एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप Polyacrylamide-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर Extracellular मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए परख आधारित

Immunology and Infection
 

Summary

हम एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप polyacrylamide-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर extracellular मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव की जांच के लिए परख आधारित विकसित की है । इस परख प्रवाह cytometry, immunostaining, और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है, कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत के मात्रात्मक माप के लिए अनुमति, उनके extracellular मैट्रिक्स, और रोगजनक बैक्टीरिया ।

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Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

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Abstract

Extracellular मैट्रिक्स कठोरता कई पर्यावरणीय यांत्रिक उत्तेजनाओं कि अच्छी तरह से सेलुलर व्यवहार, समारोह, और सामांय रूप से भाग्य को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है में से एक शामिल हैं । हालांकि तेजी से अधिक अनुयाई सेल प्रकार ' प्रतिक्रियाओं मैट्रिक्स कठोरता को विशेषता है, कैसे अनुयाई ' कोशिकाओं जीवाणु संक्रमण के लिए संवेदनशीलता पर निर्भर करता है मैट्रिक्स कठोरता मोटे तौर पर अज्ञात है, के रूप में है पर जीवाणु संक्रमण का प्रभाव मेजबान कोशिकाओं के यांत्रिक । हम परिकल्पना है कि एक जीवाणु संक्रमण के लिए मेजबान endothelial कोशिकाओं की संवेदनशीलता मैट्रिक्स की कठोरता पर निर्भर करता है जिस पर इन कोशिकाओं रहते हैं, और है कि बैक्टीरिया के साथ मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण उनके यांत्रिक बदल जाएगा । इन दो परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए, endothelial कोशिकाओं मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया मेजबान और लिस्टिरिया monocytogenes एक मॉडल रोगज़नक़ के रूप में । एक उपंयास बहु अच्छी तरह से प्रारूप परख विकसित करके, हम बताते है कि एल monocytogenes द्वारा endothelial कोशिकाओं के संक्रमण पर मैट्रिक्स कठोरता का प्रभाव मात्रात्मक प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा immunostaining के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, मेजबान endothelial सेल के यांत्रिक पर एल monocytogenes संक्रमण के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है । प्रस्तावित विधि ऊतक के प्रभाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है-अनुयाई कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण पर प्रासंगिक यांत्रिकी, जो कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है, उनके extracellular मैट्रिक्स, और रोगजनक बैक्टीरिया । इस विधि भी सेल यांत्रिक और सब्सट्रेट कठोरता की प्रतिक्रिया पर अध्ययन के अंय प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है, जहां यह महत्वपूर्ण है करने के लिए एक प्रयोग में समानांतर में कई दोहराने प्रदर्शन कर सकता है ।

Introduction

अधिकांश पशु ऊतकों में कोशिकाओं को आम तौर पर अनुयाई हैं, दोनों पड़ोसी कोशिकाओं और उनके extracellular मैट्रिक्स (ECM) के लिए संलग्न । सेल गतिशीलता से सेल प्रसार और अस्तित्व1,2को लेकर कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए उनके ECM करने के लिए कोशिकाओं की anchorage महत्वपूर्ण है । सेलुलर anchorage ECM ECM संरचना और जकड़न दोनों पर निर्भर करता है । कोशिकाओं को गतिशील रूप से फिर से उनके cytoskeleton, सेल-ECM और सेल-सेल आसंजन, जो बारी में गंभीर रूप से बदल कोशिका यांत्रिक और कार्यों3,4,5,6 की व्यवस्था द्वारा उत्तरार्द्ध में परिवर्तन का जवाब . ECM कठोरता अंतरिक्ष में भिंन हो सकते है (यानी, शारीरिक स्थान), समय में (यानी, उंर बढ़ने), और pathophysiological प्रक्रियाओं में (जैसे, धमनीकाठिंय, कैंसर, संक्रमण, आदि) । उदाहरण के लिए, यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि endothelial कठोर पर रहने वाले कोशिकाओं-के रूप में नरम-मैट्रिक्स की तुलना में उनके ECM और एक दूसरे को और प्रदर्शन वृद्धि हुई बलों में वृद्धि हुई गतिशीलता और प्रसार7,8। इसी तरह, fibroblasts पर रहने वाले अपने ECM के लिए उच्च सिकुड़ा बलों प्रदान मैट्रिक्स और वृद्धि प्रसार, गतिशीलता, और ECM उत्पादन9,10,11दिखाने के लिए । हालांकि सेल यांत्रिकी और ECM कठोरता के जवाब बड़े पैमाने पर विभिंन प्रकार के सेल के लिए अध्ययन किया गया है, अनुयाई मेजबान कोशिकाओं के बीच संबंध, उनके ECM की कठोरता, और जीवाणु संक्रमण अभी भी काफी हद तक अज्ञात है ।

के लिए बैक्टीरिया में ECM कठोरता की भूमिका का अध्ययन-मेजबान सेल बातचीत, एल monocytogenes (Lm) मॉडल रोगज़नक़ के रूप में चुना गया था । Lm एक सर्वव्यापी भोजन जनित जीवाणु कि स्तनधारी मेजबान की एक विस्तृत विविधता में प्रणालीगत संक्रमण पैदा कर सकता है । यह facultative intracellular रोगज़नक़ आंतों उपकला से संवहनी endothelia के विभिन्न प्रकार के पार से दूर अंगों के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं । यदि यह रक्त मस्तिष्क बाधा उल्लंघन, एल एम सी दिमागी बुखार का कारण बन सकता है, और जब यह अपरा पार, यह सहज गर्भपात12,13पैदा कर सकता है । Lm अलग होस्ट सेल प्रकार को संक्रमित कर सकते है और ऐसा अलग रोगजनक रणनीतियों का उपयोग करके कर सकते हैं । lm संक्रमण ज्यादातर उपकला कोशिकाओं के संदर्भ में अध्ययन किया गया है, जबकि बहुत कम कैसे Lm संक्रमित कर सकते हैं के बारे में जाना जाता है और बाईपास endothelial कोशिकाओं रक्त वाहिकाओं के लुमेन अस्तर14,15,16. इसके अलावा, यह अभी भी काफी हद तक अज्ञात है कैसे ECM की जकड़न जहां endothelial कोशिकाओं रहते है Lm इन मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण और फिर प्रसार करने की क्षमता संग्राहक । एल एम और कई अतिरिक्त बैक्टीरियल प्रजातियों (यानी, Rickettsia parkeri) मेजबान कोशिकाओं वे दोनों अपने कोशिका द्रव्य में आक्रमण करने के लिए संक्रमित की actin cytoskeleton का लाभ लेने के लिए और सेल के लिए सेल प्रसार17 की सुविधा , 18 , 19. वे प्राप्त है कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से उंहें मेजबान actin बहुलकीकरण रास्ते के साथ हस्तक्षेप करने के लिए और actin धूमकेतु पूंछ कि उनके आगे लैबोरेटरी16,20की सुविधा का उत्पादन करने में सक्षम । संक्रमण का एक परिणाम के रूप में, मेजबान सेल के actin cytoskeleton गतिशील रूप से पुनर्व्यवस्थित करने की जरूरत है एक तरीके से है कि अभी भी पूरी तरह से विशेषता नहीं है, संभावित शारीरिक बलों वे अपने ECM पर और प्रत्येक पर लागू सहित मेजबान कोशिकाओं के यांत्रिक को प्रभावित कर अन्य. इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, मानव microvascular endothelial कोशिकाओं (HMEC-1) तीन कारणों के लिए मॉडल मेजबान कोशिकाओं के रूप में चुना गया: 1. endothelial कोशिकाओं को उच्च mechanosensitive के रूप में वे लगातार शारीरिक संकेतों को अलग करने के लिए संपर्क कर रहे है21जाना जाता है; 2. रणनीतियां Lm संक्रमित endothelial कोशिकाओं को रोजगार अभी भी मोटे तौर पर22अज्ञात; और 3. HMEC-1 एक अमर सेल लाइन कर रहे है और कर सकते हैं, इसलिए, आसानी से और संस्कृति हो आनुवंशिक हेरफेर के अधीन ।

मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण ज्यादातर कोशिकाओं12,14,23के शारीरिक ECM से काफी कड़ा कर रहे हैं कि कांच या polystyrene सब्सट्रेट पर कोशिकाओं बोने के द्वारा इन विट्रो में अध्ययन किया गया है. कोशिकाओं के संक्रमण की जांच करने के लिए एक मैट्रिक्स जिसका कठोरता शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और जीवाणु रोगजनकों द्वारा कोशिकाओं के संक्रमण पर ECM कठोरता की भूमिका स्पष्ट करने के लिए, हम एक अभिनव निर्माण पतली पर आधारित दृष्टिकोण का पालन मल्टी वेल प्लेट्स पर स्वरित्र कठोरता के microbead-एंबेडेड polyacrylamide hydrogels । प्रस्तावित दृष्टिकोण की नवीनता में निहित है कि यह कई शर्तों की निगरानी की अनुमति देता है एक साथ अपनी बहु के कारण अच्छी तरह से प्रारूप और में है कि यह कई विशेष रूप से रास्ते सब्सट्रेट निर्माण कर रहे है के कारण तकनीकों के साथ संगत है । HMEC-1 कोशिकाओं को इन प्रोटीन लेपित hydrogels पर वरीयता प्राप्त थे और फिर अलग Lm उपभेदों कि या तो internalization पर फ्लोरोसेंट हो या constitutively फ्लोरोसेंट से संक्रमित । मेजबान HMEC-1 कोशिकाओं के संक्रमण संवेदनशीलता पर ECM कठोरता की भूमिका प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इसके अलावा, immunostaining और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का पालन और आंतरिक बैक्टीरिया के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया । अंत में, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (TFM) सफलतापूर्वक कर्षण तनाव पर Lm संक्रमण के प्रभाव की विशेषता है कि मेजबान endothelial कोशिकाओं संक्रमण के दौरान उनके मैट्रिक्स पर लागू करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । प्रस्तुत परख आसानी से अनुयाई कोशिकाओं के संक्रमण संवेदनशीलता पर ECM कठोरता के प्रभाव पर आगे की पढ़ाई सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है अलग सेल लाइनों या रोगजनकों का उपयोग कर ।

Protocol

1. विनिर्माण पतली दो स्तरित Polyacrylamide (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) बहु पर अच्छी तरह से प्लेटें Hydrogels

  1. आसुत ultrapure पानी में अमोनियम persulfate (एपीएस) भंग 10 ग्राम की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/ Aliquot और कम अवधि के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान (3 सप्ताह) ।
    नोट: उपरोक्त समाधान hydrogel निर्माण के अग्रिम में तैयार किया जा सकता है ।
  2. ग्लास 24-अच्छी तरह से व्यंजन की सक्रियकरण
    1. 13 मिमी व्यास कुओं के साथ 24-अच्छी तरह से गिलास नीचे प्लेटें ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 1 एच के लिए ५०० µ एल के कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से प्रति 2 मीटर NaOH ।
    2. ultrapure पानी के साथ वेल्स 1x कुल्ला और फिर जोड़ने के ५०० µ एल 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane ( सामग्री की तालिकादेखें) में ९५% इथेनॉल के लिए एक अच्छी तरह से 5 मिनट के लिए ।
    3. कुओं 1x फिर से पानी के साथ कुल्ला और ०.५% glutaraldehyde के ५०० µ एल जोड़ने के लिए 30 मिनट के लिए एक अच्छी तरह से पानी के साथ वेल्स 1x कुल्ला और उंहें ढक्कन बंद के साथ ६० ˚ सी पर सूखी ।

Figure 1
चित्रा 1 : मेजबान कोशिकाओं की बैक्टीरियल संक्रमण परख पतली दो स्तरित फ्लोरोसेंट मनका-एंबेडेड polyacrylamide (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) कठोरता बदलती के hydrogels पर रहते हैं । A. ग् coverslips hydrogel अनुलग् नक को सक्षम करने के लिए रासायनिक रूप से संशोधित हैं । B. पीए मिक्सचर के ३.६ µ l को शीशे के नीचे की तरफ जमा कर रहे हैं. C. मिश्रण बहुलकीकरण सक्षम करने के लिए एक 12 मिमी परिपत्र गिलास coverslip के साथ कवर किया जाता है । D. coverslip एक सुई सिरिंज के साथ हटा दिया जाता है । . २.४ µ microbeads के साथ एक PA समाधान के एल नीचे परत के शीर्ष पर जोड़ा और एक परिपत्र गिलास coverslip के साथ छाया हुआ है । F. एक बफर अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और coverslip निकाल दिया जाता है । जी1 एच के लिए यूवी विकिरण नसबंदी सुनिश्चित करता है । H. एक Sulfo-SANPAH-युक्त समाधान जैल पर जोड़ा जाता है, जो तब 10 min. Iके लिए यूवी के तहत रखा जाता है । hydrogels एक बफर के साथ धोया और फिर कोलेजन के साथ रात भर की मशीन है । hydrogel सेल मीडिया के साथ equilibrated है । K. मेजबान कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । एल. एल एम बैक्टीरिया समाधान करने के लिए जोड़ रहे हैं और संक्रमण केंद्रापसारक के माध्यम से सिंक्रनाइज़ है. एम1 एच के बाद संक्रमण समाधान में बैक्टीरिया दूर धोया जाता है और मीडिया एक एंटीबायोटिक के साथ पूरक जोड़ा है । N. At 4 h पद-संक्रमण, Lm (JAT985) fluorescing हुन्छ । O. HMEC-1 कोशिकाओं को उनके मैट्रिक्स से अलग कर रहे है और समाधान ट्यूबों को हस्तांतरित करने के लिए प्रवाह cytometry माप प्रदर्शन कर रहे हैं । ध्यान दें कि दिन और परख के हर कदम के लिए अनुमानित समय भी संकेत दिया जाता है । यह आंकड़ा Bastounis और Theriot५९से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. Polyacrylamide hydrogel निर्माण
    नोट: चित्र 1देखें ।
    1. जलीय समाधान है कि ४०% शेयर acrylamide समाधान के 3-10% होते तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) और ०.०६-2% स्टॉक बीआईएस का ०.६%-acrylamide समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए स्वरित्र कठोरता से लेकर hydrogels निर्माण के लिए ०.६ केपीए ते ७० केपीए । तालिका 1देखें ।
      1. ०.६ केपीए hydrogels के लिए, ०.०४५% भा-acrylamide के साथ 3% acrylamide मिलाएं । 3 केपीए hydrogels के लिए, ०.०७४% बीआईएस-acrylamide के साथ 5% acrylamide मिलाएं । 10 केपीए hydrogels के लिए, ०.०७५% बीआईएस-acrylamide के साथ 10% acrylamide मिलाएं । 20 केपीए hydrogels के लिए, ०.१९५% बीआईएस-acrylamide के साथ 8% acrylamide मिलाएं । ७० केपीए hydrogels के लिए, ०.४५% भा-acrylamide के साथ 10% acrylamide को मिलाएं ।
        नोट: वांछनीय पीए hydrogel कठोरता को प्राप्त करने के बारे में अधिक जानकारी24,25,26,27कहीं और पाया जा सकता है ।
    2. प्रत्येक वांछनीय hydrogel कठोरता के लिए दो जलीय समाधान तैयार करें । 1 समाधान तैयार करने के लिए मनका मुक्त और 2 समाधान ०.०३% ०.१ शामिल करने के लिए-µm व्यास फ्लोरोसेंट सूक्ष्म मोतियों ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. समाधान के बहुलकीकरण को बाधित करने के लिए जाना जाता है ऑक्सीजन को समाप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए निर्वात द्वारा 1 और 2 Degas ।
    4. 10 जी/एमएल स्टॉक ए पी एस के ०.६% जोड़ें समाधान और ०.४३% tetramethylethylenediamine (TEMED) समाधान 1 के लिए एक बहुलकीकरण दीक्षा सक्षम करने के लिए । तेजी से कार्य ।
    5. 1 समाधान के ३.६ µ एल जोड़ें 24 अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक अच्छी तरह से केंद्र के लिए (अपनी तैयारी के लिए कदम १.२ देखें) ।
    6. तुरंत 12 मिमी अनुपचारित परिपत्र coverslips के साथ कुओं को कवर और चलो समाधान 1 20 मिनट इतना है कि यह पूरी तरह से polymerizes के लिए बैठते हैं ।
    7. धीरे coverslips को हटाने की सुविधा के लिए अपने टिप पर एक छोटा सा हुक बनाने के लिए एक सतह के लिए एक सिरिंज सुई नल. सिरिंज सुई का उपयोग कर coverslips उठा ।
    8. 10 जी/एमएल स्टॉक ए पी एस के ०.६% जोड़ें समाधान और ०.४३% TEMED समाधान 2 । जमा २.४ 24-अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक कुआं में पहली परत के शीर्ष पर मिश्रण के µ एल ।
    9. कवर समाधान 2 12 मिमी परिपत्र ग्लास coverslips के साथ, धीरे संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए दूसरी परत की मोटाई सुनिश्चित करने के लिए नीचे दबाने कम है । समाधान 2 polymerize 20 मिनट के लिए चलो ।
    10. प्रत्येक कुएं को ५० mM HEPES pH ७.५ के ५०० µ l को जोड़ें और उसके बाद सिरिंज की सुई और संदंश के साथ ग् coverslips निकालें ।
  2. नसबंदी, कोलेजन-कोटिंग, और polyacrylamide hydrogels के equilibration
    1. यूवी-ऊतक संस्कृति हूड में 1 ज के लिए hydrogels को बेनकाब करने के लिए नसबंदी की अनुमति ।
    2. ०.५% वजन का एक मिश्रण तैयार करें/मात्रा sulfosuccinimidyl 6-(4 ′-azido-2′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, सामग्री की तालिकादेखें) में 1% DMSO और ५० mM HEPES पीएच = ७.५ ।
    3. hydrogels की ऊपरी सतह के लिए इस समाधान के २०० µ एल जोड़ें । तेजी से अभिनय, उंहें 10 मिनट के लिए यूवी (३०२ एनएम) को बेनकाब उंहें सक्रिय ।
    4. hydrogels दो बार ५० mM HEPES पीएच = ७.५ के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो । यदि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो कि कोई अतिरिक्त crosslinker निकाल दिया जाए ।
    5. प्रोटीन कोट ०.२५ मिलीग्राम के २०० µ l के साथ hydrogels/एमएल चूहा पूंछ कोलेजन मैं ( सामग्री की तालिकादेखें) ५० मिमी में HEPES । hydrogels गर्मी, शीर्ष पर कोलेजन समाधान के साथ, कमरे के तापमान पर रात भर ।
      नोट: निर्जलीकरण/वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एक माध्यमिक शामिल करने में बहु अच्छी तरह से प्लेटों जगह और रोकथाम के भीतरी परिधि में पानी में लथपथ प्रयोगशाला ऊतक सफाई जोड़ें ।
    6. hydrogels की मोटाई मापने के लिए एक 40X उद्देश्य के साथ एक epifluorescence या फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । नीचे (जहां कांच की सतह है) और hydrogel के शीर्ष विमानों (जहां फ्लोरोसेंट मोतियों की तीव्रता अधिकतम है) के जेड पदों का पता लगाने के द्वारा ऐसा करते हैं । तो ऊंचाई निर्धारित करने के लिए जेड पदों घटाना ।
      नोट: हम hydrogels की मोटाई को मापने के लिए एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप और संख्यात्मक एपर्चर ०.६५ के साथ एक 40X उद्देश्य का इस्तेमाल किया. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी माप (AFM) भी इस बिंदु पर किया जा सकता है hydrogels की सटीक कठोरता की पुष्टि ( चित्रा 2देखें) ।
    7. hydrogels पर ब्याज की कोशिकाओं बोने से पहले, hydrogels पर मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और उंहें ३७ ˚ सी पर 30 मिनट के लिए 1 h equilibration सुनिश्चित करने के लिए गर्मी ।
      नोट: हम MCDB जोड़ा-१३१ पूर्ण मीडिया है कि क्योंकि मीडिया जहां मॉडल मेजबान कोशिकाओं (HMEC-1) में संस्कृति थे (विवरण के लिए कदम २.१ देखें) ।

Figure 2
चित्रा 2: PA hydrogel कठोरता और मोतियों का वितरण की AFM माप । A. डेटा दिखाने की उंमीद है युवा मापांक पीए hydrogels के (कठोरता के उपाय), acrylamide और बीआईएस-युवा मापांक AFM (N = 5-6) के माध्यम से मापा बनाम इस्तेमाल acrylamide की राशि दी । क्षैतिज पट्टियों का अर्थ दर्शाते हैं । ०.६ केपीए hydrogels की कठोरता को मापा नहीं जा सकता है क्योंकि hydrogels बहुत नरम थे और AFM टिप का पालन किया । B. यह धाराप्रवाह HMEC-1 कोशिकाओं और एक नरम 3 केपीए-PA hydrogel की ऊपरवाला सतह पर एंबेडेड मोतियों की इसी छवि के एक चरण छवि है । HMEC-1 24 एच के लिए 4 x 105 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक एकाग्रता में वरीयता प्राप्त थे । C. यह छवि चित्रा 2बी के रूप में ही है, लेकिन एक कड़ा ७० पर रहने वाले कोशिकाओं के लिए-केपीए PA hydrogel । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. मानव Microvascular Endothelial कोशिका संस्कृति और Hydrogels पर सीडिंग

  1. संस्कृति HMEC-1 (मानव, microvascular endothelial) MCDB में कोशिकाओं-१३१ पूर्ण MCDB युक्त मीडिया-१३१ मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 10 एपिडर्मल वृद्धि कारक के एनजी/एमएल, 1 µ जी/hydrocortisone के एमएल, और 2 मिमी के एल-glutamine ( सामग्री की तालिका देखें ).
  2. धाराप्रवाह संस्कृतियों 1:6 हर 3-4 दिन भाजित और ४० बीतने तक कोशिकाओं रखो ।
  3. एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए, अपनी संस्कृति पोत से अलग कोशिकाओं ०.२५% trypsin/EDTA का उपयोग कर । सबसे पहले कोशिकाओं को धोने और उनकी संस्कृति पोत 1x बाँझ फास्फेट के साथ बफर खारा (पंजाब), और उसके बाद उपयुक्त मात्रा में जोड़ें ०.२५% trypsin/EDTA (2 मिलीलीटर प्रति १००-mm पकवान या ७५-सेमी कुप्पी, 1 मिलीलीटर प्रति ६०-mm पकवान या 25 सेमी कुप्पी), ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी की मशीन अपने सब्सट्रेट से कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति देने के लिए.
  4. MCDB की वांछित मात्रा जोड़कर trypsin बेअसर-१३१ पूर्ण मीडिया, प्लास्टिक धीरे कोशिकाओं के झुरमुट को तोड़ने के लिए, और फिर एक शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में समाधान जगह है ।
  5. धीरे कोशिकाओं के समाधान भंवर को यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे है और फिर बाहर समाधान के 20 µ एल ले और बहुत धीरे एक गिलास hemocytometer के coverslip के नीचे दो कक्षों को भरने ।
  6. शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में निहित कोशिकाओं के समाधान के नीचे गोली 10 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक का उपयोग
  7. 10 मिनट प्रतीक्षा अवधि के दौरान, एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती । एक खुर्दबीन का प्रयोग करें, एक 10x उद्देश्य के साथ hemocytometer की ग्रिड लाइनों पर ध्यान केंद्रित है, और फिर एक हाथ टैली काउंटर का उपयोग करने के लिए एक 1 मिमी x 1 मिमी वर्ग में कोशिकाओं की संख्या गिनती ।
  8. hemocytometer एक और 1 मिमी x 1 मिमी वर्ग के लिए ले जाएँ, वहाँ कोशिकाओं गिनती और फिर दो बार प्रक्रिया को दोहराएँ. चार माप के औसत की गणना और फिर औसत से गुणा करें 104. अंतिम मूल्य के व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या है/एमएल सेल निलंबन है कि केंद्रापसारक में किया जा रहा है ।
  9. शंकु केंद्रापसारक ट्यूब के बाहर तरल निकालें, जबकि सुनिश्चित करना है कि सेल गोली बाधित नहीं है । 4 x 105 कोशिकाओं की एक एकाग्रता पर MCDB-१३१ पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं/
  10. hydrogels पर निलंबन में कोशिकाओं के बीज पहले मीडिया जिसके साथ hydrogels थे और फिर प्रत्येक hydrogel पर सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ने से निकाल रहा है ।

3. एल monocytogenes के साथ मानव Microvascular Endothelial कोशिकाओं का संक्रमण

  1. अग्रिम तैयारी
    नोट: पहले से निंन समाधान तैयार करें ।
    1. Streptomycin, क्लॉरॅंफेनिकोल, और gentamicin स्टॉक्स
      1. तैयार ५० streptomycin स्टॉक समाधान के ०.५ जी streptomycin सल्फेट का वजन और यह पूरी तरह से भंग में ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर से मिलीग्राम/
      2. तैयार ७.५ क्लॉरॅंफेनिकोल स्टॉक समाधान के ७५ मिलीग्राम क्लॉरॅंफेनिकोल और यह पूरी तरह से भंग १००% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में से मिलीग्राम/
      3. gentamicin सल्फेट के ०.२ ग्राम वजनी और यह पूरी तरह से भंग ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर में 20 मिलीग्राम/एमएल gentamicin स्टॉक समाधान के तैयार ।
      4. फ़िल्टर-एक ०.२-µm सिरिंज फिल्टर के साथ सभी स्टॉक समाधान निष्फल और लंबी अवधि के उपयोग (1-2 महीने) के लिए उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
    2. ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) मीडिया और आगर प्लेट्स
      1. दो 1-एल कुप्पी का पता लगाएं और एक कुप्पी के अंदर एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें ।
      2. bhi मीडिया के लिए, एक कुप्पी में ३७ जी का एक बोतल में जोड़ें और ultrapure पानी को 1 एल. मिश्रण करने के लिए एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर कुप्पी रखकर पाउडर भंग होने तक घोल को सख्ती से मिक्स करें ।
      3. bhi आगर प्लेट्स के लिए, ३७ ग्राम के bhi पाउडर और 15 ग्राम की दानेदार आगर ( सामग्री की तालिकादेखें) को दूसरी कुप्पी में जोड़ें और ultrapure पानी को 1 एल. मिश्रण को एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर कुप्पी रखकर घोल को सख्ती से मिक्स करें जब तक कि पाउडर भंग न हो जाए ।
      4. बोतल के ढक्कन पेंच नहीं भी कसकर और आटोक्लेव तरल सेटिंग का उपयोग कर या आटोक्लेव के विनिर्देशों के अनुसार समाधान ।
      5. आटोक्लेव से समाधान निकालें, तो ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए आगर-BHI समाधान शांत हो जाओ । अगर १ एल कुप्पी में BHI मीडिया को बाँझ रखा जाता है तो इसे एक महीने तक इस्तेमाल किया जा सकता है.
      6. बैक्टीरिया आगार-bhi प्लेट्स तैयार करने के लिए, पहले एंटीबायोटिक्स, यदि उचित हो, BHI और आगर युक्त कुप्पी करने के लिए (जीवाणु उपभेदों पर निर्भर करता है) को जोड़ने । संक्षेप में एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर कुप्पी डाल करने के लिए जल्दी मिश्रण की अनुमति ।
        नोट: यहां इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं के लिए विशिष्ट है एल एम उपभेदों इस्तेमाल किया, लेकिन किसी भी आवश्यक एंटीबायोटिक्स BHI-आगर प्लेट में इस्तेमाल किया जा सकता है । हम २०० µ जी की एकाग्रता के लिए streptomycin जोड़ा/एमएल और ७.५ µ जी/एमएल की एकाग्रता के लिए क्लॉरॅंफेनिकोल क्योंकि 10403S एल एम उपभेदों streptomycin के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । इन उपभेदों एक प्लाज्मिड है कि क्लॉरॅंफेनिकोल acetyltransferase खुले पढ़ने के फ्रेम, इसलिए क्लॉरॅंफेनिकोल के प्रतिरोध शामिल है के साथ संयुग्मित गया है ।
      7. इस मिश्रण को 10-सेमी polystyrene बैक्टीरिया कल्चर प्लेट्स (लगभग 20 मिलीलीटर प्रति प्लेट) में डाल दें । बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए, प्लेटों की ऊपरी सतह को संक्षेप में लौ । कमरे के तापमान पर रात भर ठंडी प्लेटें ।
      8. अगले दिन, सूखी प्लेटों को सील करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  2. L. monocytogenes के साथ मानव microvascular endothelial कोशिकाओं का संक्रमण
    1. संक्रमण से पहले तीन दिन, Lm तनाव से बाहर लकीर एक ग्लिसरॉल स्टॉक से इस्तेमाल किया जा करने के लिए (पर संग्रहीत-८० ° c) एक BHI-आगर प्लेट कि ७.५ µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और २०० µ जी/streptomycin के एमएल, अगर उचित है पर ।
      नोट: तनाव से बाहर हो एक जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती, constitutively व्यक्त प्रतिदीप्ति (immunostaining JAT1045 के लिए इस्तेमाल किया गया था) या प्रतिदीप्ति प्रमोटर के तहत ActA व्यक्त (प्रवाह cytometry या कर्षण बल माइक्रोस्कोपी JAT983 या JAT985 के लिए किया जा सकता है का उपयोग किया गया)22.
    2. ३७ ° c पर प्लेटें जब तक असतत कालोनियों (1-2 दिन) का गठन कर रहे हैं ।
    3. संक्रमण से पहले दिन, वांछित तनाव रातोंरात बढ़ने, ७.५ µ g/क्लॉरॅंफेनिकोल के एमएल के साथ BHI मीडिया में 30 डिग्री सेल्सियस पर १५० rpm पर मिलाते (यदि उपयुक्त हो) ।
      1. एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में BHI मीडिया के 5 मिलीलीटर प्लेस, जोड़ें ७.५ µ जी/क्लॉरॅंफेनिकोल के एमएल (यदि उचित हो), और फिर inoculate एक बाँझ 10 µ एल टिप का उपयोग कर प्लेट से एक ही कॉलोनी ।
    4. अगले दिन, बस संक्रमण से पहले, नमूना 1:5 कमजोर द्वारा ६०० एनएम (OD600) पर बैक्टीरिया समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को मापने; एक रिक्त के रूप में सेवा करने के लिए अकेले BHI युक्त एक cuvette का प्रयोग करें ।
    5. ०.१ के एक OD600 के लिए रातोंरात संस्कृति को पतला और यह मशीन, 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए मिलाते हुए, BHI मीडिया में ७.५ µ जी के साथ क्लॉरॅंफेनिकोल के एमएल (यदि उचित हो) के लिए अनुमति देने के लिए बैक्टीरिया लॉग चरण के विकास तक पहुंचने के लिए ।
    6. बैक्टीरियल समाधान है, जो ०.२-०.३ के आसपास होने की उंमीद है की OD600 उपाय । यदि OD600 अधिक है, यह अकेले BHI के साथ ०.२-०.३ के लिए पतला ।
    7. एक microcentrifuge ट्यूब में बैक्टीरियल समाधान के 1 मिलीलीटर ले लो । यह स्पिन नीचे 4 मिनट के लिए २,००० x जी में कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक का उपयोग कर । ऊतक संस्कृति हूड में ऊतक संस्कृति ग्रेड पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में supernatant और बैक्टीरियल गोली reसस्पेंड निकालें । दो बार और उंहें कताई नीचे 4 मिनट के लिए २,००० x g पर कमरे के तापमान पर बैक्टीरिया से धो लो । supernatant को हटा दें और पंजाब के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया को फिर से सस्पेंड करें ।
    8. MCDB-१३१ पूर्ण मीडिया के संक्रमण की बहुलता के लिए 1 मिलीलीटर के साथ पंजाब में reसस्पैंड बैक्टीरिया के 10 या ५० µ एल मिश्रण से संक्रमण मिश्रण तैयार (MOI; यानी, मेजबान सेल प्रति बैक्टीरिया की संख्या) मेजबान सेल के अनुसार लगभग ५० बैक्टीरिया या मेजबान सेल प्रति 10 बैक्टीरिया ।
    9. 24 वेल प्लेटों के कुंए से मीडिया को हटा दें, hydrogels या कोशिकाओं को बाधित न करें सावधान । MCDB-१३१ पूर्ण मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ 1x कोशिकाओं को धो लें और फिर प्रत्येक अच्छी तरह से बैक्टीरिया की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    10. MOI के निर्धारण के लिए कुछ संक्रमण मिश्रण (कम-से १०० µ l) रखें ( चरण ३.३देखें).
    11. इसके ढक्कन से प्लेट ढक कर रख दें और रिसाव से बचने के लिए पॉलिथीन खाना लपेटकर प्लेटों में लपेट लें । इस केंद्रापसारक में प्लेट प्लेस और 10 मिनट के लिए नमूने स्पिन २०० x जी पर आक्रमण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए । ऊतक संस्कृति मशीन में प्लेटों हटो और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    12. MCDB-१३१ पूर्ण मीडिया के साथ नमूनों 4x धो और उंहें ऊतक संस्कृति मशीन में ले जाएं । एक अतिरिक्त 30 मिनट के बाद, मीडिया के साथ 20 µ g/mL gentamicin के साथ पूरक मीडिया बदलें ।
  3. संक्रमण की बहुलता का निर्धारण (MOI)
    1. प्रारंभिक 30-जीवाणुओं के साथ मेजबान कोशिकाओं की ंयूनतम मशीन के दौरान, MOI निर्धारित करने के लिए संक्रमण मिश्रण के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । 1x पंजाबियों के ९०० µ एल के साथ संक्रमण मिश्रण के १०० µ एल मिश्रण से 10 गुना कमजोर पड़ने बनाओ (10-1 कमजोर पड़ने) । फिर, पंजाब के ९०० µ एल के साथ 10-1 कमजोर पड़ने के १०० µ एल मिश्रण (10-2 कमजोर पड़ने) ।
    2. जारी रखें जब तक एक 10-5 कमजोर पड़ने प्राप्त है ।
      नोट: उन्हें कमजोर करने से पहले सभी समाधानों को अच्छी तरह से मिश्रित करने की आवश्यकता है, और प्रत्येक चरण पर ताजा साफ पिपेट युक्तियों का उपयोग किया जाना चाहिए.
    3. एक बार की कमजोरियां बना रहे हैं, १०० µ l के केंद्र पर 10-2 -10-5 के कमजोर पड़ने की जगह/क्लॉरॅंफेनिकोल/streptomycin प्लेटें (यदि उपयुक्त हो) ।
    4. पिपेट को हुक बनाने के लिए मोड़ने के लिए आग का प्रयोग करके एक गिलास पिपेट से एक फैलाव करें । नसबंदी के लिए १००% इथेनॉल में पिपेट डुबकी और फिर बंद एक लौ के साथ इथेनॉल जला ।
    5. एक बार प्रसारक ठंडा है, 10-5 कमजोर पड़ने से शुरू करने और अधिक केंद्रित घोला जा सकता है के लिए जा प्लेटों पर बैक्टीरियल कमजोरियां homogeneously फैल गया । 2 दिनों के लिए ३७ ° c पर प्लेट उल्टा नीचे की मशीन ।
    6. कॉलोनी घनत्व के आधार पर, या तो 10-3 और 10-4 या 10-4 और 10-5 कमजोर पड़ने वाली प्लेटों की कालोनियों की संख्या निर्धारित करें । निम्नानुसार MOI की गणना करें:
      कालोनियों की संख्या × कमजोर कारक ÷ खंड प्रारंभिक जोड़ा = CFU प्रति µ की संख्या l
      प्रति CFU की संख्या µ l × जीवाणु मिश्रण की मात्रा प्रति well = प्रति अच्छी तरह से CFU की संख्या
      प्रति well CFU की संख्या × प्रति well कोशिकाओं की मात्रा = सेल के अनुसार बैक्टीरिया की संख्या
      नोट: CFU कॉलोनी बनाने इकाइयों के लिए खड़ा है ।
    7. अंतिम MOIs प्राप्त करने के लिए दो प्लेटों से MOIs को एवरेज करें ।

4. प्रवाह Cytometry करने के लिए Extracellular-मैट्रिक्स-जकड़न मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के आश्रित संवेदनशीलता को बढ़ाता है

  1. वजन 5 collagenase के मिलीग्राम और यह एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है । ०.२५% trypsin-EDTA के 10 मिलीलीटर जोड़ें और उंहें अच्छी तरह से मिश्रण ।
  2. 8 एच के बाद का इंफेक्शन, मीडिया को 24 वेल प्लेट के कुंए से हटा दें और टिश्यू कल्चर वाले पंजाबियों के साथ वेल्स 1x धो लें । पंजाबियों को कुएँ से निकाल दें और trypsin-EDTA/collagenase मिश्रण के २०० µ l को प्रत्येक कुआं पर जोड़ें । 10 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति मशीन में इस जगह के लिए कोशिकाओं की पूरी टुकड़ी की अनुमति ।
  3. एक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक ताजा पिपेट का प्रयोग करें और मिश्रण ऊपर और नीचे x प्लास्टिक । कोमल बनो ताकि कोशिकाओं को नुकसान न हो । एक अच्छी तरह से trypsin बेअसर करने के लिए पूर्ण मीडिया के २०० µ एल जोड़ें ।
  4. एक ३५-µm सेल छलनी टोपी के साथ एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में एक अच्छी तरह से ४००-µ एल सेल समाधान हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. विश्लेषण १०,०००-प्रवाह cytometry द्वारा नमूना प्रति २०,००० कोशिकाओं । प्रवाह cytometry के माध्यम से डेटा अर्जन करें और प्रासंगिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करते हैं । आगे बिखराव बनाम साइड तितर बितर भूखंडों का उपयोग करें सेल गिनती के वितरण के थोक फाटक करने के लिए ।
    नोट: यह एक कोशिकाओं का विश्लेषण सुनिश्चित करने और मलबे या सेल दोहरी या तीन प्रबंधन को खत्म करेगा ।
    1. नियंत्रण-संक्रमित कोशिकाओं और फाटक autofluorescence को छोड़कर संक्रमित कोशिकाओं की आबादी से प्रतिदीप्ति संकेत को मापने ।

5. Extracellular बैक्टीरिया, माइक्रोस्कोपी और इमेज प्रोसेसिंग के Immunostaining

नोट: इस दृष्टिकोण के बाद मेजबान कोशिका सतह पर ECM-कठोरता निर्भर बैक्टीरियल आसंजन बनाम बैक्टीरियल internalization (आक्रमण) के बीच अंतर करने के लिए मेजबान के भीतर है ।

Figure 4
चित्र 4 : एल एम के Immunostaining-संक्रमित HMEC-1 कोशिकाओं आक्रमण बनाम बैक्टीरियल आसंजन अंतर करने के लिए अलग कठोरता के hydrogels पर रहने वाले. इन छवियों अंतर immunostaining दिखा एकप्रतिनिधि उदाहरण दिखा । सेल नाभिक (DAPI), बी. सभी बैक्टीरिया (GFP), और सी। बाहर बैक्टीरिया (Alexa-५४६) । HMEC-1 कोशिकाओं एक नरम 3-केपीए hydrogel पर रह रहे थे । बैक्टीरिया है कि आंतरिक गया है पर तीर बिंदु, तो ग्रीन चैनल पर ही दिखाए जाते हैं । d-F में डेटा संक्रमित HMEC-1 नर्म 3-केपीए और कड़ा ७०-केपीए hydrogels औरशो डीपर रहने वाले कोशिकाओं के लिए कब्जा कर लिया N = 20 छवियों को देखें । प्रति नाभिक कुल बैक्टीरिया; E. नाभिक प्रति आंतरिक जीवाणु; और F. आक्रमण दक्षता (कुल बैक्टीरिया के लिए आंतरिक बैक्टीरिया का अनुपात) । क्षैतिज पट्टियां डेटा के माध्य को दर्शाती हैं । P-मान की गणना गैर-पैरामीट्रिक Wilcoxon रैंक योग परीक्षण के साथ की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. 30 मिनट के बाद संक्रमण, HMEC-1 JAT1045 से संक्रमित कोशिकाओं धो (एल एम कि constitutively ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक्सप्रेस) 4x मीडिया के साथ ।
  2. चौथे धोने के बाद, MCDB-१३१ पूर्ण मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल Hoechst डाई के 1 µ एल मिश्रण और यह एक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए ' कोशिकाओं नाभिक दाग । 10 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति मशीन में कोशिकाओं प्लेस ।
  3. पंजाबियों के साथ सेल 1x धो लें । उन्हें एक गैर-permeabilizing निर्धारण के लिए अंतर immunostaining के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ठीक28.
    नोट: निर्धारण ०.३२ एम सुक्रोज, 10 मिमी एमईएस पीएच ६.१, १३८ मिमी KCl, 3 मिमी MgCl2, 2 मिमी EGTA, और 4% formaldehyde (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड) शामिल हैं ।
  4. पंजाबियों के साथ सेल 1x धो लें । पंजाब में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 30 मिनट के लिए नमूनों को ब्लॉक.
  5. एक विरोधी के साथ 1 एच के लिए नमूने मशीन-Lmप्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) 2% BSA युक्त पंजाब में 1:100 पतला ।
  6. पंजाब 3x में नमूनों धो और फिर उंहें एक AlexaFluor के साथ 1 घंटे के लिए मशीन-५४६ बकरी-विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) 2% BSA युक्त पंजाब में 1:250 पतला । पंजाब में 3x नमूनों को धो लें । इमेजिंग के लिए पंजाब के 1 एमएल में नमूनों की दुकान ।
  7. छवि और प्रति शर्त १,००० से अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण ।
    1. इमेजिंग के लिए, एक सीसीडी कैमरा के साथ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें) और एक 40X हवा की योजना fluorite ०.६ संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ हवा उद्देश्य ।
      नोट: पावर 25% करने के लिए सेट और जोखिम समय है १०० ms. mCherry के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप फिल्टर 470/525 एनएम हैं, GFP 530/645 एनएम के लिए, और DAPI 395/460 एनएम के लिए, उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए क्रमशः । माइक्रोस्कोप हम इस्तेमाल एक खुला स्रोत माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर29पैकेज द्वारा नियंत्रित किया गया था ।
    2. अंतर immunostaining के लिए, सभी ' हरी ' अनुयाई के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं के साथ जुड़े बैक्टीरिया गिनती । बैक्टीरिया है कि दोनों ' हरी ' और ' लाल ' (एंटीबॉडी बंधन के कारण) के रूप में गैर-आंतरिक गणना ।
      नोट: हम एक कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट और CellC सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) चल द्वारा नाभिक संख्या की पहचान की गणन के लिए30बैक्टीरिया ।

6. बहु अच्छी तरह से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और Monolayer तनाव माइक्रोस्कोपी

Figure 5
चित्र 5: Lm-संक्रमित HMEC-1 कोशिकाओं कर्षण बलों वे संक्रमण के दौरान अपने ECM पर लागू की भयावहता कम पैनल एक चरण छवि से पता चलता है, बी विकृति क्षेत्र से पता चलता है, सी कर्षण तनाव क्षेत्र से पता चलता है, और डी संक्रमित HMEC के intracellular तनाव क्षेत्र-1 एक 20-केपीए hydrogel पर रहने वाले कोशिकाओं से पता चलता है । विकृति नक्शे के रंग सलाखों (µm), कर्षण तनाव नक्शे (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के, और intracellular तनाव नक्शे के (एनएन µm-1) गर्मी नक्शे के ऊपरी हिस्से पर दिखाए जाते हैं । कॉलम शो तीन प्रतिनिधि समय अंक: 3, 8 और 18 एच के बाद संक्रमण । ई-एच. पैनलों के रूप में एकहीडी लेकिन कोशिकाओं के लिए ३०० के एक MOI पर Lm से संक्रमित । बैक्टीरिया (रेड चैनल) की छवियाँ कोशिकाओं के चरण छवियों पर आरोपित हैं. TFM रिकॉर्डिंग इमेजिंग एकाधिक कुओं द्वारा एक साथ आयोजित किया गया । PIV के लिए विंडो का आकार 16 के ओवरलैप के साथ ३२ पिक्सेल था । स्केल बार ३२ µm है । यह आंकड़ा Bastounis और Theriot५९से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. PA hydrogels को 24-वेल प्लेट पर तैयार करें ( चरण 1देखें). बीज HMEC-1 कोशिकाओं ( चरण 2देखें) और JAT983 के साथ उन्हें संक्रमित के रूप में ऊपर वर्णित ( चरण 3देखें).
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 एपिडर्मल वृद्धि कारक के एनजी/एमएल, और 1 μg/एमएल hydrocortisone के साथ Leibovitz एल-15 का सप्लीमेंट द्वारा एक जीवित सूक्ष्म माध्यम तैयार करें ।
    नोट: एल-15 पहले से ही 2 मिमी एल-glutamine शामिल है, तो यह MCDB के मामले में के रूप में अतिरिक्त जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है-१३१ मीडिया.
  3. 4 एच के बाद संक्रमण (जब आंतरिक JAT983 शुरू होता है fluorescing), 1 मिलीग्राम/एमएल Hoechst डाई का 1 एल के साथ 1 μL मिश्रण-15 पूर्ण मीडिया और यह एक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए ' कोशिकाओं नाभिक दाग । 10 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति मशीन में कोशिकाओं प्लेस और फिर एक अच्छी तरह से एल के 1 एमएल के साथ 15 पूर्ण मीडिया की जगह-15 पूर्ण मीडिया 20 µ जी के साथ पूरक/gentamicin के एमएल ।
  4. इसके ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और यह एक खुर्दबीन पर्यावरण चैंबर में जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) equilibrated करने के लिए ३७ ˚ सी ।
    नोट: इमेजिंग के लिए, एक सीसीडी कैमरा के साथ एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक 40X हवा की योजना fluorite हवा उद्देश्य के साथ ०.६ ना.
  5. बहु चैनल समय-चूक फ्लोरोसेंट मोतियों की छवियों और फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया, और मेजबान कोशिकाओं के चरण इसके विपरीत छवियों, 4 से 12 घंटे के लिए हर 10 मिनट के अधिग्रहण ।
    नोट: इमेजिंग के लिए, पावर 25% करने के लिए सेट किया गया था और एक्सपोज़र समय १०० ms. mCherry और GFP के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप फिल्टर (उत्तेजना/उत्सर्जन) क्रमशः 470/525 एनएम और 530/645 एनएम हैं ।
  6. रिकॉर्डिंग के अंत में, प्रत्येक कुओं में पानी में 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के ५०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: कोशिकाओं hydrogel से अलग हो जाएगा और यह लोचदार है के बाद से hydrogel अपनी प्रारंभिक undeformed राज्य के लिए वापस आ जाएगा ।
  7. hydrogel की एक छवि ले लो और यह संदर्भ undeformed छवि के रूप में उपयोग करें ।
  8. कण छवि velocimetry (PIV)31का उपयोग कर समय के प्रत्येक पल में hydrogel के दो आयामी विकृति का निर्धारण, undeformed hydrogel के संदर्भ छवि के साथ समय चूक श्रृंखला की प्रत्येक छवि की तुलना. उपयुक्त विंडो आकारों का उपयोग करें और प्रयोग के आधार पर ओवरलैप ।
    नोट: हम 16 पिक्सल के ओवरलैप के साथ ३२ पिक्सल की खिड़कियों का इस्तेमाल किया ।
  9. 2 डी कर्षण की गणना पर जोर है कि कोशिकाओं hydrogel पर लागू के रूप में कहीं३२,३३वर्णित है ।
  10. कर्षण तनाव से monolayer तनाव की गणना के रूप में पहले एक पतली लोचदार प्लेट monolayer, जो एक के है पर फिलीस्तीनी अथॉरिटी hydrogel द्वारा बनाई गई प्रतिक्रिया बलों के अधीन के लिए यांत्रिक संतुलन के समीकरण को सुलझाने के द्वारा वर्णित३४ मापा कर्षण तनाव के विपरीत हस्ताक्षर ।
    नोट: देखें अनुपूरक सामग्री 1.

7. मात्रात्मक समय चूक माइक्रोस्कोपी का आकलन करने के लिए Extracellular-मैट्रिक्स-कठोरता निर्भर L. monocytogenes प्रसार Endothelial कोशिकाओं के माध्यम से

Figure 6
चित्रा 6: HMEC-1 monolayers के माध्यम से Lm प्रसार के समय चूक मात्रात्मक सूक्ष्म डेटा 3-केपीए और ७०-केपीए कठोरता के साथ सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त. A. इस पैनल के दो प्रतिनिधि संक्रमण घावों से अभी भी छवियों को दिखाता है 0, २००, ४००, और ६०० मिनट । चरण चैनल HMEC-1 सेल monolayers चित्रित, और लाल चैनल intracellular Lm चित्रित (प्रोटोकॉल के चरण 7 देखें) । . इस पैनल उत्तल संक्रमण समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए गए ध्यान को शामिल पतवार के क्षेत्र से पता चलता है । 3-केपीए स्थिति का फोकस क्षेत्र (लाल) ७०-केपीए (हरा) की तुलना में तेजी से बढ़ता है । C. इस पैनल के लिए केंद्र से रेडियल दूरी से पता चलता है संक्रमण ध्यान प्रतिनिधि संक्रमण के लिए समय के एक समारोह के रूप में की साजिश रची HMEC में बढ़-1 monolayers 3 के पीए सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त-केपीए (लाल) और ७०-केपीए (हरे) कठोरता । रेडियल स्पीड (dr/dt) 3-केपीए हालत के लिए स्थिर है, लेकिन ७०-केपीए शर्त के लिए biphasic । D. इन आंकड़ों के दस स्वतंत्र संक्रमण घावों के पहले २०० मिनट के लिए रेडियल गति दिखाओ । लाल (3-केपीए) और हरे (७०-केपीए) डेटा बिंदुओं को पिछले पैनलों में वर्णित दो घावों की ढलानों को दर्शाते हैं । क्षैतिज पट्टियां डेटा के माध्य को दर्शाती हैं । P-मान की गणना गैर-पैरामीट्रिक Wilcoxon रैंक योग परीक्षण के साथ की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. एक 24-खैर प्लेट पर PA hydrogels तैयार ( चरण 1देखें), बीज HMEC-1 कोशिकाओं ( चरण 2देखें), और ऊपर वर्णित के रूप में रात भर JAT983 संस्कृतियों बढ़ने ( चरण 3देखें) ।
  2. संक्रमण के दिन, MCDB के प्रति मिलीलीटर-१३१ पूर्ण मीडिया बैक्टीरियल गोली के 10 µ एल मिश्रण से संक्रमण मिश्रण तैयार करते हैं । ध्यान से 24 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं से मीडिया को हटा दें, और MCDB के १.९ मिलीलीटर-१३१ पूर्ण मीडिया और जीवाणु मिश्रण के ०.१ मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें ।
    नोट: कम इस परख में प्रयुक्त MOI के प्रसार की घटनाओं है कि एक एकल जीवाणु एक मेजबान सेल हमलावर से शुरू विश्लेषण आवश्यक है ।
  3. इसके ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और रिसाव से बचने के लिए एक प्लास्टिक लपेटो के साथ इसे सील । इस केंद्रापसारक में प्लेट प्लेस और 10 मिनट के लिए नमूने स्पिन २०० x जी पर आक्रमण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए ।
  4. ऊतक संस्कृति मशीन में प्लेटें ले जाएं और उंहें 5 मिनट के लिए मशीन ।
  5. मीडिया के साथ नमूनों 4x धो और उंहें ऊतक संस्कृति मशीन के लिए कदम । एक अतिरिक्त 5-7 मिनट के बाद, मीडिया के साथ 20 µ g/mL gentamicin का पूरक मीडिया बदलें ।
  6. एक अतिरिक्त 5 एच के लिए actA प्रवर्तक पर बारी और mTagRFP ओपन रीडिंग फ्रेम३५की अभिव्यक्ति ड्राइव की अनुमति देने के लिए मशीन में थाली मशीन ।
  7. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 एपिडर्मल वृद्धि कारक के एनजी/एमएल, और 1 µ जी/एमएल hydrocortisone के साथ Leibovitz के एल 15 पूरक द्वारा एक जीवित सूक्ष्म माध्यम तैयार करें ।
    नोट: एल-15 पहले से ही 2 मिमी एल-glutamine शामिल है, तो यह MCDB के मामले में के रूप में अतिरिक्त जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है-१३१ मीडिया.
  8. 1 मिलीग्राम/मिलि Hoechst डाई के 1 एल के साथ मिश्रण-15 पूर्ण मीडिया और यह एक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए ' कोशिकाओं नाभिक दाग μL । 10 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति मशीन में कोशिकाओं प्लेस और फिर एक अच्छी तरह से एल के 1 एमएल के साथ 15 पूर्ण मीडिया की जगह-15 पूर्ण मीडिया 20 µ जी के साथ पूरक/gentamicin के एमएल । इसके ढक्कन के साथ प्लेट को कवर और यह एक खुर्दबीन पर्यावरण चैंबर में जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) equilibrated करने के लिए ३७ ˚ सी ।
    नोट: इमेजिंग के लिए, एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप एक सीसीडी कैमरा के साथ इस्तेमाल किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक 20X हवा ०.७५ ना के साथ योजना fluorite हवा उद्देश्य । बिजली ५०% करने के लिए निर्धारित किया गया था और जोखिम समय ५० ms. mCherry के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप फिल्टर क्रमशः उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए 470/525 एनएम हैं ।
  9. छवि एकाधिक पदों हर 5 एक HMEC के माध्यम से कैसे एल एम के प्रसार पर नजर रखने के लिए एक फोकस सुविधा का उपयोग कर मिनट-1 monolayers अलग कठोरता hydrogels पर वरीयता प्राप्त ।
    नोट: एल-15 HEPES के साथ बफर है, तो यह इमेजिंग के दौरान2 सह का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है.

Representative Results

ECM कठोरता-HMEC-1 कोशिकाओं के लिए एल एम संक्रमण के आश्रित संवेदनशीलता:
फिलीस्तीनी अथॉरिटी अलग कठोरता के hydrogels, सभी सतह-कोलेजन के साथ लेपित, बहु पर बनाया गया था अच्छी तरह से ग्लास नीचे प्लेटें प्रोटोकॉल के चरण 1 में वर्णित के रूप में ( 1 चित्रादेखें) । AFM माप hydrogels की सटीक कठोरता की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया गया, के रूप में पहले26,27 वर्णित ( चित्रा 2देखें) । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि endothelial कोशिकाओं के तहखाने झिल्ली के स्थानीय अनुपालन से रेंज कर सकते हैं 1 केपीए (जैसे, मस्तिष्क ऊतक) करने के लिए ७० केपीए (जैसे, महाधमनी)३६,३७,३८, ३९ , ४०. इसलिए, हम निम्नलिखित कठोरता के साथ मैट्रिक्स पर रहने वाले HMEC-1 कोशिकाओं के संक्रमण का परीक्षण करने के लिए चुना: ०.६ केपीए, 3 केपीए, 20 केपीए, और ७० केपीए. प्रत्येक hydrogel कठोरता के लिए, छह hydrogels परिणामों के reproducibility का आकलन करने के लिए गढ़े थे ।

फ्लो cytometry को ECM कठोरता-HMEC-1 कोशिकाओं के Lm संक्रमण के लिए निर्भर संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ( चित्रा 3देखें). HMEC-1 कोशिकाओं एक Lm तनाव (JAT985) है कि internalization (actAp:: mTagRFP) के बाद एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त से संक्रमित थे, intracellular बैक्टीरिया का पता लगाने की अनुमति केवल ( आंकड़े 1L - 1Nदेखें) । JAT985 भी ActA का अभाव है, कोशिका से कोशिका को फैलने से बैक्टीरिया को निष्क्रिय, के बाद से ActA actin धूमकेतु पूंछ और बाद जीवाणु प्रसार के गठन के लिए आवश्यक है । 7-8 एच के बाद संक्रमण, HMEC-1 ' कोशिकाओं संक्रमण प्रवाह cytometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था । एकल कक्षों के विश्लेषण को सुनिश्चित करने के लिए, सेल काउंट्स के वितरण का बल्क आगे बनाम साइड स्कैटर प्लॉट का उपयोग करके gated किया गया था, और तब autofluorescence दर्शाने वाले कक्षों को बाहर करने के लिए दूसरा गेटिंग चरण किया गया था (देखें आंकड़े 3 - 3 ). प्रारंभिक परिणाम चित्रा 3 में दर्शाया गया है कि HMEC-1 एल एम संक्रमण के साथ लगभग दो गुना अधिक HMEC-1 कठोर ७० केपीए hydrogels पर रहने वाले कोशिकाओं के रूप में नरम ०.६ केपीए hydrogels पर रहने वाले कक्षों की तुलना के लिए है (देखें 3 बी आंकड़े - 3 डी). HMEC-1 के रूप में नरम मैट्रिक्स की तुलना में कड़ी पर रहने वाले कोशिकाओं की वृद्धि की एलएम संक्रमण संवेदनशीलता के कारण हो सकता है: 1. HMEC-1 पर एलएम आसंजन में वृद्धि हुई; 2. HMEC-1 में वृद्धि हुई Lm आक्रमण; या 3. दोनों के ऊपर सह होने की. परीक्षण करने के लिए जो परिकल्पना रखती है, HMEC-1 कोशिकाओं नरम पर वरीयता प्राप्त (3 केपीए) और कड़ा (७० केपीए) hydrogels और constitutively GFP एक्सप्रेस Lm से संक्रमित ( आंकड़े 4a - 4cदेखें) । नमूनों में संक्रमण के फौरन बाद तय किए गए थे और बाहरी (अवय) बैक्टीरिया एंटीबॉडी से दाग गए थे. मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, हमने पाया है कि वहां काफी अधिक बैक्टीरिया HMEC-1 का पालन कर रहे है जब मेजबान कोशिकाओं नरम जैल की तुलना में कड़ी के रूप में रहते है ( चित्रा 4डीदेखें) । प्रवाह cytometry डेटा के अनुरूप, वहां काफी अधिक HMEC-1 द्वारा आंतरिक जब मेजबान कोशिकाओं नरम जैल की तुलना में कड़ी पर रहते है ( चित्रा 4देखें) । हालांकि, आक्रमण क्षमता (बैक्टीरिया आंतरिक/HMEC-1 कोशिकाओं में एल एम के बैक्टीरिया की कुल संख्या समान है, सब्सट्रेट कठोरता की परवाह किए बिना ( चित्रा 4एफदेखें).

कर्षण-एल एम संक्रमित HMEC-1 कोशिकाओं के बल माइक्रोस्कोपी:
HMEC-1 कोशिकाओं के एल एम संक्रमण संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के यांत्रिक अपने ECM के लिए या एक दूसरे को, उनके बाधा अखंडता को प्रभावित करने के लिए लगाव की ताकत सहित, बदल सकता है । हम मूल्यांकन करने के लिए कि क्या कर्षण बल माइक्रोस्कोपी३२ के लिए सेल की गणना-ECM कर्षण बलों और Monolayer तनाव माइक्रोस्कोपी४१ intracellular तनावपूर्ण बलों की गणना करने के लिए का उपयोग करके मामला हो सकता है की मांग की । चित्रा 5 विरूपण क्षेत्र, कर्षण तनाव क्षेत्र, और HMEC-1 के intracellular तनाव क्षेत्र के नक्शे को दर्शाया गया है 20-केपीए hydrogels पर रहने वाले अलग समय अंक के बाद संक्रमण पर कोशिकाओं । आंकड़े 5 ए - 5d संक्रमित नियंत्रण HMEC-1 कक्षों का संदर्भ देते हैं, जबकि आंकड़े 5E - 5H HMEC-1 कक्षों को संदर्भित करते हैं, जो Lm से संक्रमित संक्रमण की बहुलता पर ३०० बैक्टीरिया/ यह प्रारंभिक काम पता चलता है कि संक्रमित HMEC-1 कोशिकाओं को अपने सेल के परिमाण को कम-ECM और intracellular एल एम के साथ एक संक्रमण के दौरान तनाव, जबकि संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं के लिए मनाया नहीं है ।

HMEC-1 monolayers में ECM कठोरता-निर्भर Lm प्रसार:
समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रभाव मैट्रिक्स कठोरता HMEC-1 monolayers के माध्यम से Lm प्रसार पर है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । के रूप में Lm monolayer के माध्यम से फैलता है, जीवाणु संक्रमण है कि समय के एक समारोह के रूप में बढ़ता का ध्यान केंद्रित बनाने ( चित्रा 6एक और वीडियो आंकड़े 1 और 2देखें) । संक्रमण फोकस के क्षेत्र में एक उत्तल पतवार ड्राइंग द्वारा मापा गया था, सबसे छोटा उत्तल बहुभुज कि अंक का एक सेट शामिल, बैक्टीरिया४२के आसपास. मेजबान कोशिकाओं के monolayer के माध्यम से एल monocytogenes सेल-टू-सेल की कार्यकुशलता को मापने के लिए क्षेत्र में कोई मानक मेट्रिक नहीं है । प्रसार दक्षता का आकलन करने के लिए, कुछ एक संक्रमण फोकस४१में मेजबान कोशिकाओं की संख्या गिना है, और दूसरों को संक्रमण मेजबान कोशिकाओं४३के समूह के आसपास मैन्युअल रूप से सीमाओं तैयार की है. हम बैक्टीरिया के चारों ओर एक उत्तल बहुभुज आकर्षित करने के लिए चुना है, क्योंकि यह एक स्वचालित, संगत, और गणना सस्ती प्रक्रिया एल monocytogenes प्रसार की क्षमता को मापने के लिए है । ऐसा करने से, हम HMEC-1 कोशिकाओं में संक्रमण फोकस क्षेत्र में एक मामूली कमी पाया ७० केपीए hydrogels पर वरीयता प्राप्त जब उन की तुलना में 3 केपीए मैट्रिक्स पर बीज ( चित्रा 6बी और वीडियो आंकड़े 1 और 2देखें) । संक्रमण फोकस के विकास की दर निर्धारित करने के लिए, रेडियल दूरी संक्रमण फोकस के क्षेत्र के वर्ग जड़ लेने और pi द्वारा इस विभाजन के द्वारा समय के एक समारोह के रूप में रची गई थी. इस गणितीय परिवर्तन मानता है कि संक्रमण फोकस के आकार मोटे तौर पर परिपत्र४४है । फोकस वृद्धि की गति को मापने के लिए, 3-और ७०-केपीए मैट्रिक्स दोनों के लिए रेडियल दूरी की परिवर्तन की दर (यानी, ढलान) मापा गया था । इस दृष्टिकोण का आविर्भाव हुआ कि संक्रमण का ध्यान तेजी से बढ़ता गया और HMEC-१ कोशिकाओं में मोनोटोनिक ३-केपीए मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त हुई. हालांकि, फ़ोकस काफी धीमी (पहले २०० मिनट) और कुछ धीमी (२०० ६०० मिनट) में ७०-केपीए मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त ( चित्र 6Cदेखें) बढ़ी । दरअसल, आगे डेटा के विश्लेषण की पुष्टि की है कि संक्रमण ध्यान वृद्धि हुई, औसत पर, दो गुना ७० में धीमी-केपीए मैट्रिक्स, विशेष रूप से पहले २०० मिनट के दौरान ( चित्रा 6डीदेखें) ।

Figure 3
चित्रा 3 : ECM कठोरता-HMEC के आश्रित संवेदनशीलता-Lm आक्रमण करने के लिए 1 कोशिकाओं प्रवाह cytometry का उपयोग करके मापा .  HMEC-1 कोशिकाओं Lm (JAT985) से संक्रमित थे और संक्रमण प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था । इस पैनल प्रतिनिधि HMEC-1 एक अच्छी तरह से आ रही कोशिकाओं के लिए आगे तितर बितर भूखंड बनाम एक पक्ष से पता चलता है । मलबे (बाएँ) और कोशिका दोहरी या तीन प्रबंधन (दाएँ) को बाहर करने के लिए गेटिंग के माध्यम से कक्षों का थोक वितरण चुना गया. B. यह ग्राफ HMEC-1 नरम ०.६ केपीए पर मढ़वाया के लिए प्रति कोशिका Lm प्रतिदीप्ति तीव्रता के लघुगणक के हिस्टोग्राम दिखाता है । C. यह ग्राफ़ HMEC-1 के लिए प्रति कक्ष Lm प्रतिदीप्ति तीव्रता के लघुगणक के हिस्टोग्राम को कड़ा ७० केपीए hydrogels पर चढ़ाया हुआ दिखाता है. N = 4-6 प्रतिकृतियां के लिए हिस्टोग्राम भिंन रंगों में दिखाए जाते हैं । नियंत्रण संक्रमित कोशिकाओं ' हिस्टोग्राम बैंगनी है । क्या संक्रमित है परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल गेट लाल रंग में दिखाया गया है । MOI १०० है और संक्रमण 8 एच के बाद संक्रमण का आकलन किया गया था । D. डाटा शो प्रतिशत संक्रमित HMEC-1 कोशिकाओं hydrogel कठोरता बनाम (N = 5) । क्षैतिज पट्टियां डेटा के माध्य को दर्शाती हैं । P-मान की गणना गैर-पैरामीट्रिक Wilcoxon रैंक योग परीक्षण के साथ की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video Figure 1
वीडियो चित्रा 1: एक HMEC-1 सेल monolayer (चरण) के माध्यम से intracellular Lm (लाल चैनल) के प्रसार एक 3-केपीए सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त. कोशिकाओं Leibovitz एल में imaged थे 15 मीडिया (10% FBS, 20 µ जी/gentamicin के एमएल) एक पर्यावरण चैंबर equilibrated के अंदर ३७ ˚ सी के लिए छवियों हर 5 मिनट एकत्र किए गए । फिल्म की स्पीड 15 फ्रेम्स/ इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 2
वीडियो चित्र 2: एक HMEC-1 सेल monolayer (चरण) के माध्यम से intracellular Lm (लाल चैनल) के प्रसार एक ७०-केपीए सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त । कोशिकाओं Leibovitz एल में imaged थे 15 मीडिया (10% FBS, 20 µ जी/३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पर्यावरण चैंबर equilibrated के अंदर gentamicin) । छवियों हर 5 मिनट एकत्र किए गए । फिल्म की स्पीड 15 फ्रेम्स/ इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

कामवाली की मापांक (E, केपीए) Acrylamide% (४०% स्टॉक से) Bisacrylamide% (2% स्टॉक से)
०.६ 3 ०.०४५
3 5 ०.०७५
10 10 ०.०७५
20 8 ०.१९५
७० 10 ०.४५

तालिका 1. polyacrylamide (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) की संरचना बदलती कठोरता के hydrogels । इस तालिका में, शेयर का प्रतिशत ४०% acrylamide समाधान और शेयर का प्रतिशत 2% भा-acrylamide समाधान एक दिया कठोरता (यंग मापांक, ई) को प्राप्त करने के लिए विभिंन स्तंभों में संकेत कर रहे हैं ।

Supplemental Material
पूरक सामग्री 1. गणना कर्षण तनाव से intracellular तनाव की गणना । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

कोशिकाओं को भौतिक पर्यावरण cues की एक किस्म है, जो न केवल कोशिकाओं ' आकृति विज्ञान पर भी उनके जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिविधि, इस प्रकार महत्वपूर्ण कोशिका कार्यों और व्यवहार को प्रभावित४५,४६प्रभावित कर सकते है भावना कर सकते हैं । कोशिकाओं के ECM की कठोरता तेजी से सेलुलर गतिशीलता, भेदभाव, प्रसार, और अंत में सेल भाग्य४७,४८,४९का एक महत्वपूर्ण मॉडुलन के रूप में सराहना की है । यद्यपि वहां कोशिकाओं और उनके ECM के बीच जटिल यांत्रिक बातचीत को समझने में कई हाल ही में अग्रिम किया गया है, थोड़ा कैसे पर्यावरण कठोरता जीवाणु संक्रमण के लिए कोशिकाओं की संवेदनशीलता को प्रभावित करता है के बारे में जाना जाता है । इस तरह के अध्ययनों की सुविधा के लिए, हम इस उपंयास बहु अच्छी तरह से स्वरित्र कठोरता जो संक्रमण परख५०के साथ संगत है की polyacrylamide hydrogels की स्थापना की निर्माण के आधार पर परख विकसित की है । परंपरागत रूप से, ऊतक संस्कृति में कोशिकाओं के एक जीवाणु संक्रमण कांच या polystyrene सतहों कि लगभग 1-3 के आदेश सबसे अनुयाई कोशिकाओं8,५१की प्राकृतिक ECM से परिमाण कठोरता के है पर अध्ययन किया गया है । परख यहां वर्णित बैक्टीरिया के अध्ययन को सक्षम करने से नए राजमार्गों खोलता है एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक पर्यावरण कठोरता शासन में मेजबान बातचीत ।

प्रस्तुत परख की अवधारणा के सबूत के लिए, HMEC-1 कोशिकाओं मॉडल अनुयाई मेजबान कोशिकाओं और एक मॉडल जीवाणु रोगज़नक़ के रूप में एल एम के रूप में चुना गया था । हालांकि, परख आगे की पढ़ाई के लिए बढ़ाया जा सकता है अगर उचित संशोधित । इस तरह के अध्ययनों में बैक्टीरिया और वायरस सहित अतिरिक्त रोगजनकों द्वारा विभिन्न स्तनधारी अनुयाई होस्ट सेल प्रकारों के संक्रमण को शामिल किया जा सकता है । इस विशेष परख के लिए, जैल प्रोटीन-कोलेजन मैं के साथ लेपित थे, लेकिन मेजबान सेल प्रकार पर निर्भर करता है, यह एक अलग ECM प्रोटीन का उपयोग करने के लिए संभव है-कोटिंग, जैसे laminin या fibronectin, hydrogel पर ब्याज की मेजबान कोशिकाओं के लगाव की सुविधा के लिए ५२. एक अतिरिक्त विचार जो होस्ट कक्ष प्रकार पर निर्भर करता है hydrogel कठोरता श्रेणी का अध्ययन किया जाना है । कठोरता की सीमा क्या शारीरिक विशिष्ट मेजबान सेल प्रकार के लिए प्रासंगिक है और कितनी अच्छी तरह है कि मेजबान एक दिया कठोरता hydrogel पर एक monolayer बनाने देता है पर निर्भर होना चाहिए इसी प्रकार, मॉडल रोगज़नक़ के आधार पर जांच की जानी चाहिए, मामूली संशोधनों को संक्रमण परख पर लागू करने की आवश्यकता हो सकती है यहां वर्णित है ।

परख के नवाचार के रूप में polyacrylamide hydrogels24,५०,५३ के निर्माण के लिए पिछले तरीकों की तुलना में कुछ अद्वितीय प्रस्तावित संक्रमण परख में एकीकृत सुविधाओं में निहित है । सबसे पहले, hydrogels बहु पर निर्मित कर रहे है अच्छी तरह से गिलास नीचे प्लेटें, जो कई शर्तों की स्क्रीनिंग के साथ ही कुछ प्रक्रियाओं के स्वचालन सक्षम बनाता है । एक ही समय में एकाधिक शर्तों की निगरानी या कई दोहराने की जांच महत्वपूर्ण है के बाद से इस तरह के एक दृष्टिकोण के परिणाम ऐसे मेजबान सेल बीतने के रूप में कारकों से प्रभावित किया जा सकता है और बैक्टीरिया की सटीक संख्या के लिए मेजबान है, जो अक्सर बदल संक्रमित जोड़ा स्वतंत्र प्रयोगों के बीच. इस परख की एक अतिरिक्त अनूठी विशेषता यह है कि hydrogels लगभग ४० µm की ऊंचाई है, जो काफी पतली पारंपरिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि है । हमें पता चला है कि हम सफलतापूर्वक दोनों लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और सेल निर्धारण प्रदर्शन कर सकते हैं, और immunostaining इमेजिंग द्वारा पीछा किया, उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति शुरू करने के बिना । अंत में, hydrogels दो परतों से बना रहे हैं, ऊपरी एक फ्लोरोसेंट microbeads एंबेडेड होने के साथ, एक ही फोकल विमान में सीमित । इस विशेषता यह सुनिश्चित करता है कि कोई आउट-की-फोकस इमेजिंग के दौरान हस्तक्षेप प्रकाश होगा । मोतियों की उपस्थिति यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे समान हैं और TFM और एमएसएम24,३२,४१के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए जैल की सतह स्थलाकृति की दोनों परीक्षा में सक्षम बनाता है । TFM और एमएसएम के साथ, यह कोशिका-ECM और सेल-सेल बलों क्रमशः कठोरता मैट्रिक्स पर रहने वाले कोशिकाओं की गणना करने के लिए संभव है. इस उपंयास परख का प्रयोग, यह संभव है कि पर्यावरण कठोरता के दोनों योगदान और एक साथ संक्रमण की तुलना करके शारीरिक बलों के इस तरह के माप करना । इस तरह के एक दृष्टिकोण के बाद, प्रभाव संक्रमण अपने पाठ्यक्रम में मेजबान सेल यांत्रिकी पर है निर्धारित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के intracellular तनाव का विकास एमएसएम का उपयोग कर की गणना की जा सकती है और monolayer की बाधा अखंडता के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, परख के बहु अच्छी तरह से प्रकृति को देखते हुए, यह एक साथ एक जीवाणु संक्रमण के साथ औषधीय और आनुवंशिक perturbations परिचय संभव है, और अधिक गहराई में मेजबान सेल यांत्रिकी और संक्रमण के बीच जटिल पुनरावृत्ति की जांच ।

तकनीक की एक अंतर्निहित सीमा प्रभाव सब्सट्रेट कठोरता कोशिकाओं की प्रसार दर पर हो सकता है में निहित है । आमतौर पर, संक्रमण की परख में, हम यह सुनिश्चित करने की जरूरत है कि विभिंन परिस्थितियों में मेजबान सेल घनत्व एक ही है । ऐसा इसलिए है क्योंकि खुद के द्वारा कोशिका घनत्व को संक्रमण के लिए मेजबान की संवेदनशीलता पर एक प्रभाव हो सकता है । HMEC-1 कक्ष होस्ट कक्षों के रूप में उपयोग किए गए थे जब hydrogels पर 24 h के लिए वरीयता प्राप्त उनकी संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है । हालांकि, विभिंन प्रकार के सेल विभेदक प्रसार प्रदर्शित हो सकता है, hydrogel कठोरता पर निर्भर करता है, कि संक्रमण अध्ययन पूर्वाग्रह कर सकते हैं । इसी तरह, संक्रमण पूर्वाग्रह पैदा कर सकते हैं जब कोशिकाओं monolayers फार्म नहीं है या hydrogels पर अच्छी तरह से संलग्न नहीं है, के रूप में तब होता है जब कुछ कोशिका प्रकार बहुत नरम मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं (जैसे, मानव गर्भनाल endothelial कोशिकाओं या मडि़हान-डार्बी कुत्ते गुर्दे उपकला कोशिकाओं ०.६ पर वरीयता प्राप्त-केपीए hydrogels५४,५५). जहां तक रोगजनकों का संबंध है, कुछ बैक्टीरिया (जैसे, अरै burdgorferi) मेजबान कोशिकाओं पर संलग्न और उन पर आक्रमण कर सकते हैं, लेकिन उंहें५६के माध्यम से भी transmigrate कर सकते हैं । हम अभी तक अगर इस परख रोगज़नक़ स्थानांतरगमन अध्ययन के लिए काम करेंगे परीक्षण नहीं किया है, लेकिन यह न्यूट्रोफिल transmigrating endothelial कोशिकाओं पर फिलीस्तीनी अथॉरिटी hydrogels पर वरीयता प्राप्त पिछले अध्ययन के बाद से संभव है५७सफलतापूर्वक काम प्रलेखित किया गया है । वहां कैसे acrylamide और बीआईएस के उपयुक्त सांद्रता-acrylamide24,25,26 के मिश्रण से एक दिया युवा मापांक के polyacrylamide hydrogels निर्माण करने के लिए दिखा संचालित अध्ययन के एक बहुत कुछ किया गया है ,27. हालांकि, विशेष रूप से जब एक इच्छाओं को अलग कठोरता के hydrogels पर रहने वाले कोशिकाओं पर TFM प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए, यह hydrogels की कठोरता की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है या तो AFM या अंय इंडेंट५८तकनीक के माध्यम से । अपेक्षित मूल्य से मामूली विचलन इस्तेमाल एक अलग विलायक या एक वृद्ध acrylamide स्टॉक समाधान, या तरीके AFM माप प्रदर्शन कर रहे है के कारण उत्पंन कर सकते है (जैसे, AFM टिप के आकार) । अंत में, इस के साथ साथ प्रस्तुत दृष्टिकोण 2d मैट्रिक्स पर मेजबान कोशिकाओं बोने, जो एक और अधिक यथार्थवादी और शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी परिदृश्य से अलग कर सकते है पर आधारित है । हालांकि, स्वरित्र कठोरता के साथ 3 डी जैल विनिर्माण, उंहें मेजबान कोशिकाओं के साथ बोने और फिर उंहें रोगजनकों के साथ संक्रमित, अभी भी कुछ तकनीकी कठिनाइयों शामिल हैं । फिर भी, हम आशा है कि निकट भविष्य में हम एक 3 डी सेटिंग में संक्रमण का अध्ययन करने के लिए वर्तमान परख का विस्तार करने में सक्षम हो जाएगा ।

योग करने के लिए, प्रारंभिक परिणामों के साथ एक साथ वर्णित प्रोटोकॉल सबूत है कि यह उपंयास परख एक मात्रात्मक फैशन में रोगजनक बैक्टीरिया के साथ अनुयाई मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण बन सकता है और एक बहुत अधिक उपलब्ध कराने शारीरिक रूप से प्रासंगिक पर्यावरण से पहले की जांच की । प्रस्तावित सेटअप में polyacrylamide hydrogels के निर्माण की शक्ति में निहित है कि परख ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में कई तकनीकों के प्रदर्शन के साथ संगत है, immunostaining प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया, और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी । परख रोगजनकों, जो हम दोनों रणनीतियों जो रोगजनकों संक्रमित मेजबान और के विकास को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण प्रभाव होगा आशा द्वारा विभिंन अनुयाई मेजबान सेल प्रकार के संक्रमण को शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संक्रमण के खिलाफ चिकित्सीय हस्तक्षेप ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एम पाद लेख, आर Lamason, एम Rengaranjan, और उनके विचार विमर्श और प्रयोगात्मक समर्थन के लिए Theriot लैब के सदस्यों के लिए हमारी धंयवाद । इस काम को NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), द HHMI Gilliam फेलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी (F.E.O.), स्टैनफोर्ड ग्रेजुएट फेलोशिप (F.E.O.), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (E.E.B.) द्वारा सपोर्ट किया गया । फ्लो cytometry स्टैनफोर्ड साझा FACS सुविधा में प्रदर्शन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

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References

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