अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव जीन समारोह का आकलन करने के लिए माउस अंडाणुओं का प्रयोग I

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Genetics

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Summary

के रूप में आनुवंशिक मानव रोग के साथ जुड़े वेरिएंट के लिए खुला हो शुरू हो, यह तेजी से करने के लिए सिस्टम के साथ जो तेजी से उन पहचान वेरिएंट के जैविक महत्व का मूल्यांकन विकसित महत्वपूर्ण होता जा रहा है । इस प्रोटोकॉल महिला अर्धसूत्रीविभाजन मैं माउस अंडाणुओं का उपयोग कर के दौरान मानव जीन समारोह के मूल्यांकन के लिए तरीकों का वर्णन ।

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Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

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Abstract

भ्रूण aneuploidy मानव में बांझपन का प्रमुख आनुवंशिक कारण है । इन घटनाओं के अधिकांश महिला अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान शुरू, और हालांकि सकारात्मक मातृ आयु के साथ संबंधित, अकेले उंर हमेशा एक aneuploid भ्रूण पैदा करने के जोखिम का पूर्वानुमान नहीं है । इसलिए, जीन वेरिएंट oogenesis के दौरान गलत गुणसूत्र अलगाव के लिए खाते में हो सकता है । यह देखते हुए कि मानव अंडाणुओं के लिए उपयोग अनुसंधान प्रयोजनों, परख की एक श्रृंखला के लिए सीमित है अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव जीन समारोह का अध्ययन मैं माउस अंडाणुओं का उपयोग कर विकसित किया गया । सबसे पहले, दूत आरएनए (mRNA) जीन और ब्याज की जीन संस्करण के दौर में microinjected मैं गिरफ्तार माउस अंडाणुओं हैं । अभिव्यक्ति के लिए समय की अनुमति के बाद, अंडाणुओं तुल्यकालिक meiotic परिपक्वता में जारी अर्धसूत्रीविभाजन मैं पूरा कर रहे हैं । इस तरह के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Gfp) के रूप में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के एक अनुक्रम के साथ mRNA टैगिंग द्वारा, मानव प्रोटीन के स्थानीयकरण phenotypic परिवर्तन के अलावा मूल्यांकन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, लाभ या समारोह की हानि प्रयोगात्मक शर्तों कि जीन उत्पाद को चुनौती meiotic त्रुटियों को ठीक स्थापित करके जांच की जा सकती है । हालांकि इस प्रणाली oogenesis के दौरान मानव प्रोटीन समारोह की जांच में लाभप्रद है, परिणामों की पर्याप्त व्याख्या दिया जाना चाहिए कि प्रोटीन अभिव्यक्ति अंतर्जात स्तर पर नहीं है और, जब तक के लिए नियंत्रित (यानी खटखटाया बाहर या नीचे), murine homologs भी सिस्टम में मौजूद हैं ।

Introduction

बांझपन एक शर्त है कि प्रजनन आयु 1के मानव आबादी का 10-15% को प्रभावित करता है, जिसमें से लगभग एक आधा चिकित्सा उपचार 2की तलाश है । हालांकि बांझपन के एटियलजि विविध है और कई मामलों में multifactorial, मनुष्यों में सबसे आम आनुवंशिक विषमता भ्रूण aneuploidy 3है । Aneuploidy को किसी कक्ष में गुणसूत्रों की सही संख्या के विचलन (या तो लाभ या हानि) के रूप में परिभाषित किया गया है । मानव भ्रूण में aneuploidy की घटना आम है और उन्नत मातृ आयु 4,5के साथ बढ़ जाती है । चार यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षण केवल chromosomally सामांय (euploid) गर्भाशय हस्तांतरण के लिए भ्रूण के चयन के लाभ पर प्रकाश डाला है क्योंकि इस रणनीति में वृद्धि आरोपण दरों में हुई, कम गर्भपात दर और एक छोटे समय के लिए गर्भावस्था को प्राप्त करने 6,7,8,9. इसलिए, मानव aneuploidy के एटियलजि को समझना सहायतापूर्ण प्रजनन में महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकते हैं ।

हालांकि पूर्व आरोपण aneuploidies के लिए आनुवंशिक परीक्षण बांझपन उपचार, कैसे aneuploidies उत्पत्ति अभी भी कमी है की एक पूरी तरह से समझ में लाभकारी है । यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि वहां meiotic aneuploidies का एक सकारात्मक संबंध है (gamete उत्पादन के दौरान उत्पंन) और मातृ आयु, तथापि, कुछ महिलाओं को भ्रूण aneuploidy दरों कि उनके दिए उंर के लिए मतलब दर से विचलित उपस्थित 4। इन मामलों का सुझाव है कि अकेले उंर हमेशा एक aneuploid भ्रूण पैदा करने के जोखिम के पूर्वानुमान नहीं है । अंय कारकों भ्रूण aneuploidy, जैसे जीन वेरिएंट के जोखिम को बढ़ाने में एक भूमिका निभा सकता है ।

oocyte अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान aneuploidy करने के लिए एक जीन संस्करण के संभावित योगदान की जांच का एक महत्वपूर्ण पहलू को तेजी से meiotic जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रणाली डिजाइन है । नैतिक बाधाओं और सीमित पहुंच के कारण, यह मानव अंडे का उपयोग कर इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए अव्यावहारिक है । इन मुद्दों माउस अंडाणुओं का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, और यहां परख की एक श्रृंखला के लिए अर्धसूत्रीविभाजन मैं वर्णन कर रहे है के दौरान मानव जीन समारोह का आकलन । microinjecting दूत आरएनए (mRNA) ब्याज के जीन संस्करण के लिए कोडिंग के द्वारा, माउस अंडे में मानव प्रोटीन का स्थानीयकरण visualized किया जा सकता है और अगर जंगली प्रकार के अस्थानिक अभिव्यक्ति और रूपांतरित मानव प्रोटीन परिणाम निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया किसी भी phenotypic परिवर्तन है कि aneuploidy के लिए नेतृत्व कर सकता है । इन phenotypes microtubules में वृद्धि है कि बहन kinetochore के लिए अनुचित और अर्धसूत्रीविभाजन मैं के metaphase पर गुणसूत्र संरेखण समर्थन अक्षमता को देते शामिल हैं । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल दोनों लाभ और समारोह के नुकसान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना के द्वारा आनुवंशिक वेरिएंट ऐसी धुरी निर्माण और गुणसूत्र संरेखण के रूप में oocyte अर्धसूत्रीविभाजन में महत्वपूर्ण घटनाओं को चुनौती देने के लिए 10.

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Protocol

1. आण्विक क्लोनिंग

  1. ब्याज की जीन और प्लाज्मिड इन विट्रो में प्रतिलेखन (pIVT) वेक्टर11के पूर्ण लंबाई कोडिंग अनुक्रम प्राप्त करें ।
    नोट: पूर्ण लंबाई सीडीएनए क्लोन व्यावसायिक रूप से विभिंन विक्रेताओं से उपलब्ध है या रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) के माध्यम से उत्पंन किया जा सकता है । राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना (NCBI) ऑनलाइन संसाधन के लिए केंद्र न्यूक्लियोटाइड से जीन के लिए प्रतिलिपि दृश्यों प्रदान करता है और दृश्य (EST) डेटाबेस टैग व्यक्त की है । प्रोटीन दृश्य और अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण में आसानी के लिए, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए फ्यूजन (Gfp) या किसी अंय उपयुक्त फ्लोरोसेंट टैग क्लोनिंग रणनीति में वांछित हो सकता है ।
  2. एक सत्यापित क्लोनिंग रणनीति का प्रयोग, pIVT के एकाधिक क्लोनिंग क्षेत्र में ब्याज की जीन की कोडिंग अनुक्रम डालें । आणविक क्लोनिंग और आवश्यक कदमों का विस्तृत विवरण पहले १२बताया गया है.
    नोट: यदि एक जीन-फ्यूजन उत्पाद को तैयार किया जाना है, सुनिश्चित करें कि क्लोनिंग उचित पढ़ने के फ्रेम में है ।
  3. अनुक्रम ग्लोबिन प्राइमरों का उपयोग कर सही जीन प्रविष्टि, उचित में फ्रेम फ्यूजन सुनिश्चित करने के लिए निर्माण, और है कि कोई पोलीमरेज़-प्रेरित बिंदु उत्परिवर्तनों बनाया गया था ।
    नोट: अगर सैंज डीएनए अनुक्रमण उपकरण उपलब्ध नहीं है, कई कंपनियों कम लागत डीएनए अनुक्रमण विकल्प प्रदान करते हैं ।
  4. Mutagenize डीएनए यदि उत्पादन एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) या सम्मिलन/विलोपन (INDELS) । डीएनए mutagenesis नीचे दिए गए चरणों 1.5-1.7 में वर्णित है । जंगली प्रकार के निर्माण के लिए, linearization 1.7 कदम के साथ आगे बढ़ें ।
  5. डिजाइन mutagenesis प्राइमरों और mutagenesis पीसीआर प्रतिक्रिया को पूरा करने के लिए निर्मित उत्परिवर्ती निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार निर्माण । पीसीआर-मध्यस्थता साइट-निर्देशित mutagenesis को पहले 13बताई गई है । इसके अतिरिक्त, कई कंपनियों साइट-निर्देशित mutagenesis किट जो प्रोटोकॉल शामिल है प्रदान करते हैं ।
  6. बैक्टीरियल होस्ट में mutagenized डीएनए रूपांतरण । प्लाज्मिड को अलग और शुद्ध करें ।
    नोट: कई कंपनियों किट है कि आसानी से अलग और प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध किया जा सकता है बनाते हैं । तदनुसार निर्माताओं प्रोटोकॉल का पालन करें । यदि एक ग्राम का उपयोग कर-नकारात्मक बैक्टीरियल तनाव जैसे ई. कोलाई, यह एक किट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है कि endotoxins निकालता है ।
  7. वांछित SNP या INDEL की शुरूआत की पुष्टि करने के लिए मानक सैंज डीएनए अनुक्रमण का उपयोग बैक्टीरियल transformants से पृथक डीएनए अनुक्रम ।
  8. Linearize अंतिम शुद्ध डीएनए के एकल प्रतिबंध एंजाइम पाचन का उपयोग कर उत्पादों ।
    नोट: pIVT वेक्टर Addgene 14पर प्लाज्मिड मानचित्र में सूचीबद्ध कई एकल-एंजाइम कटौती साइटों शामिल हैं ।
  9. सुनिश्चित करें कि उत्पाद agarose जेल ट्रो के माध्यम से रैखिक है । agarose जेल ट्रो के लिए कार्यप्रणाली को पहले 14निर्धारित किया गया है ।
    नोट: सभी शेष चरणों के लिए, उपयोग बैरियर (फिल्टर) प्लास्टिक युक्तियाँ और RNase मुक्त सामग्री स्थिर, उच्च गुणवत्ता आरएनए का उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए.
  10. एक मान्य डीएनए क्लीन-अप प्रोटोकॉल या किट का उपयोग कर पचता उत्पाद शुद्ध, और elute में 30 µ l RNase/DNase-मुक्त पानी.
    नोट: सिलिका मैट्रिक्स स्पिन कॉलम-आधारित किट उच्च गुणवत्ता, शुद्ध डीएनए के लिए सिफारिश कर रहे हैं । तदनुसार निर्माताओं प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  11. इन विट्रो में प्रतिलिखित डीएनए का उपयोग T7 पोलीमरेज़ निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
  12. शुद्ध और elute आरएनए के 30 µ l में RNase/DNase मुक्त पानी एक सिलिका मैट्रिक्स स्पिन कॉलम आधारित न्यूक्लिक एसिड शोधन किट निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद का उपयोग कर ।
  13. denaturing agarose जेल ट्रो का उपयोग formaldehyde अंतिम आरएनए उत्पाद आकार की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन करते हैं । चरण 1.13-1.22 14नीचे देखें । (चित्र 1) ।
  14. भंग होने तक 72 मिलीलीटर पानी में 1 ग्राम agarose को गर्म करके जेल तैयार करें, फिर 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें ।
  15. 0.4 m MOPS (पीएच 7.0), 0.1 m सोडियम एसीटेट, और 0.01 m EDTA जोड़कर 10x MOPS चल रहे बफ़र तैयार करें ।
  16. 10x MOPS चल बफर के 10 मिलीलीटर, और 37% formaldehyde (12.3 M) की 18 मिलीलीटर ठंडा agarose समाधान करने के लिए जोड़ें ।
  17. एक जेल बनाने कंटेनर में agarose समाधान घनघोर द्वारा जेल कास्ट । एक बहुत बड़ी कंघी का उपयोग करने के लिए समायोजित 10 µ एल जेल के बाद सेट किया गया है और स्पर्श करने के लिए फर्म है, धीरे कंघी हटा दें ।
  18. ट्रो टैंक में जेल इकट्ठा, और पर्याप्त जोड़ें 1x MOPS चल रहे बफर, सुनिश्चित करने के जेल पूरी तरह से कवर किया जाता है ।
  19. formaldehyde-युक्त लोडिंग डाई के 0.5 x मात्रा के लिए आरएनए के 1 µ जी जोड़कर आरएनए नमूना तैयार करें ।
  20. 10 µ g/एमएल की एकाग्रता में आरएनए समाधान के लिए ethidium ब्रोमाइड जोड़ें ।
  21. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रकृति आरएनए नमूना समाधान
  22. डाई का प्रयोग, 10 µ एल फिल्टर युक्तियां, लोड 5 µ एल के आणविक वजन मार्कर और 5 µ एल आरएनए का नमूना (एस) जेल और electrophorese के अलग कुओं में 5 वी/जब तक रंग में कम से दो-तिहाई जेल की लंबाई का पलायन हो गया है ।
  23. एक यूवी ट्रांस प्रकाशक पर जेल में आरएनए कल्पना । सुनिश्चित करें कि आरएनए आणविक भार मार्कर की तुलना में सही आकार है ।
  24. आरएनए की एकाग्रता और पवित्रता को मापने के लिए, एक यूवी-spectrophotometer पर बाँझ 10 µ एल फिल्टर सुझावों का उपयोग शुद्ध आरएनए के 1.2 µ l हस्तांतरण.
    ध्यान दें कि उच्च गुणवत्ता आरएनए A260/280 (1.8-2.2) और 260/230 (> 1.7) क्रमशः के अवशोषक अनुपात होना चाहिए ।
  25. 10 µ एल फिल्टर सुझावों का उपयोग करना, aliquot शेष पतित आरएनए में बाँझ 0.5 µ l केंद्रापसारक ट्यूबों (3-5 µ एल ट्यूब). पर स्टोर ट्यूबों-80 ° c जब तक microinjection के लिए तैयार ।
    नोट: एक अंतिम इंजेक्शन एकाग्रता के 500 एनजी/µ एल एक इष्टतम प्रारंभिक बिंदु है । यह microinjection पिपेट में आरएनए के चिपचिपाहट को कम करने के लिए microinjection से पहले RNase नि: शुल्क एच20 में आरएनए 1:2 पतला करने के लिए सिफारिश की है ।

2. Kinetochore-Microtubule लगाव परख

  1. microinjection के लिए बराबर के समूहों में अंडाणुओं फूट डालो ।
    नोट: Oocyte संग्रह, स्थानांतरण, microinjection, और meiotic परिपक्वता जौव में विवरण में पहले से बताया गया है 15
  2. Microinject एक समूह के साथ प्रयोगात्मक mRNA और अन्य समूह (ओं) के साथ WT नियंत्रण और पंजाबियों या Gfp mRNA.
    नोट: 500 एनजी/µ एल की सिफारिश की इंजेक्शन एकाग्रता 10के साथ शुरू करने के लिए है । एक picoinjector इंजेक्शन राशि को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 5-10 pL के एक इंजेक्शन की मात्रा 15की सिफारिश की है ।
  3. एक हाथ या मुंह का उपयोग कर pipetting उपकरण संचालित जहां गिलास पिपेट खोलने थोड़ा एक oocyte (150 µm) के व्यास से भी बड़ा है, अंडाणुओं के एक 100 µ एल ड्रॉप में milrinone-मुक्त संस्कृति मध्यम एक पेट्री भ्रूण गुणवत्ता खनिज तेल में शामिल पकवान में हस्तांतरण और 5% C0 में 37 ° c में 7 ज के लिए अंडाणुओं की मशीन2 अर्धसूत्रीविभाजन मैं (मैं से मुलाकात की metaphase को पर्याप्त परिपक्वता की अनुमति) 15
  4. गर्मी के बाद, ऊपर के रूप में एक ही पिपेट तंत्र का उपयोग कर, एक केंद्र में अंडाणुओं हस्तांतरण अच्छी तरह से अंग संस्कृति पूर्व के 700 µ एल युक्त पकवान-ठंडा ंयूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) केंद्र अच्छी तरह से और 500 µ एल एच में संग्रह मध्यम और बाहर की अंगूठी में20 7 मिनट के लिए बर्फ पर पकवान प्लेस ।
    नोट: यह पूर्व चिल मेम मीडिया और केंद्र अच्छी तरह से अंग संस्कृति व्यंजन के लिए सिफारिश की है-20 डिग्री सेल्सियस से कम 20 अंडाणुओं के उपचार के लिए पहले मिनट ।
  5. उंहें स्थानांतरित करके अंडाणुओं फिक्स एक स्पष्ट गिलास स्थान प्लेट का एक कुआं में 2% paraformaldehyde के 400 µ l युक्त 20 मिनट के लिए 1x पंजाब में कमरे के तापमान पर ।
  6. एक ही पिपेट तंत्र का प्रयोग, एक स्थान प्लेट पर एक और अच्छी तरह से 400 µ एल ब्लॉकिंग समाधान (पंजाब + 0.3% BSA + 0.01% के बीच-20 + 0.02% नण3) और immunostaining के लिए प्रक्रिया करने के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर में अंडाणुओं हस्तांतरण ।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर अंडाणुओं भंडारण के लिए, वाष्पीकरण को रोकने के लिए parafilm के साथ ग्लास स्पॉट प्लेट कवर ।
  7. एक ही पिपेट तंत्र का उपयोग करना, एक नई अच्छी तरह से एक हाजिर प्लेट पर अंडाणुओं स्थानांतरण 400 µ l permeabilization समाधान (पंजाबियों + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% नण3) और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन जल्दी से तीन के माध्यम से स्थानांतरण अंडाणुओं 400 µ एल के बूंदें समाधान अवरुद्ध किसी भी अवशिष्ट डिटर्जेंट हटाने के लिए ।
    नोट: एक 9 अच्छी तरह से स्पष्ट ग्लास स्पॉट प्लेट एक ही डिश पर कई उपचार के माध्यम से समूहों चलती के लिए अच्छी तरह से काम करता है (कदम 2.4-2.5) ।
  8. एक humidified कक्ष में शेष immunocytochemistry प्रक्रियाओं प्रदर्शन, कमरे के तापमान पर प्रकाश से सुरक्षित । एक मध्यम आकार प्लास्टिक कंटेनर नम कागज तौलिए से बोलेंगे और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर का उपयोग करें ।
  9. पिपेट तंत्र का प्रयोग, 30 µ एल के लिए अंडाणुओं हस्तांतरण एक 96 के ढक्कन पर अच्छी तरह से थाली और जगह 10 मिनट के लिए humidified कक्ष के भीतर अवरुद्ध ।
    नोट: ड्रॉप्स को प्लेट पर गोलाकार इंडेंट में रखा जाता है.
  10. centromeres और धुरी लेबल करने के लिए, पिपेट तंत्र का उपयोग करते हुए, अंडाणुओं हस्तांतरण करने के लिए 30 µ एल अवरुद्ध समाधान युक्त विरोधी centromeric प्रतिजन (ऐका, शिखा) (1:30) और विरोधी acetylated tubulin (1:1000
  11. 10 मिनट प्रत्येक के लिए अवरुद्ध समाधान के ३ ३० µ एल बूंदों के माध्यम से स्थानांतरित करके कुल्ला अंडाणुओं ।
  12. पिपेट तंत्र का प्रयोग, एक 30 µ एल के लिए स्थानांतरण अंडाणुओं ऊपर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मानार्थ युक्त समाधान की बूंद (विरोधी मानव आईजीजी 1:200, विरोधी माउस आईजीजी 1:200) और 1 एच के लिए मशीन ।
  13. चरण 2.11 में वर्णित के रूप में 30 µ l ब्लॉकिंग समाधान में 3, 10-ंयूनतम कुल्ला चरणों को दोहराएँ ।
  14. अंडाणुओं स्थानांतरण, पिपेट तंत्र का उपयोग, 3-5 µ एल बढ़ते DAPI युक्त मध्यम (5.9 µ g/µ एल) एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ।
  15. अंडाणुओं के कुचल को रोकने के लिए कवर पर्ची के कोनों पर पेट्रोलियम जेली की 4 छोटी बूंदों (एक पिन सिर के आकार) प्लेस ।
  16. धीरे से कवर पर्ची पेट्रोलियम-जेली की ओर स्लाइड पर नीचे जगह है ।
  17. सील coverslip किनारों स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ और 5 मिनट के लिए सूखी अनुमति देते हैं ।
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान, प्रकाश से संरक्षित, फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रसंस्करण तक.
    नोट: बढ़ते माध्यम के अपवर्तन सूचकांक को सुनिश्चित करना, और coverslip, उपयोग किए जा रहे सूक्ष्मदर्शी उद्देश्यों से मेल खाता है । अनुशंसित बढ़ते सामग्री पहले 15वर्णित किया गया है ।
  19. छवि एक फोकल माइक्रोस्कोप पर एक 40 63x उद्देश्य का उपयोग कर अंडाणुओं, z में छोटे कदम (≤ 1 µm) पर कब्जा विमान, काम कर रहे उद्देश्य के लिए अनुकूलित है, और छवि metaphase धुरी के पूरे क्षेत्र ।
    नोट: छवि के लिए सुनिश्चित करें कि सभी 3 विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर 2.11 कदम चैनल में इस्तेमाल किया । छवि 4 ≥ औसत और 3 के एक ज़ूम पर्याप्त संकल्प के लिए आदर्श होते हैं । एक 1 µm चरण आकार माउस अंडाणुओं में microtubules और kinetochores का स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है । छवि पर कब्जा करने के लिए प्रक्रिया माइक्रोस्कोप से माइक्रोस्कोप के लिए भिन्न होगा. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को कॉन्फ़िगर करने के लिए कैसे पर विशिष्ट चरणों के लिए निर्माताओं के लिए फोकल उपयोगकर्ता गाइड को देखें.
  20. kinetochore-microtubule अनुलग्नक स्थिति का उपयोग कर इमेजिंग सॉफ़्टवेयर निम्न चरणों 2.21-2.23 नीचे की पहचान करें ।
    नोट: निंन चरणों का वर्णन इस कार्यविधि का उपयोग कर छवि J (NIH) नि: शुल्क डाउनलोड करने योग्य सॉफ़्टवेयर, हालांकि, वैकल्पिक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर उपयोग किया जा सकता है । अनुलग्नक स्थिति प्रकारों को पहले 16 निर्धारित किया गया है ।
  21. छवि J उपकरण पट्टी में फ़ाइल खींचकर छवि खोलें ।
  22. खोला z-श्रृंखला में, सभी चैनलों को दिखाई (डीएनए, kinetochore, और धुरी) पर क्लिक करके "विलय चैनलों", "छवि" ड्रॉप-डाउन मेनू में उपलब्ध है, "रंग" उप टैब के अंतर्गत.
  23. छवि के तल पर टॉगल का उपयोग करना, प्रत्येक z-स्लाइस के माध्यम से ले जाएं और kinetochore microtubule अनुलग्नक निर्धारित करें । विस्तृत अनुलग्नक विवरण पहले बताया गया है 16

3. गुणसूत्र संरेखण चैलेंज परख

  1. के रूप में पिपेट उपकरण का प्रयोग 2.3 कदम में वर्णित है, milrinone की एक 100 µ एल ड्रॉप में अंडाणुओं हस्तांतरण मुक्त संस्कृति मध्यम तेल और गर्मी अंडाणुओं के लिए metaphase के अर्धसूत्रीविभाजन के लिए पर्याप्त परिपक्वता की अनुमति के लिए मैं (मैं) के रूप में पहले चरण में वर्णित 2.3 4 .
    नोट: Oocyte संग्रह, microinjection, और परिपक्वता कार्यविधियां पहले 15रेखांकित किए गए थे । नियंत्रण के लिए और आरएनए microinjection सांद्रता के लिए चरणों 2.1-2.2 में अनुलग्नक परख प्रोटोकॉल का संदर्भ लें ।
  2. एक ही पिपेट तंत्र का उपयोग करना, एक केंद्र के लिए अंडाणुओं स्थानांतरण-अच्छी तरह से अंग संस्कृति 700 µ एल संस्कृति युक्त मध्यम monastrol [100 µ m] में अच्छी तरह से और 400 µ एल एच20 आसपास के रिंग में और 2 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन से युक्त पकवान ।
  3. अंडाणुओं स्थानांतरित करके monastrol बाहर कुल्ला, ऊपर के रूप में पिपेट तंत्र का उपयोग कर, के माध्यम से 100 µ एल CZB संस्कृति माध्यम की तीन बूंदें, और फिर एक नए केंद्र के लिए अंडाणुओं हस्तांतरण-अच्छी तरह से अंग संस्कृति 700 µ एल संस्कृति युक्त पकवान + MG132 [5 µ m] केंद्र में 3 एच के लिए अंगूठी. बाहर की अंगूठी के लिए 400 µ एल एच20 जोड़ें ।
  4. उन्हें स्थानांतरित करके अंडाणुओं फिक्स, पिपेट तंत्र का उपयोग कर, एक अच्छी तरह से एक स्पष्ट गिलास स्थान प्लेट की एक कुआं में 400 µ l 2% paraformaldehyde के लिए 20 मिनट में कमरे के तापमान पर.
  5. निर्धारण के बाद, अंडाणुओं स्थानांतरण, पिपेट तंत्र का उपयोग करते हुए, एक स्पष्ट गिलास हाजिर प्लेट की एक नई अच्छी तरह से 400 µ एल से युक्त समाधान और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर immunostaining के लिए संसाधित जब तक ।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर अंडाणुओं भंडारण के लिए, वाष्पीकरण को रोकने के लिए parafilm के साथ ग्लास स्पॉट प्लेट कवर ।
  6. Permeabilize और लेबल अंडाणुओं के माध्यम से immunocytochemistry के रूप में कदम 2.6-2.16 में वर्णित है ।
  7. छवि अंडाणुओं एक फोकल माइक्रोस्कोप पर एक 40-63x उद्देश्य का उपयोग कर, z-विमान metaphase धुरी के पूरे क्षेत्र की छवि को यकीन है कि बनाने में < 1 µm कदम पर कब्जा ।
  8. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग गुणसूत्र संरेखण स्थिति खुली छवि फ़ाइलों की पहचान करने के लिए ।
    नोट: निंन चरणों का वर्णन इस कार्यविधि का उपयोग कर छवि J (NIH) नि: शुल्क डाउनलोड करने योग्य सॉफ़्टवेयर, हालांकि, वैकल्पिक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर उपयोग किया जा सकता है ।
  9. छवि जंमू नियंत्रण कक्ष में छवि खींचें ।
  10. खोला z-श्रृंखला में, बिंदु उपकरण का उपयोग करें (छवि जंमू नियंत्रण पट्टी पर बिंदु उपकरण आइकन पर क्लिक करके उपलब्ध है) के लिए उनके संबंधित जेड में प्रत्येक धुरी पोल के अंत में अंक अंकन के लिए धुरी पोल पर छवि में उपकरण रखकर और छवि पर क्लिक करके । कुंजीपटल पर आदेश + t दबाकर ब्याज के क्षेत्र (ROI) प्रबंधक में इन बिंदुओं को जोड़ें.
  11. प्रत्येक चरण 3.10 में स्थापित रॉय प्रबंधक में विशिष्ट बिंदु पर प्रकाश डाला और माप बटन पर क्लिक करके निर्धारित पदों में से प्रत्येक के लिए विशिष्ट निर्देशांक निर्धारित करें । यह प्रत्येक बिंदु के लिए एक परिणाम तालिका युक्त एक्स और वाई निर्देशांक प्रदान करेगा. ये क्रमशः x1, Y1, और x1, Y2, अंक होगा ।
  12. अगला, सही Z निर्देशांक निर्धारित करें । यह z-स्टैक जिसमें धुरी ध्रुव (यानी की पहचान की गई थी में विशिष्ट z-स्लाइस की स्लाइस संख्या गुणा करके किया जाता है 6 के #2 स्लाइस) है कि प्रत्येक व्यक्ति बिंदु में ढेर मोटाई (यानी 1 µm) द्वारा (उदाहरण: स्लाइस 2 x 1 µm = 2) । इनमें क्रमशः Z1 और Z2 अंक होंगे.
  13. धुरी Pythagorean प्रमेय समीकरण का उपयोग कर लंबाई का निर्धारण (एक2 + बी2 = c2) पहले से परिभाषित x, y का उपयोग कर, और जेड कदम से 3.11-3.13 निर्देशांक । प्रत्येक धुरी के लिए अंतिम लंबाई के बराबर है:
    √ ((X1-X2)2+ (Y1-Y2)2+ (Z1-Z2)2)
  14. धुरी midzone निर्धारित करते हैं । यह एक आधा धुरी की लंबाई के रूप में गणना की है । छवि जंमू में लाइन उपकरण का प्रयोग, छवि जंमू उपकरण पट्टी में लाइन आइकन पर क्लिक करके, एक लाइन है कि धुरी midzone एक धुरी ध्रुव से है आकर्षित । लंबाई छवि J उपकरण पट्टी पर प्रदर्शित किया जाएगा ।
  15. लाइन माप उपकरण का उपयोग midzone धुरी से गुणसूत्र दूरी का आकलन करके गुणसूत्र संरेखण स्थिति का निर्धारण । छवि जंमू उपकरण पट्टी में लाइन आइकन पर क्लिक करके उपलब्ध लाइन उपकरण का उपयोग करना, धुरी midzone से गुणसूत्र के लिए एक लाइन आकर्षित । लंबाई छवि J उपकरण पट्टी पर प्रदर्शित किया जाएगा । इस धुरी midzone से 4 µm से अधिक गुणसूत्रों 18डिग्रियों माना जाता है ।

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Representative Results

के बाद इन विट्रो प्रतिलेखन उच्च गुणवत्ता आरएनए एक A260/A280 अनुपात (1.8-2.2) और एक A260/A230 अनुपात 1.7 ≥ जब एक spectrophotometer का उपयोग कर मापा जाएगा । चित्रा 1 में चित्र ट्रो के बाद एक denaturing agarose जेल पर इन विट्रोउत्पादित आरएनए के प्रवास से पता चलता है । एक बैंड है कि पैटर्न में लिप्त है या एक नमूना है कि एकाधिक आकार बैंड है संक्रमण या नमूने के क्षरण का संकेत कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, एकाधिक बैंड संकेत हो सकता है कि mRNA पूरी तरह से विकृत नहीं है, या शुरू प्लाज्मिड पूरी तरह से रैखिक नहीं था । mRNA क्योंकि पाली-adenylated pIVT, जो mRNA के विट्रो मेंस्थिर अभिव्यक्ति की अनुमति देता में निर्मित पूंछ की भविष्यवाणी की तुलना में बड़ा चला जाएगा । microinjection के बाद यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के माध्यम से वर्दी इंजेक्शन की मात्रा और अभिव्यक्ति के स्तर को सुनिश्चित करने की सिफारिश की है । चित्रा 2 में चित्र चरण मैं-गिरफ्तार अंडाणुओं समान रूप से Gfpके साथ इंजेक्शन से पता चलता है । लगातार microinjection तकनीक इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, जैसे छवि जंमू, के लिए अभिव्यक्ति की एकरूपता और तकनीक के स्वामित्व सुनिश्चित करने के स्तर को मांय किया जा सकता है । ध्यान दें कि उपसेलुलर स्थानीयकरण जानकारी प्राप्त किया जा सकता है, जबकि दोनों परख के लिए इमेजिंग कर रही है । सभी microinjection प्रयोगों के लिए एक जीन संस्करण के प्रभाव का आकलन, जंगली प्रकार जीन अंडाणुओं का एक सबसेट में इंजेक्शन के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करना चाहिए । यह एक माउस oocyte में मानव जीन के संभावित व्यक्ती phenotypes के लिए एक को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है । पंजाबियों, या fluorophore के लिए Gfp -लेबल constructs, भी अंडाणुओं के एक उपसमूह में इंजेक्शन के लिए microinjection प्रेरित phenotypes के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए । एक फ्लोरोसेंट टैग के बिना निर्माण के लिए, Gfp mRNA को पर्याप्त microinjection सुनिश्चित करने के लिए सह-इंजेक्ट किया जा सकता है । यदि सह इंजेक्शन दो या अधिक निर्माण एक साथ mRNA एकाग्रता बढ़ाने के लिए सुनिश्चित हो सकता है कि इस तरह के अंतिम समाधान शामिल है 500 एनजी/µ प्रत्येक mRNA के एल ।

शीत-स्थिर microtubule परख microtubules करने के लिए kinetochores की कुर्की की स्थिति का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है । चित्रा 3 एक z-एक metaphase मैं oocyte की एक फोकल माइक्रोस्कोप छवि के प्रक्षेपण है । यह oocyte शीत मीडिया उपचार के अधीन किया गया था depolymerize सभी microtubules कि kinetochores से जुड़ा नहीं था । अंडाणुओं कि एक अपर्याप्त समय के लिए इलाज किया गया है microtubule गुणसूत्रों से जुड़ी नहीं फाइबर शामिल होंगे (बहुत अधिक फाइबर में भी कम परिणाम) या कमी सब एक साथ (कोई धुरी संरचना में भी लंबे परिणाम) फाइबर और यह अनुशंसित है कि इन अंडाणुओं विश्लेषण में उपयोग नहीं किया जा सकता है । अर्धसूत्रीविभाजन के metaphase पर मैं यह अंडाणुओं के लिए आम है संलग्न या बाद में संलग्न kinetochores, इसलिए यह अनुशंसित है कि किसी भी लगाव अध्ययन में एक नियंत्रण समूह का इस्तेमाल किया जाएगा । औसत पर, वंय प्रकार अंडाणुओं एमआई में kinetochores के 5-10% शामिल अभी तक नहीं होगा छुरा 19से जुड़ी होगी । यह आवश्यक है कि सभी अंडाणुओं kinetochore-microtubule लगाव की स्थिति के विश्लेषण के लिए एक ही मंच पर हों । यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के समान समय तराजू के साथ परिपक्व यह सेल चक्र कैनेटीक्स का आकलन करने की सिफारिश है । इस परख, नियंत्रण और प्रयोगात्मक अंडाणुओं का एक सबसेट प्रदर्शन परिपक्व हो जाना चाहिए और समय चूक microcopy के तहत रहते visualized । milrinone के उपयोग की अनुमति देता है अंडाणुओं अर्धसूत्रीविभाजन मैं, इस तरह की है कि मीडिया में रिलीज के साथ milrinone कमी के दौर में सिंक्रनाइज़ हो एक ही समय में अर्धसूत्रीविभाजन की बहाली की अनुमति 20। दोनों नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों से अंडाणुओं एक ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना चाहिए, अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के metaphase तक पहुंचने का संकेत (द्वितीय मुलाकात), इसी तरह के समय अंक में । यदि लाइव सेल माइक्रोस्कोपी उपलब्ध नहीं है, अंडाणुओं मैं (7 एच) से मुलाकात करने के लिए परिपक्व हो सकता है और द्वितीय (16 एच) से मुलाकात की, तय, और डीएनए और microtubules के रूप में पहले वर्णित का पता लगाने के लिए दाग । मैं से मुलाकात की और द्वितीय एक बैरल के आकार से मुलाकात की, द्विध्रुवी धुरी दिखाई जानी चाहिए । नियंत्रण अंडाणुओं में, गुणसूत्रों metaphase थाली में गठबंधन किया जाना चाहिए । गुणसूत्रों का संरेखण प्रयोगात्मक समूहों में अलग प्रकार के आधार पर प्रभावित करता है, तथापि, गुणसूत्रों गाढ़ा और केंद्र धुरी पर स्थित गुणसूत्रों के बहुमत के साथ microtubules संलग्न किया जाना चाहिए । अंडाणुओं की एक समान संख्या नियंत्रण और प्रायोगिक समूहों में अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय पर पहुंच जाना चाहिए था । अनुलग्नक स्थिति निर्धारित करने में कठिनाइयों को कम करने के लिए यह अनुशंसित है इमेजिंग अंडाणुओं z-विमान में छोटे चरणों का उपयोग कर, विशिष्ट कार्य उद्देश्य के लिए अनुकूलित । विश्लेषण में शामिल होगा z-स्लाइस व्यक्तिगत रूप से देखने और विलय सेटिंग्स में जो पोल से जुड़ी microtubules निर्गत निर्धारित करने के लिए । चित्र बी असामान्य kinetochore-microtubule अनुलग्नकों के उदाहरण दिखाता है । दिखाया एक bivalent जिसमें केवल एक बहन kinetochore जोड़ी एक धुरी microtubule से जुड़ा हुआ है, एक नहीं लगाव के रूप में परिभाषित किया गया है । अगले, एक syntelic लगाव दिखाया गया है जिसमें दोनों बहन kinetochore जोड़े एक ही धुरी ध्रुव से जुड़ी हैं. अंत में, एक merotelic लगाव दिखाया गया है जिसमें एक बहन kinetochore दोनों धुरी डंडे से जुड़ी हुई है जबकि जोड़ी की दूसरी बहन kinetochore एक धुरी ध्रुव से जुड़ी हुई है.

चित्रा 4 में छवियां प्रगतिशील उंमीद डीएनए और धुरी विंयास गुणसूत्र संरेखण चुनौती परख के कदम के माध्यम से एक चाल के रूप में वर्णन । इस परख में यह महत्वपूर्ण है कि विभिंन प्रयोगात्मक समूहों अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से इसी तरह कैनेटीक्स के साथ प्रगति । के रूप में वर्णित पहले यह सेल चक्र कैनेटीक्स विश्लेषण चुनौती परख आयोजित करने से पहले पूरा करने की सिफारिश है । इस परख में, अंडाणुओं के लिए क्षमता को सफलतापूर्वक सही असामांय kinetochore-microtubule संलग्नक का आकलन किया है । इस परीक्षण के लिए, अंडाणुओं पहले से मुलाकात के लिए मैं kinetochore-microtubule संलग्नक की अनुमति के लिए स्थापित किया जा परिपक्व हो रहे हैं । अगले, अंडाणुओं monastrol में मशीन हैं, और Kinesin 5 (EG5) अवरोध करनेवाला, कि एक monopolar धुरी में द्विध्रुवी धुरी गिर 21। एक monopolar धुरी की पीढ़ी 100% गलत microtubule-kinetochore संलग्नक लाती है । monastrol अवरोधक तो बाहर धोया करने के लिए वसूली की अनुमति है । वसूली अवधि के दौरान अंडाणुओं एक द्विध्रुवी धुरी पुनर्जंम और microtubule संलग्नक सही करने का प्रयास । proteasome अवरोध करनेवाला MG132 के अलावा anaphase शुरुआत रोकता है. एक नियंत्रण के रूप में, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह से अंडाणुओं के एक छोटे सबसेट प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण में तय किया जा सकता है (मैं, इलाज monastrol, पोस्ट वसूली) सुनिश्चित करने के लिए सभी समूहों के उपचार के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं, और एक ही हद तक । Metaphase मैं अंडाणुओं Metaphase प्लेट में गठबंधन गुणसूत्रों के साथ एक बैरल के आकार का द्विध्रुवी धुरी शामिल होना चाहिए । monastrol के साथ इलाज अंडाणुओं एक ध्रुव के चारों ओर उन्मुख गुणसूत्रों के साथ एक monopolar धुरी शामिल होना चाहिए । बरामद अंडाणुओं एक बार फिर एक बैरल के आकार का द्विध्रुवी धुरी शामिल होना चाहिए । गुणसूत्र संरेखण किसी भी गुणसूत्रों के रूप में परिभाषित किया गया है धुरी midzone से 4 माइक्रोन से अधिक 22। यह दाग अंडाणुओं को डीएनए का पता लगाने और kinetochores अगर दोनों kinetochores इस केंद्रीय क्षेत्र के बाहर है के रूप में यह केवल डीएनए का पता लगाने का उपयोग कर निर्धारित मुश्किल हो सकता है स्थापित करने के लिए उपयोगी है ।

Figure 1
चित्र 1. आरएनए के Denaturingagarose जेल ट्रो. आरएनए गुणवत्ता और आकार एक denaturing agarose जेल पर ट्रो द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । एक denaturing जेल माध्यमिक संरचना गठन को रोकने के लिए सिफारिश की है । लेन 1 एक आरएनए आणविक वजन मार्कर शामिल हैं । लेन 2 एक आरएनए नमूना है । ध्यान दें कि शाही सेना में निर्मित polyA पूंछ के कारण गणना से बड़ा चलेगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. मान्य oocyte microinjection. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को सफल oocyte microinjection और अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दौर मैं-गिरफ्तार अंडाणुओं microinjected के साथ Gfp के निर्माण के रातोंरात अभिव्यक्ति के बाद दिखाए जाते हैं । इस चित्र GFP प्रकाश घन के साथ सुसज्जित Invitrogen EVOS FL ऑटो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । स्केल बार 100 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. kinetochore-microtubule अनुलग्नकों का आकलन करना. () एक प्रतिनिधि z-प्रक्षेपण के ठंडे-स्वास्थ्यकर्मी से मिले I oocyte. धुरी (हरा), kinetochores (लाल), और डीएनए (नीला) दिखाया गया है । बॉक्स ऑप्टिकल ज़ूम के क्षेत्र को इंगित करता है । ऐरोहेड एक एकल bivalent के microtubules करने के लिए kinetochores के अनुलग्नकों पर अंत निरूपित । स्केल बार धुरी, kinetochore, डीएनए, और विलय चैनलों के लिए 10 µm है । ऑप्टिकल ज़ूम के लिए स्केल बार 5 µm है । (B) माउस अंडाणुओं में असामांय kinetochore-microtubule अनुलग्नक प्रकारों के उदाहरण । तीर kinetochore-microtubule अनुलग्नक साइट्स इंगित करता है । स्केल बार 5 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. गुणसूत्र संरेखण चुनौती परख । प्रत्येक चरण में अंडाणुओं के प्रतिनिधि z-अनुमानों के साथ प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट । अंडाणुओं पहले अर्धसूत्रीविभाजन मैं (मैं) के metaphase के लिए परिपक्व हो रहे हैं, तो एक नया 2 एच के लिए monastrol युक्त पकवान को हस्तांतरित करने monopolar धुरी गठन प्रेरित । अगले अंडाणुओं के लिए परिपक्वता मध्यम एक proteasome अवरोध करनेवाला (MG132) के साथ पूरक में ठीक करने की अनुमति दी जाती है anaphase शुरुआत को रोकने के लिए 3 एच । एक बार बरामद अंडाणुओं तय कर रहे हैं, धुरी के लिए लेबल (हरा), kinetochores (लाल), और डीएनए (नीला), और फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवि को संरेखण स्थिति निर्धारित करते हैं । लाइनों धुरी (40 µm) और धुरी midzone (20 µm) Pythagorean प्रमेय समीकरण का उपयोग निर्धारित की लंबाई से संकेत मिलता है । तीर प्रत्येक पोल पर बिंदु उपकरण की स्थिति का संकेत है । कोई भी kinetochores > 4 µm से धुरी midzone पर विचार किया जाता है । तारांकन (midzone से 5.6 µm) से अनसंरेखित गुणसूत्र इंगित करता है । स्केल बार 10 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

रोग के साथ जुड़े मानव आनुवंशिक वेरिएंट की तेजी से और बढ़ती पहचान की वजह से, यह आवश्यक है कि प्रणालियों उनके जैविक महत्व का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित कर रहे हैं । मानव अर्धसूत्रीविभाजन में प्रोटीन समारोह को समझना विशेष चुनौतियों बन गया है क्योंकि मानव अंडाणुओं बहुमूल्य है और दुर्लभ और मानव शुक्राणु आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदाई नहीं हैं । माउस अंडाणुओं एक स्तनधारी मॉडल मानव meiotic जीन समारोह 10,23के मूल्यांकन के लिए मूल्यवान प्रणाली है । यह मॉडल मानव अंडे का उपयोग कर के अव्यावहारिकता दरकिनार जबकि कम लागत, manipulable अंडाणुओं है कि मानव रोगाणु कोशिकाओं के समान अर्धसूत्रीविभाजन गुजरना है, जबकि समझने के लिए उपयोगी जा रहा है कि कैसे आनुवंशिक वेरिएंट महिला प्रभाव हो सकता है की एक आसानी से उपलब्ध स्रोत प्रदान प्रजनन.

क्योंकि इन तरीकों microinjection के माध्यम से माउस अंडाणुओं में मानव प्रोटीन की अभिव्यक्ति अस्थानिक रोजगार, यह पहले नियंत्रण की एकाग्रता स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जंगली प्रकार आरएनए कि meiotic परिपक्वता को बदल नहीं करता है. यह अनुशंसा की जाती है कि meiotic परिपक्वता कैनेटीक्स मॉनिटर कर रहे हैं (परमाणु लिफाफा टूट, ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना) नियंत्रण अंडाणुओं में आधारभूत मापदंडों की स्थापना, और धुरी और गुणसूत्र आकृति विज्ञान का आकलन. इसके अलावा, वर्दी microinjection मात्रा सुनिश्चित करने समूहों की तुलना के लिए महत्वपूर्ण है । ब्याज की जीन पर एक फ्लोरोसेंट टैग सहित इस तकनीकी चुनौती को सरल कर सकते हैं । माहिर oocyte microinjection के लिए तकनीक पहले प्रदर्शन किया गया है 15। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन अंडाणुओं के दृश्य या पश्चिमी दाग के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण भी सुसंगत इंजेक्शन सांद्रता की पुष्टि के लिए मूल्यवान उपकरण हैं ।

क्योंकि गुणसूत्र अलगाव में स्तनधारी अंडाणुओं में त्रुटियों भ्रूण aneuploidy और गर्भावस्था के नुकसान का एक प्रमुख कारण है5, kinetochore-microtubule संलग्नक के विश्लेषण का मूल्यांकन है कि ब्याज की एक जीन को प्रभावित करता है के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान गुणसूत्र अलगाव (यानी अनुचित संलग्नक गलत अलगाव का कारण होगा) । एक 10 मिनट ठंडा मीडिया के लिए जोखिम depolymerize microtubules कि एक kinetochore-microtubule लगाव नहीं किया है, फोकल माइक्रोस्कोपी 24के माध्यम से स्थिर संलग्नक के दृश्य की अनुमति के लिए पर्याप्त है । इस परख के लिए, यह नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है पर ठंडा अंडाणुओं के रूप में यह स्थिर microtubules के depolymerization को बढ़ावा मिलेगा । इसके अलावा, धुंधला प्रक्रियाओं का अनुकूलन kinetochore और microtubule संरचनाओं के दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है । विश्लेषण के लिए पर्याप्त छवि संकल्प सुनिश्चित करने के लिए, एक 40x-63x उद्देश्य का उपयोग कर z-विमान में छोटे कदम (≤ 1 माइक्रोन) पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए, और सभी संलग्नक सुनिश्चित करने के लिए पूरे धुरी संरचना के माध्यम से छवियों को प्राप्त करने के लिए दिखाई दे रहे हैं । ध्यान दें कि यह अर्धसूत्रीविभाजन मैं 25के prometaphase के दौरान unattached kinetochores है आम है ।

गुणसूत्र संरेखण चैलेंज परख लाभ या हानि के मूल्यांकन समारोह वेरिएंट के लिए उपयोगी है । लाभ के समारोह वेरिएंट का आकलन करने के लिए मुश्किल हो सकता है क्योंकि युवा महिलाओं से माउस अंडाणुओं aneuploidy के कम स्तर है । यह परख एक स्थिति है जिसमें oocyte सही चाहिए प्रयोग गलत kinetochore-microtubule संलग्नक को पैदा करने से इस बाधा पर काबू । एक समय बिंदु स्थापित करने में जो नियंत्रण अंडाणुओं के बाद 1-2 डिग्रियों वाले गुणसूत्र होते हैं, यह निर्धारित करने के लिए एक quantifiable परिदृश्य प्रदान करता है कि क्या उत्परिवर्ती वृद्धि संरेखण क्षमता प्रदान करता है (यानी बेहतर संरेखण क्षमताएं रिने euploidy) । गुणसूत्र के ठहराव के लिए, एक पहले से स्थापित प्रोटोकॉल है जिसमें गुणसूत्रों धुरी midzone से 4 से अधिक माइक्रोन के रूप में की विशेषता है unडिग्रियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 18

हानि-समारोह वेरिएंट का अध्ययन करने के लिए, अतिरिक्त प्रायोगिक शर्तों के अध्ययन प्रणाली के भीतर अंतर्जात homolog की वजह से आवश्यक हैं । एक तरह से इस मुद्दे को कम करने का उपयोग करें या ब्याज के संस्करण के एक नॉकआउट माउस मॉडल उत्पंन है । कुरकुरे/Cas9 प्रणाली के आगमन के लिए एक त्वरित तरीका ऐसी नॉकआउट 26उत्पंन प्रदान कर सकता है । वैकल्पिक रूप से, यदि एक पीटा मॉडल एक विकल्प नहीं है, ऐसे सह के रूप में शास्त्रीय पछाड़ना तकनीक-antisense morpholino oligonucleotides या छोटे हस्तक्षेप RNAs इंजेक्शन हो सकता है कार्यरत हैं । हालांकि, अनुक्रम डिजाइन करने के लिए ध्यान अध्ययन के तहत microinjected संस्करण के साथ किसी भी संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, morpholino oligonucleotide को बाइंड करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है 5 ' unअनुवादित क्षेत्र (5 ' UTR) माउस जीन है कि मानव mRNA microinjection के माध्यम से पेश संस्करण में शामिल नहीं है । यदि छोटे हस्तक्षेप RNAs एक का उपयोग कर एक गैर मुताबिक़ अनुक्रम क्षेत्र या मानव जीन है कि लक्ष्यीकरण से बचने होगा में मूक अंक उत्परिवर्तनों परिचय लक्ष्य सकता है । हालांकि, अंतर्जात प्रोटीन कॉपी अभी भी संस्करण की अभिव्यक्ति पर मौजूद होने के रूप में कई वेरिएंट मानव जीनोम में heterozygous राज्य में पाए जाते है जानकारीपूर्ण जा सकता है ।

अंत में, हालांकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है, गुणसूत्र aneuploidy मूल्यांकन आसानी से मिले द्वितीय अंडे में मानव संस्करण विश्लेषण के लिए पाइपलाइन में अंतिम परख के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है । सीटू गुणसूत्र प्रसार प्रोटोकॉल में इस का एक विस्तृत वर्णन पहले 15बताया गया है । संक्षेप में, microinjected अंडाणुओं इन विट्रो में परिपक्व होते है जब तक वे मिले द्वितीय चरण तक पहुंचने, एक meiotic धुरी depolymerizing एजेंट निर्धारण से पहले के साथ उपचार के बाद । Kinetochore और गुणसूत्र धुंधला के रूप में यहां वर्णित गुणसूत्र सामग्री के आकलन के लिए अनुमति देते हैं ।

जबकि माउस अंडाणुओं महिला अर्धसूत्रीविभाजन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण उपलब्ध कराने के मॉडल के लिए कुछ सीमाएं मौजूद हैं । प्रोटीन के इजहार meiotic परिपक्वता perturb कर सकते है और इसलिए एक आरएनए एकाग्रता मौजूद नहीं है कि एक phenotype प्रेरित नहीं हो सकता है । इसके अलावा, अंतर्जात माउस homolog exogenous मानव प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । पीटा माउस मॉडल की पीढ़ी इस समस्या का समाधान प्रदान करता है; हालांकि, यह सभी परिस्थितियों में संभव नहीं हो सकता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सह इंजेक्शन RNAi या morpholino oligonucleotides exogenous आरएनए और प्रोटीन को लक्षित नहीं करने के लिए डिज़ाइन द्वारा माउस प्रोटीन चूस करने के लिए किया जाएगा । अंत में, यह ध्यान रखें कि कई प्रोटीन मानव और माउस के बीच मुताबिक़ रहे हैं, महत्वपूर्ण है, मतभेद मौजूद हो सकता है, स्थानीयकरण और समारोह में मतभेद है कि पार प्रजातियों के विश्लेषण के इस प्रकार बाधा सकता है अग्रणी । के रूप में आनुवंशिक हेरफेर उपकरण जैसे Cas9-जीनोम संपादन27 सस्ता और अधिक आम-जगह हो, इस प्रोटोकॉल में दस्तक बनाने में विकसित सकता है, बजाय microinjection पर भरोसा की मानवीय माउस लाइनों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकी प्रजनन चिकित्सा के लिए सोसायटी से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और चार्ल्स और Johanna बश मेमोरियल फंड से Rutgers में, कृष्णसिंह A.L.N. को ंयू जर्सी के राज्य विश्वविद्यालय N.I.H. (F31 HD0989597) से एक अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

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References

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