Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

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Biology

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Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

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Abstract

Laser captura microdissection (LCM) tem permitido a análise da expressão de genes de células únicas e enriquecido populações de células em cortes de tecido. LCM é uma ótima ferramenta para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes a diferenciação celular e o desenvolvimento e a progressão de várias doenças, incluindo o glaucoma. Glaucoma, que compreende uma família de neuropatia óptica progressiva, é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo. Mudanças estruturais e danos dentro da malha trabecular (TM) podem resultar em aumento da pressão intra-ocular (Pio), que é um importante fator de risco para o desenvolvimento de glaucoma. No entanto, os mecanismos moleculares precisos envolvidos são ainda mal compreendidos. A capacidade de realizar análise de expressão do gene será crucial na obtenção de mais insights sobre a função dessas células e seu papel na regulação do desenvolvimento IOP e glaucoma. Para conseguir isso, um método reprodutível para isolar altamente enriquecido TM de seções congeladas do olhos de rato e um método para análise de expressão do gene a jusante, tais como RT-qPCR e RNA-Seq é necessária. O método descrito neste documento é desenvolvido para isolar altamente pura TM de olhos de rato para a jusante do PCR digital e análise de microarray. Além disso, esta técnica pode ser facilmente adaptada para o isolamento de outras células oculares altamente enriquecidas e compartimentos de célula que tem sido difícil isolar-se dos olhos de rato. A combinação da análise de LCM e RNA pode contribuir para uma compreensão mais abrangente dos eventos celulares subjacentes glaucoma.

Introduction

Glaucoma é um grupo de doenças caracterizadas por neuropatia óptica e retinopatia que aprimorem a cegueira irreversível1,2. Estima-se que por 2020 over 70 milhões de pessoas no mundo inteiro estaremos vivendo com alguma forma de doença3,4,5,6,7. Glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), o tipo mais prevalente de glaucoma, é caracterizada por uma diminuição no escoamento do humor aquoso (AH) levando ao aumento da pressão intra-ocular (Pio)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Esquerda não tratada, cronicamente elevada IOP conduz ao dano progressivo e irreversível à retina e cabeça do nervo óptico causando cegueira radial1,2,19. Todos os métodos atuais para retardar a progressão do glaucoma enfocam reduzindo IOP, diminuindo a taxa de produção de AH pelo corpo ciliar ou aumentando a vazão1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. a malha trabecular (TM) desempenha um papel vital na regulação ativamente o caminho de saída primário AH e sua função inadequada é um fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. No entanto, os mecanismos moleculares associados com disfunção TM e como regula AH drenagem não são compreendidos ainda inteiramente e é atualmente um grande foco de glaucoma pesquisa1,2,19, 20. enquanto vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) têm associados um número de genes para glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM, os mecanismos moleculares exatos que levam à doença não são ainda totalmente compreendidos21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Modelos animais melhoraram grandemente nosso conhecimento atual de progressão da doença no glaucoma (extensivamente revisado em3,15,16,26,,27,28, 29,30,31,32,33). Vários métodos pioneiros foram desenvolvidos para estudar o TM34,35,36 e esses métodos têm sido amplamente utilizados para fazer avançar a nossa compreensão atual do tecido normal e doente. Uma área que não tem sido extensivamente explorada é a utilização de modelos de rato geneticamente modificado para estudar os mecanismos moleculares da falha de TM. Transgênico bater-no e estudos de mata-mata rato de genes TM associado, tais como Myocilin (Myoc)37,38 e Cyp1b139, têm sido as principais ferramentas para estudar os mecanismos moleculares de TM função. Compreensivelmente, o pequeno tamanho da TM em camundongos representa um sério obstáculo que deve ser superado a fim de começar a estudar este tecido. Modelos de mouse representam uma poderosa ferramenta para estudar a genética e os mecanismos moleculares da doença, enquanto os avanços em tecnologias de LCM fornecem as ferramentas necessárias para capacitar o estudo dos tecidos menores e mais delicados, incluindo o TM.

Neste relatório, um método robusto e reprodutível é descrito para o LCM de TM altamente enriquecido de olhos de rato junto com posterior isolamento do RNA e amplificação para análise de expressão a jusante. Métodos semelhantes têm sido utilizados com sucesso em ratos para isolar outros tipos de olho tecidos40,41,42,,43,44, a metodologia aqui indicada pode ser aplicada a outros discretos tecidos do olho para estudar microRNA, RNA, DNA e proteínas. Importante, esta técnica permite o uso de camundongos geneticamente modificados para melhor compreender a patogênese molecular da imparidade TM em glaucoma e doença ocular3,15,16,17 ,18,26,31,,45,46. A capacidade de isolar o TM de olhos de rato por LCM será uma técnica útil na obtenção de mais insights sobre os mecanismos moleculares de diversas doenças oculares.

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Protocol

O cuidado do Animal nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e Comité de uso (ACUC) aprovaram todos metodologia deste estudo sob o NIEHS Animal estudar proposta IIDL 05-46.

1. coleção tecido ideal para o Laser Microdissection

  1. Obter 2 a 3 meses, ratos, masculino ou feminino C57BL/6. Eutanásia com CO2 por um período mínimo de 1 min ou até respiração cessou. Retire o animal da gaiola e assegurar a morte por deslocamento cervical, decapitação ou toracotomia.
  2. Antes de dissecação, certifique-se de todas as ferramentas de dissecação são limpos e esterilizados.
    Nota: Para a remoção dos olhos curvado tesoura e pinça com ponta serrilhada (preferido do tamanho da ponta: 0.5 x 0.4 mm) serão necessários.
  3. Estabelecer o mouse sobre uma superfície plana de lado para que o olho é facilmente acessível. Agarrar o canto do olho (o canto do olho) com a pinça para estabilizar o mouse, em seguida, usando a tesoura curva, enfrentando a curva longe o olho, corte em volta do olho usando o soquete do olho como um guia até o globo ocular pode facilmente ser tomado da tomada (use a curva não o pontas da tesoura).
  4. Puxe delicadamente e, usando a tesoura curva, cortar o nervo óptico, que libera o olho da tomada da orbital. Retire cuidadosamente o tecido não-ocular de olho e enxágue em 1 x salina tamponada fosfato (PBS). Repita 1.3-1.4 para o olho contralateral.
  5. Borre o olho com uma toalhita de tecido para remover qualquer umidade antes de incorporação. Coloque o olho num molde de amostra (25 x 20 x 5 mm3) para que a lente e o nervo óptico são paralelos à parte superior do banco a fim de obter as seções sagitais. Incorporar os olhos no ideal corte temperatura (O.C.T.) composto e coloque sobre o gelo seco para congelar. Uma vez congelado, armazenar os blocos a-80 ° C.

2. biópsia de preparação para o Laser Microdissection

  1. Antes de usar incube polietileno tereftalato (PET) da membrana em cross-linker UV a máxima potência durante 45 min.
  2. Pulverize a solução de descontaminação RNase sobre a escova, fórceps, acoplamento vidrinhos e montando o chuck. Limpe cuidadosamente. Enxague com água livre de nuclease e seque. Limpe o criostato com 100% de etanol para evitar contaminação cruzada.
  3. Ajustar o criostato a-18 ° C. Remover um bloco congelado do congelador-80 ° C em um tempo e entregar o criostato com gelo seco. Permitir que o bloco congelado equilibrar com a temperatura do criostato para um mínimo de 10 min.
  4. Espremer uma pequena quantidade de O.C.T. a massa de montagem (figura 1A) e remover o bloco do tecido do molde e coloque cuidadosamente o bloco sobre o mandril de montagem (figura 1B). Uma vez que o bloco de tecido sobre o mandril de montagem está congelado, insira o suporte de amostra do criostato (Figura 2A).
  5. Ajuste o criostato para 8 µm de seções de corte e secção cuidadosamente através do bloco O.C.T. para chegar a amostra de tecido. Uma vez que o tecido é observado, seccionamento, aparar os blocos congelados por todos os lados, usando uma lâmina limpa e deixam 3 a 4 mm de O.C.T. o tecido circundante para habilitar o tratamento com a escova de pintura (Figura 2B). Use um pincel limpo de novo em vez da placa entre cada mudança de amostra para evitar a contaminação da amostra.
  6. Secção através do olho a trabalhar rapidamente. Mancha cada terceira seção inundando o slide com um rápido passo hematoxilina e eosina (H & E) Mancha por 60 s, enxágue com água da torneira, ar seco, claro no despachante e montar em uma placa de vidro carregada com uma lamela. Ver no microscópio e continuar até que o TM é evidente nas seções de corte de corte.
  7. Uma vez que o TM começa a aparecer, 2 seções de corte e montar numa lâmina de vidro carregada por rotina, H & E mancha para formar um mapa para corte com LCM.
    Nota: Consulte a seção 3 para mapa e detalhes de coloração.
  8. Após a primeira H & E mapeiam slide, cortar e linha 6 seções de espessura 8 serial-µm em criostato e montar simultaneamente para o slide de membrana de PET (Figura 3A, B). Aderir o tecido brevemente deslizando com o polegar ao longo das costas da membrana. Após a montagem, coloque o slide de membrana PET imediatamente em uma caixa de slides em gelo seco.
    Nota: Menos seções podem ser montadas, no entanto, várias seções para o slide de montagem ao mesmo tempo é recomendado para reduzir a degradação do RNA, limitando a quantidade de tempo que cada seção é exposta ao ar a temperatura ambiente.
  9. Continue a seção o olho, depois cada dois slides de membrana de PET com 6 seções cada, recolher duas seções sobre uma lâmina de vidro carregada para criar outro slide de mapa para coloração H & E. Continue o seccionamento, aproximadamente 100 µm-8 serial espessas seções, até TM não é mais visível. Confirme pela coloração rapidamente uma seção sobre uma placa de vidro carregada (ver 2.6).
  10. Armazenar todos os slides de membrana de PET a-80 ° C para uso posterior do LCM.

3. H & Slide de mapa E manchando o protocolo e análise morfológica

  1. Para visualizar e revisar os slides mapa nas corrediças de vidro carregada, fix o tecido pela transferência imediatamente para um frasco de coloração preenchido com 100 mL da solução de fixação rápida para 7 s. Enxágue o slide mergulhando-a em água destilada, 10 - 20 vezes , então transfira o slide para um frasco de acoplamento com água destilada limpa.
  2. Retirar a lâmina da água e borre secas bordas com limpeza do tecido. Pipetar 200 µ l modificado filtrada Harris Hematoxylin em cada seção e incube por 30 s, à temperatura ambiente. Lave cuidadosamente o slide sob água corrente até que água saia clara. Borre o fim do slide com um tecido de limpeza entre cada etapa (borrão entre cada etapa de 3,2-3.5) para remover o excesso de líquido.
  3. Slide de lugar em 1X PBS em temperatura ambiente por 30 s. Então, cuidadosamente, enxágue o slide sob água corrente por 30 s.
  4. Mergulhe o slide 3 - 4 vezes em banho de etanol 95%. Aplique bastante solução de corante eosina Y para cobrir o tecido no slide e incube por 15 s à temperatura ambiente.
  5. Enxágue o slide no banho de etanol 95% duas vezes com os mergulhos rápidos 10-20. Enxágue o slide no banho de etanol 100% duas vezes com os mergulhos rápidos 10-20. Em seguida, enxágue slide duas vezes num banho de xileno (10-20 rápidos mergulhos cada).
  6. Montagem aplicando o meio de montagem resinoso ao tecido, adicionar lamela cuidadosamente para evitar bolhas de ar e deixe secar durante a noite no bairro.
  7. Revisão H & E slides visualmente ou por meio de um scanner de slides digitais. Identifica o mapa slides com TM claramente visível e acessível para o corte. Usar o PET mapeiam de slides membrana entre estes slides para LCM.

4. polietileno tereftalato (PET) membrana desliza protocolo de transformação e coloração

  1. Antes de remover slides de PET do congelador primeiro preparar solução estoque de cresilo violeta dissolvendo 0,3 g de acetato de cresilo violeta em 20 mL de etanol 75% e colocar no abanador para 2 h. filtrar a solução com 0,22 µm unidade de filtro estéril e loja a 4 ° C, para não mais do que 6 seg THS.
  2. Prepare eosina Y solução alcoólica com fresco 75% de etanol na proporção de 1:4. Prepare soluções de desidratação (75%, 95% e 100% de etanol) e fixação (75% de etanol) em tubos polipropileno cônico de 50ml limpo, livre de nuclease, no gelo. Adicione inibidor de RNase para cada solução.
  3. Remova a caixa de slides contendo seções de tecido congelado do congelador-80 ° C e coloque-o em gelo seco. Processe um slide no momento. Corrigir slides, colocando o slide imediatamente em álcool etílico frio de 75% por 30 s.
  4. Mergulhe delicadamente o slide em água livre de nuclease por 10-15 s para dissolver O.C.T. sem interferir com as secções de tecido.
  5. Cuidadosamente, pipete 300 µ l de solução de acetato de violeta de cresilo 1,5% diretamente sobre as seções e incubar durante 45 s em temperatura ambiente. Em seguida, lavar uma vez, colocando-o em banho de etanol 75% por 30 s. Pipetar 200 µ l eosina Y solução sobre as seções e incubar durante 3-5 s.
  6. Desidrata-se tecido, colocando o slide posteriormente em 75% de etanol, etanol 95% e, finalmente, banho de etanol 100% por 30 s cada. Borre o fim do slide com uma toalhita de tecido entre todos os passos para remover o excesso de líquido. Deixe o ar de slide secar completamente sob o capô, por 5 min. Depois de seco, execute LCM imediatamente a seguir.
    Nota: Recomenda-se evitar o uso de xileno para esta etapa, pode causar cortes histologicos de vínculo inadequadamente para o slide de membrana e reduz a eficiência de captura de tecido.

5. laser Microdissection com Laser UV

  1. Ligue o computador e permitir que a bota. Ligue a fonte de alimentação de luz branca de microscópio. Ligue a chave do laser UV e um amarelo LED acenderá. Inicie o software de LCM, permitem carregar totalmente e um vídeo ao vivo irão exibir. Pressione o botão do laser na caixa do controlador e um LED verde acende.
  2. Carregar uma nova lâmina de vidro para o palco do microscópio e, em seguida, coloque o slide de membrana de PET com o lado do tecido manchado virado para baixo diretamente na parte superior da lâmina de vidro. Certifique-se que a membrana e a lâmina de vidro estão emparelhados firmemente no palco microscópio.
  3. LCM iniciar definindo os limites do slide. Escolha o mais baixo 4 X ampliação no painel objetiva (Figura 4). Em seguida, defina a área de trabalho do slide membrana movendo o microscópios xy-palco até o canto superior esquerdo, onde se encontram o metal e a membrana é visível no vídeo ao vivo de alimentação, pressione o botão "Limite 1" e um retângulo vermelho aparecerá sobre o roteiro. Em seguida, passar para a fase de xy para o canto oposto e pressione o botão "limitar a 2". Pressione o botão "scan" para criar uma imagem de roteiro da membrana e tecidos entre os limites definidos.
  4. Dê um duplo clique perto o TM de uma das seções olho dentro do roteiro, a TM pode ser localizado perto do ápice do ângulo iridocorneal (Figura 5A). Uma vez que o TM foi identificado, aumente a ampliação de 10x e manualmente o foco no TM. Repita com 20 X e 40 X de objectivos. Quando o TM está em foco, com o objetivo de X 40 (Figura 5B), navegar em uma área em branco nas proximidades (foco pode precisar ser ajustada ligeiramente), selecione a "ferramenta de desenho à mão livre" e desenhe uma linha de tempo em uma área em branco do tecido.
  5. Defina os parâmetros do laser para que a velocidade de"corte" é de 34%, "foco" é de 58%, e "poder" é de 70% (Figura 4) e, em seguida, pressione o botão "cortar". Fazer ajustes de laser bem a velocidade, foco e parâmetros de potência até uma linha de corte fino e claro for observada (ver Figura 5). Para um corte preciso, certifique-se de ação de corte segue a linha desenhada.
  6. Carregue a tampa do tubo de isolamento no suporte da tampa e abra o tubo. Anexar o cap-titular para o cap-elevador e verifique se que o tubo está invertido. Assegurar que o material do tampão adesivo se projeta para além da ponta da PAC para garantir que o tecido desejado corretamente é capturado.
  7. Selecione o modo de dissecação "Manual" no painel de software. Reveja com cuidado que o TM (Figura 5B) está diretamente abaixo do tubo de isolamento. Definir o balanço de branco e ajustar o brilho para adquirir a qualidade de imagem ideal (Figura 4).
  8. Para iniciar o corte, manualmente ajustar o foco e desenhe uma linha utilizando a ferramenta mão livre, certifique-se de que a tampa da coleção permanece na posição ainda não tocar a membrana. Desenhar círculos parciais perto de onde o TM encontra a esclera (Figura 5), em seguida, pressione "corta". Uma vez que são feitos os primeiros cortes, posicione a tampa na posição para baixo e re-ajustar o foco e, em seguida, desenhe duas linhas no espaço livre ou aberto para conectar os dois círculos parciais, completando o círculo em torno do TM, em seguida, pressione "cortar" e coletar tecido de seção , certifique-se de que a TM foi apanhada pela PAC microdissection (Figura 5D-F).
  9. Coloque a tampa de volta para a posição correcta e repita (5,2-5,8) nas restantes secções. Ligeiramente ajuste a posição da tampa para que todas as amostras isoladas o encaixe no PAC e não sobrepor (Figura 5). Para obter consistência, a janela de tempo para um slide é 20 min. Use menos seções por animal deslize se é necessário mais tempo para isolar TM de todas as seções. Para a membrana de PET próxima, inserir um novo tubo de isolamento e repetir a seção 5.

6. lise de Microdissected TM tecido

  1. Recentemente prepare o tampão de lise de RNA para lyse tecido isolado de LCM. Adicione 10 µ l de β-Mercaptoetanol para cada 1 mL de tampão de Lise. Armazene a Lise com β-Mercaptoetanol à temperatura ambiente para não mais de 1 mês.
  2. Retire o tubo de isolamento do titular do cap dentro de 20 minutos desde o início do microdissection. Visualize a superfície da tampa pelo olho para garantir a captura de TM.
  3. Pipete cuidadosamente lise de 10 µ l para a tampa do tubo da coleção, garantindo a Lise cubra completamente o microdissected TM. Delicadamente feche adesiva tampa e incubar o tubo da coleção do avesso à temperatura ambiente por 10 min. Após a incubação, centrifugar a 800 x g por 2 min e coloque lisado em gelo seco. Loja lysates a-80 ° C para posterior análise e purificação.

7. RNA isolamento e análise de qualidade

  1. Analise a qualidade do RNA por descongelar amostras à temperatura ambiente. Piscina junto todas as amostras isolaram de um único rato em um tubo de microcentrífuga de RNase-livre 1,5 mL.
    Nota: por exemplo, para replicar cada biológico, 10-12 tubos com tampas de microdissected em 10 µ l lisado foram gerados e lisados todos foram transferidos para um tubo único para cada replicar biológico (100-120 µ l de lisado).
  2. Adicione um volume de etanol a 70% (feito com água livre de RNase) recentemente preparada para cada solução lisada. Em seguida, purifica o RNA total, seguindo as diretrizes de usuário de kit de isolamento de RNA. Garantir a remoção do DNA genômico de cada amostra de RNA.
    Nota: O DNA genômico pode interferir com análise de RNA a jusante.
  3. Medir a qualidade do RNA isolado do TM juntos pool de amostras de cada mouse e analisando a integridade do RNA ribossomal (figura 6A).
    Nota: Devido ao pequeno tamanho da TM, picos de RNA ribossomal podem não ser observável (Figura 6B) no perfil de qualidade de RNA (dois picos observados entre 1.000-4.000 bp na figura 6A, C) que é usado para calcular o número de integridade do RNA (RIN) 47.
    1. Obter uma medida mais precisa da integridade do RNA, isolando o RNA do tecido remanescente do slide de membrana mais abundante. Para obter um representante RIN, isolado do RNA do tecido-ocular do slide de membrana por pipetagem 10 lise µ l de buffer na seção de um tecido e realizar o isolamento de RNA. Analisar a qualidade do RNA e calcular RIN (Figura 6).
  4. Para aplicações a jusante do RNA, uso um kit de RNA de entrada baixo para geração de sequenciamento e cDNA biblioteca produzir reprodutíveis resulta do tão pouco quanto 80 seções de LCM isolado TM.

8. análise

  1. Para verificar que o tecido coletado na verdade é enriquecido em genes associados a TM, colete vários RNA adicional de olho toda microdissected, esclera, íris, retina, córnea e lente de 3 ratos separados. Uso que esse RNA em combinação com LCM coletou RNA do isolado TM e corpo ciliar coletadas de 4 ratos separados.
  2. Converter que o RNA das amostras microdissected foi a utilização de um kit de transcrição reversa do cDNA de cDNA. Amplificar o RNA das amostras isolada de LCM e converter para cDNA usando uma entrada baixa RNA para kit de cDNA.
  3. Analisar todos os RNA para expressar genes, myocilin (MYOC) e alfa-actina-2 (ACTA2), de malha trabecular e normalizar usando o gene de limpeza HSP90a1 por PCR digital (Figura 7A-B).

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Representative Results

LCM coletados RNA de TM e corpo ciliar de 4 diferentes ratos foi isolado para ser capaz de analisar a expressão gênica e comparar a expressão com que em todo olho, esclera, íris, retina, córnea e lente isolados de três ratos separados. TM expressando genes, MYOC48 e ACTA249 foram analisados em todos os tecidos coletados para confirmar que as amostras isoladas de TM foram de fato altamente enriquecidas em TM. Devido a quantidade extremamente baixa de cDNA das amostras LCM de PCR digital foi usado, que tem sido provado ser mais reprodutíveis com menos material50. A expressão de MYOC e ACTA2 foi normalizada usando o gene de limpeza HSP90a1 e, em seguida, cada tecido foi comparado com a do olho todo. Esses resultados mostram que MYOC (Figura 7A) e ACTA2 (Figura 7B) são altamente expressos nas amostras de TM, confirmando o sucesso isolamento do RNA de alta qualidade das amostras de TM altamente enriquecidos para jusante do RNA análise. Como prova de conceito, esta técnica foi aplicada para o RNA isolado TM preparado de camundongos WT e de uma estirpe de ratos com um fenótipo IOP elevado e analisados por microarray. Esta análise identificou muitos genes implicados no glaucoma diferencialmente expressos entre os ratos de TM de WT e aqueles dos ratos com o fenótipo de glaucoma (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: colocação do tecido congelado bloco em criostato. (A) O.C.T meio de montagem é aplicado para a parte de montagem do criostato. (B) bloco de amostra congelada uniformemente é colocado sobre o mandril de montagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: corte interno do tecido do olho congelado em criostato. (A) preparação de superfície de corte para atingir o tecido do olho. (B) aparar O.C.T. do bloco congelado antes de coletar as seções para o laser microdissection. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: preparação das seções congeladas em criostato. (A) 6 serial 8 µm espessura seções estão alinhadas em criostato. (B) as seções são montadas simultaneamente do slide de membrana de PET. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: captura de tela do software de laser microdissection destacando características importantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: localização da malha trabecular e configurações de parâmetro de laser UV para isolamento adequado da malha trabecular. (A) ampliação baixa (4x) de uma única seção na membrana do PET, destacando a malha trabecular para o laser microdissection. (B) ampliação de alta (40 X) da malha trabecular e tecidos adjacentes. (C) o primeiro círculo parcial cortes de TM perto da região scleral com a tampa na posição. (D) Final cortes no espaço livre que completar o círculo ao redor o TM com a tampa na posição para baixo. (E) TM retirado da seção e (F) anexado ao PAC. (G) várias seções de corte corte da mesma membrana PET não sobreposição aderidas à tampa. S (esclera), SC (Canal de Schlemm), TM (malha Trabecular), AC (Câmara Anterior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: estimativa de rendimento e a qualidade do RNA Total obtidos de microdissected tecido de malha trabecular. (A) RNA Total de 80 seções da malha trabecular (tamanho de área aproximada foi de 0,8 mm2). (B) RNA Total das 20 seções de malha trabecular (tamanho de área aproximada foi de 0,2 mm2). (C) o RNA Total de tecido remanescente de olho depois do laser microdissection. RIN, número de integridade do RNA; BP, pares de bases. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: análise de RNA a jusante de LCM isolado malha trabecular. Digital do PCR análise quantitativa de genes associados TM na TM isolado por LCM. Os genes TM-associado (A) MYOC (B) ACTA2 altamente expressado no LCM capturado amostras TM em comparação com outros tecidos oculares. (C) Heatmap gerado a partir de dados obtidos da análise de microarray da malha trabecular RNA isolado de ratos WT e KO ratos com um fenótipo IOP elevado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: comparação da preparação do tecido antes e depois da otimização. Seções de olho cortado e colocado na PET slides membrana ou com o (A) a preparação de desidratação de etanol a 95% padrão (B) ou a preparação de desidratação do etanol otimizado de 75%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O TM desempenha um papel vital em manter ativamente IOP homeostático e sua disfunção é amplamente aceito como o principal fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Um número de polimorfismos de nucleotídeo único em vários genes identificados pela análise GWAS tem sido associado ao risco aumentado de glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM; no entanto, os mecanismos moleculares precisos que dão origem a esta doença ainda não estão totalmente compreendidos21,22,23,24,25. Modelos de genética do rato podem fornecer uma poderosa ferramenta para estudar os mecanismos moleculares de glaucoma. No entanto, o pequeno tamanho do mouse tecido TM representa um desafio formidável para o isolamento de TM altamente enriquecido de olhos de rato e a alta qualidade do RNA para análise de expressão do gene. LCM é uma valiosa técnica para isolar um único ou baixo número de células e pode ser usado para estudar a expressão gênica em amostras de tecido enriquecido para tipos específicos de célula. Neste estudo, um método robusto e reprodutível do LCM é descrito para isolar TM altamente enriquecido e RNA de alta qualidade que pode ser usado para estudar a regulação da expressão gênica e sinalização na TM celular. Além disso, o método de LCM descrito também pode ser aplicado a outros tecidos dentro do olho.

Tecnologia de LCM e uma elevada atenção ao detalhe para otimização de manipulação de tecido desempenharam um papel vital no desenvolvimento bem-sucedido deste método. A metodologia de isolamento e preservação de tecidos é um componente chave no isolamento do RNA de alta qualidade para o perfilamento de expressão do gene. LCM requer uma atenção muito alta ao detalhe na dissecação, cryosectioning, fixação, coloração, desidratação e tempo de duração do laser microdissection para ser bem sucedido na obtenção de qualidade de RNA51. Espessura de corte de tecido pode ser aumentada; no entanto, à medida que a espessura aumenta assim o UV poder laser necessária. Aumentou os resultados de potência do laser em um caminho mais amplo de laser que pode causar degradação de RNA. Verificou-se que o caminho do laser com 8 µm seções era magro e fornecido tecido suficiente para análise de RNA a jusante. Figura 8 mostra como otimização da preparação tecido drasticamente pode alterar a capacidade de a laser disseca o TM do olho. A otimização desta etapa no protocolo (conforme descrito na seção 4) rendeu superior tecido ocular de imobilização e remoção completa de O.C.T. (Figura 8B) simplesmente usando 75% em vez de etanol a 95% (Figura 8A) para desidratar o tecido seguida de incubação em água livre de RNase para remover a mídia de montagem. Ainda mais a desidratação e a coloração é obtida usando reagentes coloração à base de álcool. Além disso, verificou-se que superior de reagentes rendidos coloração à base de álcool resulta em relação os reagentes manchando aquosos (à base de água cresilo violeta ou hematoxilina) e ainda mais, ajuda a preservar a integridade de RNA52. Em geral, processamento de tecidos oculares, usando o protocolo otimizado com base de álcool coloração reagentes rendidos consistente ocular-tecido seções que foram totalmente imobilizadas do slide de membrana de PET.

Nossa meta para este estudo foi desenvolver um método robusto e confiável para isolar a alta qualidade mRNA de TM de olhos de rato para análise de expressão a jusante, a fim de obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a elevada IOP e glaucoma. Conforme o heatmap na Figura 7, o protocolo descrito de isolar TM por LCM fornece um método muito confiável para isolar o RNA de TM e estudar as diferenças na expressão gênica em TM de tipo selvagem e ratos mutantes. O método descrito neste documento permitirá que os investigadores realizar análise molecular em um tecido central para a patogênese do glaucoma em um sistema na vivo que é relativamente fácil e confiável e pode ser aplicado a análise de expressão do gene.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

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References

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