Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Omurilik nöronal altgrupları seçici manipülasyon esas olarak iki farklı yöntemlerle elde: 1) Intersectional genetik, mademki ikili ya da üçlü transgenik fareler bir muhabir veya efektör seçici ifade ulaşmak için oluşturulur Gen (örneğin, Rosa26 odağı üzerinden) istenen spinal nüfus. 2) Cre-bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV); kesici enjeksiyon Burada seçim muhabir veya efektör gen için kodlama Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler Cre recombinase istenen nöronal subpopulation içinde ifade farelerin omurilik içine enjekte edilir. Bu iletişim kuralı Cre-bağımlı rAAV vektörel çizimler oluşturmak açıklar ve nasıl lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce L3-L5 kesimleri ile rAAVs. L3-L5 innervated hindlimbs duyusal bilgileri iletmek bu çevresel duyusal sinir hücreleri tarafından lomber spinal segmentler kendiliğinden davranış ve enjeksiyon tarafına Ipsilateral hindlimb uygulanan duyusal testler için yanıt olabilir duyusal işleme işlenmiş nöronlarda işlevi sorguya çekmek için analiz. Biz kümelerinden oluşan omurilik sinir hücreleri genetik olarak analiz etmek için bu tekniği nasıl kullanılacağını gösteren örnekler sağlar. Virüs-aracılı transgene ifade Cre transgenik farelerde klasik muhabir fare kaynaklı transgene ifadesine göre başlıca avantajları şunlardır: 1) çeşitli muhabir veya efektör proteinlerin kodlama farklı Cre-bağımlı rAAVs olabilir Böylece birkaç birden fazla transgenik fare satırları oluşturma gereğini üstesinden tek Cre transgenik satır enjekte. 2) kesici enjeksiyon enjeksiyon yeri ve enjeksiyon sonra zaman Cre ifade hücreleri manipülasyon sınırlar. Ana dezavantajları vardır: 1) muhabir gen ifade rAAVs iş daha fazla değişken. 2) cerrahi spinal sinir hücreleri ilgi transduce için gereklidir. İki yöntem daha uygun olduğu ele alınması nöron nüfus ve araştırma soru üzerinde bağlıdır.

Introduction

Dorsal spinal kord çevre vücut ve beyin arasında bilgi değişimi için gerekli olduğunu. Isı, soğuk, gibi duyusal uyaranlara dokunmak veya zararlı uyaranlara hangi nöronlar bu bilgileri omurilik dorsal boynuz, özel çevre nöronlar tarafından tespit edilir. Burada, eksitatör ve inhibitör interneurons karmaşık bir ağ gelen ve sonunda röle duyusal bilgi yolu ile spinal projeksiyon nöronlar supraspinal için1,2siteleri. Omurilik tarafından yapılan hesaplamaları Inter- ve projeksiyon nöronlar kapı duyusal bilgi, böylece hangi bilgilerin bastırılır veya hangi yoğunlukta geçirilen belirleme. Değişiklikleri inhibisyonu ve uyarma, arasında değişen bir denge gibi duyusal uyaranlara entegrasyonundaki aşırı duyarlılık ya da allodynia (normalde non-feci stimülasyon sonra acı hissi) gibi duyusal işlev bozuklukları neden olabilir. Bu değişiklikleri çeşitli kronik ağrı altta yatan neden3,4devletler olduğu düşünülür. Böylece, duyusal işleme yüksek öneme sahip spinal devreleri vardır ve bu nedenle bir canlı çevre ve benlik algısı. Son varış ve moleküler, genetik bir kombinasyonu ve genetik olarak tanımlanan omurga nöron altgrupları kesin manipülasyon sağlar cerrahi teknikleri ile bilim adamları şimdi temel spinal devreleri anlamaya başlıyor farklı duyusal yöntemleri işlenmesi için sorumludur.

RAAV kesici enjeksiyon vahşi-türü veya transgenik fareler içine büyük katkıda bulundu işleme, analiz ve omurilik sinir hücreleri5,6,7, belirli alt kümeleri işlev anlayışı 8 , 9 , 10 , 11. bu teknik teslimat işaretçisi proteinlerin sağlar (GFP gibi / GFP füzyon protein), muhabir proteinler (örneğin, GCaMP) veya (örneğin, bakteriyel toksinler, channelrhodopsin veya pharmacogenetic reseptörleri) efektör proteinler arasında bir dağınık şekilde spinal sinir hücreleri sınırlı şekilde. Cre-bağımlı rAAVs yerel enjeksiyon transgenik fareler Cre recombinase spinal sinir hücreleri belirli alt kümesinde ifade içine ilgili nöronal nüfus belirli analiz sağlar. Biz etiket, ablate, inhibe veya bu gösteren nöronlar onlar ağrı kontrol spinal kapı önemli bir parçası ve iletim7kaşıntı spinal glycinergic etkinleştirmek için bu tekniği istihdam. Bu deneylerde Cre-bağımlı rAAV kesici enjeksiyon GlyT2::Cre fareler içine glycinergic nöronlar lomber spinal kord seçici manipülasyon etkin. Böylece, eş zamanlı glycinergic nöronlar hayvan yaşam için kritik içeren supraspinal devreleri manipülasyon önlenebilir.

RAAVs kesici bir enjeksiyon enjeksiyon sitesine enfeksiyon sınırlar, viral iletim sadece yerel nöronlar zamanda aksonal projeksiyonlar enjeksiyon siteye bağlanmak nöronlar gelişebilir. İkinci kez belirli bir çekirdek beyinde nöronal giriş sağlayan izleme CNS alanları için kullanılır. Zaman nöronlar tanımlanmış nüfusu belirli bir sitede eğitimi aksonal projeksiyonlar enfeksiyon ancak, aynı zamanda bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu sorunları çözmek için biz son zamanlarda AAV serotipleri ve serotipleri ve en aza indirmek ya da retrograd iletim en üst düzeye çıkarmak için kullanılan rehberleri tanımlamak için ifade kaset kapsamlı bir analiz yaptık. Omurilik devrelerde bu özel araştırma bağlamında analiz ettik retrogradely dorsal kök gangliyon (DRG), ventromedial rostral medulla (RVM) ve somatosensor korteks nöronlar transduce yeteneği farklı serotipleri ve rehberleri 12. bu protokol için özetlenen teknik bu nedenle enjeksiyon yerinde omurilik sinir hücreleri çözümlemek veya spinal kord enjekte sitenin giriş sağlamak projeksiyon nöronlar analiz etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokolünde rAAV üç iğne sol tarafındaki lomber spinal kord içine üç lomber segmentlere (L3-L5) nöron iletimi sağlamak için gerçekleştirilir. L3-L5 kesimleri duyusal girdi çoğunluğu enjeksiyon siteye hindlimb Ipsilateral alırsınız. Böylece genetik olarak etiketli nöron alt türündeki devre işlevi için fonksiyonel kanıt sağlayan fonksiyonel genetik olarak etiketli L3-L5 nöronlarda manipülasyon sağlam davranış değişiklikleri, uyandırmak için yeterli olduğunu ispat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Swiss Kanton veteriner ofisi (Zürih) tarafından kabul edildi ve uygun olarak ve tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri ile uyum vardır.

Not: İlgili üreticileri ve/veya satıcı ile birlikte tüm malzemeler Malzemeler tablolistelenir.

1. nesil Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler

Not: Cre-bağımlı vektörleri farklı rehberleri ile çeşitli satın alınabilir ( Tablo malzemelerigörmek) veya istenen ifade yapısı kullanılabilir değilse, bu varolan AAV yapıları değişiklik yaparak oluşturulabilir. Dikkat, organizatörü ve serotip viral iletim yayılmasını üzerinde bir etkisi olabilir (bkz. 12). Bu iletişim kuralı ilk bölümünde kısaca iki farklı Cre-bağımlı AAV vektörlerin kazanç için uygun üretimi ve işlev deneyler, kaybı sırasıyla açıklar.

  1. Pharmacogenetic harekete geçirmek (işlevinin kazanç)
    1. PAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq) sipariş-mCherry ( Tablo malzemelerigörmek) tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar (DREADD) tarafından harekete geçirmek için-harekete geçirmek aracılı.
    2. Bakteriyel bıçak kültür aldıktan sonra bakteri dışarı çizgi LB plakaları (Luria-Bertani sıvı ortamda çözünmüş bakteriyolojik-grade agar) uygun antibiyotik ile desteklenmiştir. Geceleri 37 ° C üzerinde kuluçkaya ve ertesi gün bir koloni seçin.
      Not: AAV içeren vektör genleri kararsız olabilir ve özellikle viral ters terminal içinde viral genom rekombinasyon (ITR), yinelenen denetim plazmidleri E. coliamplifikasyon sırasında oluşabilir. Biz böyle suşları recA-eksik bastırılmış-/ kullanarak öneririz rekombinasyon AAV genom içeren plazmid içinde önlemek için MDS42 veya Stbl3.
    3. Seçilen satıcı tarafından verilen talimatları uygulayarak bakteri yükseltmek DNA-Maxi-Kit ve yüksek kaliteli plazmid DNA piyasada bulunan bir DNA-Maxi-Kit ile hazırlamak (örneğin, Tablo malzemelerigörmek). Plazmid DNA hazırlık kalite kontrolünü bütünlüğü ve plazmid DNA bir aliquot bir kısıtlama Özeti aracılığıyla plazmid DNA kimliğini doğrulayarak gerçekleştirin.
      Not: Orada tanıma site kısıtlaması endonükleaz SmaI ITRs içinde için. SmaI Özet ITRs bütünlüğünü doğrulamak için kalite denetiminde içerir.
    4. DNA kaliteli rAAV üretmek için bir viral vektör çekirdek tesise göndermek.
      Not: Yüksek titresi yüksek kaliteli viral preps viral hazırlık contaminations neden fenotipleri semptomlarıdır kaçınmak için büyük önem taşımaktadır. Biz bu nedenle AAV üretim laboratuvarda iyi kurulmuş olmadıkça bir kurulan vektör çekirdek tesiste üretilen seçim rAAV olmasını öneriyoruz.
  2. Ablasyon (fonksiyon kaybı)
    Not: Bakteriyel toksinler, uyuşturucu ve toksin reseptörleri hücre ablasyon veya nöronal susturmak arabuluculuk için kullanılabilir. Cre-bağımlı bir şekilde pAAV.EF1α.flex.DTA hızlı difteri toksini parçası A (DTA) için oluşturmuş.
    1. Cre-bağımlı viral vektör oluşturmak için uygun bir organizatörü (örneğin, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). ile Cre-bağımlı vektör seçin Polimeraz zincir tepkimesi ile sivil savunma ve NheI veya uyumlu kısıtlama endonükleaz tanıma (bkz: koruyucu ve ark. onların çıkıntılar eklemeyi astar tarafından (örneğin, DTA) seçtiğiniz kodlama dizisi yükseltmek 7)
    2. Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanarak, vektör DNA kısıtlama digests yerine (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) ve PCR güçlendirilmiş (NheI-DTA-ASCI) restriksiyon ile sivil savunma ve NheI ekleyin. Arıtılmış parçaları ligate.
    3. Seçim yetkili bakteri tedarikçi tarafından verilen protokolüne göre uygun bakteri, içine tüp ligasyonu tepki dönüştürmek ve bakteri LB plakalar üzerine plakası. RecA-eksik bastırılmış-/ kullanmak için klonlama suşları, MDS42 veya Stbl3, gibi ve sonraki plazmid DNA amplifikasyon.
    4. Gün'den sonra dönüştürme, klonlar almak ve onlara uygun antibiyotik gecede 37 ° C'de ile takıma LB ortamda aşılamak Ertesi gün, plazmid DNA kültürlü bakterilerden ayıklayın. Başarılı kısıtlama digests tarafından klonlama ve ayıklanan plazmid DNA sıralama doğrulayın.
    5. Yüksek kalite, bakteriyel plazmid DNA yükseltmek (bkz. Adım 1.1.3). Güçlendirilmiş DNA virüs üretim için bir viral vektör çekirdek tesise göndermek.

2. omurilik hücreleri iletim

  1. Virüs çözümü hazırlanması
    Dikkat: Virüsler bulaşıcı reaktifler vardır ve ilgili kurallarına göre ele alınmalıdır. Çoğu durumda, rAAVs Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL1) ele alınabilir.
    1. Enjeksiyon gününde, buz üzerinde istenen arıtılmış şunun bir hisse senedi aliquot defrost ve buz kadar enjeksiyon önce doğrudan üzerinde tutun. Donma-çözülme-döngüsü tekrarlanan, kaçmak aynı derecede bunlar Virüsün etkili titresi azaltacaktır.
      Not: gerekirse, fetişlerin virüs aliquot 4 ° C'de 3 güne kadar tutulabilir.
    2. Steril % 0,9 virüs parçacıkları seyreltik NaCl veya fosfat tamponlu tuz (PBS).
      Not: Uygun titresi deneysel amaçlar üzerinde bağlıdır ve deneysel olarak tespit edilmelidir. İyi bir toplam viral yük ile başlayan 3 x 109 genom (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL enjekte) kopyalanır. Hesap alarak aşırı ve kılcal damar içine yüklenirken bazı kaybı, yaklaşık 2.5 µL virüs çözüm her fare için gerekli olacaktır.
  2. MİKROPİPETLER hazırlanması için kesici iğne
    1. 'İnce çeperli cam kılcal çekin' (dış çapı 1 mm) şaft ~5.5 mm uzunluğunda oluşturmak için bir micropipette çektirmenin sığ. Tablo 1de olduğu gibi adapte P(A) ile 3.0 mm ısıtıcı filament ve 00 programının ayarlarını kullanın.
      Not: Çekerek önceden yapılabilir. Çekti kılcal kil daha sonra micropipette yapışmasına neden toz önlemek için modelleme üzerinde kapalı bir kap içinde saklanmalıdır. MİKROPİPETLER ısıyla gerekli değildir.
    2. 25-35 mikron bir iç çapı ile açılış ipucu oluşturmak için yaklaşık 4.5-5 mm uzunluğu laminektomi Forseps ile çekti kılcal şaft küçük. Mikroskop ile bir ölçüm ölçeği kullanarak, ne kadar büyük açılması, ya da her micropipette için ölçmek için bir hisse kapılıyorum birkaç MİKROPİPETLER iç çapını ölçün.
      Not: Daha küçük bir ipucu tıkanma için yol açabilir; büyük bahşiş doku hasarı ve spinal kord nüfuz için zorluklara neden olabilir.
  3. Cerrahi kurulum ve araçları hazırlanması
    1. Ekipman temiz ve kullanılmak üzere hazır olduğundan emin olun. Çalışma alanının % 70 etanol ile silerek dezenfekte ve sterilize ısıyla veya onları dezenfeksiyon araçları. Herhangi bir dezenfektan kullanılmak üzere viral vektör zarar vereceğini microliter şırınga bırakmayın.
  4. Anestezi ve ameliyat için hayvan hazırlanması
    Not: Ameliyat toplam süresi 60-90 dk kadardır.
    1. Cerrahi işlem kolaylaştırmak için 6 - 10 - hafta yaşlı fareler seçin.
      Not: deneysel tasarım gerektirirse, genç ya da yaşlı hayvanlar enjeksiyon mümkündür. Herhangi bir zorlanma ve her iki cinsiyette prensip olarak kullanılabilir, ama davranışları farklı transgenik fare satırları arasındaki karşılaştırma için aynı arka plan zorlanma (Örneğin, C57BL/6J) kullanın. Cinsiyet farklılıkları bekleniyor veya araştırılması için kadın ve erkek ayrı gruplar halinde analiz.
    2. % ~ 5 isoflurane kullanarak anestezi neden. Hayvan stereotaksik çerçeve ısı Mat yerleştirin ve anestezi, 1-%2,5 isoflurane korumak (hava akımı oranı 900 mL/dk). Ameliyat boyunca solunum hızı izlemek.
    3. Ameliyat sırasında kornea kurutma önlemek için yağ göz merhem uygulamak.
    4. Hayvanın arka tıraş ve saç ıslak mendil ile dikkatli bir şekilde çıkarın. İyot solüsyonu ile traş cilt dezenfekte ve kuru cilt izin.
    5. Analjezik tedavi vermek (örneğin, 0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subkutan).
  5. Lomber Spinal Kord düzeyinde Vertebral sütunun pozlama
    Not: spinal kord ve vertebral sütunun fark gelişimi nedeniyle, ilgili düzeyleri hizalanmamış ama lomber spinal kord L4 torasik vertebra T13 aynı düzeyde kesimdir.
    1. En Kaudal kaburga çifti vertebral sütun palpating tarafından bulun. Bir neşter kullanmadan, sadece rostral en Kaudal kaburga çiftine başlayan deri içine bir 1,5-2,5 cm boyuna kesim olun.
    2. Forseps ile cilt kaldırın ve makas ile temel kas ayırarak. Ameliyat maruz dokuları nemli steril % 0,9 ile tutmak NaCl.
    3. İyi forseps ve küçük makas kullanarak, hemen yanında orta hat sonraki, ince zar tabaka haline bir kesi yapmak ve spinöz süreçlerden kesilmiş. Temel paraspinous kas ayrıdır ama spinöz süreçlerine bağlı.
  6. Lomber Spinal Kord düzeyinde vertebra tanımlaması
    Not: vertebral sütunun maruz bir kez, intertransverse bağ ve dorsal spinöz işlemleri görünür olmalıdır. Çeşitli anatomik yerler (şekil 1B) hedefe doğru omur teşhis etmek için yardım.
    1. Cilt geri kuyruk iliyak kret ortaya çıkarmak için doğru çekin. Aynı düzeyde görünür intertransverse ligamentler en Kaudal çifti L6 spinöz proses katılır. Kaudal omur ilgi tanımlamak için rostral yönüne içinde geriye doğru say.
    2. Vertebral sütun muayene et. En Kaudal kaburga çifti sadece T13 omur rostral bulunur ve leğen kemiği kalça düzeyinde L6 omur düzeyinde bulunur.
    3. Tendon vertebral sütunun sol tarafındaki en beyaz ve en medial nerede nokta bulun. T13 omur sadece rostral bulunur. Lomber spinal kord segment L4 bu omur içinde yer alır.
  7. Vertebral sütun ve maruz kalma Lomber Spinal Kord fiksasyonu
    1. Hayvan stereotaksik çerçeve spinal kelepçeler için yükseltmek için toplanan dokuların bir yastık üzerine yerleştirin.
    2. Hareketleri nedeniyle nefes vertebral sütunun önlemek için hedef omur düzeltmek. Bu amaç için hedef omur bitişik kelepçeler hizalamak, bir kelepçe bulunduğu saptamak ve vertebral sütunun ikinci kelepçe tamir ederken Adson Forseps ile tutun.
      Not: Sütun enjeksiyon uçağa dik olmalı ve böylece yukarıdan baskı üzerine hareket etmez sıkıca sabit. Gerekirse, kelepçeler ikinci bir çifti vertebral sütunun sabit olabilir. Bu durumda, kelepçeler için hedef omur bitişik iki omurga için iki çift saptamak yararlıdır.
    3. Paraspinous kas faiz vertebra yukarıda kaldırın. Bir neşter kullanmadan, bir paralel kesi vertebral sütunun paralel tendonlar için sadece medial yanı sıra dikey kesi rostral ve Kaudal hedef omur olun. Çok derin kesmemeye dikkat et. Gözyaşı/uzak rongeurs kullanarak kas kes. Forseps omur üstünde ya da yukarıda dura intervertebral alanı içinde kalan doku kaldırmak için gerektiği gibi kullanın.
    4. İntervertebral uzayda dorsal kan damarı spinal kord orta hat işaretleme görünür olmalıdır. Tek taraflı enjeksiyonlar için kısmi bir laminektomi omur hedef yan ortasına bir delik delme tarafından gerçekleştirin. Delme aparatı 0,5 mm küresel kesici ile iyi bir diş hekimliği kullanın ve spinal kord yaklaşırken özellikle dikkatle matkap. Kalan herhangi bir kemik parçaları 26 G eğimli iğne ile omurilik ortaya çıkarmak için kaldırın.
    5. 26 G eğimli iğne kullanarak, beyin zarı delinmiş delik ve intervertebral alanı rostral ve hedef omur, tüm yaklaşık 200 µm lateral dorsal kan damarı için Kaudal sorgulamaktı. Beyin omurilik sıvısı deliklerden kaçan ve spinal kord biraz şişkin.
  8. Enjeksiyon şırınga hazırlanması
    Not: Enjeksiyon şırınga enjeksiyon başlamadan hemen toz parçacıkları micropipette tıkanma riskini azaltmak için hazırlanmalıdır.
    1. Cam kılcal kiti montaj çıkarılabilir iğne sıkıştırması kullanan bir microliter şırınga üzerine monte. Sıkı sıkı ve güvenli uyum sağlar somun bağlayın.
    2. Microliter şırınga steril distile su ile doldurun ve dışarı pistonu ile basarak başlatın.
      Not: su kolayca ucunu dışarı gelmez böylece çok fazla direnç varsa, micropipette büyük olasılıkla engellendi ve değiş tokuş.
    3. Şırınga elektronik kontrollü bir microinjector bağlı bir micromanipulator üzerine monte. Micropipette şeyle dokunmamasını dikkat et.
    4. Microinjector kullanarak, hava su ve virüs arasında bir kabarcık oluşturmak için yaklaşık 1 µL kadar çizin.
    5. Stereotaksik çerçeve kullanarak damlacık micropipette ucunu taşımak dikkatli 2.5 µL damlacık virüs çözüm parafin film, bir parça üzerine yerleştirin ve onu çizin. O zaman dikkatle basın dağıtmak kadar biraz virüs çözümü ucunda ortaya çıkıyor.
    6. Şırıngayı geri çekmek ve bir kalemi, bir ölçek ile micropipette işaretleyin ve virüs çözümü düzeyini unutmayın; Bu infüzyon programlanmış gibi ilerliyor izleme kolaylaştıracaktır.
  9. Kesici iğne
    1. Bir beyin zarı delik yukarıda micropipette ucunu taşımak ve sonra hafif bir göçük dura içinde belirtildiği kadar aşağı. Spinal dorsal boynuz için enjeksiyon hedeflemek için doku mekanik stabilizasyon için izin vermek 500 µm 100 µm ardışık adımlarla (1 mm/s hız) ve daha sonra 200 µm yukarı aşağı iner.
      Not: Ucu son derinliği 300 µm bu durumda olduğunu, ancak hedef alan bağlı olarak adapte edilebilir.
      1. Doku penetrasyon için dayanıklı ise, micropipette dura üzerinde yakalamak. Bu durumda, geri çek ve biraz delik kaplamasını veya iğne dura düzgün penetrasyon girişimi tekrarlanmadan önce sorgulamaktı kullanmayı yeniden için hareket ettirin.
    2. 300 hedef enjeksiyon hacmi pompa programı nL bir enjeksiyon hızı 50 nL/dk ve Başlat düğmesine basın, infüzyon başlamak için.
    3. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra virüs düzeyi düşmüştür olup olmadığını görmek ve basınç yavaş yavaş şırınga çekiyoruz önce equilibrate için izin vermek ek bir 3 dk için yerinde micropipette bırakmak için ölçek kontrol edin.
    4. Adım 2.9.1.-2.9.3 tekrarlayın. diğer iki enjeksiyon siteler için.
  10. Dikiş ve kurtarma
    1. Omurilik kelepçeler ve yastık altında fare kaldırın.
    2. Kesintiye uğramış dikiş, yüzeysel doku katmanları ile absorbe dikiş ve cilt ile absorbe olmayan Dikiş dikiş katmanlarla yarada kapatın. İyot dezenfektan dikilmiş yaraya uygulayın.
    3. Anestezi bitirmek ve ev onun kafes dönmeden önce normale dönene kadar hayvan ısı mindere bırakın.
  11. Ameliyat sonrası bakım
    1. Ameliyat günü, ertesi gün ve daha sonra 2-3 günde hayvan sağlığını izlemek. Hayvan sağlamak normal bir yürüyüş, sağlıklı bir görünüm (ağırlık, gözler, kürk ve davranış) vardır ve yara iyileşiyor.
    2. Analjezik tedavi devam (örneğin, 0.1-0.2 mg/kg buprenorfin subkutan) gerektiği gibi üç kere-de gün.

3. davranışsal ve morfolojik analizleri

  1. Davranış Analiz
    Not: hayvanlar ölçümleri yeni deneysel çevreye uyum izin başlamadan önce ilgili kurulum için en az 30 dk karşılamak izin.
    1. von Frey Test
      1. Yer hayvanları tek tek bireysel bölmeleri yaklaşık 10 cm x 10 cm bir metal ızgara katta.
      2. Enjeksiyon yeri ile dinamik bir von Frey filament plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine teşvik. Hangi hayvan pençe uyarıcı çekilirse kuvvet unutmayın.
      3. Beş kez tekrarlayın ve ortalama para çekme eşik üzerinden her hayvan için altı ölçümleri hesaplayın.
    2. PIN Prick testi
      1. Bireysel bölümler yaklaşık hayvanlar koyun 10 cm x 10 cm bir metal ızgara katta.
      2. Penetrasyon cilt olmadan körelmenin 26-G iğneyle enjeksiyon yeri plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine teşvik. Davranış olarak sıfır (herhangi bir tepki) ya da (reaksiyon) puan.
      3. 9 kez ile elektrodlar arasında 3 dk aralıklarla tekrarlayın ve her hayvan için 10 ölçümleri yanıtından yüzdesi hesaplamak.
    3. Enjeksiyon DREADD-ligand klozapin-N-oksit (Kao)
      1. Kao Dimetil sülfoksit (0.2 mg/µL, hisse senedi bir çözüm oluşturmak için DMSO) oda sıcaklığında saklanan geçiyoruz.
      2. Deneme günü, hisse senedi steril % 0,9 çözümde sulandırmak için 0.2 µg/µL NaCl ve 10 µL/g vücut ağırlığı intraperitoneally enjekte. Denetim hayvanlar ile araç enjekte (% 0,2 DMSO içinde % 0,9 NaCl).
        Not: deneyim göre en yüksek etkileri davranışları beklenen 1-3 h sonra enjeksiyon olabilir ve etkileri tamamen 24 h sonra çökmek. Söz konusu olduğunda harekete geçirmek glycinergic nöronların az ağrı ve kaşıntı yanıt-e doğru katmak davranışlar görülmektedir. DREADD-aracılı etkinleştirme nöronların tarafından uyarılmış davranışları üzerinde spinal nöronların alt hedeflenen bağlı olacaktır.
    4. Kaşıntı ikna etmek için Pruritogens enjeksiyon
      1. Pruritogens %0,9 dağıtılması NaCl 8 mg/mL (klorokin) veya 10 mg/mL (histamin) çözümler için. 2 h sonra Kao yönetim, enjekte pruritogen ya da araç çözüm 10 µL subkutan spinal enjeksiyon yeri plantar Ipsilateral hindpaw yüzeyine içine. Alternatif olarak, pruritogen intradermally bir gün önce tıraş tarafından neden caydırıcı davranış azaltmak için traş buzağı içine enjekte.
    5. Spontan Nocifensive veya Pruritogen bağlı kaşıntı davranışları analiz etmek için kameraya
      1. Hayvanlar ayrı ayrı--dan onların anılan sıraya göre ev-kafes kattaki odada biraz şeffaf bölmeleri (yaklaşık 10 cm çapında) yerleştirin.
      2. Hayvanlar kayda kendiliğinden 5 min ve 30 dk pruritogen kaynaklı davranışları kaydetmek için video kaydı. 5 dk depo gözlerindeki devre dışı videolar analiz.
    6. Ağrı kaşıntı davranışları karşı
      1. Gözlemleyin ve Not i gözü kapalı, yalama ve davranışları ısırma.
        Not: İ gözü kapalı ve etkilenen sitenin yalama ısırma ise ağrı, yanıtlarını kabul kaşıntı ile ilişkilidir.
      2. Normal hızda videolar analiz, fare yalama veya etkilenen sitenin ısırma harcanan zamanı ölçmek veya yavaş yalamak ve refleksleri ısırma arasında daha kesin bir ayrım için ölçmek. Alternatif olarak, yalama/ısırma/i gözü kapalı nöbetleri saymak.
  2. Morfolojik analiz
    1. Bir ila üç hafta sonra enjeksiyon virüs veya davranışsal deney sonunda morfolojik çözümlemesi.
      Not: Biz eGFP ifade sürede 48 h olarak enjeksiyon sonra tespit var ama ifade önemli ölçüde içinde ertesi gün ve hatta hafta arttığını da bulundu. Güçlü muhabir ifade içeren hücreler için kuluçka (dan kesici enjeksiyon perfüzyon kadar) bir hafta yeterli olabilir. Zayıf transgene ifade, zayıf rehberleri veya zayıf fluorophores, virüs içeren hücreler için daha uzun bir ifade tespit düzeyleri sağlamak için gerekebilir.
    2. Doku fiksasyon
      1. Her fare transcardially ilk ile buz gibi yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glikoz 20 mM, KCl 2.5 mM ve CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), 20 ml 100 mL ile sonra sıvı (içinde 0.1 M sodyum fosfat tampon, pH 7,4) % 4 Buz gibi paraformaldehyde.
        Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve bakımı ile ele alınması gerekir.
      2. Hemen lomber spinal kord teşrih ve doku ile % 4 paraformaldehyde 2 h için buza sonrası düzeltin. Kısa bir süre sonrası sabit doku 0.1 M sodyum fosfat tampon (pH 7,4) ile yıkayın ve ardından çözümde %25 sukroz (0.1 M sodyum fosfat tampon, pH 7,4) gecede 4 ° C'de kuluçkaya
      3. Bir cryostat üzerinde 30 mikron, cryoprotected doku kesmek ve mikroskop slaytlarda bölümleri bağlayabilirsiniz.
    3. Ayirt boyama
      1. PBS içinde kısa yıkama sonra çözüm engelleme 300 μL uygulamak (% %0,3 10 Normal eşek serum Triton-PBS) bölümlerinde oda sıcaklığında 1 h için.
      2. 300 μL çözüm kapatmaktır birincil antikorların ilgili kombinasyonları ile slaytlar kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek) gece 4 ° C'de Bölüm 5 dk her PBS için 3 kez yıkayın.
      3. Oda sıcaklığında 1 h için engelleme çözüm ikincil antikor ilgili kombinasyonları ile slaytlar kuluçkaya. Bölüm 5 dk her PBS için 3 kez yıkayın.
      4. Kısaca slaytları GKD2içinde O durulama sonra floresan montaj orta kullanarak coverslips mount.
      5. Floresan görüntüleri 20 x 40 x amacı ile donatılmıştır ve confocal mikroskop kullanarak elde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir işaretleyici protein kodlama rAAV kesici iğne ile elde edilebilir ifade düzeyleri göstermek için ilk AAV1 enjekte. CAG.eGFP lomber spinal kord vahşi tipi farelerin içine. Üç enjeksiyonları aralıklı yaklaşık 1 mm ayrı üretilen lomber spinal segmentler L3 L5 için neredeyse sürekli bir enfeksiyon (şekil 1A-C). Omurilik yüzeyinden 300 µm derinlikte virüs enjeksiyon omurilik dorsal boynuz hücrelerinde baskın enfeksiyon yol açar. Ancak, enfekte hücreleri de ventral boynuz (şekil 1 d) bulunamadı. Sonra ne zaman bir Cre-bağımlı rAAV Cre transgenik fareye enjekte rAAV aracılı ifade arasındaki farkı göstermek için hedefi oldu. Bu nedenle Cre-bağımlı AAV1 enjekte. CAG.flex.eGFP vektör GlyT2::Cre transgenik farelerin omurilik içine. Olarak daha önce eGFP ifade dorsal ve ventral boynuz gözlendi. Ancak, beklendiği gibi eGFP ifade daha sınırlı dağıtım GlyT2 + nöronların, Yani yüzeysel dorsal boynuz nispeten seyrek ifadesinde ve yoğun derin dorsal boynuz (1E rakam) ifadesinde yansıtan oldu.

Daha sonra spinal nöronal altgrupları, iki farklı Cre-bağımlı AAVs işlevinin devre adresleme fizibilite göstermek için farklı efektör proteinler (DTA ve hM3Dq) için kodlama enjekte GlyT2::Cre transgenik fareler. AAV1 üç enjeksiyonları sonra gözlenen viral ifade benzer. CAG.eGFP yaban tipi fareler vardı inhibitör nöronlar (Pax2 +) sağlam ablasyon lomber segmentlere L3-L5 AAV1 enjeksiyon sonra. EF1a.Flex.DTA içine Glyt2::Cre fareler (şekil 2AC). Bu kesimler glycinergic inhibitör nöronlar kaybı uyarılmış işaretli mekanik aşırı duyarlılık (şekil 2B) ve spontan itici davranışı yönetmen doğru Ipsilateral hindlimb (şekil 2E). İtici davranışı yol açtı pençeleri, buzağı ve uyluk gözlenen kendi kendine olan lezyonlar için (bkz: veri için koruyucu vd. 7) etkileri glycinergic nöronlar AAV1.hSyn.flex.hM3Dq enjeksiyon ve Kao (şekil 2B) sonraki mayi enjeksiyon yoluyla aktif hale getirildiğinde gözlendi. Fareler zararlı mekanik stimülasyon (şekil 2F) ve (bkz: koruyucu ve ark. diğer zararlı uyaranlara desensitized haline geldi 7) Ayrıca, pruritogens histamin veya klorokin ile tedavi ederken, hM3Dq-aracılı harekete geçirmek glycinergic nöronların verimli bir şekilde prurifensive yanıt (Şekil 2 g) bastırılır. Bu sonuçlar rAAV üç enjeksiyonları içine lomber spinal kord lomber spinal kord karşılık gelen hindlimb uyarılması tarafından uyarılmış sağlam davranış değişiklikleri gözlemlemek için yeterli yüzölçümü transduce mümkün olduğunu göstermektedir.

Deneyler son bir küme, Cre muhabir virüs ile karşılaştırıldığında Cre muhabir fare kullanarak potansiyel farkları göstermek istedim. Bu nedenle, bir Cre sürücü gen, daha önce bir kısıtlı ifade deseni fare omurilik görüntüleme olarak tarif edilmiştir seçildi. Gen RORβ derin dorsal boynuz13,14inhibitör interneurons içinde ağırlıklı olarak ifade edilecek sürülmüştür. Bu çalışmada kullanılan RORβCre çakma fareler ve onları tdTomato analizi () önce herhangi bir zamanda noktada Cre ifade görüntüleme tüm hücrelerdeki ifade yol Rosa26füme balığı-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) Cre muhabir farelere, geçti Şekil 3A). TdTomato + RORβCrehücrelerde karakterizasyonu; R26Tom fareler ifade nöronlar ve dorsal boynuz (şekil 3BC) astrocytes ortaya koydu. Aslında, miktar tdTomato + hücre hücreleri Cre-aracılı rekombinasyon (% 58) geçiren çoğunluğu nöronal sigara vardı önerdi. Biz daha sonra enjekte Cre-bağımlı tdTomato muhabir rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) (şekil 3D) P40 RORβCre farelerin omurilik içine. R26Tomaksine-muhabir ifade, aracılı nöronlar (şekil 3EF) olmak muhabir virüs tarafından etiketli tüm tdTomato + hücreler bulduk. Son olarak, kimlik tdTomato + nöronların fareler (RORβCre; her iki kümesi analiz edildi R26Tom ve AAV1 ile enjekte RORβCre . CAG.flex.tdTomato). her iki durumda da, çoğunluk nöronların inhibitör (> % 85) ve eksitatör nöronlar azınlık (< % 20) (Şekil 3 G-Ben), RORβ + nöronlar13,14kimliğini önceki Değerlendirmeler ile anlaşma olduğu.

Figure 1
Resim 1: AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP kesici enjeksiyon
(A) bir AAV1 kesici bir enjeksiyon şematik gösterimi. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) hindlimb innervated lomber spinal kord içine. (B) anatomik lomber spinal kord kesimleri L3-L4 konumunu bir yukarıdan aşağıya bir fare arkası görünümünü görülebilir. Cilt vertebral sütunun ortaya çıkarmak için açıldı. Omurilik omurga T13-L6 süreçlerinin anatomik referans olarak renkli ve iliyak kret bir ok gösterir. (C) bütün Dağı lomber spinal kord temsilcisi görüntüsü. Yeşil Floresans omurilik virüs transduced alanlarını belirtir. (D) temsilcisi görüntüsü ile lomber spinal AAV1-eGFP-transduced Kord vahşi tipi fare--dan bir kesit. (E) temsilcisi görüntüsü bir AAV1 bir kesit. CAG.flex.eGFP transduced spinal kord GlyT2::Cre fare. Kesik çizgiler anahat gri maddenin ve omurilik yüzeysel dorsal boynuz temsil eder. Ölçek çubukları C = 1 mm, D = 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Fonksiyonel manipülasyon Spinal Cre ifade etme Glycinergic nöronlar
(A + B) Bir AAV1 kesici bir enjeksiyon şematik gösterimi. EF1a.Flex.DTA (A) veya bir AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) lomber spinal kord içine. CRE-bağımlı ifade pharmacogenetic tasarımcı reseptör hM3Dq GlyT2 nöronlar tarafından alınabilen kılacağını iken Cre-bağımlı ifade difteri toksini parçasının A (DTA) için glycinergic nöronlar (GlyT2 +) (A), ablasyon götürecek klozapin-N-oksit (Kao) (B). (C) AAV1 üç enjeksiyonlari. EF1a.Flex.DTA GlyT2::Cre farelerin L3-L5 parçalara Ipsilateral nınkini değil kontralateral yan ilgili kesimleri içinde inhibitör nöronlar işaretli kaybına yol açtı. (D) mekanik von Frey uyarılması Ipsilateral arka pençe içinde AAV1 ile enjekte GlyT2::Cre fareler için uzun süreli aşırı duyarlılık kaybı GlyT2 nöronlar uyarılmış. EF1a.Flex.DTA, ama herhangi bir değişiklik Cre-negatif farelere enjekte edildi gözlendi. (E) GlyT2 kaybı nöronlar spontan itici davranışı kronik kaşınma anımsatan uyarılmış. (F) hM3Dq-aracılı aktivasyonu GlyT2 nöronlar iğne stimülasyon tarafından uyarılmış zararlı mekanik ağrı hafifletti. (G) hM3Dq-aracılı aktivasyonu GlyT2 nöronlar azaltılmış pruritogen (klorokin veya histamin)-itici davranışı uyarılmış. Verileri ortalama ± SEM temsil edilen *** p < 0,001; p < 0,01. Ölçek C bar = 1 mm. g = gram. Görüntüleri yeniden kullanılan ve koruyucu ve ark. güncelleme 7 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: etiketleme RORβ ifade hücrelerinin genetik ve virüs-aracılı. (A) floresan tdTomato muhabir Cre-bağımlı ifade için strateji RORβCreiçinde; gösteren diyagram Rosa26füme balığı-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) fareler. (B) Immunostaining RORβCreomurilik bölümlerinde; R26Tom fareler NeuN + RORβ-Tom nöronlar lamina ı-IV içinde bulunabilir saptandı. (C) Cre-bağımlı ifade tdTomato de GFAP'nin + RORβCresütundaki hücrelerde gözlenmiştir; R26Tom fareler, düşündüren RORβ geliştirme sırasında astrocytes ifade edilir. Ok uçları Çift etiketli astrocytes lamina III olarak gösterir. (D) AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) virüs kesici enjeksiyon RORβCre fareler için sürücü yerel Cre-bağımlı ifade tdTomato içine gösteren şekil. AAV-flex-Tom virüsle enjekte RORβCre farelerin omurilik bölümlerinde (E) Immunostaining. RORβ-Tom nöronlar spinal dorsal boynuz yüzeysel lamina için yerelleştirilmiş ve tdTomato ifadesi yok astrocytes üzerinden. (F) yüzde RORβ-Tom hücreleri nöronal işaretçiyi NeuN spinal RORβCrebölümlerini ifade; R26Tom fareler ve AAV-flex-Tom virüsle enjekte RORβCre fareler. (G-H) Immunostaining (G) RORβCreomurilik bölümlerinde; R26Tom fareler ve (H) RORβCre fareler colocalization RORβ-Tom nöronlar ve inhibitör işaret Pax2 veya Uyarıcı işaret Lmx1b. (ı) yüzde RORβ-Tom arasında gösterilen AAV-flex-Tom virüs enjekte Lmx1b ve Pax2 RORβCreiçinde ifade nöronlar; R26Tom fareler ve AAV-Tom virüsle enjekte RORβCre fareler. Verileri ortalama ± SEM bilgilerse 2-3 fare ve fare başına 1-3 bölüm olarak gösterilir. Ölçek çubukları 100 µm (B, E) ve 20 µm (C, E görüntülerde yüksek büyütme, G ve H) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Değişken Küme değeri Birim
ısı (H) 450 -(yayılan ısı iktidara orantılı değeri)
ön çekme (F(TH)) zorla 20 -(bobin zorlamak için uygulanan gerilim ile orantılı değeri)
mesafe eşik (s(TH)) 25 0,12 mm
heatstop (t(H)) gecikme 30 0.5 ms
mesafe heatstop (s(H)) 0 0,12 mm
gecikme çekme 1 (t(F1)) 200 0.5 ms
Çekme 1 (F1) zorla 300 -(bobin zorlamak için uygulanan gerilim ile orantılı değeri)
mesafe çekme 2 (s(F2)) 30 0,12 mm
Çekme 2 (F2) zorla 600 -(bobin zorlamak için uygulanan gerilim ile orantılı değeri)
(reklam) ayarlamak 0 -

Tablo 1: Çektirme ayarları

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AAVs kesici enjeksiyon yüksek zamansal ve mekansal çözüm ile spinal hücreleri analizini sağlayan güçlü bir teknik araştırma laboratuvarında hale gelebilir. Bu iletişim kuralı hindlimb için onların periferik aksonlar uzanan duyusal sinir hücreleri tarafından innervated üç ana omurga segmentleri iletim sağlar. Üç transducing sağlam ve tekrarlanabilir davranış veri üretir. Ayrıca mümkün daha geniş bir duyu alanı tek bir kesici enjeksiyon sonra test sağlar. Örneğin, aynı enjeksiyon rejimi pençe test etmek için izin verir (von Frey, Hargreaves, vb) ve uyluk (intradermal enjeksiyon, mekanik-reseptör stimülasyon), böylece ele alınabileceği duyusal yöntemleri genişletiyor.

Kritik adımlar:

Kritik sağlam morfolojik ve davranışsal verileri elde etmek için ve eserler önlemek için birkaç adım vardır. Viral vektör tasarımı ve seçimi organizatörü ve serotip iletim verimliliği ve ölçüde transduced alanının üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir ve bu nedenle davranışsal sonuçlar (viral yayılması ve iletim verimliliği hakkında ayrıntılar için bkz . 12). oluşabilir virüs enjeksiyon yan etkileri en aza indirmek için gerekli yüksek kaliteli viral hazırlıklar kirletici ya hücre enkaz virüs çözüm mevcut. Spinal kord enjekte için gereken cerrahi cerrahi ile tanıtılan morfolojik ve davranışsal eserler önlemek için büyük bir özenle yapılmalıdır var. Özellikle dikkat özellikle laminektomi ve iğne ile dura perforasyon sırasında spinal kord işleme gerekir. Omurilik hasarı somatik duyu ve motor koordinasyon böylece herhangi bir planlanmış davranış deneyler ödün fare, zarar. Buna ek olarak, şırınga dikkatli bir şekilde birleştirmek önemlidir. Yanlış montaj veya micropipette tıkanma deneme engel olabilir. Enjeksiyon yerinde spinal doku deneme sonunda başarılı enjeksiyon ve iletim enjekte çevrenin doğrulamak için ve aşırı doku hasarı ameliyat sonucu olarak dışlamak için muayene edilmesi gerekiyor. Bu iletişim kuralı bir konsantrasyon 1 x 1013 GC/mL belirgin toksisite olmadan kadar viral titreleri kullandı, henüz virüs daha yüksek titreleri zaman eninde sonunda toksik hale gelebilir. Buna ek olarak, toksisite büyük olasılıkla aynı zamanda protein enjekte AAV tarafından kodlanmış bağlı olacaktır.

Değişiklikler:

İletişim kuralı birkaç parametre belirlenmesi için nöronal nüfus ve araştırma soru için adapte edilebilir. 300 nL virüs çözümü 300 µm derinliğe, enjeksiyon iletim nöronların ve ağırlıklı olarak dorsal boynuz boyunca yol açar. Amaç hedef nöronlar için daha fazla ventral ise, derinliği ayarlanabilir. Enjeksiyon virüs daha büyük hacimli (biz-si olmak kullanılmış ilâ 500 nL enjeksiyon başına) olacak yol dorsoventral daha geniş bir yayılma ve rostrocaudal yön. Bu ek hücre rostrocaudal ölçüde hedefleme ulaşmak yararlı olabilir, ancak kontralateral yan bir iç denetim olarak kullanmak engel olabilir kontralateral tarafa yayılma artırabilir. Buna ek olarak, transduced hücre dorsoventral ölçüde, hangi istenen etkiyi olabilir ya da kaçınılmalıdır artacak. Enjeksiyon 300 300 µm kaçınılması yan derinlikte nL etkileri motor kontrol ederken enjeksiyon 500 GlyT2::Cre farelerde nL veya enjeksiyon daha büyük bir derinlik, zaman zaman hindlimb (veri gösterilmez) Spastik uzantısı gibi motor fenotipleri üretilen. Enjeksiyon daha küçük birimler daha sınırlı alanlarda5için hedefleme kısıtlamak için kullanılabilir. Viral titresi değiştirilebilir ve aslında her virüs tespit edilmelidir başka bir parametresi olarak belirtilir. Floresan gazetecilere ve DREADDs için daha yüksek titreleri algılanabilir veya etkili ifade için gerekli olabilir, ancak yüksek verimli DTA gibi bakteriyel toksinler için düşük ifade düzeyi istenen etkiyi ikna etmek yeterli olabilir.

Yöntemi mevcut/alternatif yöntemleri açısından önemi:

Bugüne kadar esas olarak iki teknik işlevsel olarak gerekli duyusal sinyallerinin iletimi için nöronal devreler sorguya çekmek için kullanılmıştır. Pek çok araştırmacı gazeteci ve efektör proteinler fareler recombinase ifade etiket ve omurilik nöronal altgrupları işlemek için kodlama rAAV kesici iğne kullandık. Kesici enjeksiyon spinal hücreleri işlemek için bir teknik olarak daha önce açıklanan15,16oldu. Burada özetlenen Protokolü lomber spinal kord üç ardışık kesimleri genetik olarak etiketli nöronlarda cerrahi işleme en aza indirerek transduce için özel olarak tasarlanmıştır. Bu iki üç enjeksiyonları intervertebral uzayda rostral ve Kaudal T13 omurga ve ikinci, vertebra kaldırmak yerine üçüncü enjeksiyon için T13 bir delik delme tarafından yerleştirerek elde edilir. Hedeflenen L3-L5 kesimleri duyusal nöronlar hindlimb innerve ana fesih alanı vardır. Biz bu tür iletim glycinergic nöronlar manipülasyon sonra sağlam davranış değişiklikleri üretmek ve farklı genetik olarak etiketli omurilik sinir hücreleri çeşitli analiz için uygun olduğunu göstermektedir için yeterli olduğunu göstermek.

Omurilik nöron alt kümeleri işlev işlemek için kullanılan ikinci teknik geçiş Transjenik hayvanlar üzerinde temel alır. Burada, farelerin omurilik sinir hücreleri belirli alt kümesinde bir recombinase ifade muhabir fareler için istenen marker veya ilgili nöronal alt17,18, efektör protein ifade ulaşmak için geçti gerekiyor 19. bazı karşılaştırma-den sonuçlanmak muhabir fareler veya kesici virüs iğneleri kullanarak elde edilen oluşabilecek farkı göstermek için biz RORβCre çakma hayvanlar Cre-bağımlı muhabir fareyle geçti ya da RORβ enjekte CRE Cre-bağımlı muhabir rAAV ile fareler. Muhabir gen ekspresyonu rAAV muhabir gen ekspresyonu RORβCreiçinde elde elde karşılaştırıldığında; R26Tom fareler. Muhabir gen ekspresyonu Cre-bağımlı rAAV kesici enjeksiyon elde edilen omurilik nöronlar için sınırlı idi, R26Tom muhabir fare uyarılmış tdTomato ifade da astrocytes içinde bulunur. Bu RORβ geçici astrocytes ifade edilir göstermektedir. Benzer şekilde, daha sınırlı bir muhabir ifade bulundu Gutierrez-Mecinas vd (dağınık şekilde ve hücre türü özel) viral enjeksiyon Tac1Cre fareler20fare uyarılmış muhabir ifade göre sonra. RAAV muhabir kesici iğne yetişkin farelerin omurilik içine kullanarak, muhabir ve/veya efektör gen ekspresyonu verimli gen yetişkin hızlı ve böylece rekombinasyon/ifadede önlemek hücreleri nüfusu tahsis edilebilir Bu nüfus önceki geçici gen aktivitesi.

Kesici rAAV enjeksiyonları ikinci bir büyük avantajı rAAV kodlanmış genler ifade enjeksiyon siteye kısıtlamak için yeteneğidir. Transgenik farelerde Cre sürücü-aracılı ifade sadece ilgi nöronal subpopulation, aynı zamanda diğer nüfus sinir sistemi içinde bulunan kez. Dymecki ve arkadaşları, aynı zamanda anne ve Goulding, grupları zarif yolları rekombinasyon değiştirilmemiş17, kalacaktır sinir sistemi bölgelerinde önlemek intersectional muhabir fare tabanlı yaklaşımlar kullanarak geliştirdik 18,19,21,22,23. Çakma fare işaretçisi veya efektör proteinlerin ifade elde etmek için kullanarak aynı zamanda daha az değişken olarak ilgili ifade kaset hücre başına tek bir genom kopyası ve ifade kaset olan ilgi bölgedeki tüm hücreler vardır için kabul edilebilir . Buna ek olarak, ilgili ifade kaset ve viral hedefidirler sonra ifadeyi kaset kopya sayısı varlığı hangi hücre hücre, enjeksiyon enjeksiyon değişiklik gösterebilir ve bağlıdır iletim verimliliği üzerinde bağlıdır virüs çok. Son olarak, virüs-aracılı gen ekspresyonu geleneksel genetik yöntemler üzerinde ana dezavantajı cerrahi zorunluluktur. Cerrahi-aracılı yaralanma/enflamasyon nöronlar ve devreleri doğrudan etkileyebilir. Aynı ameliyat geçirmiş kontrol fareler eklenmesi bu nedenle zorunludur.

Gelecekteki uygulamalar:

Kesici enjeksiyon analiz ve genetik olarak tanımlanan herhangi bir omurilik subpopulation overexpression marker ve efektör proteinlerin aracılığıyla işlemek için kullanılabilir. Bu nedenle gelecekte birçok nöron popülasyonları onların belirli odak eğitim için bu teknik kabul edecek evim gibi. Ayrıca eksojen efektör proteinlerin overexpression ulaşmak için rAAVs kesici enjeksiyon kullanmanın yanı sıra, bu teknik de sessizlik ya da overexpress endojen proteinler için kullanılabilir ve bu nedenle herhangi bir belirli bir gen ile yüksek işlev çalışmaya mekansal ve zamansal çözünürlük.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Hanns Ulrich Zeilhofer cömertçe Bu eser destek için teşekkür ederiz. Hendrik Wildner Olga Mayenfisch Vakfı tarafından desteklenmiştir. Carmen Birchmeier Lmx1b antikor için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)
Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11, (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89, (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92, (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508, (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91, (6), 1413 (2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85, (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93, (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87, (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13, (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125, (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168, (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33, (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350, (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160, (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159, (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158, (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35, (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63, (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics