Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
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Summary

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

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Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

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Abstract

Extrazelluläre Matrix Steifigkeit umfasst eines der mehrere mechanische Reize aus der Umwelt, die beeinflussen zellulären Verhalten, Funktion und Schicksal im Allgemeinen bekannt sind. Obwohl immer mehr adhärente Zellen-Typen Antworten auf Matrix Steifigkeit charakterisiert wurden, wie adhärenten Zellen Anfälligkeit für bakterielle Infektion hängt von der Matrix Steifigkeit weitgehend unbekannt, wie ist die Wirkung der bakteriellen Infektion auf die Biomechanik der Wirtszellen. Wir vermuten, dass die Anfälligkeit der endothelialen Zellen zu einer bakteriellen Infektion hängt von der Steifigkeit der Matrix, auf der sich diese Zellen befinden, und dass die Infektion des Wirtes mit Bakterien Zellen ihre Biomechanik ändert. Um diese beiden Hypothesen zu testen, wurden Endothelzellen als Modell Gastgeber und Listeria Monocytogenes als ein Modell-Erreger verwendet. Durch die Entwicklung eines neuartigen Multi-well-Format-Assays, zeigen wir, dass die Wirkung von Matrix Steifigkeit auf Endothelzellen von L. Monocytogenes -Infektion durch Durchflusszytometrie und Immunostaining gefolgt von Mikroskopie quantitativ bewertet werden kann. Darüber hinaus kann mit Traktion Rasterkraftmikroskopie, die Wirkung von L. Monocytogenes -Infektion auf Host Endothelzellen Biomechanik studiert werden. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht die Analyse der Wirkung von Gewebe-relevanten Mechanik auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, die extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien. Diese Methode gilt auch für eine Vielzahl von anderen Arten von Studien zur Zelle Biomechanik und Reaktion auf Substrat Steifigkeit wo ist es wichtig, viele Wiederholungen parallel in jedem Experiment durchführen zu können.

Introduction

Zellen in den tierischen Geweben sind in der Regel anhaftenden, Anbringen von benachbarten Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Die Verankerung der Zellen zu ihrer ECM ist entscheidend für viele zelluläre Prozesse von Zelle Motilität, Zell-Proliferation und das Überleben1,2. Zelluläre Verankerung an das ECM richtet sich nach der ECM-Zusammensetzung und Steifigkeit. Zellen reagieren auf Änderungen in den letzteren durch dynamisch neu arrangieren ihre Zytoskelett, Zelle-ECM und Zellezelle Verwachsungen, die wiederum kritisch Zelle Biomechanik und Funktionen3,4,5,6 ändern . ECM-Steifigkeit kann im Raum (d.h., anatomische Lage) rechtzeitig (d.h., Altern) und pathophysiologische Prozesse (z.B., Arteriosklerose, Krebs, Infektionen, etc.) variieren. Zum Beispiel es ist allgemein anerkannt, dass endotheliale Zellen auf härtere-im Vergleich zu weicher-Matrizen erhöhte Kräfte an ihrer ECM und zueinander ausüben und weisen erhöhte Motilität und Verbreitung7,8. Ebenso Fibroblasten mit Wohnsitz auf härtere Matrizen hohe KONTRAKTILE Kräften für ihre ECM zu vermitteln und zeigen erhöhte Proliferation, Motilität und ECM Produktion9,10,11. Die Steifigkeit ihrer ECM und bakteriellen Infektionen ist noch weitgehend unbekannt, obwohl Zelle Mechanik und Reaktion auf ECM Steifigkeit für verschiedene Zelltypen, die Beziehung zwischen anhaftende Wirtszellen ausgiebig untersucht wurden.

Um die Rolle der ECM Steifheit in Bakterien-Host-Zell-Interaktionen zu untersuchen, wurde L. Monocytogenes (Lm) als Modell Erregers gewählt. LM ist eine allgegenwärtige lebensmittelbedingte Bakterium, das systemische Infektion in einer Vielzahl von Säugetieren Hosts führen kann. Diese fakultativen intrazellulären Erreger aus dem Darmepithel zu entfernten Organen gelangen durchlaufen verschiedene Arten von vaskulären gefäßendothelien. Wenn sie die Blut - Hirn-Schranke durchbricht, kann Lm Meningitis verursachen, und wenn sie die Plazenta kreuzt, es kann dazu führen, dass Spontanaborte12,13. LM einzelnen Host Zelltypen infizieren kann und kann mit Hilfe von verschiedenen pathogenen Strategien tun. LM-Infektion ist meist im Zusammenhang mit Epithelzellen, untersucht worden, während viel weniger bekannt ist, über wie Lm infizieren kann und Bypass Endothelzellen Futter das Lumen der Blutgefäße14,15,16. Darüber hinaus ist es noch weitgehend unbekannt, wie die Steifigkeit des ECM Endothelzellen Wohnsitz Lm die Fähigkeit, diese Wirtszellen eindringen und breitete sich dann moduliert. LM und mehrere zusätzliche Bakterienarten (d.h., Rickettsia Parkeri) nutzen Sie die Vorteile des Aktin-Zytoskeletts des Wirtes Zellen, die sie, beide infizieren dringen in ihrem Zytoplasma und Erleichterung der Verbreitung von Zelle zu Zelle17 , 18 , 19. sie erreichen, dass durch die Expression von Proteinen, die befähigen, mit Host-Aktin-Polymerisation-Wege einzugreifen und Aktin Komet Schwänzen zu produzieren, die ihren Vortrieb16,20zu erleichtern. Als Folge einer Infektion muss der Wirtszelle Aktin-Zytoskelett, dynamisch in einer Art und Weise neu zu ordnen, die noch nicht vollständig möglicherweise Auswirkungen auf die Biomechanik von Wirtszellen, die auch die physikalischen Kräfte, die sie auf ihre ECM und auf jedem ausüben gekennzeichnet ist, andere. Um diese Prozesse zu untersuchen, wurden menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) als Modell Wirtszellen aus drei Gründen gewählt: 1. Endothelzellen sind dafür bekannt, sehr Mechanosensitive sein, da sie ständig ausgesetzt sind, auf unterschiedliche körperliche Signale21; (2) die Strategien, die LM beschäftigt, um endotheliale Zellen zu infizieren, sind noch weitgehend unbekannt22; und 3. HMEC-1 können sind eine immortalisierte Zelllinie und daher problemlos kultiviert und genetische Manipulation ausgesetzt.

Bakterielle Infektion von Wirtszellen wurde meist studierte in Vitro durch impfen Zellen auf Glas oder Polystyrol Substrate, die deutlich stabiler als die physiologische ECM die meisten Zellen12,14,23. Zu prüfen, die Infektion der Zellen auf eine Matrix, deren Steifigkeit physiologisch relevanten ist, ausgesät und die Rolle der ECM Steifigkeit auf die Infektion von Zellen durch bakterielle Krankheitserreger zu erhellen, folgten wir einen innovativen Ansatz, basierend auf Herstellung dünn Microbead eingebettet Polyacrylamid Hydrogele abstimmbaren Steifigkeit auf Multi-well-Platten. Die Neuheit der vorgeschlagene Ansatz liegt, dass es ermöglicht die Überwachung mehrerer Bedingungen gleichzeitig aufgrund seiner Multi-well-Format kompatibel mit mehreren Techniken aufgrund der besonderen Art ist die Substrate baute. HMEC-1-Zellen wurden auf dieser Protein-beschichtete Hydrogele entkernt und dann mit verschiedenen Lm-Stämme, die entweder nach Internalisierung fluoreszierende oder sind konstitutiv fluoreszierend infiziert. Die Rolle der ECM Steifigkeit auf Infektion Anfälligkeit von Wirtszellen HMEC-1 wurde von Durchflusszytometrie bewertet. Darüber hinaus wurden Immunostaining und Fluoreszenz-Mikroskopie zur Unterscheidung zwischen anhaftenden und internalisierten Bakterien verwendet. Schließlich wurde Traktion Force Microscopy (TFM) erfolgreich durchgeführt, um die Wirkung von Lm-Infektion auf die Traktion betont, die dass die endotheliale Zellen ausüben auf ihre Matrizen während der Infektion zu charakterisieren. Die vorgestellte Assay kann leicht geändert werden, um weitere Studien über die Wirkung von ECM Steifigkeit auf Infektion Suszeptibilität des adhärenten Zellen mit verschiedenen Zelllinien oder Krankheitserregern ermöglichen.

Protocol

1. Herstellung von dünnen zweischichtigen Polyacrylamid (PA) Hydrogele auf Multi-Well-Platten

  1. Lösen sich Ammonium Bleichen (APS) in destilliertem Reinstwasser, eine Endkonzentration von 10 g/mL zu erreichen. Aliquoten und laden die Lösung bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz (3 Wochen).
    Hinweis: Die oben genannte Lösung kann im Vorfeld Hydrogel Fertigung vorbereitet werden.
  2. Glas-Aktivierung von 24 Wohlen Teller
    1. 1 h mit 500 µL 2 M NaOH pro Bohrloch bei Raumtemperatur inkubieren Sie 24 Wohlen unteren Glasplatten mit 13 mm Durchmesser-Brunnen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Spülen Sie die Brunnen 1 X mit Reinstwasser und fügen Sie dann 500 µL 2 % (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (siehe Tabelle der Materialien) in 95 % igem Ethanol zu jedem gut für 5 Minuten.
    3. Der Brunnen 1 x erneut mit Wasser spülen und fügen 500 µL 0,5 % Glutaraldehyd in jede Vertiefung für 30 min. Spülen die Vertiefungen 1 X mit Wasser und trocknen sie bei 60 ° c bei geschlossenem Deckel ab.

Figure 1
Abbildung 1 : Bakterielle Infektion-Assay von Wirtszellen auf dünnen zweischichtigen fluoreszierende Perle eingebettet Polyacrylamid (PA) Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit. A. Glasdeckgläser sind chemisch modifiziert um Hydrogel-Anlage zu ermöglichen. B. 3,6 µL PA Mischungen sind auf dem Glas Boden abgelagert. C. die Mischung ist bedeckt mit einem kreisförmigen Glas 12 mm deckgläschen Polymerisation zu ermöglichen. D. das Deckglas wird mit einer Nadel Spritze entfernt. E. 2,4 µL einer PA-Lösung mit Microbeads ist die Unterschicht aufgebracht und mit einem runden Glas deckgläschen begrenzt. F. Puffer wird in den Brunnen hinzugefügt und das Deckglas wird entfernt. G. UV-Bestrahlung für 1 h sorgt für Sterilisation. H. eine Sulfo-SANPAH-haltige Lösung wird auf die Gele, die dann unter UV für 10 min. ichplatziert werden hinzugefügt. Die Hydrogele sind mit einem Puffer gewaschen und dann über Nacht inkubiert mit Kollagen I. J. Das Hydrogel ist mit Zelle Medien equilibriert. K. die Wirtszellen ausgesät. L. LM-Bakterien werden hinzugefügt, um die Lösung und die Infektion wird durch Zentrifugation synchronisiert. M. 1 h nach der Infektion Bakterien in der Lösung werden weggespült und Medien ergänzt mit einem Antibiotikum werden hinzugefügt. N. fluoreszieren beginnt bei 4 h nach der Infektion, Lm (JAT985). O. HMEC-1-Zellen sind losgelöst von ihrer Matrix und die Lösungen an Röhren, Flow Cytometry Messungen durchzuführen. Beachten Sie, dass Tage und ungefähre Zeiten für jeden Schritt des Tests auch angegeben sind. Diese Zahl wurde von Bastounis und Theriot59geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Polyacrylamid-Hydrogel-Fertigung
    Hinweis: Siehe Abbildung 1.
    1. Vorbereiten von wässrigen Lösungen, die von 3-10 % 40 % Aktien Acrylamid-Lösung enthalten (siehe Tabelle der Materialien) und 0,06 - 0,6 % von 2 % auf Lager Bis-Acrylamid-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), Hydrogele abstimmbaren Steifigkeit von 0,6 bis hin zu fertigen kPa bis 70 kPa. Siehe Tabelle 1.
      1. 3 % Acrylamid mix für 0,6 kPa Hydrogele mit 0,045 % Bis-Acrylamid. 5 % Acrylamid mix für 3 kPa Hydrogele mit 0,074 % Bis-Acrylamid. 10 % Acrylamid mix für 10 kPa Hydrogele mit 0,075 % Bis-Acrylamid. 8 % Acrylamid mix für 20 kPa Hydrogele mit 0.195 % Bis-Acrylamid. 10 % Acrylamid mix für 70 kPa Hydrogele mit 0,45 % Bis-Acrylamid.
        Hinweis: Weitere Details zur Erreichung wünschenswert PA Hydrogel Steifigkeit an anderer Stelle24,25,26,27finden.
    2. Bereiten Sie zwei wässrige Lösungen für jede wünschenswerte Hydrogel-Steifigkeit. Bereiten Sie Lösung 1 Perle frei und Lösung 2 0.03 % 0,1 µm Durchmesser fluoreszierende Mikro-Perlen enthalten (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Degas Lösungen 1 und 2 durch Vakuum für 15 min, Sauerstoff zu beseitigen, die Polymerisation der Lösungen zu hemmen.
    4. Lösung 1 zum Aktivieren einer Polymerisation Initiation fügen Sie 0,6 % der 10 g/mL Brühe APS-Lösung und 0,43 % Tetramethylethylenediamine (TEMED hinzu). Handeln Sie schnell.
    5. 3.6 µL Lösung 1 in die Mitte jedes gut der 24 Wohlen Schale hinzufügen (siehe Schritt 1.2 für die Vorbereitung).
    6. Sofort die Brunnen mit 12 mm unbehandelt kreisförmige Deckgläsern und lassen Sie Lösung 1 für 20 min sitzen, so dass es vollständig polymerisiert.
    7. Klopfen Sie leicht eine Spritzennadel zu einer Oberfläche zu erstellen Sie einen kleinen Haken an der Spitze, die Entfernung von den Deckgläsern zu erleichtern. Heben Sie die Verwendung der Spritzennadel Deckgläsern.
    8. Hinzufügen von 0,6 % des APS-Stammlösung 10 g/mL und 0,43 % TEMED mit Lösung 2. 2.4 µL der Mischung auf die erste Schicht in jede Vertiefung der Schale 24 Wohlen einzahlen.
    9. Lösung 2 mit 12 mm kreisförmige Glasdeckgläser bedecken, sanft drücken nach unten mit einer Zange um die Dicke der zweiten Schicht zu gewährleisten ist minimal. Lassen Sie die Lösung 2 für 20 min polymerisieren.
    10. Jeder der Brunnen 500 µL 50 mM HEPES pH 7,5 hinzu und entfernen Sie dann die Glasdeckgläser mit der Spritzennadel und Pinzette.
  2. Sterilisation, Kollagen-Beschichtung und Gleichgewichtherstellung Polyacrylamid Hydrogele
    1. UV-Expose Hydrogele für 1 h in der Gewebekultur Haube Sterilisation zu ermöglichen.
    2. Bereiten Sie eine Mischung von 0,5 % Gewicht/Volumen Sulfosuccinimidyl 6-(4 '-Azido-2′-Nitrophenylamino) Hexanoate (Sulfo-SANPAH, siehe Tabelle of Materials) in 1 % DMSO und 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Die Oberseite der Hydrogele 200 µL dieser Lösung hinzufügen. Schnelles, handeln sie aussetzen, UV (302 nm) für 10 min um sie zu aktivieren.
    4. Waschen Sie die Hydrogele zweimal mit 1 mL 50 mM HEPES pH = 7,5. Wiederholung ist notwendig, um sicherzustellen, dass überschüssige Vernetzer entfernt.
    5. Protein-Mantel die Hydrogele mit 200 µL von 0,25 mg/mL Ratte tail Kollagen ich (siehe Tabelle der Materialien) in 50 mM HEPES. Inkubieren Sie die Hydrogele mit der Kollagen-Lösung an der Spitze, über Nacht bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Um Austrocknung/Verdunstung zu verhindern, legen Sie die Multi-well-Platten in einem Auffangeinrichtungen und fügen Sie Labor Reinigung Gewebe in den Innenumfang des Containments in Wasser eingeweicht.
    6. Verwenden Sie ein Epifluoreszenz oder confocal Mikroskop mit einem 40 X Objektiv zur Messung der Dicke der Hydrogele. Dazu suchen die Z-Positionen von unten (wo die Glasoberfläche ist) und top-Flugzeuge der Hydrogel (wo die fluoreszierenden Perlen Intensität maximale ist). Dann subtrahieren Sie die Z-Positionen, um die Höhe zu bestimmen.
      Hinweis: Wir verwendet ein umgekehrtes Epifluoreszenz-Mikroskop und einem 40 X Objektiv mit numerischer Apertur 0,65 zur Messung der Dicke der Hydrogele. Atomische Force Microscopy Messungen (AFM) können auch an dieser Stelle durchgeführt werden, um die genaue Steifigkeit die Hydrogele zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
    7. Fügen Sie vor der Aussaat der Zellen der Zinsen auf die Hydrogele 1 mL der Medien auf die Hydrogele und inkubieren sie bei 37 ° c für 30 min bis 1 h um Gleichgewichtherstellung zu gewährleisten.
      Hinweis: Wir MCDB-131 Medien hinzugefügt, weil das die Medien ist wo die Modell Wirtszellen (HMEC-1) (siehe Schritt 2.1 für Details) kultiviert wurden.

Figure 2
Abbildung 2: AFM-Messungen von PA Hydrogel Steifigkeit und Perlen Verteilung. A. Daten zeigen die erwarteten Elastizitätsmodul (Maß für die Steifigkeit) der PA Hydrogele, angesichts der Menge an Acrylamid und BIZ-Acrylamid verwendet im Vergleich zu den Elastizitätsmodul gemessen durch AFM (N = 5-6). Die horizontalen Balken zeigen den Mittelwert. Die Steifigkeit der 0,6 kPa Hydrogele konnte nicht gemessen werden, weil die Hydrogele sehr weich und die AFM-Spitze eingehalten wurden. B. Dies ist eine Phase-Bild von konfluierende HMEC-1-Zellen und das entsprechende Bild der Perlen auf die oberste Fläche eine weiche 3 kPa-PA-Hydrogel eingebettet. HMEC-1 wurden für 24 h in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen pro Well ausgesät. C. dieses Bild ist das gleiche wie Abbildung 2B aber für Zellen auf einem steifen 70 kPa PA Hydrogel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(2) menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen Kultur und Aussaat auf Hydrogele

  1. Kultur HMEC-1 (human, mikrovaskuläre Endothelzellen) Zellen in MCDB-131 volle Medien mit MCDB-131 Medien ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 10 ng/mL des epidermal Growth Factor, 1 µg/mL von Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin (siehe Tabelle der Materialien ).
  2. Konfluierende Kulturen 1:6 alle 3-4 Tage aufgeteilt und halten die Zellen bis zum Durchgang 40.
  3. Lösen Sie einen Tag vor dem Experiment, die Zellen aus ihrer Kulturgefäß mit 0,25 % Trypsin/EDTA. Waschen Sie zuerst die Zellen und ihre Kulturgefäß 1 X mit sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und fügen Sie dann die entsprechende Menge an 0,25 % Trypsin/EDTA (2 mL pro 100-Millimeter-Teller oder 75-cm-Kolben, 1 mL pro 60-Millimeter-Teller oder 25 cm Kolben), den Kolben bei 37 ° C für 5-10 min Inkubation um das Ablösen der Zellen aus ihrem Substrat zu ermöglichen.
  4. Die Trypsin zu neutralisieren, indem die gewünschte Lautstärke MCDB-131 Medien, pipettieren sanft zum Brechen der Klumpen von Zellen, und stellen Sie dann die Lösung in einer konischen Zentrifugenröhrchen hinzufügen.
  5. Sanft schwenken Sie die Lösung der Zellen zu gewährleisten, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind und dann 20 µL der Lösung herausnehmen und füllen Sie sehr sanft die beiden Kammern unter dem Deckglas ein Glas Hemocytometer.
  6. Pellet-die Lösung in die konische Zentrifugenröhrchen mit Zentrifugation für 10 min bei 500 X g enthaltenen Zellen.
  7. Während der 10 min Wartezeit zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Verwenden Sie ein Mikroskop, konzentrieren Sie sich auf die Rasterlinien des Hemocytometer mit einem 10 X-Objektiv und dann verwenden Sie eine Hand Stückzähler, um die Anzahl der Zellen in einem 1 x 1 mm Platz.
  8. Verschieben Sie der Hemocytometer in ein anderes 1 x 1 mm Quadrat, zählen Sie die Zellen dort und dann wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal. Berechnen Sie den Mittelwert der vier Messungen und dann im Durchschnitt mit 10 multiplizieren4. Der letzte Wert ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen/mL in der Zellsuspension, die zentrifugiert werden.
  9. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem konischen Zentrifugenröhrchen gleichzeitig sicherzustellen, dass die Zelle Pellet nicht gestört wird. Die Zellen in den MCDB-131 vollständige Medien in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen/mL aufzuwirbeln.
  10. Samen der Zellen in Suspension auf die Hydrogele durch zunächst die Medien, mit denen die Hydrogele inkubiert wurden, entfernt und anschließend hinzufügen 1 mL Zellsuspension auf jeder Hydrogel.

3. Infektion der menschlichen mikrovaskuläre Endothelzellen mit L. monocytogenes

  1. Frühzeitige Vorbereitung
    Hinweis: Die folgenden Lösungen im Voraus vorbereitet.
    1. Gentamicin, Streptomycin und Chloramphenicol Aktien
      1. Bereiten Sie 50 mg/mL von Streptomycin Stammlösungen, indem mit einem Gewicht von 0,5 g von Streptomycin Sulfat und komplett in 10 mL hochreines Wasser auflösen.
      2. Bereiten Sie 7,5 mg/mL Chloramphenicol Stammlösungen durch wiegen 75 mg von Chloramphenicol und komplett in 10 mL 100 % Ethanol auflösen.
      3. Bereiten Sie 20 mg/mL von Gentamicin Stammlösungen, indem mit einem Gewicht von 0,2 g von Gentamicin Sulfat und komplett in 10 mL hochreines Wasser auflösen.
      4. Sterilisieren Sie Filter-alle Stammlösungen mit einem 0,2-µm-Spritze-Filter und bei-20 ° C für den langfristigen Einsatz (1-2 Monate) zu speichern.
    2. Gehirn Herz-Infusion (BHI) Medien und Agar-Platten
      1. Suchen Sie zwei 1-L-Flaschen und fügen Sie eine magnetische Stir Bar in jedem Kolben.
      2. Für die BHI-Medien 37 g BHI-Pulver in einen Kolben und fügen Sie Reinstwasser bis zu 1 L. Mix die Lösung kräftig, indem Sie den Kolben auf eine magnetische rühren-Platte, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
      3. Für die BHI Agarplatten hinzufügen 37 g BHI Pulver und 15 g Granulat Agar (siehe Tabelle der Materialien) in der zweiten Flasche und fügen Sie Reinstwasser bis zu 1 L. Mix die Lösung kräftig, indem Sie den Kolben auf eine magnetische rühren-Platte, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
      4. Schrauben Sie den Deckel der Flaschen nicht zu fest und Autoklaven den Lösungen mit der Flüssigkeit einstellen oder gemäß den Autoklaven Spezifikationen.
      5. Entfernen Sie die Lösung aus dem Autoklav, dann kühlen Sie lassen die Agar-BHI-Lösung bis 55 ° C ab. Wenn die BHI-Medien in der 1 L Flasche steril gehalten werden, es eignet sich für bis zu einem Monat.
      6. Um die Bakterien Agar-BHI Platten vorzubereiten, fügen Sie Antibiotika, zuerst hinzu, gegebenenfalls in den Kolben mit BHI und Agar (abhängig von der Bakterienstämme angebaut werden). Kurz gesagt des Kolbens auf einer magnetischen rühren Platte ermöglichen schnelles mischen.
        Hinweis: Die hier verwendeten Antibiotika sind spezifisch für die Lm-Stämme verwendet, aber keine notwendige Antibiotika können in BHI-Agarplatten verwendet werden. Wir hinzugefügt Streptomycin zu einer Konzentration von 200 µg/mL und Chloramphenicol zu einer Konzentration von 7,5 µg/mL, weil 10403S Lm Stämme resistent gegen Streptomycin sind. Diese Stämme wurden mit einem Plasmid, das den Chloramphenicol Acetyltransferase offenen Leserahmen, daher enthält die Beständigkeit gegenüber Chloramphenicol konjugiert.
      7. Den Teig in 10 cm Polystyrol Bakterien Kultur Platten (ca. 20 mL pro Teller). Um Luftblasen zu entfernen, die die Oberfläche der Platten kurz Flamme. Coole Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
      8. Am nächsten Tag die Trockenplatten zu versiegeln und bei 4 ° c Lagern
  2. Infektion der menschlichen mikrovaskuläre Endothelzellen mit L. monocytogenes
    1. Drei Tage vor der Infektion, Streifen, die Lm anstrengen, um aus einem Glycerin-bestand (bei-80 ° C gelagert) verwendet werden auf eine BHI-Agar-Platte, die 7,5 µg/mL Chloramphenicol und 200 µg/mL Streptomycin, gegebenenfalls enthält.
      Hinweis: Die Sorte heraus gestreift werden kann ein Wildtyp oder Mutant, konstitutiv auszudrücken Fluoreszenz (für Immunostaining verwendeten JAT1045) oder mit dem Ausdruck Fluoreszenz unter der ActA-Promoter (für Flow Cytometry oder Traktion Rasterkraftmikroskopie JAT983 oder JAT985 verwendet wurden)22.
    2. Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C, bis einzelne Kolonien (1-2 Tage) gebildet werden.
    3. Wachsen Sie der Tag vor der Infektion, die gewünschte Belastung über Nacht, schütteln bei 150 u/min bei 30 ° C im BHI-Medien mit 7,5 µg/mL Chloramphenicol (falls zutreffend).
      1. Platz 5 mL BHI Medien in 15 mL konische Zentrifugenröhrchen hinzufügen 7,5 µg/mL Chloramphenicol (falls zutreffend) und dann impfen eine einzige Kolonie von der Agarplatte mit einer sterilen 10 µL Spitze.
    4. Am nächste Tag, kurz vor der Infektion, Messung die optische Dichte der Bakterien-Lösung bei 600 nm (OD600) durch eine Verdünnung der Probe 1:5; Verwenden Sie eine Küvette mit BHI allein, um als eine leere zu dienen.
    5. Verdünnen Sie über Nacht zu einer OD600 von 0,1 Kultur und inkubieren Sie, Schütteln für 2 h bei 30 ° C, im BHI-Medien mit 7,5 µg/mL Chloramphenicol (falls zutreffend) um die Bakterien zu Log-Phase Wachstum zu erreichen.
    6. Messen Sie die OD600 der bakterielle Lösung, die voraussichtlich um 0,2 - 0,3. Wenn die OD600 höher ist, verdünnen Sie es auf 0,2 - 0,3 mit BHI allein.
    7. Nehmen Sie 1 mL der bakterielle Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch. Drehen Sie es nach unten für 4 min bei 2.000 x g mit Zentrifugation bei Raumtemperatur. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 1 mL PBS Gewebekultur-Klasse, in der Gewebekultur-Haube. Waschen Sie die Bakterien noch zweimal durch Drehen sie nach unten für 4 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen des Überstands und die Bakterien in 1 mL PBS Aufschwemmen.
    8. Bereiten Sie die Infektion Mischung durch Mischen 10 oder 50 µL der Bakterien Nukleinsäuretablette in PBS mit 1 mL MCDB-131 Medien für eine Vielzahl von Infektionen (MOI; d. h., die Anzahl der Bakterien pro Wirtszelle) ca. 50 Bakterien pro Wirtszelle oder 10 Bakterien pro Wirtszelle.
    9. Entfernen Sie das Medium aus den Brunnen des 24-Well-Platten, vorsichtig die Hydrogele oder die Zellen zu stören. Waschen Sie die Zellen 1 X mit 1 mL MCDB-131 Medien voll und dann fügen Sie 1 mL der Bakterien in jede Vertiefung.
    10. Halten Sie einige Infektion Mix (mindestens 100 µL) für die Bestimmung der MOI (siehe Punkt 3.3).
    11. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und wickeln Sie die Platten mit Polyethylen Frischhaltefolie um Leckagen zu vermeiden. Legen Sie die Platten in der Zentrifuge und drehen Sie die Proben für 10 min bei 200 X-g, die Invasion zu synchronisieren. Verschieben Sie die Platten in der Gewebekultur Inkubator und inkubieren sie für 30 min bei 37 ° C.
    12. Waschen Sie die Proben 4 X mit MCDB-131 voller Medien und verschieben Sie sie in der Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach einer zusätzlichen 30 min die Medien mit Medien mit 20 µg/mL von Gentamicin ergänzt.
  3. Bestimmung der Multiplizität der Infektion (MOI)
    1. Bereiten Sie während der ersten 30 min Inkubation von Wirtszellen mit den Bakterien 10-divisibel serielle Verdünnungen der Infektion Mischung das MOI zu bestimmen. Machen Sie 10-divisibel Verdünnungen durch Mischen von 100 µL der Infektion-Mix mit 900 µL 1 X PBS (10-1 Verdünnung). Dann mischen Sie 100 µL der 10-1 Verdünnung mit 900 µL PBS (10-2 Verdünnung).
    2. Fortgesetzt, bis eine 10-5 Verdünnung erreicht wird.
      Hinweis: Alle Lösungen müssen gemischt werden, bevor sie verdünnen und frische saubere Pipettenspitzen sollte bei jedem Schritt verwendet werden.
    3. Sobald die Verdünnungen hergestellt werden, legen Sie 100 µL der 10-2 - 10-5 Verdünnungen in der Mitte der BHI, Agar, Chloramphenicol, Streptomycin Platten (falls zutreffend).
    4. Nehmen Sie Streuer aus einer Glaspipette mithilfe von Feuer, die Pipette erstellen einen Haken biegen vor. Tauchen Sie die Pipette in 100 % igem Ethanol für Sterilisation und dann das Ethanol mit einer Flamme verbrennen.
    5. Sobald der Streuer abgekühlt ist, verbreiten Sie die bakterielle Verdünnungen homogen auf die Platten ab 10-5 Verdünnung und Umzug nach konzentrierteren Mischungen. 2 Tage inkubieren Sie die Platten auf dem Kopf stehend bei 37 ° C.
    6. Abhängig von der Dichte der Kolonie bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien 10-3 und 10-4 oder 10-4 und 10-5 Verdünnung Platten. Berechnen Sie das MOI wie folgt:
      Anzahl der Kolonien × Verdünnung Faktor ÷ erste hinzugefügte Volumen = Anzahl der KBE pro Mikroliter
      Anzahl der KBE pro µL × Volumen des Bakterien-Mix pro Bohrloch = Anzahl der KBE pro Bohrloch
      Anzahl der KBE pro gut × Volumen von Zellen pro Bohrloch = Anzahl der Bakterien pro Zelle
      Hinweis: KBE steht für koloniebildenden Einheiten.
    7. Durchschnitt der MOIs aus zwei Platten, die endgültige MOIs zu erhalten.

4. die Durchflusszytometrie, extrazelluläre Matrix Steifigkeit abhängigen Infektanfälligkeit von Wirtszellen zu quantifizieren

  1. Wiegen Sie 5 mg Kollagenase und legen Sie sie in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen. 10 mL 0,25 % Trypsin-EDTA hinzugeben und gut mischen.
  2. 8 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie das Medium aus den Brunnen des 24-Well-Platte und waschen Sie die Vertiefungen 1 X mit Gewebekultur PBS. Entfernen der PBS aus den Brunnen und 200 µL des Trypsin-EDTA/Kollagenase-Mix in jede Vertiefung. Platzieren Sie diese in der Gewebekultur-Inkubator für 10 min bis zum vollständigen Ablösung der Zellen ermöglichen.
  3. Verwenden Sie eine frische Pipette für jeden Brunnen und pipettieren der Mischung nach oben und unten 8 X. Seien Sie sanft, um nicht die Zellen zu schädigen. Fügen Sie 200 µL der Medien in jede Vertiefung, die Trypsin zu neutralisieren.
  4. 400 µL Zelle Lösung von jedem Bohrloch in einer 5 mL Polystyrol Röhrchen mit 35 µm Zelle Sieb Cap zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien).
  5. 10.000-20.000 Zellen pro Probe durch Durchflusszytometrie analysiert. Datenerfassung durch Durchflusszytometrie durchführen und den Prozentsatz der infizierten Zellen pro Bohrloch mit einem entsprechenden handelsüblichen Software bestimmen. Verwendung der forward Scatter versus Side Scatter-plots, um den Großteil der Verteilung der Zelle Tor zählt.
    Hinweis: Dies sorgt für Analyse einzelner Zellen und beseitigen Schmutz oder Zelle Dubletten oder Drillinge.
    1. Das Fluoreszenzsignal vom Steuerelement nicht infizierten Zellen zu messen und die Bevölkerung von infizierten Zellen außer Autofluoreszenz Tor.

5. Immunostaining extrazelluläre Bakterien, Mikroskopie und Bildverarbeitung

Hinweis: Dieser Ansatz wird verfolgt, um ECM-Steifigkeit abhängigen bakterielle Adhäsion auf der Zelloberfläche Host gegenüber bakteriellen Internalisierung (Invasion) innerhalb der Hosts unterscheiden.

Figure 4
Abbildung 4 : Immunostaining HMEC-1 Lm-infizierten Zellen auf Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit, bakterielle Adhäsion und Invasion zu unterscheiden. Diese Bilder zeigen ein repräsentatives Beispiel für differenzielle Immunostaining zeigen A. die Zellkerne (DAPI), B. alle Bakterien (GFP), und C. die äußere Bakterien (Alexa-546). Die HMEC-1-Zellen wurden auf einem weichen 3-kPa-Hydrogel wohnhaft. Die Pfeile zeigen auf Bakterien, die verinnerlicht wurden, also auf den grün-Kanal nur angezeigt werden. Daten in D-F beziehen sich auf N = 20 Bilder für die infizierten HMEC-1-Zellen auf weichen 3-kPa und steifen 70 kPa Hydrogele und Dzeigen . die insgesamt Bakterien pro Kerne; E. die internalisierten Bakterien pro Kerne; und F. die Invasion Effizienz (Verhältnis der internalisierten Bakterien insgesamt Bakterien). Die horizontalen Balken zeigen die Daten bedeuten. Der P-Wert wurde berechnet mit dem nicht-parametrische Wilcoxon Rang Summe Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. 30 min nach der Infektion, waschen die HMEC-1-Zellen mit JAT1045 infiziert (Lm, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) konstitutiv ausdrückt) 4 X mit Medien.
  2. Mischen Sie nach der vierten Wäsche 1 µL von 1 mg/mL Hoechst Farbstoff mit 1 mL MCDB-131 Medien und fügen Sie es in jede Vertiefung, die Zellen Kerne zu beflecken. Legen Sie die Zellen in der Gewebekultur-Inkubator für 10 min.
  3. Waschen Sie die Zellen 1 X mit PBS. Befestigen Sie sie mit einem nicht permeabilizing Fixiermittel für differenzielle Immunostaining für 20 min bei Raumtemperatur28.
    Hinweis: Das Fixiermittel enthält 0,32 M Saccharose, 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA, und 4 % Formaldehyd (Elektronenmikroskopie-Klasse).
  4. Waschen Sie die Zellen 1 X mit PBS. Die Proben für 30 min mit 5 % Rinderserumalbumin zu blockieren (siehe Tabelle der Materialien) mit PBS-Puffer.
  5. Inkubieren Sie die Proben für 1 h mit einem Anti-LmPrimärantikörper (siehe Table of Materials) verdünnt 1: 100 mit PBS-Puffer mit 2 % BSA.
  6. Waschen Sie die Proben mit PBS-Puffer 3 X und dann inkubieren 1 h mit einem AlexaFluor-546 Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) verdünnt 1: 250 in PBS mit 2 % BSA. Waschen Sie die Proben 3 X mit PBS-Puffer. Speichern Sie die Proben in 1 mL PBS für die Bildgebung.
  7. Bild und mehr als 1.000 Zellen pro Zustand zu analysieren.
    1. Für die Bildgebung, verwenden eine invertierte Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer CCD-Kamera (siehe Tabelle der Materialien) und ein 40 X Luft Fluorit Luft Ziel mit 0,6 numerischer Apertur (NA).
      Hinweis: Die Macht ist auf 25 % gesetzt und die Belichtungszeit bis 100 Ms. die Mikroskop-Filter für die mCherry verwendet sind 470/525 nm, für GFP 530/645 nm und DAPI 395/460 nm, für Anregung und Emission bzw.. Das Mikroskop, die, das wir verwendet, wurde durch ein open-Source-Mikroskopie Software Paket29gesteuert.
    2. Zählen Sie für differentielle Immunostaining alle "grüne" Bakterien, die einzelne Zellen als Anhänger zugeordnet. Zählen Sie Bakterien, die "grüne" und "rot" (durch Antikörperbindung) als nicht verinnerlicht werden.
      Hinweis: Wir die Anzahl der Kerne durch ein maßgeschneidertes Skript und die CellC-Software identifiziert (siehe Tabelle der Materialien) für die Aufzählung der Bakterien-30.

6. Multi-gut Traktion Rasterkraftmikroskopie und Monolayer-Stress-Mikroskopie

Figure 5
Abbildung 5: HMEC-1 Lm-infizierten Zellen, die das Ausmaß der Zugkräfte zu verringern, die sie auf ihre ECM während der Infektion ausüben. Zentrale A zeigt das Bild Phase B zeigt die Verformung, C zeigt die Traktion Spannungsfeld und D zeigt die intrazelluläre Spannungsfeld der nicht infizierten HMEC-1 Zellen auf einem 20 kPa Hydrogel. Die Farbbalken der Verformung Karten (µm), der Traktion Karten Druck (Pa) und die intrazelluläre Spannung Karten (nNµm-1) auf den oberen Teil der Heatmaps dargestellt sind. Die Spalten zeigen drei repräsentativen Zeitpunkten: 3, 8 und 18 Uhr nach der Infektion. E-H. Gleiche Eigenschaften wie Paneele A-D aber mit Lm bei einer MOI von 300 infizierten Zellen. Die Bilder der Bakterien (Rot-Kanal) sind die Phasenbilder der Zellen überlagert. TFM-Aufnahmen wurden von mehreren Quellen gleichzeitig imaging durchgeführt. Die Fenstergröße für PIV war 32 Pixel mit einer Überlappung von 16. Der Maßstab beträgt 32 µm. Diese Zahl wurde von Bastounis und Theriot59geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Bereiten Sie die PA-Hydrogele auf einer 24-Well-Platte (siehe Schritt 1). Samen HMEC-1 Zellen (siehe Schritt 2) und infizieren sie mit JAT983 wie beschrieben oben (siehe Schritt 3).
  2. Bereiten Sie ein live-Mikroskopie-Medium durch die Ergänzung Leibovitzs L-15 mit 10 % fötalen Rinderserum und 10 ng/mL des epidermal Growth Factor 1 μg/mL Hydrocortison.
    Hinweis: Der L-15 enthält bereits 2 mM L-Glutamin, so ist es nicht notwendig, zusätzliche wie im Fall der MCDB-131 Medien hinzuzufügen.
  3. 4 h nach der Infektion (Beginn der internalisierten JAT983 fluoreszierend), mischen 1 μL von 1 mg/mL Hoechst Farbstoff mit 1 mL L-15 Medien und fügen es in jede Vertiefung, die Zellen Kerne zu beflecken. Legen Sie die Zellen in der Gewebekultur-Inkubator für 10 min und dann in jede Vertiefung der L-15 Medien ersetzen mit 1 mL L-15 Medien mit 20 µg/mL von Gentamicin ergänzt.
  4. Abdeckung der Platte mit Deckel und Stelle es in einem Mikroskop Klimakammer (siehe Tabelle der Materialien), 37 ˚C equilibriert.
    Hinweis: Verwenden Sie für die Bildgebung, einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer CCD-Kamera (siehe Tabelle der Materialien) und ein 40 X Luft Fluorit Luft Ziel mit 0,6 na
  5. Multi-Channel Zeitraffer Bilder von fluoreszierenden Perlen und die fluoreszierenden Bakterien und Kontrast Phasenbilder von Wirtszellen, alle 10 min für 4 bis 12 h zu erwerben.
    Hinweis: Für die Bildgebung wurde die Leistung auf 25 % eingestellt und die Belichtungszeit bis 100 Ms. die Mikroskop-Filter (Anregung/Emission) verwendet für mCherry und GFP sind 470/525 nm und 530/645 nm bzw..
  6. Fügen Sie am Ende der Aufnahme 500 µL 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) in Wasser in jedem der Brunnen.
    Hinweis: Die Zellen werden losgelöst von den Hydrogel und Hydrogel kehrt in seinen ursprünglichen unverformten Zustand da es elastisch ist.
  7. Nehmen Sie ein Bild von der Hydrogel und verwenden Sie es als unverformten Referenzbild.
  8. Bestimmen Sie die zweidimensionale Verformung der Hydrogel in jedem Moment mit Partikel Image Velocimetry (PIV)31, jedes Bild der Time-Lapse-Serie mit dem Referenzbild unverformten Hydrogel zu vergleichen. Verwenden Sie die entsprechenden Fenstergrößen und je nach dem Experiment überschneiden.
    Hinweis: Wir verwendet Windows 32 Pixel mit einer Überlappung von 16 Pixeln.
  9. Berechnen Sie die 2D Traktion betont, die dass die Zellen auf das Hydrogel wie32,33an anderer Stelle beschrieben auszuüben.
  10. Berechnen Sie die Monolayer-Spannung von der Traktion betont wie oben beschrieben34 durch die Lösung der Gleichungen des mechanischen Gleichgewichts für eine dünne elastische Platte unterliegt die Reaktionskräfte, erstellt von der PA-Hydrogel auf der Monolage, die von einem Umgekehrtes Vorzeichen, die gemessene Zugkraft betont.
    Hinweis: Siehe Zusatzmaterial 1.

(7) Quantitative Zeitraffer Mikroskopie zu Assess extrazelluläre Matrix Steifigkeit von L. Monocytogenes Verbreitung durch Endothelzellen

Figure 6
Abbildung 6: Zeitraffer quantitative Mikroskopie Daten der Lm Verbreitung durch HMEC-1 Monolagen ausgesät auf Substraten mit 3-kPa und 70 kPa Steifigkeit. A. dieses Panel zeigt noch Bilder aus zwei repräsentativen Infektion Schwerpunkte bei 0, 200, 400 und 600 min. Die Phase-Kanal zeigt HMEC-1 Zelle Monolagen und der rote-Kanal zeigt intrazellulären Lm (siehe Schritt 7 des Protokolls). B. dieses Panel zeigt den Bereich der die konvexe Hülle umfasst die Infektion Fokus als Funktion der Zeit dargestellt. Der Schwerpunkt der Erkrankung 3 kPa (rot) wächst schneller als der 70-kPa (grün). C. dieses Panel zeigt, dass der radiale Abstand von der Mitte bis zum Rand der Infektion Fokus als Funktion der Zeit für repräsentative Infektion Herde wächst in HMEC-1 Monolagen ausgesät auf PA Substraten von 3 kPa (rot) und 70-kPa (grün) Steifigkeit geplottet. Die Radialgeschwindigkeit (dr/dt) ist für die 3 kPa Zustand, aber biphasische für den 70 kPa Zustand konstant. D. diese Daten zeigen die Radialgeschwindigkeit für die ersten 200 min von zehn unabhängige Infektion Brennpunkte. Rot (3-kPa) und grün (70 kPa) Datenpunkten darzustellen die Hänge der beiden Brennpunkte in der vorherigen Platten beschrieben. Die horizontalen Balken zeigen die Daten bedeuten. Der P-Wert wurde berechnet mit dem nicht-parametrische Wilcoxon Rang Summe Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Bereiten Sie die PA-Hydrogele auf einer 24-Well-Platte (siehe Schritt 1), Saatgut (siehe Schritt 2) HMEC-1-Zellen, und wachsen über Nacht JAT983 Kulturen wie beschrieben (siehe Schritt 3).
  2. Bereiten Sie Tag der Infektion, die Infektion Mischung durch 10 µL des bakteriellen Pellets pro mL MCDB-131 Medien mischen. Sorgfältig entfernen Sie das Medium aus den Brunnen des 24-Well-Platten, und jedes gut fügen Sie 1,9 mL MCDB-131 vollständige Medien und 0,1 mL des bakteriellen Mix hinzu.
    Hinweis: Die unteren MOI in diesem Assay verwendet ist notwendig, Veranstaltungen zur Weitergabe zu analysieren, die aus einem einzigen Bakterium eine Wirtszelle Eindringen beginnen.
  3. Die Platte mit dem Deckel abdecken und Abdichten mit einer Plastikfolie um Leckagen zu vermeiden. Legen Sie die Platten in der Zentrifuge und drehen Sie die Proben für 10 min bei 200 X-g, die Invasion zu synchronisieren.
  4. Verschieben Sie die Platten in der Gewebekultur Inkubator und inkubieren sie 5 min.
  5. Waschen Sie die Proben 4 X mit Medien und verschieben Sie sie in der Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach einer zusätzlichen 5-7 min die Medien mit Medien mit 20 µg/mL von Gentamicin ergänzt.
  6. Inkubieren Sie die Platte in den Inkubator für Aufpreis 5 h um der ActA-Promoter zu aktivieren und den Ausdruck der mTagRFP open reading Frame35fahren zu ermöglichen.
  7. Bereiten Sie ein live-Mikroskopie-Medium durch die Ergänzung Leibovitzs L-15 mit 10 % fötalen Rinderserum und 10 ng/mL des epidermal Growth Factor 1 µg/mL Hydrocortison.
    Hinweis: Der L-15 enthält bereits 2 mM L-Glutamin, so ist es nicht notwendig, zusätzliche wie im Fall der MCDB-131 Medien hinzuzufügen.
  8. Mix 1 μL von 1 mg/mL Hoechst färben mit 1 mL L-15 Medien und fügen Sie es in jede Vertiefung, die Zellen Kerne zu beflecken. Legen Sie die Zellen in der Gewebekultur-Inkubator für 10 min und dann in jede Vertiefung der L-15 Medien ersetzen mit 1 mL L-15 Medien mit 20 µg/mL von Gentamicin ergänzt. Abdeckung der Platte mit Deckel und Stelle es in einem Mikroskop Klimakammer (siehe Tabelle der Materialien), 37 ˚C equilibriert.
    Hinweis: Für die Bildgebung, war ein umgekehrtes Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer CCD-Kamera verwendet (siehe Tabelle der Materialien) und ein 20 X Luft Fluorit Luft Ziel mit 0,75 na Die Leistung wurde auf 50 % eingestellt und die Belichtungszeit bis 50 ms die Mikroskop-Filter für die mCherry verwendet sind 470/525 nm für Anregung und Emission bzw..
  9. Bild mehrere Positionen alle 5 min. mit eine Autofokus-Funktion zur Überwachung, wie Lm durch HMEC-1 Monolagen verteilt auf unterschiedliche Steifigkeit Hydrogele ausgesät.
    Hinweis: L-15 wird mit HEPES, gepuffert, so ist es nicht notwendig, CO2 während der Bildgebung zu verwenden.

Representative Results

ECM Steifigkeit-abhängige Infektanfälligkeit HMEC-1 Zellen Lm:
PA-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit, alle Oberfläche beschichtet mit Kollagen ich, wurden auf mehreren gut Glasplatten unten gebaut, wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben (siehe Abbildung 1). AFM-Messungen wurden durchgeführt, um die genaue Steifigkeit die Hydrogele zu bestätigen, wie zuvor beschrieben26,27 (siehe Abbildung 2). Frühere Studien haben gezeigt, dass die lokalen Compliance der Basalmembran der Endothelzellen von 1 kPa (z.B. Hirngewebe) bis 70 kPa (z.B. Aorta)36,37,38, reichen kann 39 , 40. daher, wir entschieden uns für die Infektion von HMEC-1-Zellen mit Wohnsitz auf Matrizen mit der folgenden Steifigkeit zu testen: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa und 70 kPa. Für jede Hydrogel Steifigkeit wurden sechs Hydrogele hergestellt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bewerten.

Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die ECM Steifigkeit-abhängige Infektanfälligkeit HMEC-1 Zellen Lm zu beurteilen (siehe Abbildung 3). HMEC-1-Zellen wurden mit einem Lm-Stamm (JAT985) infiziert, die einen fluoreszierenden Marker nach Internalisierung (actAp::mTagRFP), so dass die Erkennung von intrazellulären Bakterien nur (siehe Abbildungen 1 L - 1N) ausdrückt. JAT985 fehlt auch ActA, die Bakterien an der Ausbreitung von Zelle zu Zelle, da ActA ist notwendig für die Bildung von Aktin Komet Endstücke und anschließende bakterielle Verbreitung zu deaktivieren. 7 - 8 Stunden nach der Infektion, Infektion der HMEC-1-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie. Um die Analyse einzelner Zellen zu gewährleisten, wurde der Großteil der Verteilung der Zellzahlen gated, mit der nach vorn im Vergleich zu Seite Streudiagramm, und dann in einem zweiter Schritt gating wurde durchgeführt, um die Zellen ausschließen, die Autofluoreszenz aufweisen (siehe Abbildungen 3A - 3 C ). Die vorläufigen Ergebnisse, dargestellt in Abbildung 3 zeigen, dass HMEC-1-Infektion mit Lm etwa zweifach für HMEC-1-Zellen mit Wohnsitz auf dem steifen 70 kPa Hydrogele im Vergleich zu Zellen mit Wohnsitz auf dem weichen 0,6 kPa Hydrogele größer (siehe Abbildungen 3 b - 3D). Lm-Infektion zurückkehrende HMEC-1 Zellen auf steif im Vergleich zu weichen Matrizen konnte wegen werden: 1. erhöht Lm Adhäsion auf HMEC-1; 2. erhöhte Lm Invasion in HMEC-1; oder 3. beide der oben genannten Co-auftritt. Um zu testen, welche Hypothese hält, HMEC-1-Zellen wurden auf Soft (3 kPa) und steif (70 kPa) Hydrogele entkernt und infiziert mit konstitutiv GFP Lm zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildungen 4A - 4 C). Die Proben wurden kurz nach der Infektion fixiert und die externe (haftenden) Bakterien waren voller Flecken mit Antikörpern. Verwenden quantitative Mikroskopie, fanden wir, dass es deutlich mehr Bakterien an HMEC-1 gibt, wenn die Wirtszellen auf steif im Vergleich zu weiche Gele befinden (siehe Abbildung 4D). In Übereinstimmung mit der Förderdaten zytometrie, gibt es deutlich mehr Bakterien verinnerlicht durch HMEC-1, wenn die Wirtszellen auf steif im Vergleich zu weiche Gele befinden (siehe Abbildung 4E). Die Invasion-Effizienz (Bakterien verinnerlicht/Gesamtzahl der Bakterien) der Lm in HMEC-1-Zellen ist jedoch ähnlich, unabhängig vom Substrat Steifigkeit (siehe Abbildung 4F).

Zugkraft Mikroskopie des Lm-infizierten HMEC-1-Zellen:
LM-Infektion von HMEC-1-Zellen konnte die Biomechanik des infizierten Wirtszellen, einschließlich die Stärke der Anlage zu ihrer ECM oder miteinander, beeinflussen ihre barriereintegrität ändern. Wir wollten prüfen, ob dies der Fall sein könnte, mittels Rasterkraftmikroskopie Traktion32 zur Berechnung der Zelle-ECM Zugkräfte und Monolayer Stress Mikroskopie41 , die intrazellulären Zug Kräfte zu berechnen. Abbildung 5 zeigt Karten von der Verformung Feld, Traktion Spannungsfeld und intrazellulären Spannungsfeld zwischen HMEC-1-Zellen, die auf 20 kPa Hydrogele in verschiedenen Zeit Punkte nach der Infektion. Figuren 5A - 5D beziehen sich auf nicht infizierten Kontrollzellen HMEC-1 während Zahlen 5E - 5 H beziehen sich auf HMEC-1-Zellen mit Lm bei einer Vielzahl von Infektion gleich 300 Bakterien/Zelle infiziert. Diese Vorarbeiten legt nahe, dass infizierte HMEC-1-Zellen im Verlauf einer Infektion mit Lm, das Ausmaß ihrer Zelle-ECM und intrazellulären Spannungen reduzieren während, nicht für nicht infizierte Kontrollzellen beobachtet wird.

ECM Steifigkeit-abhängige Lm Verbreitung über HMEC-1 Monolagen:
Time-Lapse Mikroskopie wurde zur Untersuchung der Wirkung Matrix Steifigkeit hat auf Lm Verbreitung durch HMEC-1 Monolagen. Wie Lm durch die Monolage verbreitet, erzeugen die Bakterien einen Schwerpunkt der Infektion, die als Funktion der Zeit (siehe Abb. 6A und Video Abbildungen 1 und 2) wächst. Bereich der Infektion Fokus wurde gemessen, indem man eine konvexe Hülle, das kleinste konvexe Polygon, das eine Reihe von Punkten, um die Bakterien42umfasst. Es gibt keine standard Metrik in das Feld, um die Effizienz von L. Monocytogenes Zell-Zell-Verbreitung durch eine Monolage von Wirtszellen zu messen. Zur Beurteilung der Ausbreitung Effizienz, einige haben die Anzahl der Wirtszellen in eine Infektion Fokus41gezählt, und andere haben gezogene Grenzen manuell um die Gruppe der Infektion Host Zellen43. Wir haben ein Konvexes Polygon um die Bakterien zu ziehen, weil es eine automatisierte, konsistente und rechnerisch günstig Prozess, die Effizienz von L. Monocytogenes Ausbreitung zu messen ist. Auf diese Weise fanden wir einen leichten Rückgang der Infektion Fokusbereich in der HMEC-1-Zellen ausgesät auf 70 kPa Hydrogele, wenn im Vergleich zu denen auf 3 kPa Matrizen (siehe Abbildung 6B und Video Abbildungen 1 und 2) ausgesät. Um die Wachstumsrate der Infektion Schwerpunkt zu ermitteln, wurde der radiale Abstand als Funktion der Zeit aufgetragen, indem man die Quadratwurzel des Bereichs der Infektion Fokus und dies durch Pi dividiert. Diese mathematische Transformation wird davon ausgegangen, dass die Form der Infektion Schwerpunkt etwa kreisförmig44. Um die Geschwindigkeit des Wachstums Fokus zu messen, wurde die Änderungsrate (d.h. die Steigung) der Radialabstand für beide Matrizen 3 und 70 kPa gemessen. Dieser Ansatz erläutert, dass die Infektion Fokus schneller und monoton in HMEC-1-Zellen ausgesät auf 3 kPa Matrizen wuchs. Jedoch wuchs der Fokus deutlich langsamer (erste 200 min) und etwas langsamer (200 bis 600 min) in Zellen ausgesät auf 70 kPa Matrizen (siehe Abbildung 6C). In der Tat weitere Daten bestätigte, dass die Infektion konzentrieren, im Durchschnitt zwei-Fach langsamer 70 kPa Matrizen, vor allem während der ersten 200 min wuchs in (siehe Abbildung 6D).

Figure 3
Abbildung 3 : ECM Steifigkeit-abhängige Anfälligkeit der HMEC-1-Zellen Lm Invasion mit Durchflusszytometrie gemessen .  HMEC-1-Zellen mit Lm (JAT985) infiziert waren und die Infektion wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. A. dieses Panel zeigt eine Seite gegen vorwärts Streudiagramm für repräsentative HMEC-1-Zellen, die aus einem einzigen Brunnen. Die Massen Verteilung der Zellen wurde ausgewählt, über gating um auszuschließen Schutt (links) und Zell-Dubletten oder Drillinge (rechts). B. dieses Diagramm zeigt ein Histogramm des Logarithmus der Fluoreszenzintensität Lm pro Zelle für HMEC-1 auf Weiche 0,6 kPa überzogen. C. dieses Diagramm zeigt ein Histogramm des Logarithmus der Fluoreszenzintensität Lm pro Zelle für HMEC-1 vernickelt auf steifen 70 kPa Hydrogele. Die Histogramme für N = 4 bis 6 Wiederholungen sind in verschiedenen Farben dargestellt. Die nicht infizierten Kontrollzellen Histogramm ist lila. Das Tor zum definieren was infiziert ist wird in rot angezeigt. Das Innenministerium ist 100 und die Infektion war bewerteten 8 h nach der Infektion. D. Daten zeigen Prozentsatz der infizierten HMEC-1-Zellen versus Hydrogel Steifigkeit (N = 5). Die horizontalen Balken zeigen die Daten bedeuten. Der P-Wert wurde berechnet mit dem nicht-parametrische Wilcoxon Rang Summe Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video Figure 1
Video Abbildung 1: Verbreitung von intrazellulären Lm (Rot-Kanal) durch eine HMEC-1 Zelle Monolayer (Phase) auf einem 3-kPa-Substrat ausgesät. Die Zellen wurden in Leibovitzs L-15 Medien abgebildet (10 % FBS, 20 µg/mL von Gentamicin) innen eine Klimakammer, 37 ˚C equilibriert. Die Bilder wurden alle 5 min. gesammelt. Die Film-Geschwindigkeit ist 15 Frames/s. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Video Figure 2
Video- Abb. 2: Verbreitung der intrazellulären Lm (Rot-Kanal) durch eine HMEC-1 Zelle Monolayer (Phase) auf einem 70 kPa Substrat ausgesät. Die Zellen wurden in Leibovitzs L-15 Medien abgebildet (10 % FBS, 20 µg/mL von Gentamicin) innen eine Klimakammer auf 37 ° C equilibriert. Die Bilder wurden alle 5 min. gesammelt. Die Film-Geschwindigkeit ist 15 Frames/s. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)

Elastizitätsmodul (E, kPa) Acrylamid-% (ab 40 % Lager) Bisacrylamide % (ab 2 % Lager)
0,6 3 0,045
3 5 0,075
10 10 0,075
20 8 0.195
70 10 0,45

Tabelle 1. Zusammensetzung der Polyacrylamid (PA) Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit. In dieser Tabelle den Prozentsatz auf 40 % Acrylamid-Lösung und der Prozentsatz der Lager 2 % Bis-Acrylamid-Lösung für eine bestimmte Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) zu erreichen sind in verschiedenen Spalten angegeben.

Supplemental Material
Zusatzmaterial 1. Berechnung der intrazellulären Spannungen von berechneten Traktion betont. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Zellen spürt eine Vielzahl von physischen Umwelt Hinweise, die nicht nur die Morphologie der Zellen, sondern auch ihren Ausdruck und Protein Genaktivität, was sich auf kritische Zelle Funktionen und Verhaltensweisen45,46beeinflussen können. Die Steifigkeit des ECM der Zellen wird zunehmend als eine wichtige Modulator zellulärer Motilität, Differenzierung, Proliferation und letztlich Zelle Schicksal47,48,49geschätzt. Zwar gab es viele Fortschritte im Verständnis der komplexen biomechanischen Interaktion zwischen Zellen und ihrer ECM, ist wenig bekannt über wie die Umwelt Steifigkeit beeinflusst die Empfindlichkeit der Zellen für bakterielle Infektionen. Um solche Studien zu erleichtern, haben wir diese neuartige Multi-gut Assay basiert auf der etablierten Herstellung von Polyacrylamid Hydrogele abstimmbaren Steifigkeit, die kompatibel mit Infektion Assays50entwickelt. Traditionell ist eine bakterielle Infektion der Zellen in Zellkultur auf Glas oder Polystyrol Flächen, etwa 1-3 Größenordnungen stabiler als das natürliche ECM der meisten adhärenten Zellen8,51untersucht worden. Der hier beschriebene Test öffnet neue Autobahnen durch das Studium der Bakterien-Wirt Interaktionen in einem physiologisch relevanten ökologischen Steifigkeit Regime aktivieren.

Für Proof of Concept des vorgestellten Tests wurden HMEC-1-Zellen als Modell anhaftende Wirtszellen und Lm als ein Modell bakterielle Erreger gewählt. Der Test kann jedoch für weitere Studien verlängert werden, wenn entsprechend geändert. Solche Studien können durch weitere Krankheitserreger wie Bakterien und Viren Infektion von anderen Säugetieren anhaftende Host Zelltypen beinhalten. Für diese besondere Probe Gele wurden Protein-beschichtet mit Kollagen ich, aber je nach Host Zelle, es ist möglich, eine andere ECM-Protein-Beschichtung, z. B. Laminin oder FIBRONEKTIN, verwenden um die Befestigung der Wirtszellen auf das Hydrogel zu erleichtern 52. eine weitere Überlegung, die die Host-Zelltyp abhängig ist der Hydrogel Steifigkeit Bereich untersucht werden. Das Spektrum der Steifigkeit sollte abhängen, was für den bestimmten Host Zelltyp physiologisch relevant ist und wie gut, dass Host legt bilden eine Monolage an eine bestimmte Steifigkeit Hydrogel. Ebenso können je nach Modell Erregers untersucht werden wollte, geringfügige Änderungen auf die Infektion Assay beschriebenen umgesetzt werden müssen.

Die Innovation des Assays im Vergleich zu bisherigen Methoden zur Herstellung Polyacrylamid Hydrogele24,50,53 liegt in bestimmte Besonderheiten in der vorgeschlagenen Infektion Test integriert. Erstens sind die Hydrogele auf Multi-gut unten Glasplatten, die das Screening von mehreren Bedingungen gleichzeitig ermöglicht, sowie die Automatisierung bestimmter Verfahren gebaut. Überwachung mehrerer Bedingungen gleichzeitig oder Prüfung mehrere Wiederholungen ist entscheidend, da das Ergebnis eines solchen Ansatzes von Faktoren wie der Host-Zelle-Passage und die genaue Anzahl der Bakterien hinzugefügt, um die Wirte infizieren beeinflusst werden kann, die oft ändern zwischen unabhängigen Experimenten. Eine zusätzliche Besonderheit dieses Tests ist, dass die Hydrogele eine Höhe von etwa 40 µm haben, die ist dünn genug, um Bild mit konventionellen Mikroskopie. Wir zeigten, dass wir sowohl live Zelle Mikroskopie und Zelle Fixierung und Immunostaining gefolgt von Bildgebung, ohne dabei hohe Hintergrundfluoreszenz erfolgreich durchführen können. Schließlich bestehen die Hydrogele aus zwei Schichten, mit dem oberen fluoreszierende Microbeads, nur in einem einzigen Fokalebene eingebettet haben. Dieses Attribut wird sichergestellt, dass keine Out-of-Focus Licht während der Aufnahme stören. Die Perlen können sowohl die Prüfung der Oberflächentopographie der Gele zu gewährleisten, dass sie einheitlich sind und verbessert die Leistung der TFM und MSM24,32,41. Mit TFM und MSM ist es möglich, die Zelle-ECM und Zellezelle Kräfte bzw. der Zellen, die auf unterschiedliche Steifigkeit Matrizen zu berechnen. Mit dieser neuartigen Assay, ist es möglich, solche Messungen der physikalischen Kräfte zu machen, durch den Vergleich des Beitrags der ökologischen Steifigkeit und der Infektion gleichzeitig. Nach diesem Ansatz hat die Effekt-Infektion auf Wirtszelle, die Mechanik während seines Kurses ermittelt werden kann. Darüber hinaus die Entwicklung der intrazellulären Spannungen der Zellen kann mit MSM berechnet werden und kann als ein Maß für die barriereintegrität der Monolayer verwendet werden. Endlich, Multi-auch angesichts des Assays, ist es möglich, gleichzeitig pharmakologische und genetische Störungen mit einer bakteriellen Infektion zu eingehender untersuchen, das komplexe Zusammenspiel von Host Cell Mechanik und Infektion einzuführen.

Eine inhärente Begrenzung der Technik liegt in der Wirkung Substrat Steifigkeit kann auf die proliferationsrate der Zellen auswirken. In der Regel in Infektion Assays müssen wir sicherstellen, dass die Host-Zelldichte unter verschiedenen Bedingungen übereinstimmt. Und zwar deshalb, weil Zelldichte von selbst auf die Anfälligkeit der Gastgeber auf eine Infektion auswirken kann. Die HMEC-1-Zellen, die als Wirtszellen dienten zeigen keinen signifikanten Unterschied in ihrer Zahl, wenn für 24 h auf die Hydrogele ausgesät. Jedoch könnten verschiedene Zelltypen differenzielle Verbreitung, abhängig von der Hydrogel-Steifigkeit aufweisen, die Infektion Studien beeinflussen können. In ähnlicher Weise kann Infektion Vorurteile entstehen, wenn Zellen keine Monolagen bilden oder befestigen Sie nicht gut auf die Hydrogele, wie tritt auf, wenn bestimmte Zelltypen auf sehr weichen Matrizen (z.B., menschlichen Nabelschnur Endothelzellen oder Madin Darby canine Nieren ausgesät werden epitheliale Zellen ausgesät auf 0,6 kPa Hydrogele54,55). Krankheitserreger angeht, können bestimmte Bakterien (z.B. Borrelien-Burdgorferi) auf Anhängen Zellen zu hosten und dringen sie aber kann auch durch sie transmigrate56. Wir haben noch nicht getestet, wenn dieser Assay für Erreger Seelenwanderung Studien funktionieren würde, aber es möglich, scheint da frühere Studien zu Neutrophilen einen endotheliale Zellen ausgesät auf PA Hydrogele dokumentiert worden sind, um57erfolgreich zu arbeiten. Es wurden viele Studien durchgeführt, die zeigt, wie Polyacrylamid Hydrogele von bestimmten Elastizitätsmodul herzustellen durch Mischen der entsprechenden Konzentrationen von Acrylamid und BIZ-Acrylamid24,25,26 ,27. Vor allem, wenn man wünscht, TFM Experimente auf Zellen mit Wohnsitz auf Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit durchführen, ist es jedoch entscheidend für die erwarteten Steifigkeit der Hydrogele entweder durch AFM oder andere Einrückung Techniken58bestätigen. Geringfügige Abweichungen vom erwarteten Wert können aufgrund verschiedener Lösungsmittel verwendet oder eine Stammlösung im Alter von Acrylamid entstehen, oder durch die Art und Weise AFM sind Messungen durchgeführt (z. B.die Form der AFM-Spitze). Zu guter Letzt ist die enthaltenen Lösungsansatz Aussaat Wirtszellen auf 2D Matrizen, die sich aus einer realistischeren und physiologisch relevanten 3D Szenario unterscheiden können. Jedoch, Herstellung von 3D Gele mit einstellbaren Steifigkeit, Säen sie mit Wirtszellen und dann mit Krankheitserregern zu infizieren noch umfasst einige technischen Schwierigkeiten. Allerdings erwarten wir, dass wir in naher Zukunft in der Lage, die aktuelle Probe für das Studium der Infektion in einer 3D Umgebung erweitern werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, das beschriebene Protokoll zusammen mit den vorläufigen Ergebnissen nachweisen, dass dieser neuartige Assay ein extrem nützliches Werkzeug für das Studium der Infektion von anhaftenden Wirtszellen mit pathogenen Keimen quantitativ und in einem viel mehr werden kann physiologisch relevanten Umfeld als zuvor überprüft. Die Macht der Herstellung von Polyacrylamid Hydrogele in der vorgeschlagenen Einrichtung liegt darin, dass der Test kompatibel mit der Leistung von mehreren Techniken wie Durchflusszytometrie, Immunostaining ist gefolgt von Lichtmikroskopie und Zugkraft Mikroskopie. Der Assay Studien, an denen die Infektion von anderen anhaftende Host Zelltypen durch Krankheitserreger, einsetzbar für die erwarten wir haben erhebliche Auswirkungen sowohl entwirren die Strategien, die mit dem Erreger infizieren Gastgeber und erleichtern die Entwicklung von therapeutische Interventionen gegen Infektionen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Vielen Dank an M. Footer, R. Lamason, M. Rengaranjan und Mitglieder des Theriot Lab für ihre Diskussionen und experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde von NIH R01AI036929 (J.T.A), HHMI (J.T.A), das HHMI Gilliam Stipendium für Advanced Study (F.E.O.), der Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) und der American Heart Association (E.E.B.) unterstützt. Durchflusszytometrie wurde an der Stanford geteilt FACS-Anlage durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

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