장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Cancer Research

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Summary

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

라이브 셀 이미징은 직접 시간의 연장된 기간 동안 단일 세포에서 생물 학적 현상을 시각화 하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 지난 10 년간, 새롭고 혁신적인 기술을 크게 라이브 셀 이미징의 실용성을 향상 했다. 세포는 이제 초점에 보관 하실 수 있습니다 하 고 지속적으로 유지에서 37 °C, 5% CO2 동안 몇 일 동안 셀 문화 조건 군데. 또한, 다른 실험 조건을 나타내는 여러 필드 볼 수 있습니다 취득 될 동시에, 따라서 높은 처리량 실험적인 데이터를 제공 하. 라이브 셀 이미징 직접 시각화 및 동적 셀룰러 이벤트의 시간 정량 함으로써 고정 셀 이미징에 상당한 이점을 제공 합니다. 라이브 셀 이미징 또한 그렇지 않으면 되었습니다 놓친 것 인구 기반 분석을 사용 하 여 단일 셀의 행동에 변화를 식별할 수 있습니다. 여기, 우리 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하기 위해 라이브 세포 이미징 프로토콜을 설명 합니다. Mitotically 여부를 시각화 하는 방법을 체포 유사 분열 또는 interphase에 다시 슬립에서 직접 셀 다 설명 합니다. 우리는 또한 형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기 (FUCCI) 시스템을 사용 하 interphase 셀 mitotic 미끄럼에서 태어난 세포 주기를 다시 입력 할 수 있는 부분을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 핵 파열 이벤트를 식별 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다.

Introduction

반대로 mitotic 마약과 긴 단단한 종양의 다양 한 종류의 화학요법 식이요법에 사용 되었습니다 종종 위대한 효능1,2,3를 표시. Mechanistically, 이러한 약물 정상적인 mitotic 진행 하 고 급속 하 게 확산에 mitotic 체포 홍보 암 세포. 그러나, 셀 mitotic 체포에 대 한 응답에서 운명이 매우 변수: 셀의 일부 유사 분열에서 세포 죽음을 겪 습, 하는 동안 다른 유사 분열에서 나가고 interphase tetraploid 셀 (프로세스 라고 mitotic 미끄럼)으로 돌아갑니다4, 5,6,,78. 이러한 interphase 세포 apoptosis를 실행, 영구 세포 주기 검거를 받아야 하거나 입력할 수 있습니다 심지어 다시는 세포 주기4,,56,7,8,9 ,,1011. Interphase, 다시 약물 제거 다음 세포 주기를 입력에에 걸리고 여 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀은 암 세포 인구의 재 출현에 따라서 기여할 수 있습니다. 또한, 세포 유사 분열에서 슬립 tetraploid, 고 홍보는 종양 염색체 불안정 하 알려져 tetraploidy12,13,,1415재발. 세포 운명 안티 mitotic 약물 치료에 대 한 응답에서을 제어 하는 요소를 정의 하는 것은 따라서 현재 치료제를 최적화 하기 위해 중요 한입니다.

이 프로토콜에서 우리가 직접 관찰 하 고 장기간된 mitotic 체포 안티 mitotic 마약 paclitaxel에 대 한 응답에서을 받아야 하는 셀의 운명을 연구 하는 방법을 설명 합니다. Paclitaxel는 설립은 병원에서 치료는 유 방, 난소, 그리고 폐16,17,,1819, 의 그들을 포함 하 여 많은 종양 종류에 높은 효능 입증 20. 주목 나무의 껍질에서 파생 된 식물 알칼로이드는 Paclitaxel microtubules 안정화 및 따라서 그들의 통합과21,22를 방지. Paclitaxel에 의해 microtubule 역학의 감쇄 미치지 않습니다 G1 부터 G2 에서 세포 주기 진행 하는 동안 약 이어질지 않습니다 유사 분열 동안 스핀 들 어셈블리 검사점의 지속적인된 활성화 방해 하 여 kinetochore-microtubule 첨부 파일 (여기 심층에서 검토23,24)25. 결과적으로, anaphase 발병 paclitaxel 치료 세포와 장기 mitotic 체포에서 결과 방지 된다.

이 프로토콜 먼저 라이브 셀 이미징 실험에 mitotic 세포를 식별 하는 방법을 설명 합니다. 유사 분열은 두 눈에 띄는 셀 생물 학적 변경 부착 조직 배양 세포에서 구상 될 수 있다. 첫째, 염색체 핵 붕괴 직전 높은 응집 된다. 동안 종종 표준 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 감지, 염색체 응축 수 더 명확 하 게 검출 될 형광을 사용 하 여 태그를 레이블 염색체 (예: 붙일 표시 된 히스톤 단백질). 두 번째, mitotic 세포는 또한 셀 반올림에 기인 하는 극적인 형태학 변화에 의해 식별할 수 있습니다.

이 프로토콜 것입니다 다음 라이브 셀 이미징 접근을 사용 하 여 장기간된 mitotic 체포를 발생 하는 셀의 운명을 추적 하는 방법을 보여 줍니다. 세포 유사 분열에서 체포 중 세 가지 운명을 겪는 다. 첫째, 세포는 유사 분열 동안에 세포 죽음을 받을 수 있습니다. 이 현상은 죽어가는 세포 축소, bleb, 또는 파열 관찰은 가벼운 현미경 검사 법에 의해 쉽게 시각화 됩니다. 둘째, 세포는 유사 분열에서 종료할 수 그리고 interphase 염색체 분리 또는 cytokinesis 없이 다시 복귀, 프로세스 라고 mitotic 미끄럼. 염색체의 decondensation 또는 쉽게 mitotic 셀 병합이 프로세스를 식별 합니다. 유사 분열에서 슬립 셀도 종종 불규칙 한, 다중 lobed 핵을 표시 하 고 자주 여러 micronuclei5항구. 셋째, 세포 유사 분열에서 체포 anaphase 시작 하 고 긴 지연 후 유사 분열을 진행할 수 있습니다. 드문 높은 약물 농도에, 하는 동안이 동작 체포 셀 스핀 들 어셈블리 검사점을 만족 수 있습니다 또는 스핀 들 어셈블리 검사점은 부분적으로 약화 또는 결함이 있는 제안 합니다. Anaphase 발병 염색체 분리 및 후속 cytokinesis 라이브 셀 이미징 사용 하 여 구상 될 수 있다.

겪고 mitotic 미끄럼에 의해 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀의 운명을 추적 하 라이브 셀 이미징 방법은 또한 설명 합니다. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀 후속 interphase에, 튼튼한 G1 세포 주기 검거, 실행 하거나 다시 세포 분열4의 새로운 라운드를 시작 하는 세포 주기를 입력 합니다. Mitotic 미끄럼 다음 세포 주기를 다시 입력 하는 셀의 일부분을 FUCCI (형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기) 시스템을 사용 하 여 접근 방식을 설명 합니다. FUCCI G1/S 전환의 직접적인 시각화 가능 하며 장기 라이브 셀 이미징 생체 외에서 그리고 vivo에서26,27와 함께 사용 될 수 있습니다. FUCCI 시스템은 두 개의 붙일 레이블된 단백질, hCdt1의 잘린된 형태 활용 (chromatin 라이선스 및 DNA 복제 요소 1) 및 hGeminin, 누구의 수준 진동 세포 주기 위치에 따라. hCdt1 (빨간 형광 단백질을 융합) SCFSkp2 G1 단계 어디 그것 복제, DNA를 라이센스 하는 역할을 하지만 E3 유비퀴틴 리가 여 ubiquitinated 동안 높은 수준에서 현재 고 방지 하기 위해 S/G2/M 단계 동안 저하 다시 복제 DNA26의입니다. 대조적으로, hGeminin (녹색 형광 단백질에 융합), hCdt1의 억제제 인 레벨 피크 S/G2/M, 동안 이지만 E3 유비퀴틴 리가 APC에 의해 ubiquitinatedCdh1 G1 에 걸쳐 유사 분열의 끝에 타락 26. 셀 S/G2/M 동안 G1, 및 녹색 형광 동안 빨간색 형광을 전시로 FUCCI 세포 주기 단계, 간단한 형광 판독을 제공 따라서. FUCCI 시스템은 중요 한 사전 (bromodeoxyuridine 얼룩) 등 다른 방법을 통해 증식 세포, 셀 고정 필요 하지 않습니다에 대 한 필요 없이 단일 셀 이미징에 대 한 추가 허용 하기 때문에 약리 세포 인구를 동기화 하는 치료. 이 프로토콜에 설명 하지, 하지만 추가 라이브 세포 센서 또한 G128, DNA 리가 RFP29 및 PCDNA GFP30 센서 helicase B 센서를 포함 하 여 세포 주기 진행을 시각화 하기 위해 개발 되었습니다. S 단계, 및 최근 FUCCI-4 센서는 세포 주기31의 모든 단계를 감지합니다.

마지막으로, 핵 파열을 감지 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다. 최근 연구는 암 세포의 핵 봉투는 불안정 하 고, 하는 경향이 수 있도록 nucleoplasm와 혼합할 하 세포질의 내용을 밝혀 있다. 이 현상, 핵 파열 되 나 DNA 손상 및 타고 난 면역 반응32,33,,3435,36,37, 의 자극을 홍보할 수 있습니다. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. 핵 파열의 근본적인 원인은 불완전 특징이 유지, 핵 구조에서 변형 핵 파열42의 발생률이 증가 연관 알려져 있다. Paclitaxel 치료의 한 잘 알려진 효과 유사 분열; 다음 기 막히게 비정상적인 핵 구조의 생성 따라서, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 핵 파열을 계량 하는 방법을 설명 합니다, 또한 paclitaxel 치료 핵 파열 이벤트의 빈도 증가 하는 경우를 탐험 하면서. 핵 파열 (예: 탠덤 이합체 핵 지 방화 신호, TDRFP-NLS를 융합 하는 RFP의 반복) 세포질에 핵-타겟 형광 단백질의 관찰된 누설에 의해 감지할 수 있습니다. 이 누설 파열 이벤트의 간단한 정량 가능 눈으로 분명히 표시 됩니다.

이 프로토콜 인코딩된 무대와 autofocusing 소프트웨어 widefield epifluorescence 현미경을 필요 합니다. 인코딩된 단계 자동 소프트웨어 이미징 기간 동안 셀에 초점을 유지 하는 동안 정의 된 X-Y 좌표, 정밀 자동화 된 운동에 대 한 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 장비와 37 ° C에서 셀 5% CO2 습도 유지 필요로 분위기. 이 온도 내에서 전체 현미경을 포함 하 여 달성 될 수 있다 고 분위기 제어 인클로저, 또는 그 로컬 무대 최고 장치를 사용 하 여 온도 및 환경 유지. 이 프로토콜에 사용 되는 단계 대조 목표는 계획 형 석 10 x 0.30의 숫자 조리개와. 그러나, 20 X 목표 단일 초점 평면에서 두 둥근된 mitotic 그리고 평평 interphase 셀을 식별 하기에 충분 한 있습니다. 단계 대조를 수행 하는 경우 (이 방법에 설명 된) 대로 이미징, 커버 수 유리 또는 플라스틱. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하는 경우 빛의 도발은 방지 하기 위해 유리 커버를 사용 하는 것이 필수적입니다.

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Protocol

이 프로토콜 비 변형 및 chromosomally 안정 망막 안료 상피 (RPE-1) 셀 라인을 사용 하 여 라이브 셀 이미징 실험에 집중 한다. 그러나,이 프로토콜으로 세포 배양 조건을 필요에 따라 조정 됩니다 어떤 부착 셀 라인에 적응 될 수 있다. 모든 절차는 기관 biosafety 및 윤리 지침을 준수 해야 합니다.

1. 라이브 셀 이미징에 대 한 셀을 준비합니다.

  1. 갓 해 동 하 고 초기 통로 RPE-1 셀 인간의 히스톤 H2B 형광 단백질 (예: H2B GFP), 융합 또는 FUCCI 시스템 (FUCCI 표현 하는 세포를 생성 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜 참조45에서 찾을 수 있습니다)를 표현 사용 mitotic 세포 운명 평가 하기
    1. 핵 파열의 주파수 측정, H2B GFP와 단일 핵 지 방화 신호 (NLS TDRFP)를 융합 하는 빨간 형광 단백질의 탠덤 이합체 RPE-1 셀을 사용 합니다.
      참고: 3 개의 녹색 형광 단백질의 구조는 단일 핵 지 방화 신호에 연동에서 융합 (GFP3-NLS) 또한 (참조42)에서 파열을 보여 주기 위해 사용 되었습니다.
    2. 적절 한 성장 매체에 10cm 조직 문화 접시에 셀을 유지 합니다. RPE-1 셀에 유지 됩니다 페 놀 레드-무료, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 IU/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM:F12).
  2. 셀에서 매체를 발음, 살 균, 실내 온도 버퍼링 인산 염 분 (PBS) 나머지 매체를 제거 하 고 PBS 발음의 10 mL와 함께 조직 문화 접시를 세척.
    1. 0.25%의 2 개 mL를 추가 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세포를 트립 신, 또는 세포의 대다수는 접시에서 분리 될 때까지 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: 필요 이상 trypsin에 세포를 보관 하지 마십시오.
  3. 10 mL 혈 청 학적인 stripette와 trypsinized 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 분배 하는 완전 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    1. 실내 온도에 3 분 동안 180 x g 에서 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛.
  4. 발음 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 상쾌한 고 철저 하 게 resuspend 펠 릿 10 ml 신선한 매체의 매체 serological stripette에 아래로 pipetting 부드럽게 하 여.
  5. 계산 셀46hemocytometer 또는 자동된 셀 카운팅 기계를 사용 합니다.
    1. 30, 000 셀/ml 전체 매체의 새로운 원뿔 튜브에 세포를 희석.
    2. 30000 RPE-1 (볼륨 1 mL) 당 세포 12 잘 유리 바닥 (#1.5 두께)의 다음날 (30-50% 합칠) 필요한 세포 밀도 달성 하기 위해 접시 이미징 플레이트.
      참고: 항상 장갑과 접시를 처리 하 고는 유리 바닥을 터치 하지 않도록 주의 하십시오.
  6. 때까지 그들은 완벽 하 게 연결 하 고 유리 바닥 이미징 접시에 평평 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 셀 4 h 만큼 적게 첨부할 수 있습니다, 하는 동안 셀 약물 치료와 다음 날까지 몇 군데 되지는 하는 것이 좋습니다.
  7. Paclitaxel (디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해) 완전 한 매체와 혼합에 원하는 최종 농도를 철저 하 게 추가 합니다.
    1. 완전 한 매체 제어로 사용 하 여 혼자 DMSO의 동일한 볼륨을 준비 합니다.
    2. 따뜻한 셀에 추가 하기 전에 37 ° C에 마약 또는 DMSO를 포함 하는 매체. 이것은 갑작스런 온도 변화로 인해 초점 드리프트를 방지 합니다.
    3. Paclitaxel 또는 12 잘 이미징 접시의 개별 우물 혼자 DMSO를 포함 하는 매체의 1 mL를 추가 합니다.

2. 설정 라이브 셀 이미징에 대 한 현미경

  1. 모든 지문 또는 이미지를 방해할 수 있는 먼지를 제거 하려면 광학 청소기 이미징 접시의 유리 바닥을 청소 합니다. 충분 한 광 청소기를 사용 하 여 전체 유리 표면에 젖은.
  2. 유리 하단 접시 이미징 접시 어댑터에서 현미경 단계에, 요리에서 플라스틱 커버를 제거 놓고 유리 올랐다 챔버와 함께 요리를 커버 합니다. 챔버는 5% CO2의 구성 된 공기의 지속적인 흐름을 허용 하도록 밸브를 확인 합니다.
    참고:을 축이다 5% CO2, 가스 배관 살 균 물 목욕 주택에 삽입을 통해 이동은. 95% 습도에 equilibrated 될 가스에 대 한 수 있습니다.
  3. 시작/보정 현미경 제어 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 인코딩된 무대. 이 정확한 X Y 좌표를 확인 하 고 초점 드리프트를 방지 합니다.
  4. 단계 대조 광학을 사용 하 여 셀에 집중 하 고 (자세히 설명 참조47) 빛을 집중 하 고 최적의 대비를 제공 하는 Kohler 조명 수행.
  5. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 흰 빛과 모든 형광 채널 사용 되 고 (노출 카메라에 게 75% 픽셀 채도 이상적인, 빛의이 금액은 세포에 독성 제공)에 대 한 최적의 노출 시간을 결정.
    1. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 여러, 선택 겹치지 시야 이미징 각 우물에서. 셀은 유리 바닥 잘 준수 하 고 50%와 70% 합칠 사이 이미지 영역을 선택 합니다. 이 후속 분석을 어렵게 만들 것입니다 이멀전의 셀의 영역을 피하십시오.
      참고: 두 번 같은 셀을 추적 하지 않으려면 각 우물에서 겹치지 않는 시야를 중요 하다. 셀 매우 운동 있다면, 그것은 중앙 점과 함께 하나의 큰 시야를 만들기 위해 다시 스티치에서 밖으로 발산 하는 여러 이미지를 필요할 수 있습니다.
  6. 유지 하려면 모든 포인트 초점에 실험의 기간에 대 한 현미경의 autofocusing 기능을 활성화 합니다.
  7. Mitotic 세포 운명 평가, 수집 이미지에서 볼 때 각 선택한 필드 마다 10 분에 대 한 최대 96 h. Unperturbed에 유사 분열 정도 20-40 분, 10 분 간격으로 세포 분열 하는 경우를 식별 하려면 충분 한 샘플링을 제공 합니다 따라서 이미징 소프트웨어를 설정 합니다. 일시적인 이벤트 인 핵 파열을 식별 하려면 이미지 마다 5 분을 취득 합니다.
    참고: 이미지 수집 소프트웨어를 구동 하는 컴퓨터는 자동 업데이트, 화면 보호기, 및 에너지 절약 모드 비활성화, 이들은 종종 긴 실험을 통해 이미지 수집 방해 수 다는 것을 확인 하십시오.
  8. 이미징 실험을 시작 합니다. 정기적으로 이미지 수집 비디오의 과정을 통해 원활 하 게 실행 중인 확인 하십시오.

3. 비디오 분석 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 식별 하

  1. 군데 세포 이미징 실험의 과정을 통해 건강 한가 확인 합니다. 실용적이 고 적극적으로 확산 제어 셀 DMSO로 치료 해야 합니다.
    참고: 셀을 전시 하는 경우, 긴장의 표시 하지 비디오 quantitate 고 이미징 조건48를 최적화에 초점을 대신. 이미징 스트레스의 증상 blebbing/죽어가는 셀, 셀 첨부/확산에, 실패 하는 및 낮은 mitotic 색인 및 장기간된 유사 분열을 표시 하는 셀을 포함 합니다. 스트레스의 가능한 소스 변동 온도 또는 이미징 챔버 또는 phototoxicity48안으로 CO2 레벨에 포함합니다.
  2. 10 X 20 X 목표와 전체 필드 보기는 이미징 때 개별 셀의 수백 존재할 수 있습니다. 따라서, 정량 지원, 보기의 필드 사용할 수 있는 소프트웨어 도구를 사용 하 여 작은 사분면으로 나눕니다. 각 사분면 내에서 셀을 별도로 (단계 3.3.1–3.6.2에서와 같이) 점수.
  3. 비디오 분석, 위상 대조 및 형광 이미지를 사용 하 여 병합 된 보기에서 각 셀을 추적 합니다. 소프트웨어 분석 도구를 사용 하 여 병합 된 뷰를 만드는.
    1. 비디오의 시작 부분에서 시작, 단일 interphase 셀을 식별 하 고 세포 주기 단계 광학을 사용 하 여 진행률 추적. 단일 셀을 추적 하려면 관찰 셀 프레임을 눈으로 합니다. Interphase 셀 (평가 단계 대조 하 여)로 병합 된 그들의 형태학과 DNA 응축의 그들의 부족 (H2B GFP에 의해 평가)를 식별 (그림 1A).
  4. 셀 (를 사용 하 여 단계 대조 광학) 반올림의 관찰에 의해 유사 분열을 입력 하는 셀을 식별 및 염색체 응축 (H2B GFP를 사용 하 여) (그림 1A-C). 두 셀 반올림 및 염색체 응축 쉽게 눈으로 시각화 됩니다.
    1. 주석을 셀 유사 분열은 시간. 그것은 그것의 운명 (3.5 단계, 단계 3.6.1에서 유사 분열에서 세포 죽음 또는 단계 3.6.2 에서처럼 mitotic 미끄럼 anaphase)에 도달할 때까지 셀을 추적 계속.
  5. 제어 셀 효율적으로 그들의 염색체를 정렬 하 고 anaphase 1 h (그림 1D) 안에 입력 해야 합니다. 셀 2로 또는 poleward를 이동 염색체 H2B GFP (그림 1A)와 표시의 시각화를 통해 대 타를 시작으로 단계 대조 광학 여 anaphase를 시각화. 주석을 시간 때 셀 anaphase 겪 습.
  6. 대조적으로, 세포 paclitaxel 치료 몇 시간 (3-40 h) (그림 1B-D)에 대 한 압축 된 염색체를 가진 둥근 유지 됩니다.
    1. 세포의 죽음을 받 다 mitotically 체포 셀을 식별 합니다.
      참고: 유사 분열 동안에 죽는 세포는 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 시각, 셀으로 bleb, 축소, 또는 파열 (그림 1B). H2B GFP를 이미징 하는 경우 염색체 세포 죽음 동안 또한 조각화 됩니다.
    2. 셀 미끄럼을 받아야 하는 mitotically 체포 셀을 식별 합니다.
      참고: 셀 mitotic 미끄럼을 받 다 관찰 된다 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 그들은 interphase에 다시 밖으로 평평 하 고 염색체 anaphase (그림 1C)을 겪고 하지 않고 decondense. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀을 일으키 다 큰 tetraploid 셀 그는 종종 multinucleated (그림 1C).
  7. 원래 시야에서 세포를 추적 계속. 보기의 전체 필드를 추적 하는 일단 잘 동일한에서 인수 별도 필드의 보기를 이동 하 고 세포를 추적 계속.

4. 비디오 분석 셀 운명 Mitotic 미끄럼 다음 식별을

  1. 세포 운명 다음과 같은 mitotic 미끄럼 (3.6.2 단계에서 설명)를 평가 FUCCI 시스템을 표현 하는 RPE-1 셀을 사용 하 여. 단계 대조 이미징, 뿐만 아니라 그것은 빨간 형광 (G1 단계 지표) 및 녹색 형광 (S/G2/M의 지표) 이미지 획득 하는 데 필요한).
    1. FUCCI RPE-1 셀 3.7 통해 3.3 단계에서 설명한 대로 추적 합니다.
      1. FUCCI 시스템은 제대로 작동 하는지 확인, 해당 컨트롤을 유효성 검사를 적절 하 게 라이브 셀 이미징 데이터의 분석에서에서 빨간색과 녹색 형광 단백질의 대체 식 세포. 제어 셀 G1 에서 S 단계 세포 진행으로 interphase 동안 완전히 핵 녹색 형광을 전시에 완전히 핵 빨간색 형광을 전시에서 전환 해야 합니다. 세포는 유사 분열의 완성을 통해 녹색 형광을 전시 계속 해야 합니다. 유사 분열, 즉시 다음 셀 다시 한번 interphase 동안 완전히 빨간색 형광을 전시 한다.
        참고: 형광 흔적49를 사용 하 여 단일 셀의 FUCCI 시스템에서 RFP 및 GFP 형광 강도 계량 방법 존재이 종종 필요는 없습니다 형광 색상 변화는 강력 하 고 눈으로 볼 수 없습니다.
  2. 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 유사 분열에 체포 하는 셀을 식별 하 고 그들 mitotic 미끄럼을 받을 때까지 3.4 및 3.6.2에 설명 된 대로 추적 합니다. 셀 G1 단계 (그림 2A-C) 빨간색 형광에 유사 분열 동안 녹색 형광을 전시에서 슬립 유사 분열 그리고 interphase로 다시 변경 됩니다.
    1. 단계 대조 및 epifluorescent 이미징 사용 하 여 셀 (2D 그림) 그들의 세포 운명 평가 하는 눈으로 미 끄 러이 추적 합니다.
      1. 세포 주기를 다시 입력 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 빨강-녹색 변화 G1/S 전환 (그림 2A)를 나타내는 FUCCI 시스템을 사용 하 여 형광 식에 의해 식별 됩니다.
      2. G1 세포 주기 검거를 받아야 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 지속 되는 붉은 형광의 식으로 식별 된 > 24 h (그림 2B).
      3. Interphase에 셀을 식별 합니다. 이 세포는 파열/blebbing/축소 위상 대비 영상 (그림 2C)를 사용 하 여 셀에 의해 식별 됩니다.

5. 비디오 분석 핵 파열의 주파수를 식별 하

  1. RPE-1 셀 H2B GFP와 TDRFP NLS를 사용 하 여 평가 핵 파열. 위상 대비 영상, 뿐만 아니라 빨간색 형광 (TRITC)와 녹색 형광 (FITC) 이미지를 모두 획득. 파열을 시각화 이미지 마다 5 분을 취득 합니다.
    참고: 셀 라인 있는 TDRFP NLS 효율적으로 가져올 핵으로 최소한의 세포질 형광으로 생성에 중대 하다.
  2. 이미지 셀 3.4 통해 3.3 단계에서 설명한 대로. TDRFP-NLS 형광 신호 및 H2B GFP 공동 interphase 동안 지역화 해야 합니다. 유사 분열 (세포 단계 광학 및 염색체 응축 H2B GFP에 의해를 사용 하 여 반올림 하 여 시각)으로, 시 핵 봉투는 침착 하 고 TDRFP NLS 신호 세포질 (그림 3A) 될 것 이다. 유사 분열, 다음 핵은 딸 세포에 개혁 그리고 TDRFP NLS 신호 핵 될 것입니다.
  3. 라이브 셀 이미징에 의해 후속 interphase 동안 딸 세포를 추적 합니다. 주변의 세포질에 핵 지역화 TDRFP NLS의 일시적인 버스트를 관찰 하 여 핵 파열 이벤트를 식별 합니다. 분 이내에, 핵은 복구 되 고 TDRFP NLS 핵 (그림 3A)에 relocalized 것입니다.
    참고: 종종, 핵 DNA H2B GFP에 의해 시각 것입니다 볼 수 작은 bleb으로 파열 사이트 밖에 내 다.
  4. Interphase 동안 파열 이벤트를 받아야 하는 핵의 일부를 점수. 이 분수를 점수, 셀의 총 수는 파열 이벤트를 받아야 하는 셀의 개수를 추적 합니다.

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Representative Results

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, H2B GFP를 표현 하는 RPE-1 셀 안티 mitotic 또는 차량 제어 (DMSO)로 치료 되었고 라이브 셀 이미징으로 분석. 분석은 100% 제어 mitotic RPE-1 세포의 유사 분열 (그림 1A, 1d)를 입력 한 후 anaphase 22 분의 평균을 시작 밝혔다. 대조적으로, RPE-1 셀 paclitaxel 치료 몇 시간 (그림 1D) 지속 깊은 mitotic 체포 전시. 이미징 잔여 하는 동안이 mitotically 체포 셀의 48 %mitotic 세포 죽음 (그림 1B, 1E), 받았다 밝혀 52 %mitotic 미끄럼 (그림 1C, 1E)을 받았다.

평가 받았다 mitotic 미끄럼 RPE-1 셀의 운명, FUCCI 시스템을 표현 하는 RPE-1 셀 중 낮은 복용량 50 nM paclitaxel, 높은 복용량 5 µ M paclitaxel로 치료 했다 또는 차량 (DMSO)를 제어 하 고 장기 라이브 셀 이미징으로 분석. 데이터 공개는 50 nM paclitaxel와 치료 다음과 mitotic 미끄럼을 받았다 하는 RPE-1 셀, 22% 사망 이후 세포 주기 (그림 2C, 2D), 72% 유도 된 세포 주기 검거 (그림 2B, 2D), 그리고 5%만 다시 S 단계 (그림 2A, 2D)를 입력합니다. 대조적으로, mitotic 미끄럼, 35% 이후 세포 주기에서 사망을 받았다 높은 량 5 µ M paclitaxel 치료 RPE-1 셀의 65%는 세포 주기 검거를 유도 하 고 아무도 다시 S 단계 (그림 2D)를 입력 키를 누릅니다.

흥미롭게도, 낮은 복용량 paclitaxel 치료 RPE-1 셀 다음과 유사 분열에서에서 핵 파열을 촉진 합니다. Mitotic 완료 후 딸 세포 추적 되었고 반면 딸 세포 치료 10 nM paclitaxel의 ~ 23% 파열 ( 전시만 ~ 4%의 파열, RPE-1 (DMSO 처리) 딸 세포를 제어 공개 어떤 핵 파열 이벤트에 대 한 득점 그림 3A, 3B).

Figure 1
그림 1: 반대로 mitotic 치료에 Mitotic 세포 운명. 안정적으로 H2B GFP를 표현 하는 RPE-1 셀 DMSO 차량 제어 (A) 또는 5 µ M paclitaxel (B, C)로 치료 했다 고 mitotic 세포 운명 평가 하기 위해 저속 단계 대조 및 widefield epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. Interphase 셀 (왼쪽된 패널) 그들은 유사 분열 (중간 패널)를 입력 하 고 그들이 anaphase (A) 시작, mitotic 세포 죽음 (B), 수술 또는 interphase (C)로 다시 유사 분열에서 미 끄 러 때까지 추적 했다. 흰색 화살표는 추적된 셀을 나타냅니다. (D) 시간 을 제어 하는 세포 (DMSO 치료) 및 라이브 셀 이미징에 의해 quantitated 안티 mitotic 치료 세포 유사 분열에 보냈다 (n = 각 조건에 대 한 100 셀). (E) 세포의 분 율 (n = 100)는 anaphase, mitotic 세포 죽음, 또는 DMSO 치료 셀 또는 셀 5 µ M paclitaxel 치료에 mitotic 미끄럼을 받았다. 시간, h:min. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀의 운명. FUCCI 시스템을 안정적으로 표현 하는 RPE-1 셀 50 nM paclitaxel 또는 5 µ M paclitaxel로 치료 했다 고 quantitate mitotic 미끄럼 다음 셀 운명에 시간 경과 단계 대조 및 widefield 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 빨강-녹색 형광 변화에 의해 심판을 FUCCI 시스템 (A);에 셀 중 다시 세포 주기 입력으로 득점 했다 G1 단계에서 체포에 대 한 영구 빨간색 형광에 의해 심판 > 24 h (B); 또는 셀룰러 blebbing/파열 (C)에 의해 판단으로 후속 유사 분열 동안에 죽어. 흰색 화살표는 추적된 셀을 나타냅니다. (D) 세포의 분 율 (n = 100)는 각 운명을 겪었다. 오차 막대는 두 개의 독립적인 실험에서 평균에서 표준 편차를 나타냅니다. 시간, h:min. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: paclitaxel 치료 세포에서 핵 파열의 주파수. 안정적으로 TDRFP NLS와 H2B GFP를 표현 하는 RPE-1 셀 10 nM paclitaxel로 치료 했다 또는 차량 (DMSO)를 제어 하 고 시간 경과 단계 대조 및 widefield epifluorescence 현미경 검사 법 (A)를 사용 하 여 몇 군데. 유사 분열 (분열/Anaphase) 중 핵은 분해 하 고 TDRFP NLS 된다 세포질. 유사 분열, 다음 TDRFP NLS interphase 셀 (사전 파열)의 핵을 relocalizes. 핵 파열 이벤트 TDRFP-NLS 핵에서 interphase 셀 (파열), 세포질에 핵 복구 (후 파열)를 수행 하는 핵 TDRFP NLS의 relocalization 다음의 delocalization로 식별 됩니다. 흰색 화살표는 추적된 셀을 나타냅니다. (B) 세포의 분 율 (n > 조건 당 100) 핵 파열 paclitaxel 또는 차량 제어의 유사 분열을 다음 보여. 시간, h:min. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

장기 라이브 셀 이미징의 가장 중요 한 측면은 몇 군데 되 고 세포의 건강을 하도록 하 고 있다. 세포 온도, 습도, 및 CO2 레벨에 관한 이하의 조건 등 최소한의 외부 환경 스트레스에 노출 될 필수적 이다. 로 셀 동작50영향을 알려져 있다 스트레스 이미징 photodamage 형광 여기 조명에서 제한 하는 것이 중요 이기도 합니다. Photodamage 제한 하는 것은 여러 가지 방법으로 다른48자세한 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 충분히 충분히 밝은 형광 신호를 생성 하는 데 필요한 가장 짧은 노출 시간을 사용 하 여 효율적으로 추적 하는 세포, 따라서 제한 phototoxicity 최상 이다. 그러나, 세포는 모든 10-20 분 이상 노출 (하 픽셀 채도)는 일반적으로 한 번만 몇 군데 잘 용납 (비록이 각 fluorophore 및 셀 형식에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다). 이미지 셀 환경 및 이미징 스트레스에 민감한 때문에, 그것은 절대적 제어 세포는 항상 라이브 셀 이미징 실험에 포함 하 고 정상적인 확산을 확인 하려면 모니터링.

장기 라이브 셀 이미징에 한 가지 한계 온도 5% CO2 분위기, 습도 유지 하는 환경 챔버 또는 수도 있는 무대 상단 챔버 기존 현미경 장비 요구 한다 이다 적절 한 온도 분위기를 지원합니다. 흐르는 CO2 는 최적의 세포 CO2를 사용 하 여 최대 48 h에 대 한 이미지 또한 수 있습니다-독립 매체 경우 5% 환경 챔버 습도 CO2 는 사용할 수 없습니다. 그러나, 많은 세포 유형 같은 매체의 허용 하지 않습니다 그리고이 세포 성장 및 생존 능력을 측정 하 여 실험적으로 결정 되어야 합니다. 미네랄 오일 셀 overlaying 또한 중간 증발을 방지 하기 위해 사용할 수 있습니다.

이 방법에는 두 번째 주요 한계가입니다 수동으로 추적 셀 운명을 매우 힘들고 시간이 많이 소요. 그러나, 셀 추적 프로그램 사용할 수 있으며 이미지 분석51,,5253자동화에 최적화 될 수 있습니다. 이 방법으로 추가 제한 높은 운동 세포는 종종 시간의 연장된 기간을 추적 하기 어려운입니다. 이 중요 한 문제가 포즈, 잘 수행해 수 전체 하 고 이미지 보기의 한 큰 분야를 형성 하기 위하여 함께 물 렸 다. 많은 소프트웨어 프로그램은이 메서드를 지원합니다.

Autofluorescence이 프로토콜 해결 되어야 다른 제약 조건입니다. 페 놀 레드 무료 매체 라이브 셀 이미징 동안 배경 autofluorescence를 감소 시킨다. 그것은 또한 성장 매체, 리 보 플 라빈, pyridoxal, 흔히 두 비타민 형광 단백질의 photostability를 줄일 수 있습니다 입증 되었습니다. 따라서, 이러한 비타민 부족 매체 또한 사용할 수 있습니다 형광 이미징 동안 식량을 잡음에 신호를 강화 하. 플라스틱 바닥 요리 덜 비싼 하는 동안 적절 한 이미징 결과 제공할 수 있습니다, 그들은 또한 부정적인 신호 대 잡음 비율에 영향을 주는 autofluorescence의 큰 금액을 생산. 또한, 플라스틱 바닥 요리 많은 현미경의 자동 초점 기능을 중단 시킬 수 있는 두께에 큰 변화를 했습니다. 이 프로토콜에서 유리 바닥된 이미징 접시의 두께 현대 현미경 사용 하기 위해 이상적인 유리 0.17 m m, 이다.

마지막으로, 장기 영화 보기의 여러 분야를 포괄 하 고 여러 형광 채널 인수 생산 대규모 데이터 파일 (수십 기가바이트 테라 바이트 각도), 데이터 저장 및 백업에 대 한 문제를 포즈. 이 문제를 완화 하는 것이 좋습니다 모든 이미지에 대 한 취득 또는 사용 하 여 2 x 2 4 x 4 binning, 해상도 결과 손실을 제공 하는 것은 허용. 노출 시간 (H2B GFP 또는 FUCCI 시스템을 안정적으로 표현 하는 세포있어야 노출 500 밀리초 미만), 뿐만 아니라 제한 binning 하지만 또한 크게 데이터 파일의 크기를 감소 (범주화 된 2 x 2는 이미지는 1 / 4의 파일 크기는 범주화 되지 않은 이미지)입니다.

이러한 제한에도 불구 하 고 장기 라이브 셀 이미징 셀 운명을 매우 이질적인 때 특히 전체 인구에서 개별 셀 운명을 추적 하는 좋은 방법은 나타냅니다. 더 라이브 셀 형광 마커 및 센서 되, 라이브 셀 이미징 접근 시각화 하 고 세포 생물학의 몇 가지 추가적인 측면을 quantitate 확장 됩니다. 예를 들어 라이브 셀 센서 현재 DNA 손상 foci, p53 레벨, 세포 주기 위치 및 apoptosis26,54,55,56,,5758 quantitate 존재 . 따라서, 이미징 실험은 어떻게 그리고 왜 단일 셀을 변함없이 화학요법 에이전트에 응답을 지정 하는 기본 세포 속성을 용량을가지고.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

AFB, MAV와 NJG 라이언 Quinton 원고와 아드리안 Salic TDRFP NLS 구문에 대 한 의견 감사 하 고 싶습니다. AFB, MAV NIGMS 바이오 약리학 훈련 그랜트 5T32GM008541에 의해 재정 지원 됩니다. NJG은 Shamim Ashraf Dahod 유 방 암 연구 실험실의 일원 이다와 NIH 교부 금 GM117150 및 CA 154531, 카린 Grunebaum 재단, 스미스 가족 보너스 프로그램, Searle 학자 프로그램 그리고 흑색 종 연구에 의해 지원 됩니다. 얼라이언스입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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