPES (1 米, 20 毫米最终浓度) 到200毫升汉克的平衡盐溶液 (HBSS, 10x, 不含酚红色和不含碳酸氢钠, 1x 最终浓度) 制备化验缓冲器。添加超纯水以获得 2 l 的最终体积, 添加4克 (0.2% 重量/体积) 牛血清白蛋白 (bsa), 并通过磁性搅拌溶解 bsa。最后, 调整 pH 值为 7.4 (使用氢氧化钠) 和过滤溶液通过0.2 µm 毛孔 (参见材料表和试剂) 使用真空歧管。
    注: 此检测缓冲器将用于该议定书的所有进一步步骤。
  3. 计算单元格的数量和生存能力。为此, 取一个细胞悬浮的样品和稀释它在磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
    注意: 我们经常使用自动细胞生存能力分析仪 (参见材料和试剂表), 能够在不同浓度下计数细胞悬浮液。对于细胞计数, 稀释0.5 毫升细胞悬浮在1.5 毫升 pbs (其他稀释,例如, 0.1 毫升在1.9 毫升 pbs, 也是可能的)。此方法的使用是基于台盼蓝染料排除方法, 以前已经描述了26。还有一些其他的设备在商业上可用于计数细胞数和生存能力, 应该同样良好的工作。
  4. 收集所需的单元格数 (即, ~ 24 x 106在无菌50毫升管中使用一个完整的 96-井板来运行化验结果) 离心 (参见材料和试剂的为离心机的类型) 在 400 x g 为5分钟在rt.
  5. 在不干扰细胞颗粒的情况下, 轻轻地倒上清液。添加新鲜化验缓冲区 (例如, 20 毫升), 并通过轻轻吹打向上和向下并用重悬细胞。
  6. 再次离心细胞在 400 x g 5 分钟的 RT。
  7. 再次倒入上清液, 并在新鲜的化验缓冲器中并用重悬细胞颗粒, 以获得 5 x10 6 细胞/毫升的密度。

3. 竞争结合试验

注: 实际的竞争结合试验是在 RT 进行的, 可以在无菌条件下进行。

  1. 稀释检测缓冲物中所研究的化合物 (见 2.2) 以获得所需浓度。要么准备一个固定浓度的化合物初始筛选 (例如, 10 µM 最终浓度), 或者, 或者, 一个系列稀释系列的浓度, 以更详细的描述化合物 (例如, 1/3, 1/4 或 1/5稀释系列从1µM 开始, 最后集中)。请记住, 复合溶液最终将成为2x 稀释的化验;因此, 准备一个2x 集中解决方案。
  2. 将100µL 的复合溶液 (2x 浓缩) 成一个清晰的96井圆底板 (参见材料目录和试剂表), 按照预定义的实验布局 (例如, 图 1C)。
    注: 在这个阶段, 阴性和阳性对照样品包括在化验中。在负控制样本中, 将100µL 的检测缓冲器添加到96井板的井中, 而不是复合物。对于正则控件示例, 在此步骤中还添加了检测缓冲区。另请参见图 1C中的典型实验布局, 其中对几种化合物的稀释系列进行了测试。
  3. 添加50µL 的细胞悬浮 (见 2.7; 0.25 x 106细胞) 从试剂库到96井板使用多通道吸管。在黑暗中在 RT 中孵化出15分钟的盘子。
  4. 添加50µL 的荧光标记为 CXCL12 (即, 100 ng/毫升 CXCL12AF647在化验缓冲区, 4x 浓缩, 25 ng/毫升最终浓度) 从一个类似的试剂库到96井板井。在黑暗中在 RT 孵化30分钟。
    注意: 对于负控件示例, 请改用检测缓冲区。因此, 在负控制样本中检测到的荧光信号将对应于 autofluorescent 背景信号 (图 1A)。对于正则控件示例, 请添加50µL CXCL12AF647。阳性控制样本将产生最大荧光信号检测, 因为不包括预先孵化与化合物的潜在抑制 (图 1A)。
  5. 离心96井板在 400 x g 为5分钟在 RT. 通过翻转盘子从颗粒细胞中取出上清。在纸巾上擦干盘子。
  6. 用多通道吸管在试剂库中添加200µL 的新鲜化验缓冲器。立即进行。
  7. 再次离心板5分钟, 在 400 x g 在 RT. 通过翻转盘子, 再将其干燥在组织上, 取出上清液。
  8. 轻轻并用重悬细胞颗粒在200µL 的1% 多聚甲醛溶解在 PBS。此步骤将修复单元格。
  9. 使用流式细胞仪对荧光进行量化, 立即继续该协议。

4. 流式细胞术对样品的分析

CXCL12AF647染色和固定细胞现在可以使用流式细胞仪进行分析。可以使用几种类型的流 cytometers, 但它们需要配备正确的激光 (一个红色激光, 励磁范围 ~ 630 nm) 为励磁和适当的过滤器为荧光检测 (发射过滤器 ~ 660 毫微米)。他们需要能够处理样品的96井板格式。在材料和试剂表中给出了合适的流式细胞术装置的例子。

  1. 启动设备并打开相应的软件 (请参阅材料和试剂表)。
  2. 选择下面的蜂窝参数以斑点印迹格式进行可视化: 正散射 (FSC)、侧散点 (SSC) 和荧光 (CXCL12AF647) 检测通道。
    注: 在 FSC 参数下, 由于检测到的光吸收与细胞直径成正比, 因此根据其大小对细胞进行判别。SSC 参数, 测量在90°角的光散射, 提供了有关细胞粒度的信息。
  3. 选择一个示例 (例如,一个负控制样本), 根据 FSC 和 SSC 参数执行已定义的同质细胞填充的浇口。
    1. 选择自动注射100µL 的固定细胞从这个负控制样本进入流式分析仪。在注入前选择 "混合" 选项, 并使用1.5 µL 的采样流率。
    2. 通过选择 "获取数据" 运行此示例。此示例的 FSC 和 SSC 参数现在将显示在屏幕上。
    3. 选择软件的浇口工具。基于 FSC 和 SSC 斑点杂交可视化, 预先定义了一个均匀和可行的细胞群的门。为此, 请创建一个多边形 (使用软件的浇口工具), 其中包括基于这两个维度的 homogenously 分布式单个单元格 ("事件")。
      注: 浇注程序的目的是定义一个均匀和可行的细胞群体, 将用于进一步分析。浇口依赖的假设, 大多数可行的细胞将形成一个同质细胞种群的基础上的 FSC 和 SSC 参数。通过执行这一步骤, 细胞碎片、死细胞和细胞聚集物可以很大程度上被排除在进一步分析之外。在图 1B中给出了浇口过程的说明。
  4. 选择以分析每个示例的2万个 "事件" (即,单个单元格)。
    注意: 这意味着对于每个样本, 在预定义的门内的2万个单元将最终被分析。每个示例的数据获取将继续进行, 直到分析此事件的数量。
  5. 启动运行 (选择 "记录数据")。流式细胞仪现在将通过记录每个样本的平均荧光强度 (多边基金会) 对所有样本进行一次分析。这一多边基金会对应于2万个细胞的平均荧光信号在预定的门之内。

5. 数据分析

使用为每个样本获得的多边基金会执行所有进一步的计算。对流式细胞仪数据的分析可以通过几个商业上可用的软件包进行 (参见材料和试剂表)。

  1. 为了确定荧光结合信号的百分比抑制, 由于复合预孵化, 应用以下公式:
    Equation 1
    地方:
    "多边化" Exp = 实验性 (= 复合处理) 示例的多边化
    "多边化" PC = 正控件的多边化
    多边化NC = 负控制的多边化
  2. 要确定复合 () 的 IC50值, 可将荧光绑定信号减少50% 的化合物的浓度, 请应用以下公式:
    Equation 2
    地方:
    Log轻质. 2 = 一个化合物浓度的对数, 导致不到50% 抑制 PC 和 NC 的多边化值之间的差异
    Log轻质 1 = 一个化合物浓度的对数, 导致超过50% 抑制了 PC 和 NC 的多边建筑的价值之间的差异。
    注: 另外, 在高活性化合物的情况下, 可以根据每个测试的化合物浓度对应的多边建筑, 生成覆盖数个震级对数的剂量响应曲线。通过使用适当的软件 (参见材料和试剂表) 应用非线性回归曲线, 可以从生成的曲线推断出 IC50值。此分析方法的一个示例显示在图 3中。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

绑定分析的一般工作流显示在图 1A中。在图 1B中描述了在标准实验中为不同样本类型获得的流式细胞仪数据的类型 (负控制、正控制和实验样本), 以及可能的版面布局来执行96井板格式的化验在图 1C中给出。Jurkat 细胞的孵化, 内在表达趋化因子受体 CXCR4 (即,这一检测中的兴趣 GPCR), 随着荧光标记 CXCL12 (即, CXCL12AF647) 的数量增加, 导致荧光水平 (图 2), 反映了与 CXCR4 的配体结合程度的增加。为了证明 CXCL12AF647绑定的受体特异性, 使用了一个建立良好的和受体特异的 CXCR4 拮抗剂 (小分子 AMD3100)。Jurkat 细胞首先预先孵化了1/5 稀释系列 AMD3100 范围从 0.064 ng/毫升到 1000 ng/毫升, 其次是孵化与最终浓度 25 ng/毫升 CXCL12AF647 (即,固定数量的标记趋化因子在化验中经常使用)。然后, Jurkat 细胞进一步处理, 如议定书所述。通过流式细胞仪分析所有样品, 得到了固定量的 CXCL12AF647到预孵化的 Jurkat 细胞后的荧光信号 (平均荧光强度, 多边化)。这种荧光信号几乎可以完全抑制, 以防 Jurkat 细胞被预先治疗的最高浓度的 AMD3100 (1000 ng/毫升)。在这种情况下, 荧光的抑制水平仅略高于 Jurkat 细胞的自体荧光水平对应的背景水平。总之, 在结合试验中应用 25 CXCL12 (最终浓度) 的AF647 , 产生了一个大的荧光信号窗口 (当与负控制相比) 与最小的残留水平的非特定受体结合 (图 3A)。

这种结合试验主要用于筛查化合物在单固定浓度下阻断未标记化合物面板中的配体结合, 或研究活性化合物的剂量依赖性效应。在后一种情况下, 目标是获取 IC50值 (, 抑制绑定信号的化合物浓度为 50%), 这反映了化合物的结合效力。图 3演示如何使用此绑定分析获得的流式细胞术数据可用于确定小分子的抑制效力 (从 IC50) 到干扰 CXCL12 对 CXCR4 的绑定。基于 AMD3100 对 CXCL12AF647绑定的剂量依赖性抑制, 应用非线性回归分析方法确定了 IC50值。在此示例中, 用于 AMD3100 的计算的 IC50值对应于 18.12 ng/mL。由于在筛选活动中, 大多数随机选择的化合物预计不会抑制 CXCL12AF647对 CXCR4+ Jurkat 单元格的绑定, 因此本研究中也包括了非活动化合物的一个示例。在这里, 小分子 maraviroc, 通过充当 CC 趋化因子受体 5 (CCR5)27的特定拮抗剂, 在结合试验中进行了有效的 anti-HIV-1 活动。在预孵化 Jurkat 细胞与 maravoric, 即使在最高浓度测试 (100 ng/毫升), 未发现最大荧光结合信号的抑制;图 3B)。在同一实验中, AMD11070 的一系列稀释系列, 另一个与 AMD3100 相关的小分子, 但含有改进的药代动力学特性28。与 maraviroc 不同的是, 从0.0064 到 100 ng/毫升的1/5 稀释系列 AMD11070 清楚地和剂量依赖性抑制 CXCL12AF647绑定 (图 3B)。

Figure 1
图 1: 工作流的概览和获得的数据类型的说明.(A). 该协议的主要步骤为阴性和正向控制样本和复合处理样品图解。不含复合预孵化的样品, 不添加荧光标记的趋化因子 (CXCL12AF647), 以确定背景 (自动) 荧光 (阴性对照样品)。没有复合预孵化的样本, 但添加了固定量的 CXCL12AF647用于确定检测中的最大绑定信号 (正控制样本)。在复合处理的样品中, 在添加固定量的 CXCL12AF647之前, 先用复合物预先孵化细胞。(B). Jurkat 细胞流式细胞分析法测定了均值荧光结合信号。从所有事件 (即, Jurkat 单元格) 分析 (左面板) 只有从封闭的细胞群中的荧光信号用于进一步分析 (中间板)。小分子细胞的预孵化 (例如, AMD3100) 抑制荧光标记的受体配体的结合, 这将减少最大绑定信号 (右面板, 显示在直方图表示)。(C). 在96井板格式中执行竞争性装订试验时, 可能的板布局。在这种情况下, 六种不同的化合物 (1-6) 测试在1/5 系列稀释系列 (重复) 范围从1000毫微米到0.32 毫微米。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 将 CXCL12AF647绑定到 Jurkat 单元格.Jurkat 细胞以增加的 CXCL12AF647的数量进行孵化, 缺乏预培养的化合物。平均荧光强度 (以任意光单位表示的多边基金会) 显示 (n = 2)。采用非线性回归法进行曲线拟合, 采用单点全约束模型后的方程

Equation 3

使用B最大 (最大特定绑定) = 18345;Kd = 92.8 ng/毫升;NS(不特异的束缚的倾斜) = 2.139;和背景= 332.6。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 通过活动和非活动化合物抑制 CXCL12AF647的绑定.(A) 剂量依赖性抑制 CXCL12AF647的预孵化细胞与增加的 AMD3100 浓度, 之前添加 25 ng/毫升 CXCL12AF647。请注意, 最大抑制平均荧光强度 (在任意光单位表示) 仍然略高于背景 (自动) 荧光获得的 Jurkat 细胞 (平均 * SD (n = 3))。用变斜率 (四参数) 的非线性回归进行曲线拟合, 根据

Equation 4

这里的山坡为 1.313, 计算出的 IC50为 18.12 ng/毫升。(B). AMD11070 和 maraviroc 对 CXCL12AF647绑定到 CXCR4+ Jurkat 单元 (3) 的剂量依赖性效应。AMD11070 响应的曲线拟合类似于山坡1.458 和计算出的 IC50值 0.9052 ng/毫升。对于 maraviroc 反应, 由于该化合物缺乏活性, 所以没有进行拟合。请单击此处查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

与其他类型的结合分析 (即,饱和结合和动力学结合实验) 相比, 竞争结合检测最适合于筛选目的。事实上, 它们允许对大量未标记化合物 (例如小分子) 进行评估, 通过评分它们的能力来干扰固定数量的标记受体配体的绑定。与标记配体绑定到其他受体部位的化合物在化验中可能仍未被发现。虽然本文所描述的竞争约束实验尤其侧重于趋化因子受体 CXCR4, 但它也可能成为其他受体竞争结合分析设计的蓝图。例如, CXC 趋化因子受体 7 (CXCR7) 被描述为 CXCL12 的替代受体, 能够绑定 CXCL12 与高亲和力29,30。因此, 所描述的 CXCR4 竞争结合试验所使用的标记趋化因子 (CXCL12AF647) 可用于建立 CXCR7 结合实验。因为 CXCR4 和 CXCR7 分享 CXCL12 作为一个共同的配体, 这将是重要的细胞模型, 其中只有两个受体之一表达在细胞表面, 以评估特定的受体结合。我们以前的研究表明, Jurkat 细胞不显示 CXCR717的内源表达式。因此, 在这里描述的 CXCR4, 对 CXCR7 的干扰被排除在外。

竞争结合试验的几个关键特征允许它作为一个快速, 初步, 筛选工具, 以识别小分子干扰激动剂绑定到 CXCR4。该检测的主要好处之一是使用整体, 活细胞表达兴趣的受体。这就省去了劳动密集型细胞膜制剂的需要。此外, Jurkat 细胞检测的低背景 (自动) 荧光是有益的。连同所得到的大信号窗口增加了定义的数量荧光标记探针, 它贡献一个有利信号到背景比率。这有助于发现未标记化合物可能具有约束力的抑制。如果这种结合试验与其他 CXCR4 表达细胞, 我们建议始终评估这些参数 (背景荧光, 信号窗口), 因为它们可能不同的细胞线, 细胞线。事实上, Jurkat 细胞内在表达 CXCR4 在一个长期一致的水平, 使它成为一个方便的细胞模型。稳定转染的细胞克隆可以获得同样一致的受体表达水平。相反, 我们不建议使用瞬变转染细胞, 因为这可能会导致更广泛的荧光强度分布, 更少的反应细胞的检测和更少的一致性实验。由于没有 CXCR4 阴性 Jurkat 细胞存在, 受体结合的特异性对这些细胞是通过预先孵化与建立良好的特异受体拮抗剂 (AMD3100 和 AMD11070) 证明。这些拮抗剂在结构上与标记配体不同。这一点很重要, 因为当使用配体的未标记变体作为竞争对手时, 标记的和未标记的配体也可能争夺绑定到可能存在于细胞表面的非特定绑定站点。

除了细胞宿主, 这里描述的其他几个方面需要考虑, 然后开始建立一个类似的检测其他受体. 荧光标记的探针, 目标受体已发展为替代放射性探头, 但目前只适用于有限数量的受体, 他们是相对昂贵的。此外, 用显影修饰天然受体配体可能会改变与未标记的母体分子相比的结合性质, 特别是在非常小的配体 (例如,胺) 或小肽31,32. 例如, 在小配体的情况下, 通常需要链接器将药效团与荧光分离, 以允许访问受体的 orthosteric 绑定站点 31.此外, 需要考虑到受体-荧光探针复合物的稳定性。根据我们的经验, 在 90-120 分钟 (运行两个连续96井板所需的时间) 之后, 正控制井的平均荧光强度通常减少了 5%, 而与所有正控制井的平均值相比,板, 在5和10% 之间偶尔的异常点。

同时, 标记配体的内在活性具有重要意义。受体拮抗剂在受体上没有任何内在的活性, 标记的激动素可能诱发受体活化, 从而导致受体内化。这就损害了配体受体相互作用的可逆性33。为了尽量减少受体内化的可能问题, 用标记的配体 (在有标记的激动剂的情况下) 孵化需要时间限制, 应优先在室温下或更低的地方进行。这一过程是在室温下进行的, 这使得该检测方法也更方便, 更符合板格式的筛分工作。最后, 每个样本的足够数量的细胞 (例如, 96 井板的25万每井) 应用于最终保留足够数量的细胞 (2万细胞, "单一事件", 基于所有细胞的门控; 请参阅图 1)流式细胞术分析。使用较少的单元格会使持续地达到此数量的分析细胞变得更加困难, 这可能会危及读出的可靠性。每个样本使用较少的细胞 (每井) 也会增加流式细胞仪分析样本所需的时间间隔, 从而增加了分析整个96井板的总时间。这就增加了吞吐量。由于上述原因, 未来的微型化化验结果可能不会是一项微不足道的任务。

结合起来, 在我们的实验室中, 作为一种筛选工具, 主要用于识别能够与固定数量的标记 CXCL12 相竞争以绑定到 CXCR4 的小分子的竞争结合试验已被详细描述。这些具有约束力的研究是有兴趣的, 因为它们是一种相对快速和简单的方法来识别具有受体结合能力的化合物。虽然鉴定具有结合能力的化合物本身已经有价值, 但这种类型的化验并没有提供有关所鉴定化合物的活性的信息。因此, 仍然有必要进一步验证和表征其潜在的竞赛或拮抗活性的其他药理和功能受体化验。的兴趣, 在 CXCR4 的情况下已经表明, 受体拮抗剂, 显示增强活性的结合试验 (即,生成低 IC50值的约束抑制) 执行相对较好的其他功能CXCR4-related 化验以及17

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢埃里克. 芳廷承袭提供了出色的技术援助。这项工作得到了库鲁汶 (格兰特) 的支持。PF/10/018), 全宗与客厅里 Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, 授予 no。G. 485.08) 和基金会 Dormeur 瓦杜兹。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
  3. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
  4. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  5. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  6. Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
  7. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  8. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  9. Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
  10. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  11. Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  12. Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
  13. Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
  14. Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
  15. Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. (2017).
  16. Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
  18. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  19. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  20. Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
  21. Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
  22. Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
  23. De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
  24. Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  25. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  26. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  27. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  28. Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
  29. Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  30. Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  31. Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
  32. Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
  33. Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics