लंबे समय तक रहते सेल इमेजिंग Paclitaxel के जवाब में सेल भाग्य का आकलन करने के लिए

Cancer Research

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Summary

लाइव सेल इमेजिंग एकल कोशिकाओं या पूरी आबादी है कि तय सेल इमेजिंग अकेले द्वारा अप्राप्य है पर जानकारी का खजाना प्रदान करता है । यहां, लाइव सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल विरोधी mitotic दवा paclitaxel के साथ उपचार के बाद सेल भाग्य निर्णय का आकलन करने के लिए वर्णित हैं ।

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

Live-सेल इमेजिंग एक शक्तिशाली तकनीक है कि सीधे समय की विस्तारित अवधि में एकल कोशिकाओं में जैविक घटना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले एक दशक में, नई और अभिनव प्रौद्योगिकियों ने बहुत से लाइव सेल इमेजिंग की व्यावहारिकता को बढ़ाया है । कोशिकाओं को अब ध्यान में रखा जा सकता है और लगातार कई दिनों से छवि बनाई है, जबकि ३७ डिग्रीसेल्सियस और 5% सह2 सेल संस्कृति की स्थिति के तहत बनाए रखा । इसके अलावा, विभिंन प्रयोगात्मक स्थितियों का प्रतिनिधित्व देखने के कई क्षेत्रों एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार उच्च प्रवाह प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करते हैं । लाइव सेल इमेजिंग प्रत्यक्ष दृश्य और गतिशील सेलुलर घटनाओं के लौकिक quantitation के लिए अनुमति देकर फिक्स्ड सेल इमेजिंग पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । लाइव सेल इमेजिंग भी एकल कोशिकाओं है कि अंयथा जनसंख्या का उपयोग कर याद किया गया होगा के व्यवहार में भिंनता की पहचान कर सकते है आधारित परख । यहां, हम लाइव सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सेल भाग्य विरोधी mitotic दवा paclitaxel के साथ उपचार के बाद निर्णय का आकलन । हम तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए कल्पना है कि क्या mitotically गिरफ्तार कोशिकाओं बँटवारा से सीधे मर जाते हैं या चरण में वापस पर्ची. हम यह भी वर्णन कैसे फ्लोरोसेंट ubiquitination आधारित कोशिका चक्र संकेतक (FUCCI) प्रणाली के लिए mitotic फिसलन है कि फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने में सक्षम है से पैदा चरण कोशिकाओं के अंश का आकलन किया जा सकता है । अंत में, हम एक जीवित सेल इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए परमाणु लिफाफा टूटना घटनाओं की पहचान ।

Introduction

विरोधी mitotic दवाओं लंबे ठोस ट्यूमर के विभिन्न प्रकार के कीमोथेरेपी परहेजों में इस्तेमाल किया गया है और अक्सर महान प्रभावकारिता1,2,3दिखा । Mechanistically, ये दवाएं सामान्य mitotic प्रगति को बाधित करती हैं और तेजी से proliferating कैंसर कोशिकाओं में mitotic गिरफ्तारी को बढ़ावा देती हैं । हालांकि, mitotic गिरफ्तारी के जवाब में सेल भाग्य अत्यधिक चर रहा है: जबकि कोशिकाओं का एक अंश बँटवारा से सीधे कोशिका मृत्यु हो जाती है, दूसरों के बँटवारा से बाहर निकलें और tetraploid कोशिकाओं के रूप में एक चरण में वापसी (एक प्रक्रिया mitotic फिसल)4, 5,6,7,8. इन चरण कोशिकाओं apoptosis निष्पादित कर सकते हैं, स्थायी सेल चक्र की गिरफ्तारी से गुजरना, या यहां तक कि सेल चक्र4,5,6,7,8,9 ,10,11. कोशिकाओं है कि चरण में फिसल द्वारा mitotic सेल मौत से बचने, केवल फिर से दवा हटाने के बाद सेल चक्र में प्रवेश करने के लिए, इसलिए कैंसर सेल आबादी के फिर से उभरने में योगदान कर सकते हैं । इसके अलावा, कोशिकाओं है कि बँटवारा से पर्ची tetraploid हैं, और tetraploidy गुणसूत्र अस्थिरता को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है कि ड्राइव ट्यूमर पलटा12,13,14,15. कारकों को परिभाषित करने कि विरोधी mitotic दवा उपचार के जवाब में सेल भाग्य नियंत्रण इसलिए वर्तमान चिकित्सकीय अनुकूलन महत्वपूर्ण है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम तरीकों का वर्णन करने के लिए सीधे निरीक्षण और कोशिकाओं है कि विरोधी mitotic दवा paclitaxel के जवाब में लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी से गुजरना के भाग्य का अध्ययन । Paclitaxel क्लिनिक में एक स्थापित चिकित्सीय है और कई ट्यूमर प्रकार, स्तन, अंडाशय, और फेफड़ों के उन सहित में अत्यधिक प्रभावोत्पादक साबित कर दिया है16,17,18,19, 20. Paclitaxel, जो Yew पेड़ की छाल से व्युत्पंन एक संयंत्र उपक्षार है, microtubules स्थिर और इस प्रकार उनके गतिशीलता रोकता है21,22। जबकि paclitaxel द्वारा microtubule गतिशीलता के भीगा जी 2 के माध्यम से1 से सेल चक्र प्रगति को प्रभावित नहीं करता है, दवा बाधा द्वारा बँटवारा के दौरान धुरी विधानसभा चौकी के निरंतर सक्रियण के लिए नेतृत्व करता है kinetochore-microtubule अनुलग्नक (गहराई में समीक्षा की यहां23,24)25। एक परिणाम के रूप में, anaphase शुरुआत paclitaxel-इलाज कोशिकाओं और एक लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी में परिणाम में रोका जाता है ।

यह प्रोटोकॉल पहले live-सेल इमेजिंग प्रयोगों में mitotic कोशिकाओं की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे । बँटवारा दो नजर कोशिका जैविक परिवर्तनों के कारण अनुयाई टिशू कल्चर की कोशिकाओं में visualized किया जा सकता है. पहला, गुणसूत्रों परमाणु लिफाफा टूटने से तुरंत पहले अत्यधिक गाढ़ा हो जाते हैं । जबकि अक्सर मानक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable, गुणसूत्र संघनित्र और अधिक स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग कर पाया जा सकता है कि लेबल गुणसूत्रों (जैसे फ्लोरोसेंट-लेबल हिस्टोन प्रोटीन) । दूसरा, mitotic कोशिकाओं को भी नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन है कि सेल गोलाई से परिणाम द्वारा पहचाना जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल तो कैसे रहते सेल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी का अनुभव कोशिकाओं के भाग्य ट्रैक प्रदर्शित करेगा । कोशिकाओं का बँटवारा में गिरफ्तार तीन अलग किस्मत में से एक से गुजरना. सबसे पहले, कोशिकाओं बँटवारा के दौरान कोशिका मृत्यु से गुजरना कर सकते हैं. इस घटना को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized है, के रूप में मर कोशिकाओं को सिकोड़ें, bleb, और/ दूसरा, कोशिकाओं बँटवारा से बाहर निकलें और गुणसूत्र अलगाव या cytokinesis, एक प्रक्रिया mitotic फिसल के बिना चरण के लिए वापस लौट सकते हैं । गुणसूत्रों और/या mitotic सेल के समतल को आसानी से इस प्रक्रिया की पहचान करता है । बँटवारा से निकलने वाली कोशिकाएँ भी प्रायः अनियमित, बहु-पालिक नाभिक और बहुधा हार्बर कई micronuclei5प्रदर्शित करते हैं. तीसरे, बँटवारा में पकडे गए कक्ष anaphase आरंभ कर सकते हैं और एक लंबे विलंब के बाद बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ें. जबकि उच्च दवा सांद्रता पर असामांय, इस व्यवहार से पता चलता है कि गिरफ्तार कोशिकाओं धुरी विधानसभा चौकी, या कि धुरी विधानसभा चौकी आंशिक रूप से कमजोर या दोषपूर्ण है संतुष्ट हो सकता है । Anaphase शुरुआत गुणसूत्र अलगाव और बाद cytokinesis लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करके visualized किया जा सकता है ।

लाइव सेल इमेजिंग तरीके कोशिकाओं है कि से बचने के भाग्य को ट्रैक करने के लिए mitotic कोशिका मृत्यु से गुजरना mitotic फिसलन भी बताई जाएगी । कोशिकाओं है कि mitotic फिसलन से गुजरना या तो बाद के दौर में मर जाते हैं, एक टिकाऊ जी1 सेल चक्र गिरफ्तारी ट्रिगर, या सेल चक्र के फिर से प्रवेश के लिए सेल डिवीजन4के एक नए दौर शुरू करते हैं । FUCCI (फ्लोरोसेंट ubiquitination-आधारित कोशिका चक्र संकेतक) प्रणाली का उपयोग कर कोशिकाओं के अंश का निर्धारण करने के लिए एक दृष्टिकोण है कि फिर से mitotic फिसलन निंनलिखित सेल चक्र में प्रवेश का वर्णन किया जाएगा । FUCCI G1//संक्रमण के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है और लंबी अवधि के लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में दोनों में और vivo26,27में इस्तेमाल किया जा सकता है । FUCCI प्रणाली दो फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन का लाभ लेता है, hCdt1 के छोटे रूपों (क्रोमेटिन लाइसेंस और डीएनए प्रतिकृति कारक 1) और hGeminin, जिसका स्तर कोशिका चक्र की स्थिति के आधार पर दोलन । hCdt1 (एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए) जी1 चरण के दौरान उच्च स्तर पर मौजूद है, जहां यह प्रतिकृति के लिए डीएनए लाइसेंस के लिए कार्य करता है, लेकिन E3 ubiquitin ligase एससीएफSkp2 द्वारा ubiquitinated है और S/जी के दौरान नीचा2/M चरणों को रोकने के लिए डीएनए की पुन: प्रतिकृति26. इसके विपरीत, hGeminin (एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए), hCdt1 के एक अवरोध करनेवाला है, जिसका स्तर एस के दौरान चोटी2/M, लेकिन E3 ubiquitin ligase APCCdh1 द्वारा ubiquitinated है और बँटवारा के अंत में नीचा और जी1 भर में 26. नतीजतन, FUCCI कोशिका चक्र चरण का एक सीधा प्रतिदीप्ति readout बचाता है, के रूप में कोशिकाओं के दौरान जी1, और ग्रीन प्रतिदीप्ति के दौरान लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन S/2/M. FUCCI प्रणाली अंय दृष्टिकोण पर एक महत्वपूर्ण अग्रिम है (जैसे bromodeoxyuridine धुंधला) प्रफलन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, क्योंकि यह सेल निर्धारण की आवश्यकता नहीं है और अतिरिक्त औषधीय के लिए की आवश्यकता के बिना एकल सेल इमेजिंग के लिए अनुमति देता है कोशिका आबादी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए उपचार. हालांकि इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं, अतिरिक्त रहते सेल सेंसर भी सेल चक्र प्रगति कल्पना, जी128, डीएनए ligase-आरएफपी29 और PCDNA-GFP30 सेंसर के लिए एक helicase बी सेंसर सहित विकसित किया गया है एस चरण के लिए, और हाल ही में FUCCI-4 सेंसर, जो सेल चक्र के सभी चरणों का पता लगाता है31.

अंत में, परमाणु लिफाफा टूटना का पता लगाने के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग विधि वर्णित किया जाएगा । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कैंसर कोशिकाओं के परमाणु लिफाफे अस्थिर और फटने की संभावना है, जिससे nucleoplasm और कोशिका द्रव्य की सामग्री intermix करने की अनुमति है । इस घटना, परमाणु टूटना करार, डीएनए क्षति और जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया३२,३३,३४,३५,३६,३७, की उत्तेजना को बढ़ावा कर सकते है ३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२ , ४३ , ४४. जबकि परमाणु टूटना के अंतर्निहित कारणों को पूरी तरह से लक्षण रहते हैं, यह ज्ञात है कि परमाणु संरचना में विकृति परमाणु टूटना४२की वृद्धि हुई घटनाओं के साथ सहसंबंधी बनाना । paclitaxel उपचार के एक प्रसिद्ध प्रभाव स्पष्ट रूप से असामान्य परमाणु संरचनाओं का बँटवारा के बाद की पीढ़ी है; जैसे, एक लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए परमाणु टूटना यों तो विधि का वर्णन किया जाएगा, जबकि भी तलाश अगर paclitaxel उपचार परमाणु टूटना घटनाओं की आवृत्ति बढ़ जाती है । परमाणु टूटना एक परमाणु के मनाया रिसाव से पता लगाया जा सकता कोशिका द्रव्य में फ्लोरोसेंट प्रोटीन लक्षित (एक मिलकर आरएफपी के एक मिलकर डिमर दोहराने के एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत करने के लिए जुड़े, TDRFP-एनएलएस) । यह रिसाव आंख, जो टूटना घटनाओं के सरल quantitation सक्षम बनाता है द्वारा अलग दिखाई है ।

इस प्रोटोकॉल एक widefield epifluorescence माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है कि एक इनकोडिंग मंच और फोकस सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित है । एनकोडेड अवस्था सटीक स्वचालित आंदोलन के लिए X-Y निर्देशांक परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है, जबकि स्वत focus सॉफ्टवेयर इमेजिंग अवधि की अवधि के लिए ध्यान में कोशिकाओं को बनाए रखता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल humidified 5% CO2 वातावरण के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए उपकरणों की आवश्यकता है । यह एक तापमान और वायुमंडल नियंत्रित बाड़े के भीतर पूरे माइक्रोस्कोप संलग्न द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या स्थानीय रूप से तापमान और पर्यावरण को बनाए रखता है कि स्टेज-टॉप उपकरणों का उपयोग करके. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त चरण-कंट्रास्ट उद्देश्य ०.३० की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ 10x fluor योजना है । हालांकि, 20X उद्देश्य भी एक ही फोकल विमान में दोनों गोल mitotic और चपटा चरण कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं । यदि चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग प्रदर्शन (जैसा कि इस विधि में वर्णित है), आवरण या तो कांच या प्लास्टिक हो सकता है । यदि विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) माइक्रोस्कोपी प्रयोग किया जाता है, यह प्रकाश के ध्रुवीकरण को रोकने के लिए एक गिलास कवर का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल रहते सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए गैर तब्दील और chromosomally स्थिर रेटिना pigmented उपकला (RPE-1) सेल लाइन का उपयोग करने पर केंद्रित है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल किसी भी अनुयाई सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है इतने लंबे समय के रूप में सेल संस्कृति शर्तों के रूप में आवश्यक समायोजित कर रहे हैं । सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत सुरक्षा और नैतिक दिशानिर्देशों और विनियमों का पालन करना होगा ।

1. लाइव सेल इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रयोग हौसले से गल और जल्दी बीतने RPE-1 कोशिकाओं या तो मानव हिस्टोन H2B एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदा H2B-GFP), या FUCCI प्रणाली (कैसे FUCCI उत्पंन करने के लिए पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल-व्यक्त कोशिकाओं को व्यक्त करने के संदर्भ में पाया जा सकता है४५) mitotic सेल भाग्य का आकलन करने के लिए ।
    1. परमाणु टूटना की आवृत्ति को मापने के लिए, RPE-1 दोनों H2B-GFP और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक मिलकर डिमर एक एकल परमाणु स्थानीयकरण संकेत (TDRFP-एनएलएस) से जुड़े हुए व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग करें ।
      नोट: एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत करने के लिए मिलकर में जुड़े तीन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निर्माण (GFP3-एनएलएस) भी टूटना प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ के रूप में४२) ।
    2. उपयुक्त विकास माध्यम में 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट्स पर कोशिकाओं को बनाए रखें । RPE-1 कोशिकाओं phenol लाल मुक्त में बनाए रखा, Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/पोषक मिश्रण एफ 12 (DMEM: F12) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल streptomycin के साथ पूरक है ।
  2. कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण, 10 मिलीलीटर बाँझ के साथ ऊतक संस्कृति पकवान धोने, कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) शेष माध्यम को हटाने के लिए, और फिर महाप्राण पंजाबियों.
    1. कोशिकाओं के लिए ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ ०.२५% Trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट या कोशिकाओं के बहुमत थाली से अलग है जब तक के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: trypsin में कक्षों को आवश्यकता से अधिक समय तक न रखें ।
  3. 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक stripette के साथ trypsinized कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में वितरित करने के लिए पूर्ण माध्यम की 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए १८० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
  4. महाप्राण supernatant, गोली बाधित नहीं सावधान किया जा रहा है, और फिर अच्छी तरह से मध्यम ऊपर और सीरम वैज्ञानिक stripette में नीचे pipetting द्वारा ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से स्थगित ।
  5. कक्ष४६की गणना करने के लिए hemocytometer या स्वचालित कक्ष गणना मशीन का उपयोग करें ।
    1. एक नए शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को पतला करने के लिए ३०,००० कोशिकाओं/
    2. प्लेट ३०,००० RPE-1 कोशिकाओं (1 मिलीलीटर मात्रा) एक 12-अच्छी तरह से गिलास तली हुई (#1 .5 मोटाई) इमेजिंग डिश के लिए आवश्यक सेलुलर घनत्व अगले दिन (30-50% धाराप्रवाह) को प्राप्त करने के प्रति अच्छी तरह से ।
      नोट: हमेशा दस्ताने के साथ प्लेट संभाल और गिलास नीचे छूने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  6. कोशिकाओं को एक ३७ डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति मशीन में बढ़ने की अनुमति दें जब तक वे पूरी तरह से संलग्न है और कांच के नीचे इमेजिंग प्लेट पर सपाट । जबकि कोशिकाओं के रूप में छोटे रूप में 4 एच में संलग्न कर सकते हैं, यह अनुशंसित है कि कोशिकाओं दवाओं के साथ इलाज नहीं कर रहे है और अगले दिन तक छवि ।
  7. paclitaxel जोड़ें (dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग) पूर्ण माध्यम में वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    1. एक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए अकेले DMSO के बराबर मात्रा के साथ पूरा माध्यम तैयार करें ।
    2. कोशिकाओं को जोड़ने से पहले दवा या DMSO से ३७ डिग्री सेल्सियस युक्त मध्यम गर्म करें । यह एक अचानक तापमान परिवर्तन के कारण फोकल बहाव को रोकने जाएगा ।
    3. या तो paclitaxel या अकेले 12-अच्छी तरह से इमेजिंग डिश के व्यक्तिगत कुओं को DMSO युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।

2. लाइव सेल इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप की स्थापना

  1. इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप हो सकता है कि किसी भी फिंगरप्रिंट या धूल को दूर करने के लिए ऑप्टिकल क्लीनर के साथ इमेजिंग डिश के कांच के नीचे साफ । पूरे कांच की सतह गीला करने के लिए पर्याप्त ऑप्टिकल क्लीनर का प्रयोग करें ।
  2. इमेजिंग डिश अनुकूलक में माइक्रोस्कोप की स्टेज पर ग्लास-बॉटम डिश लगाएं, डिश से प्लास्टिक कवर निकालें, और डिश को शीशे के ऊपर बने चैंबर से ढक दें । सुनिश्चित करें कि चैंबर में 5% कं2से मिलकर हवा के एक सतत प्रवाह की अनुमति के लिए एक वाल्व है ।
    नोट: 5% CO humidify करने के लिए2, गैस एक बाँझ पानी स्नान आवास में डाला टयूबिंग के माध्यम से प्रवाहित है । यह गैस के लिए अनुमति देता है ९५% नमी के लिए equilibrated बन जाते हैं ।
  3. आरंभ/इनकोडिंग मंच माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर जांचना । यह सही X-Y सुनिश्चित करेगा निर्देशांक और फोकल बहाव को रोकने के ।
  4. चरण-कंट्रास्ट प्रकाशिकी का उपयोग कर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने और प्रकाश ध्यान केंद्रित करने और इष्टतम विपरीत प्रदान करने के लिए (संदर्भ४७में विस्तार से वर्णित) कोल स्दीप्ति प्रदर्शन करते हैं ।
  5. उपयोग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सफेद प्रकाश और सभी फ्लोरोसेंट चैनल के लिए इष्टतम जोखिम समय निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है (जोखिम है कि कैमरे पर ७५% पिक्सेल संतृप्ति दे आदर्श हैं, प्रकाश की इस राशि प्रदान की कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है) ।
    1. उपयोग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इमेजिंग के लिए एक अच्छी तरह से देखने के कई, गैर अतिव्यापी क्षेत्रों का चयन करने के लिए । उन इमेजिंग क्षेत्रों का चयन करें जहां कक्षों को शीशे के नीचे अच्छी तरह से पालन किया गया है और ५०% और ७०% के बीच धाराप्रवाह हैं । झुरमुट कोशिकाओं के क्षेत्रों से बचें, के रूप में यह बाद में विश्लेषण मुश्किल कर देगा ।
      नोट: यह एक ही कोशिकाओं को दो बार ट्रैकिंग से बचने के लिए एक अच्छी तरह से देखने के गैर अतिव्यापी क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं को अत्यधिक गतिशील हैं, तो यह एक केंद्रीय बिंदु से बाहर radiating कई छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है और उन्हें एक साथ वापस सिलाई देखने के एक बड़े क्षेत्र बनाने के लिए ।
  6. सभी बिंदुओं के प्रयोग की अवधि के लिए ध्यान में रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप की फोकसिंग सुविधा को सक्रिय करें ।
  7. mitotic सेल भाग्य का आकलन करने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट करने के लिए हर 10 मिनट के प्रत्येक चयनित क्षेत्र से छवियों को इकट्ठा करने के लिए ९६ ज. बेफिक्र बँटवारा 20-40 मिनट तक रहता है, और इस तरह 10 मिनट अंतराल पर्याप्त जब कोशिकाओं विभाजन की पहचान करने के लिए नमूना प्रदान करेगा । परमाणु टूटना है, जो एक क्षणिक घटना है की पहचान करने के लिए, छवियों हर 5 मिनट प्राप्त ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर ड्राइविंग ऑटो अद्यतन, स्क्रीनसेवर, और ऊर्जा बचत मोड अक्षम है, के रूप में इन अक्सर लंबे प्रयोगों पर छवि अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
  8. इमेजिंग प्रयोग आरंभ । समय पर पुष्टि करते है कि छवि अधिग्रहण वीडियो के पाठ्यक्रम पर सुचारू रूप से चल रहा है ।

3. वीडियो विश्लेषण Paclitaxel के जवाब में सेल भाग्य की पहचान करने के लिए

  1. पुष्टि करें कि छवि वाले कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग के पाठ्यक्रम में स्वस्थ हैं । नियंत्रण DMSO के साथ इलाज कोशिकाओं व्यवहार्य और सक्रिय रूप से proliferating होना चाहिए ।
    नोट: यदि कक्ष तनाव के लक्षण दर्शाते हैं, तो वीडियो को quantitate न करें और इसके बजाय४८इमेजिंग शर्तों को ऑप्टिमाइज़ करने पर ध्यान दें । इमेजिंग तनाव के लक्षण शामिल blebbing/मरने वाली कोशिकाओं, कोशिकाओं है कि प्लेट पर संलग्न/प्रसार करने के लिए विफल है, और कोशिकाओं है कि एक कम mitotic सूचकांक दिखाने के लिए और/ तनाव के संभावित स्रोतों इमेजिंग चैंबर या phototoxicity४८के अंदर तापमान या सह2 स्तरों में उतार चढ़ाव शामिल हैं ।
  2. जब इमेजिंग एक 10x या 20X उद्देश्य के साथ देखने के एक पूरे क्षेत्र, व्यक्तिगत कोशिकाओं के सैकड़ों मौजूद हो सकता है । इसलिए, quantitation के साथ सहायता करने के लिए, उपलब्ध सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग छोटे चक्रों में देखने के क्षेत्र को विभाजित । प्रत्येक चक्र के भीतर स्कोर कोशिकाओं को अलग से (के रूप में चरणों में वर्णित 3.3.1 – 3.6.2) ।
  3. वीडियो का विश्लेषण करते समय, चरण-कंट्रास्ट और/या फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग करके मर्ज किए गए दृश्य में प्रत्येक कक्ष को ट्रैक करें । मर्ज किए गए दृश्य बनाने के लिए सॉफ़्टवेयर विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करें ।
    1. वीडियो की शुरुआत में शुरू, एक एकल चरण सेल की पहचान और कोशिका चक्र के माध्यम से अपनी प्रगति ट्रैक चरण प्रकाशिकी का उपयोग कर । किसी एकल कक्ष को ट्रैक करने के लिए, फ़्रेम से फ़्रेम तक कक्ष को आँख से निरीक्षण करें. उनकी समतल आकृति विज्ञान (चरण-कंट्रास्ट द्वारा मूल्यांकन के रूप में) और उनके डीएनए के अभाव में (जैसा कि H2B-GFP द्वारा मूल्यांकन किया गया है) (चित्र 1a) के कारण परस्पर निवृति कक्षों की पहचान करें ।
  4. सेल गोलाई के अवलोकन द्वारा बँटवारा दर्ज करने वाले कक्षों की पहचान करें (चरण-कंट्रास्ट प्रकाशिकी का उपयोग करके) और/या गुणसूत्र (H2B-GFP का उपयोग करके) (चित्र 1a-C) । दोनों सेल गोलाई और गुणसूत्र संघनित्र आसानी से आंख से कल्पना कर रहे हैं ।
    1. समय व्याख्या जब सेल बँटवारा में प्रवेश करती है । सेल ट्रैकिंग जारी रखें जब तक यह अपने भाग्य तक पहुंचता है (चरण में के रूप में anaphase ३.५, चरण 3.6.1 में के रूप में बँटवारा से कोशिका मृत्यु, या mitotic फिसलन चरण 3.6.2 में के रूप में).
  5. नियंत्रण कक्ष को अपने गुणसूत्रों को कुशलतापूर्वक संरेखित करना चाहिए और 1 h (चित्र 1 d) के भीतर anaphase दर्ज करना चाहिए । चरण के विपरीत प्रकाशिकी द्वारा anaphase कल्पना कक्ष के रूप में दो या poleward के दृश्य के माध्यम से H2B-GFP (चित्र 1a) के साथ लेबल चल गुणसूत्रों में चुटकी शुरू होता है । समय व्याख्या जब सेल anaphase से गुजरती है ।
  6. इसके विपरीत, paclitaxel के साथ इलाज कोशिकाओं कई घंटे के लिए गाढ़ा गुणसूत्रों के साथ गोल रहेगा (3-40 ज) (चित्र 1b-D) ।
    1. कोशिका मृत्यु से गुजरने वाले mitotically-पकड कोशिकाओं को पहचानें ।
      नोट: बँटवारा के दौरान मरने वाली कोशिकाओं चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं, के रूप में कोशिकाओं bleb, हटना, और/या टूटना (चित्र 1b) होगा । यदि इमेजिंग H2B-GFP, गुणसूत्रों भी कोशिका मृत्यु के दौरान टुकड़ा होगा ।
    2. सेल फिसलन से गुजरने वाले mitotically-पकड कक्षों की पहचान करें ।
      नोट: mitotic फिसलन से गुजरने वाली कोशिकाएं चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी जाती हैं, क्योंकि वे anaphase (figure 1C) के बिना परस्पर विरोधी और गुणसूत्रों में वापस समतल करते हैं । mitotic फिसलन से गुजरने वाले कक्ष बड़े tetraploid कोशिकाओं को जन्म देते हैं जो अक्सर multinucleated (फिगर 1C) होते हैं ।
  7. दृश्य के मूल फ़ील्ड से कक्ष ट्रैक करना जारी रखें । एक बार देखने का एक पूरा क्षेत्र ट्रैक है, एक ही अच्छी तरह से प्राप्त दृश्य के एक अलग क्षेत्र में ले जाएं और ट्रैकिंग सेल जारी है ।

4. वीडियो विश्लेषण सेल भाग्य की पहचान करने के लिए निंनलिखित Mitotic फिसलन

  1. FUCCI प्रणाली को व्यक्त RPE-1 कोशिकाओं का उपयोग कर (चरण 3.6.2 में वर्णित के रूप में) mitotic फिसलन निम्नलिखित सेल भाग्य का आकलन करें । चरण के विपरीत इमेजिंग के अलावा, यह दोनों लाल प्रतिदीप्ति (जी के संकेत1 चरण) और हरी प्रतिदीप्ति (S/जी के संकेत2/M) छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
    1. FUCCI RPE-1 कक्ष ३.७ के माध्यम से चरण ३.३ में वर्णित के रूप में ट्रैक ।
      1. पुष्टि करने के लिए कि FUCCI प्रणाली ठीक से काम कर रहा है, सत्यापित करें कि नियंत्रण कोशिकाओं को लाल और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वैकल्पिक अभिव्यक्ति जी के विश्लेषण से उचित रूप से सेल इमेजिंग डेटा । नियंत्रण कोशिकाओं को पूरी तरह से परमाणु लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन से संक्रमण के रूप में एक चरण के दौरान पूरी तरह से परमाणु हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शन से होना चाहिए जी1 से एस चरण में प्रगति । कोशिकाओं का बँटवारा पूरा होने के दौरान हरी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन जारी रखना चाहिए. बँटवारा के तुरंत बाद, कोशिकाओं को एक बार फिर दौर के दौरान पूरी तरह से लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शन करना चाहिए ।
        नोट: जबकि तरीकों को दोनों आरएफपी और GFP प्रतिदीप्ति एकल कोशिकाओं में FUCCI प्रणाली से तीव्रता फ्लोरोसेंट निशान४९का उपयोग करते हुए मौजूद है, यह अक्सर आवश्यक नहीं है के रूप में प्रतिदीप्ति रंग परिवर्तन मजबूत और आंख से दिखाई है ।
  2. चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बँटवारा में गिरफ्तार कोशिकाओं की पहचान और उन्हें ट्रैक जब तक वे mitotic फिसलन से गुजरना, ३.४ और 3.6.2 में वर्णित के रूप में. कोशिकाओं है कि बँटवारा से बाहर पर्ची और चरण में वापस जी1 चरण (चित्रा 2a-सी) के दौरान लाल प्रतिदीप्ति के लिए बँटवारा के दौरान हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शन से बदल जाएगा.
    1. अपने सेल भाग्य (चित्रा 2d) का आकलन करने के लिए आँख से चरण कंट्रास्ट और epifluorescent इमेजिंग का उपयोग कर इन फिसल कोशिकाओं को ट्रैक करें ।
      1. उन कक्षों की पहचान करें जो कक्ष चक्र को पुन: दर्ज करते हैं । इन कोशिकाओं की पहचान की लाल से हरी परिवर्तन प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति में FUCCI प्रणाली का उपयोग करते हुए कि जी1s संक्रमण (चित्रा 2a) इंगित करता है ।
      2. जी1 सेल साइकिल गिरफ्तारी से गुजरना कोशिकाओं की पहचान । ये कक्ष > 24 h (आरेख b) के लिए बनी लाल प्रतिदीप्ति की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाने जाते हैं ।
      3. चरण में मरने वाले कोशिकाओं की पहचान करें । इन कक्षों की पहचान चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग (चित्र 2c) का उपयोग करके कक्ष टूटना/blebbing/

5. परमाणु लिफाफा टूटना की आवृत्ति की पहचान करने के लिए वीडियो विश्लेषण

  1. परमाणु लिफाफा टूटना का आकलन करने के लिए H2B-GFP और TDRFP-एनएलएस व्यक्त RPE-१ कोशिकाओं का उपयोग करें. चरण-कंट्रास्ट इमेजिंग के अलावा, दोनों लाल प्रतिदीप्ति (TRITC) और हरी प्रतिदीप्ति (FITC) छवियां प्राप्त करें । टूटना कल्पना करने के लिए हर 5 मिनट छवियों प्राप्त करें ।
    नोट: यह सेल लाइनों जिसमें TDRFP-एनएलएस कुशलता से कम cytoplasmic प्रतिदीप्ति के साथ नाभिक में आयात किया जाता है उत्पंन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  2. ३.४ के माध्यम से चरण ३.३ में वर्णित के रूप में छवि कक्ष । TDRFP-एनएलएस प्रतिदीप्ति संकेत और H2B-GFP को चरणबद्ध के दौरान सह-स्थानीयकृत करना चाहिए । बँटवारा होने पर (के रूप में H2B-GFP द्वारा चरण प्रकाशिकी और/या गुणसूत्र संघनित्र का उपयोग कर गोलाई सेल द्वारा visualized), परमाणु लिफाफा टूट जाएगा और TDRFP-एनएलएस संकेत cytoplasmic (चित्रा 3) बन जाएगा । बँटवारा के बाद, परमाणु लिफाफे से बेटी कोशिकाओं में सुधार होगा और TDRFP-एनएलएस संकेत परमाणु बन जाएँगे.
  3. लाइव सेल इमेजिंग द्वारा बाद के चरण भर में बेटी की कोशिकाओं को ट्रैक । आसपास के कोशिका द्रव्य में नाभिकीय स्थानीयकृत TDRFP-एनएलएस का एक परिवर्तनीय फट देख कर परमाणु टूटना घटनाओं की पहचान करना । मिनट के भीतर, परमाणु लिफाफा की मरंमत की जाएगी और TDRFP-एनएलएस नाभिक (चित्र 3ए) के लिए relocald किया जाएगा ।
    नोट: अक्सर, परमाणु डीएनए, के रूप में H2B द्वारा visualized-GFP, एक छोटे से bleb के रूप में टूटना साइट के बाहर बहर देखा जाएगा ।
  4. चरण के दौरान एक टूटना घटना से गुजरना है कि नाभिक के अंश स्कोर । इस भिंन को स्कोर करने के लिए, ट्रैक किए गए कक्षों की कुल संख्या से एक टूटना ईवेंट से गुजरने वाले कक्षों की संख्या की गणना करें ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, RPE-1 H2B-GFP एक्सप्रेस कोशिकाओं एक विरोधी mitotic या वाहन नियंत्रण (DMSO) के साथ इलाज किया गया और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण । विश्लेषण से पता चला है कि नियंत्रण mitotic RPE-1 कोशिकाओं के १००% बँटवारा (चित्र 1a, 1 d) में प्रवेश करने के बाद 22 मिनट के एक औसत anaphase शुरू की । इसके विपरीत, RPE-1 paclitaxel के साथ इलाज कोशिकाओं को एक गहरा mitotic कई घंटे तक चलने की गिरफ्तारी का प्रदर्शन (चित्र 1 d) । इमेजिंग से पता चला है कि इन mitotically गिरफ्तार कोशिकाओं के ४८% mitotic कोशिका मृत्यु (आंकड़ा 1b, 1E) से गुजरा, जबकि शेष ५२% mitotic फिसल (चित्रा 1C, 1E) गुजरा ।

RPE-1 कोशिकाओं है कि mitotic फिसल गया के भाग्य का आकलन करने के लिए, RPE-1 FUCCI प्रणाली एक्सप्रेस कोशिकाओं या तो कम खुराक ५० एनएम paclitaxel, उच्च खुराक 5 µ एम paclitaxel, या वाहन नियंत्रण (DMSO) के साथ इलाज किया गया और दीर्घकालिक लाइव सेल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण । डेटा RPE-1 कोशिकाओं है कि ५० एनएम paclitaxel के साथ उपचार के बाद mitotic फिसल गया है कि पता चला, 22% बाद के सेल चक्र (चित्रा 2c2d), ७२% प्रेरित सेल साइकिल गिरफ्तारी (चित्रा 2 बी, 2 डी) में मृत्यु हो गई, और केवल 5% फिर से प्रवेश किया S-चरण (चित्र 2a, 2d) । इसके विपरीत, RPE-1 कोशिकाओं के उच्च खुराक 5 µ मीटर paclitaxel है कि mitotic फिसल गया था के साथ इलाज किया, ३५% बाद में सेल चक्र, ६५% प्रेरित सेल चक्र गिरफ्तारी में मृत्यु हो गई, और कोई नहीं फिर से प्रवेश किया S-चरण (चित्रा 2d).

मजे की बात है, कम खुराक paclitaxel उपचार RPE-1 का बँटवारा निंनलिखित कोशिकाओं में परमाणु लिफाफा टूटना को बढ़ावा देता है । mitotic पूरा होने के बाद बेटी कोशिकाओं पर नज़र रखी और किसी भी परमाणु टूटना घटनाओं के लिए रन बनाए थे, खुलासा है कि केवल ~ नियंत्रण के 4% (DMSO-इलाज) RPE-1 बेटी कोशिकाओं उठी, जबकि ~ 23% बेटी कोशिकाओं के साथ इलाज 10 एनएम paclitaxel टूटना प्रदर्शित ( चित्र 3, बी) ।

Figure 1
चित्र 1: विरोधी Mitotic उपचार के जवाब में Mitotic सेल भाग्य । RPE-1 कक्ष छुरा H2B-GFP व्यक्त DMSO वाहन नियंत्रण () या 5 µ एम paclitaxel (बी, सी) के साथ इलाज किया और समय चूक चरण-कंट्रास्ट और widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग mitotic सेल भाग्य का आकलन करने के लिए imaged थे । (बाएं पैनल) के रूप में वे बँटवारा (मध्य पैनलों) में प्रवेश किया और जब तक वे या तो शुरू anaphase (एक), mitotic सेल मौत (बी), या वापस (सी) का बँटवारा करने से फिसल गया दौर (सी) । सफ़ेद तीर ट्रैक किए गए कक्षों को इंगित करते हैं । (D) उस समय की मात्रा जिसका नियंत्रण कक्षों (DMSO-स्वास्थ्यकर्मी) और anti-mitotic-स्वास्थ्यकर्मी कक्षों में खर्च होता है, जैसे live-cell इमेजिंग द्वारा quantitated (n = १०० कक्ष प्रत्येक शर्त के लिए) । (E) कक्षों के भिंन (n = १००) जो कि anaphase, mitotic कोशिका मृत्यु, या mitotic DMSO-उपचारित कक्षों या कक्षों में 5 µ m paclitaxel के साथ इलाज किया गया था । समय, h:min. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: mitotic फिसलन से गुजरना कोशिकाओं के भाग्य । RPE-1 की कोशिकाओं को छुरा FUCCI प्रणाली व्यक्त ५० एनएम paclitaxel या 5 µ एम paclitaxel के साथ इलाज किया गया और समय चूक चरण-कंट्रास्ट और widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी quantitate फिसल के बाद mitotic कोशिका भाग्य का उपयोग कर छवि । कोशिकाओं के रूप में या तो फिर से बनाए गए थे सेल चक्र में प्रवेश, एक लाल द्वारा ंयाय के रूप में FUCCI प्रणाली में हरे प्रतिदीप्ति परिवर्तन (a); जी1 चरण में गिरफ्तार, के रूप में > 24 एच (बी) के लिए लगातार लाल प्रतिदीप्ति द्वारा ंयाय; या बाद में बँटवारा के दौरान मर रहा है, के रूप में सेलुलर blebbing द्वारा ंयाय/ सफ़ेद तीर ट्रैक किए गए कक्षों को इंगित करते हैं । (D) कक्षों के भिंन (n = १००) जो प्रत्येक भाग्य से गुजरे । त्रुटि पट्टियां दो स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । समय, h:min. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: paclitaxel-इलाज कोशिकाओं में परमाणु लिफाफा टूटना की आवृत्ति. RPE-1 कोशिकाओं को छुरा TDRFP-एनएलएस और H2B-GFP व्यक्त 10 एनएम paclitaxel या वाहन नियंत्रण (DMSO) और समय चूक चरण-कंट्रास्ट और widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी () का उपयोग कर छवि के साथ इलाज किया गया । बँटवारा के दौरान (Metaphase/Anaphase) परमाणु लिफाफा टूट जाता है और TDRFP-एनएलएस हो जाता है cytoplasmic. बँटवारा के बाद, TDRFP-एनएलएस के नाभिक के लिए reinformationes (पूर्व टूटना). नाभिकीय टूटना घटनाओं TDRFP के स्थानीयकरण से पहचाने जाते हैं-एनएलएस नाभिक से कोशिका द्रव्य करने के लिए चरण कक्षों में (टूटना), बाद नाभिक को TDRFP-एनएलएस के स्थानीयकरण के बाद परमाणु लिफाफा मरंमत (बाद टूटना) । सफ़ेद तीर ट्रैक किए गए कक्षों को इंगित करते हैं । (B) कक्षों के भिंन (n > 100 शर्त प्रति) जो paclitaxel या वाहन नियंत्रण की उपस्थिति में बँटवारा करने के बाद परमाणु लिफाफा टूटना दिखाते हैं । समय, h:min. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

लंबी अवधि के लाइव सेल इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा रहा है की कोशिकाओं के स्वास्थ्य की छवि है । यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को न्यूनतम बाहरी पर्यावरणीय तनावों को उजागर किया जाए, जैसे कि तापमान, आर्द्रता, और/2 के स्तर के बारे में घटिया स्थिति । यह भी फ्लोरोसेंट उत्तेजना रोशनी से धूप सीमा महत्वपूर्ण है, इमेजिंग तनाव के रूप में सेल व्यवहार५०को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । सीमित धूप कई मायनों में कहीं विस्तृत के रूप में प्राप्त किया जा सकता है४८। सामांय में, यह सबसे कम करने के लिए पर्याप्त रूप से उज्ज्वल पर्याप्त प्रतिदीप्ति संकेत कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए, इस प्रकार phototoxicity सीमित उत्पादन करने के लिए आवश्यक अल्प जोखिम समय का उपयोग करें । हालांकि, अगर कोशिकाओं को केवल एक बार हर 10-20 मिनट, अब जोखिम (है कि पिक्सेल संतृप्ति) आम तौर पर अच्छी तरह से सहन (हालांकि यह प्रत्येक fluorophore और कोशिका प्रकार के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए) छवि है । क्योंकि imaged कोशिकाओं दोनों पर्यावरण और इमेजिंग तनाव के प्रति संवेदनशील हैं, यह जरूरी है कि नियंत्रण कोशिकाओं को हमेशा रहते सेल इमेजिंग प्रयोगों में शामिल है और निगरानी के लिए सामांय प्रसार की पुष्टि है ।

लंबे समय तक रहते सेल इमेजिंग के लिए एक सीमा है कि यह या तो एक पर्यावरण चैंबर कि दोनों तापमान और 5% humidified CO2 वातावरण, या एक मंच-शीर्ष कक्ष है कि भी सक्षम है के साथ एक मौजूदा माइक्रोस्कोप लैस की आवश्यकता है उपयुक्त तापमान और वातावरण का समर्थन । जबकि बह सह2 इष्टतम है, कोशिकाओं को भी अप करने के लिए ४८ एच के लिए imaged जा सकता है सह2-स्वतंत्र माध्यम का उपयोग अगर 5% humidified co2 के साथ एक पर्यावरण चैंबर उपलब्ध नहीं है । हालांकि, कई कोशिका प्रकार ऐसे माध्यम के असहिष्णु हैं, और यह सेल विकास और व्यवहार्यता को मापने के द्वारा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । खनिज तेल के साथ कोशिकाओं ओवरले भी मध्यम वाष्पीकरण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस विधि के लिए एक दूसरी बड़ी सीमा है कि मैंयुअल रूप से सेल भाग्य ट्रैकिंग अत्यधिक श्रमसाध्य और समय गहन है । हालांकि, सेल ट्रैकिंग कार्यक्रम उपलब्ध है और छवि विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है५१,५२,५३। इस विधि के साथ एक और सीमा है कि उच्च गतिशील कोशिकाओं अक्सर समय की विस्तारित अवधि पर ट्रैक करने के लिए मुश्किल हैं । यदि यह एक महत्वपूर्ण समस्या बन गया है, पूरी तरह से imaged किया जा सकता है और एक साथ सिले छवियों को देखने के एक बड़े क्षेत्र के रूप में । कई सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम इस विधि का समर्थन करते हैं ।

Autofluorescence एक और बाधा है कि इस प्रोटोकॉल के साथ संबोधित किया जाना चाहिए है । Phenol लाल मुक्त माध्यम लाइव सेल इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि autofluorescence कम कर देता है । यह भी प्रदर्शित किया गया है कि दो सामांयतः वृद्धि मध्यम, riboflavin और pyridoxal में पाया विटामिन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photostability कम कर सकते हैं । इस प्रकार, मध्यम इन विटामिन की कमी भी प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है शोर राशन के लिए संकेत बढ़ाने के लिए । जबकि प्लास्टिक नीचे व्यंजन कम खर्चीले है और पर्याप्त इमेजिंग परिणाम प्रदान कर सकते हैं, वे भी autofluorescence की एक बड़ी राशि का उत्पादन है कि नकारात्मक संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्रभावित करता है । इसके अलावा, प्लास्टिक नीचे व्यंजन मोटाई में अधिक से अधिक भिंनता है, जो कई सूक्ष्मदर्शी की फोकस सुविधा को बाधित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में ग्लास तली हुई इमेजिंग डिश की मोटाई ०.१७ मिमी है, जो आधुनिक सूक्ष्मदर्शी के साथ उपयोग के लिए आदर्श गिलास है ।

अंत में, लंबे समय तक देखने के कई क्षेत्रों को शामिल फिल्मों और कई प्रतिदीप्ति चैनलों को प्राप्त करने के बड़े पैमाने पर डेटा फ़ाइलों का उत्पादन (गीगाबाइट के दसियों के लिए भी एक टेराबाइट्स), जो डेटा भंडारण और बैक अप के लिए एक समस्या पैदा करते हैं । इस समस्या को कम करने के लिए, यह अनुशंसित है कि सभी छवियां 2 x 2 या 4 x 4 बिन्नी का उपयोग कर प्राप्त की जाएं, बशर्ते समाधान में परिणामी हानि स्वीकार्य हो । बिन्नी ने न केवल एक्सपोजर टाइम्स को सीमित कर (यानी सेल छुरा H2B-GFP या FUCCI प्रणाली व्यक्त ५०० ms से कम जोखिम होना चाहिए), लेकिन यह भी तेजी से डेटा फ़ाइलों के आकार को कम कर देता है (एक छवि है कि 2 एक्स 2 बिन्नी है एक के एक चौथाई फ़ाइल का आकार है गैर-बिन्नी छवि).

इन सीमाओं के बावजूद, लंबी अवधि के रहते सेल इमेजिंग सबसे अच्छा तरीका पूरी आबादी से व्यक्तिगत सेल भाग्य ट्रैक का प्रतिनिधित्व करता है, खासकर जब कोशिका भाग्य अत्यधिक विषम हैं । के रूप में अधिक रहते है सेल फ्लोरोसेंट मार्करों और सेंसर उपलब्ध हो, जी सेल इमेजिंग दृष्टिकोण को कल्पना और सेल जीवविज्ञान के कई अतिरिक्त पहलुओं quantitate विस्तार किया जाएगा । उदाहरण के लिए, लाइव-सेल सेंसर वर्तमान में डीएनए क्षति घावों quantitate करने के लिए मौजूद हैं, p53 स्तर, सेल चक्र की स्थिति, और apoptosis26,५४,५५,५६,५७,५८ . इस प्रकार, इमेजिंग प्रयोगों की क्षमता अंतर्निहित सेलुलर गुण प्रकट करने के लिए कि कैसे और क्यों एकल कोशिकाओं कीमोथेरेपी एजेंटों के लिए परिवर्तनशील प्रतिक्रिया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

AFB, MAV और NJG को Salic-TDRFP के निर्माण के लिए पांडुलिपि और एड्रियन एनएलएस पर टिप्पणी के लिए रयान Quinton शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । AFB और MAV NIGMS आणविक औषध प्रशिक्षण अनुदान 5T32GM008541 द्वारा वित्त पोषित हैं. NJG शमीम और अशरफ दाहोद स्तन कैंसर अनुसंधान प्रयोगशालाओं के एक सदस्य है और NIH अनुदान GM117150 और सीए-१५४५३१, करीन Grunebaum फाउंडेशन, स्मिथ परिवार पुरस्कार कार्यक्रम, Searle विद्वानों कार्यक्रम, और मेलेनोमा अनुसंधान द्वारा समर्थित है एलायंस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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References

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