Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

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Biology

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Summary

Nous décrivons ici un protocole pour une microdissection laser reproductible de la saisie (LCM) pour isoler le réseau trabéculaire (TM) pour l’analyse en aval de RNA. La capacité d’analyser les changements dans l’expression des gènes dans le TM aidera à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents des maladies oculaires liées au TM.

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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

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Abstract

Microdissection de saisie de laser (LCM) a permis à analyse d’expression de gène des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules dans des sections de tissu. LCM est un excellent outil pour l’étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation cellulaire et le développement et la progression de diverses maladies, notamment un glaucome. Le glaucome, qui comprend une famille de neuropathies optiques progressifs, est la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde entier. Augmenté la pression intraoculaire (PIO), qui est un facteur de risque majeur pour le développement de glaucome peuvent entraîner des changements structurels et des dommages dans le réseau trabéculaire (TM). Cependant, les mécanismes moléculaires précis sont encore mal compris. La capacité d’effectuer l’analyse de l’expression génique sera cruciale pour obtenir un complément d’éclairage sur la fonction de ces cellules et son rôle dans la régulation du développement IOP et glaucome. Pour ce faire, une méthode reproductible pour isoler fortement enrichi TM de coupes congelées d’yeux de souris et une méthode pour l’analyse de l’expression génique en aval, tels que la RT-qPCR et RNA-Seq est nécessaire. La méthode décrite ici est développée pour isoler fortement pur TM des yeux de souris pour PCR numérique en aval et l’analyse de microarray. En outre, cette technique peut être facilement adaptée pour l’isolement des autres cellules oculaires hautement enrichis et les compartiments cellulaires qui ont été difficiles à isoler des yeux de souris. La combinaison de l’analyse de LCM et de l’ARN peut contribuer à une compréhension plus approfondie des événements cellulaires qui sous-tendent le glaucome.

Introduction

Le glaucome est un groupe de maladies caractérisées par une neuropathie optique et rétinopathie qui conduit finalement à une cécité irréversible1,2. On estime qu’en 2020 plus 70 millions de personnes dans le monde vivra avec une certaine forme de la maladie3,4,5,6,7. Glaucome primaire à angle ouvert (GPAO), le plus répandu type de glaucome, se caractérise par une diminution de l’écoulement de l’humeur aqueuse (AH) conduisant à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Gauche IOP non traitée, chroniquement élevé entraîne des dommages progressifs et irréversibles de la rétine et de la tête du nerf optique entraînant la cécité radial1,2,19. Toutes les méthodes actuelles pour ralentir la progression du glaucome portera essentiellement sur réduction IOP, soit en diminuant le taux de production de AH par le corps ciliaire ou en améliorant son écoulement1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. le réseau trabéculaire (TM) joue un rôle essentiel dans la régulation active de la voie de sortie primaire AH et sa fonction incorrecte est un facteur de causalité pour les hypertendus glaucome1,2,19. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la dysfonction TM et comment il régule AH drainage ne sont pas encore bien compris et est actuellement une préoccupation majeure de glaucome recherche1,2,19, 20. bien que plusieurs études d’association pangénomique (GWAS) ont lié à un certain nombre de gènes au glaucome et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM, les mécanismes moléculaires exacts qui mènent à la maladie ne sont pas encore pleinement compris21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Des modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances actuelles de la progression de la maladie dans le glaucome (largement revu dans3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,,33). Plusieurs méthodes pionnières ont été développées pour étudier les TM34,35,36 , et ces méthodes ont été largement utilisées pour faire progresser notre compréhension actuelle des tissus normaux et malades. Un domaine qui n’a pas été intensivement exploré est l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’échec de TM. Transgénique knock-in et études sur les souris knock out de gènes TM associé, tels que Myocilin (Myoc)37,38 et39de Cyp1b1, ont été les principaux outils pour étudier les mécanismes moléculaires du TM fonction. Naturellement, la petite taille du TM chez la souris représente un obstacle sérieux qui doit être surmonté afin de commencer à étudier ce tissu. Modèles de souris représentent un outil puissant pour l’étude de la génétique et les mécanismes moléculaires de la maladie, tandis que les percées dans les technologies LCM fournissent les outils nécessaires pour permettre l’étude des tissus plus petits et plus délicats, y compris le TM.

Dans ce rapport, une méthode fiable et reproductible est décrite pour le ppcm de TM fortement enrichi d’yeux de souris avec les ARN et amplification pour l’analyse de l’expression en aval. Des méthodes similaires ont été utilisés avec succès chez des souris pour isoler des autres types d’oculaires tissus40,41,42,43,44, la méthodologie rapportée ici peut être appliquée à d’autres tissus discrètes de le œil pour étudier les ARN, micro-ARN, ADN et protéines. Ce qui est important, cette technique permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de la déficience de TM dans le glaucome et maladie oculaire3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacité d’isoler le TM des yeux de souris par LCM sera une technique utile à obtenir un complément d’éclairage sur les mécanismes moléculaires de plusieurs maladies oculaires.

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Protocol

Le Comité de son utilisation (ACUC) et de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) animalier approuvé toute méthodologie de cette étude sous le NIEHS Animal étudier proposition IIDL 05-46.

1. Collection de tissus optimale pour Microdissection Laser

  1. Obtenir 2 à 3 mois souris C57BL/6 mâles ou femelles. Euthanasier avec CO2 pendant au moins 1 min ou jusqu'à ce que la respiration a cessé. Retirez la cage de l’animal et assurer la mort par dislocation cervicale, décapitation ou thoracotomie.
  2. Avant la dissection, s’assurer que tous les outils de dissection sont propres et stérilisés.
    Remarque : Pour la suppression des yeux curved ciseaux et pinces avec extrémité dentelée (préféré pointe taille : 0,5 x 0,4 mm) sera nécessaire.
  3. Fixer la souris sur une surface plane sur le côté pour que l’oeil est facilement accessible. Saisir sur le canthus (coin de l’oeil) avec la pince pour stabiliser la souris, puis en utilisant les ciseaux courbes, face à la courbe de l’oeil, coupe autour de le œil en utilisant l’orbite comme un guide jusqu'à ce que le globe oculaire peut facilement être prélevé sur la prise (utiliser la courbe de pas le conseils des ciseaux).
  4. Tirez doucement et, à l’aide des ciseaux courbes, couper le nerf optique, qui libère le œil de la prise de l’orbitale. Retirer délicatement le tissu non oculaires de l’oeil et le rincer dans 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Répétez 1,3-1,4 pour le œil controlatéral.
  5. Épongez le œil avec une lingette de tissu pour enlever toute trace d’humidité avant l’intégration. Placer le œil dans moule spécimen (25 x 20 x 5 mm3) afin que la lentille et le nerf optique sont parallèles à la paillasse afin d’obtenir des coupes sagittales. Incorporer les yeux en Optimal coupe température (PTOM) composé et placez sur la glace de geler. Une fois congelé, stocker les blocs à-80 ° C.

2. surgelé préparation de Microdissection Laser

  1. Avant utilisation, incuber en polyéthylène téréphtalate (PET) membrane diapositives de réticulant UV à puissance maximale pendant 45 min.
  2. Pulvériser la solution de décontamination de RNase sur la brosse, pinces, bocaux de couplage et mandrin de montage. Essuyer soigneusement. Rincer avec de l’eau exempte de nucléase et sécher. Essuyer le cryostat avec 100 % d’éthanol pour éviter la contamination croisée.
  3. Ajuster le cryostat à-18 ° C. Supprimer un bloc congelé du congélateur-80 ° C à la fois et remettre au cryostat à la glace sèche. Permettre des blocs congelés s’équilibrer avec la température du cryostat pendant au moins 10 min.
  4. Déposez une petite quantité des PTOM sur le bloc de montage (Figure 1 a) et enlever le bloc de tissu du moule et déposer délicatement le bloc sur le mandrin de montage (Figure 1 b). Une fois le bloc de tissu sur le mandrin de montage est gelé, insérez sur le porte-échantillon du cryostat (Figure 2 a).
  5. Ajuster le cryostat pour coupes de 8 µm et l’article soigneusement à travers le bloc PTOM pour atteindre l’échantillon de tissu. Une fois que le tissu est observé, arrêter de sectionnement, tailler les blocs congelés sur tous les côtés à l’aide d’une lame de rasoir propre et laisser 3-4 mm des PTOM le tissu environnant pour activer le traitement avec le pinceau (Figure 2 b). Utilisez un nouveau pinceau propre au lieu de la plaque roll entre chaque changement de l’échantillon pour éviter la contamination croisée de l’échantillon.
  6. Section à travers l’oeil de travailler rapidement. Tache chaque troisième section en inondant la diapositive avec une rapide en une seule étape hématoxyline et à l’éosine (H & E) tache pendant 60 s, rincer à l’eau du robinet, l’air sec, clair en clarifiant et monter sur une lame de verre chargée avec une lamelle. Voir sous le microscope et continuer jusqu'à ce que le TM est évident dans les sections coupées de sectionnement.
  7. Une fois que le TM commence à apparaître, 2 coupes et monter sur une lame de verre chargée de routine H & E coloration pour former une carte pour la découpe avec LCM.
    Remarque : Voir la Section 3 pour carte et détails de coloration.
  8. Après que le premier H & E carte slide, couper et s’alignent 6 coupes série 8 µm d’épaisseur dans le cryostat et en même temps monter sur le toboggan de membrane de PET (Figure 3 a, B). Collez le tissu en poussant brièvement ganté pouce le long du dos de la membrane. Après montage, placez le PET membrane immédiatement dans une boîte de glisser sur la glace sèche.
    Remarque : Moins de sections peuvent être montées, toutefois, plusieurs sections sur le toboggan de montage à la fois est recommandé pour réduire la dégradation de l’ARN en limitant la durée de que chaque section est exposée à l’air à température ambiante.
  9. Continuer à la section de le œil, après chaque deux diapositives de membrane de PET avec 6 sections de chaque, recueillir deux sections sur une lame de verre chargée de créer une autre diapositive de la carte pour une coloration H & E. Continuer de sectionnement, environ 100 coupes épaisses série 8 µm, jusqu'à ce que TM n’est plus visible. Confirmer par coloration rapidement une section sur une lame de verre chargée (voir 2.6).
  10. Stockez toutes les diapositives de membrane de PET à-80 ° C pour une utilisation ultérieure de LCM.

3. H & E carte Slide souillant le protocole et l’examen morphologique

  1. Pour visualiser et consulter les diapositives de carte sur les lames de verre chargée, fixer le tissu de transférer immédiatement dans un pot de coloration rempli avec 100 mL de la solution de fixation rapide pour 7 s. Rincer la diapositive en plongeant dans l’eau distillée 10 - 20 fois , puis transférer la lame un bocal de couplage à l’eau distillée.
  2. Retirer la lame de l’eau et épongez les bords secs avec la lingette de tissu. Pipette de 200 µL modifiée filtré Harris hématoxyline sur chaque section et incuber pendant 30 s à température ambiante. Rincez soigneusement la lame sous l’eau courante jusqu'à ce que l’eau soit claire. Épongez la fin de la diapositive avec une lingette de tissu entre chaque étape (blot entre chaque étape de 3,2 à 3,5) pour enlever l’excès de liquide.
  3. Diapositive place dans du PBS 1 x à température ambiante pendant 30 s. Ensuite, Rincez soigneusement la lame sous l’eau courante pendant 30 s.
  4. Trempez la diapositive 3 - 4 fois dans le bain d’éthanol 95 %. Appliquer suffisamment éosine Y de solution de colorant pour couvrir le tissu sur la diapositive et incuber pendant 15 s à température ambiante.
  5. Rincer la lame dans le bain d’éthanol 95 % deux fois avec 10-20 rapides trempettes chaque. Rincer la lame dans le bain d’éthanol 100 % deux fois avec 10-20 rapides trempettes chaque. Ensuite, rincer lame deux fois dans le bain de xylène (10-20 rapides trempettes chaque).
  6. Monter en appliquant le milieu de montage résineuse au tissu, ajouter la lamelle couvre-objet avec soin pour éviter les bulles d’air et laissez-le sécher dans la hotte du jour au lendemain.
  7. Examiner les lames H & E visuellement ou à l’aide d’un scanner de diapositives numériques. Identifier les diapositives de carte avec TM clairement visible et accessible pour la coupe. Utiliser le PET diapositives membrane entre ces carte diapositives pour LCM.

4. le polyéthylène téréphtalate (PET) Membrane glisse protocole de transformation et coloration

  1. Avant suppression diapositives PET congélateur tout d’abord préparer violet de crésyle solution en dissolvant acétate violet de crésyle 0,3 g dans 20 mL d’éthanol 75 % et placez-la sur vibreur pendant 2 h. filtrer la solution avec 0,22 µm filtre stérile et conserver à 4 ° C pour ne plus que 6 Lun THS.
  2. Préparer la solution alcoolique d’éosine Y avec frais d’éthanol 75 % à un ratio de 1:4. Préparer la fixation (75 % d’éthanol) et des solutions de déshydratation (75 %, 95 % et 100 % éthanol) dans les tubes en polypropylène conique propre, exempte de nucléase, 50 mL sur la glace. Ajouter inhibiteur de RNase à chaque solution.
  3. Enlever le boîtier de la diapositive contenant des coupes de tissus congelés du congélateur-80 ° C et placez-le sur la glace sèche. Traiter une diapositive à temps. Difficulté des diapositives en plaçant la lame immédiatement en éthanol froid de 75 % pendant 30 s.
  4. Doucement, tremper la lame dans l’eau sans nucléase pour 10-15 s dissoudre les PTOM sans interférer avec les coupes de tissus.
  5. Soigneusement distribuer 300 µL de solution d’acétate violet de crésyle 1,5 % directement sur les sections et incuber pendant 45 s à température ambiante. Ensuite, laver une seule fois en le plaçant dans le bain d’éthanol 75 % pour s. solution 30 µL Pipette 200 éosine Y sur les sections et incuber pendant 3-5 s.
  6. Déshydrater le tissu en plaçant la diapositive par la suite dans 75 % d’éthanol, éthanol à 95 % et enfin, bain d’éthanol 100 % pendant 30 s de chaque. Épongez la fin de la diapositive avec une lingette de tissu entre chaque étape pour enlever l’excès de liquide. Laissez l’air de la lame sécher sous le capot pendant 5 min. Une fois sec, effectuez immédiatement après LCM.
    Remarque : Il est recommandé d’éviter l’utilisation du xylène pour cette étape, il peut causer des sections de tissu à coller insuffisamment à la diapositive de la membrane et réduit l’efficacité de capture des tissus.

5. laser Microdissection laser UV

  1. Allumez l’ordinateur et permettent de démarrer. Ouvrir l’alimentation de puissance lumineuse blanche du microscope. Mettez la clé de laser UV et un jaune LED s’allume. Démarrez le logiciel LCM, permettent pour charger entièrement et une vidéo en direct seront affiche. Appuyez sur le bouton du laser sur le boîtier et un voyant vert s’allume.
  2. Charger une nouvelle lame de verre sur la platine du microscope, puis placez le chariot de membrane de PET avec le côté tissu taché vers le bas, directement sur le dessus de la lame de verre. S’assurer que la membrane et la lame de verre sont couplées étroitement sur la platine du microscope.
  3. Début LCM en premier définissant les limites de la diapositive. Choisissez le plus bas 4 X grossissement dans le panneau objectif (Figure 4). Définissez ensuite la zone de travail de la diapositive de membrane en déplaçant le microscopes xy-étape jusqu'à ce que le coin supérieur gauche, où se rencontrent le métal et la membrane est visible dans la vidéo en direct d’alimentation, appuyez sur le bouton « Limit 1 » et un rectangle rouge apparaît sur la feuille de route. Ensuite, passer à la phase-xy jusqu’au coin opposé et appuyez sur le bouton « limiter la 2 ». Appuyez sur le bouton « scan » pour créer une image de la feuille de route de la membrane et le tissus entre les limites définies.
  4. Double-cliquez sur près de la TM d’une des sections yeux dans la feuille de route, le TM peut être situé près du sommet de l’angle iridocornéen (Figure 5 a). Une fois que le TM a été identifié, augmenter le grossissement de 10 X et manuellement mettant l’accent sur le TM. Répéter l’opération avec 20 X et 40 X objectifs. Lorsque le TM est en discussion avec l’objectif de X 40 (Figure 5 b), naviguer dans une zone vide à proximité (accent éventuellement être légèrement modifié), sélectionnez l’outil « dessin à main levée » et tracez une ligne longue sur une zone vide du tissu.
  5. Définissez les paramètres laser afin que la « vitesse de coupe » est de 34 %, « focus » est de 58 % et « power » est de 70 % (Figure 4), puis appuyez sur le bouton « couper ». Faire des ajustements de laser fine à la vitesse, le focus et paramètres de puissance jusqu'à ce qu’une ligne de coupe claire et fine est observée (voir Figure 5). Pour des coupes précises, s’assurer que l’action de coupe suit la ligne tracée.
  6. Chargez le couvercle du tube d’isolation dans le porte-bouchon et ouvrir le tube. Fixer le porte-bouchon au cap-lève-patient et s’assurer que le tube est inversé. S’assurer que le matériel adhésif cap fait saillie au-delà de l’extrémité de la PAC pour s’assurer que le tissu désiré est correctement saisis.
  7. Sélectionnez le mode de dissection « Manuel » dans le panneau de logiciel. Examiner attentivement que le TM (Figure 5 b) située directement sous le tube d’isolation. Régler la balance des blancs et régler la luminosité afin d’acquérir la qualité d’image optimale (Figure 4).
  8. Pour commencer la coupe, manuellement ajuster la mise au point et tracer une ligne à l’aide de l’outil dessin à main levée, s’assurer que le bouchon de la collection reste en position haute pas encore toucher la membrane. Tirage au sort des cercles partielles près où le TM rencontre la sclère (Figure 5), puis appuyez sur « couper ». Une fois effectuées les premières coupes, placer le bouchon en position basse et ré-ajuster le focus, puis dessinez deux lignes dans l’espace ouvert ou libre pour connecter les deux cercles partielles boucler la boucle autour de la TM, puis appuyez sur « couper » et recueillir des tissus de section , faire en sorte que le TM a été repris par le bouchon de la microdissection (Figure 5 D-F).
  9. Placer le bouchon arrière en position relevée et répéter (5.2-5.8) sur les autres sections. Ajustez légèrement la position du capot afin que tous les échantillons isolés conviendront sur le capuchon et se chevauchent pas (Figure 5). Par souci de cohérence, la fenêtre de temps pour une diapositive est 20 min. utilisation moins de sections par animal glissent si un délai supplémentaire est nécessaire pour isoler les TM de toutes les sections. Pour la prochaine membrane PET, insérez un nouveau tube d’isolation et répéter la section 5.

6. Lyse tissu de Microdissected TM

  1. Fraîchement préparer tampon de lyse RNA à lyse tissulaire LCM isolé. Ajouter 10 µL de β-mercaptoéthanol à chaque 1 mL de la mémoire tampon de lyse. Stocker le tampon de lyse avec β-mercaptoéthanol à température ambiante pendant pas plus de 1 mois.
  2. Retirez le tube d’isolation de porte-bouchon à 20 min du début de la microdissection. Visualiser la surface de la PAC par œil pour s’assurer de la prise de TM.
  3. Soigneusement Pipeter 10 µL de tampon de lyse sur le couvercle du tube collection assurant le tampon de lyse couvre complètement le microdissected TM. Doucement fermer bouchon adhésif et incuber le tube de prélèvement à l’envers à température ambiante pendant 10 min. Après incubation, centrifuger à 800 g pendant 2 min et placez lysat sur la glace sèche. Stocker des lysats à-80 ° C pour la purification et l’analyse ultérieure.

7. isolement et analyse de la qualité

  1. Analyser la qualité de RNA de décongeler les échantillons à la température ambiante. Piscine ensemble tous les échantillons prélevés une seule souris dans un tube à centrifuger exempte de RNase 1,5 mL.
    NOTE : par exemple, pour chaque réplicat biologique, 10-12 tubes avec bouchons microdissected en 10 µL de lysat ont été générés et tous les lysats ont été transférées dans un tube unique pour chaque réplicat biologique (100-120 µL de lysat).
  2. Ajouter un volume d’éthanol à 70 % fraîchement préparée (faite avec de l’eau exempte de RNase) à chaque solution lysate. Puis, purifier l’ARN total suivant les directives d’utilisateur RNA isolation kit. Assurer l’élimination de l’ADN génomique de chaque échantillon de RNA.
    Remarque : L’ADN génomique peut interférer avec l’analyse en aval de RNA.
  3. Mesurer la qualité de l’ARN isolé de la TM en rassemblant des échantillons provenant de chaque souris et en analysant l’intégrité de l’ARN ribosomique (Figure 6 a).
    Remarque : En raison de l’exiguïté du TM, ARN ribosomique pics peut-être pas observable (Figure 6 b) sur le profil de qualité RNA (deux pics observés entre 1 000-4 000 bp dans la Figure 6 a, C) qui est utilisé pour calculer le nombre d’intégrité RNA (RIN) 47.
    1. Isoler l’ARN du tissu restant plus abondant sur la diapositive de la membrane pour obtenir une mesure plus précise de l’intégrité de la RNA. Afin d’obtenir un représentant RIN, RNA isolat provenant du tissu oculaire-sur la lame de la membrane par pipetage 10 lyse µL de tampon avec la section d’un tissu et effectuer des ARN. Analyser la qualité de RNA et calculer RIN (Figure 6).
  4. Pour les applications en aval de RNA, utiliser un kit d’ARN d’entrée faible pour génération de bibliothèque séquençage et ARNC céder reproductible résulte d’aussi peu que 80 sections de LCM isolé TM.

8. analyse

  1. Pour vérifier que les tissus collectés sont en effet riche en gènes associés à la TM, recueillir plusieurs RNA supplémentaire de microdissected oeil entier, sclera, iris, rétine, cornée et lentille de 3 souris séparées. Utilisation de que cet ARN en combinaison avec LCM recueillies RNA isolé TM et le corps ciliaire prélevé 4 souris séparées.
  2. Conversion de que l’ARN à partir des échantillons de microdissected était de cDNA utilisant un kit de transcription inverse de cDNA. Amplifier l’ARN provenant d’échantillons de LCM isolé et convertir au cDNA utilisant un faible apport RNA pour trousse de cDNA.
  3. Analysez tous les ARN pour exprimer de gènes, myocilin (MYOC) et alpha-actine-2 (ACTA2), réseau trabéculaire et normaliser l’utilisation du gène de ménage HSP90a1 par PCR numérique (Figure 7 a-B).

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Representative Results

LCM prélevés RNA dans le TM et le corps ciliaire de 4 différentes souris a été isolé pour pouvoir analyser l’expression des gènes et de comparer l’expression avec celle dans l’oeil entier, sclera, iris, rétine, cornée et lentille isolés de trois souris séparées. TM exprimant des gènes, MYOC48 et49 de la ACTA2ont été analysés dans tous les tissus prélevés afin de confirmer que les échantillons de TM isolés étaient en effet fortement enrichis en TM. Étant donné le nombre extrêmement faible de l’ADNc des échantillons de LCM numérique PCR a été utilisée, qui a fait ses preuves pour être plus reproductible avec moins de matière50. L’expression du MYOC et ACTA2 a été normalisée à l’aide du gène de ménage HSP90a1 , puis chacun des tissus a été comparée à celle de le œil entier. Ces résultats montrent que MYOC (Figure 7 a) et ACTA2 (Figure 7 b) sont fortement exprimés dans les échantillons de TM, confirmant la réussite de l’isolement de l’ARN haute qualité des échantillons fortement enrichi de TM ARN en aval analyse. Comme preuve de concept, cette technique a été appliquée à l’ARN isolé TM préparés à partir des souris WT et d’une souche de souris présentant un phénotype de Pio élevé et analysés par microarray. Cette analyse a identifié de nombreux gènes impliqués dans le glaucome qui sont exprimés de façon différentielle entre les souris TM de WT et ceux des souris avec le phénotype de glaucome (Figure 7).

Figure 1
Figure 1 : emplacement des tissus congelés bloquer dans le cryostat. (A) milieu de montage O.C.T est appliqué sur le bloc de montage du cryostat. (B) bloc de spécimen congelé est uniformément placée sur le mandrin de montage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : la section procédure de tissus congelés oeil dans le cryostat. (A) préparation de la surface de coupe pour atteindre les tissus oculaires. (B) les PTOM de règlage du bloc congelé avant de recueillir des sections pour microdissection laser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : préparation de coupes congelées dans le cryostat. (A) 6 8 µm épais sériées sont alignées dans le cryostat. (B) Sections sont simultanément montées sur la diapositive de membrane de PET. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : capture d’écran du logiciel de microdissection laser mettant en évidence les caractéristiques importantes de. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : emplacement du réseau trabéculaire et réglages des paramètres laser UV pour une isolation correcte du trabéculum. (A) grossissement faible (4 X) d’une section unique sur la membrane de PET en soulignant le trabéculum pour microdissection laser. Grossissement de haut (40 X) (B) du réseau trabéculaire et les tissus adjacents. (C) premier cercle partiel Coupe du TM près de la région sclérale avec le bouchon en position relevée. (D) finale coupe dans l’espace libre qui complètent le cercle autour de la TM avec le bouchon en position basse. TM (E) retiré de la section et (F) attaché à la PAC. (G) plusieurs sections coupées réduit de la même membrane PET ne pas chevauchement collées à la PAC. S (sclérotique), SC (Canal de Schlemm), TM (trabéculum), AC (chambre antérieure). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : estimation rendement et la qualité de l’ARN Total obtenu à partir du tissu microdissected trabéculaire. (A) l’ARN Total de 80 sections du réseau trabéculaire (taille de la zone approximative était de 0,8 mm2). (B) l’ARN Total des 20 sections de réseau trabéculaire (superficie approximative était de 0,2 mm2). (C) l’ARN Total des autres tissus oculaires après microdissection laser. RIN, nombre de RNA de l’intégrité ; BP, paires de bases. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : analyse de l’ARN en aval de LCM isolé trabéculaire. Analyse par PCR quantitative numérique de gènes associés à la TM dans le TM isolé par LCM. Les gènes associés à la TM de (B) (A) MYOC ACTA2 fortement exprimée dans le LCM capturé échantillons de TM par rapport à d’autres tissus de le œil. (C) Heatmap généré à partir des données obtenues par l’analyse de microarray de trabéculum RNA isolés de souris WT et KO souris présentant un phénotype de Pio élevé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Comparaison de préparation de tissus avant et après optimisation. Sections d’oeil couper et placé sur PET diapositives de membrane soit avec (A) la préparation de déshydratation d’éthanol à 95º standard (B) ou la préparation de déshydratation optimisé 75 % d’éthanol. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le TM joue un rôle essentiel pour maintenir activement IOP homéostatique et son dysfonctionnement est largement reconnue comme le principal facteur causal pour hypertendus glaucome1,2,19. Un certain nombre de polymorphismes dans plusieurs gènes identifiés par analyse GWAS ont été lié à risque de glaucome accrue et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM ; Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui donnent lieu à cette maladie ne sont pas encore pleinement compris21,22,23,24,25. Modèles murins génétique peuvent fournir un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires du glaucome. Toutefois, la petite taille de souris tissu TM représente un formidable défi pour l’isolement de TM hautement enrichi yeux de souris et le RNA de haute qualité pour l’analyse de l’expression génique. LCM est une technique utile pour isoler un seul ou faible nombre de cellules et peut être utilisé pour étudier l’expression des gènes dans les échantillons de tissus enrichis pour les types spécifiques de cellules. Dans cette étude, une méthode fiable et reproductible de LCM est décrite pour isoler TM hautement enrichi et l’ARN de haute qualité qui peut être utilisé pour étudier la régulation de l’expression génique et cellulaire, la signalisation dans le TM. En outre, la méthode décrite de LCM peut également servir à d’autres tissus intérieur de le œil.

La technologie LCM et une grande attention aux détails pour l’optimisation de la gestion des tissus a joué un rôle essentiel dans la réussite de cette méthode. La méthodologie de la préservation des tissus et l’isolement est un élément clé pour isoler l’ARN de haute qualité pour le profil d’expression génique. LCM exige une très grande attention aux détails en disséquant, cryosectioning, fixation, coloration, déshydratation et durée de microdissection laser pour réussir à obtenir la qualité RNA51. Épaisseur de coupe de tissu peut être augmentée ; Toutefois, comme l’épaisseur augmente donc le UV laser puissance nécessaire. A augmenté de résultats puissance laser dans un chemin plus large de laser qui peuvent causer la dégradation de l’ARN. Il a été constaté que le chemin d’accès de laser avec 8 sections µm était mince et fourni suffisamment de tissu pour analyse en aval de RNA. Figure 8 montre comment l’optimisation de la préparation de tissu peut modifier radicalement la capacité au laser de disséquer le TM de le œil. L’optimisation de cette étape dans le protocole (tel que décrit dans la section 4) cédé supérieure des tissus oculaires immobilisation et une élimination complète des PTOM (Figure 8 b) en utilisant simplement les 75 % au lieu de l’éthanol à 95 % (Figure 8 a) pour déshydrater le tissu suivie d’une incubation dans une eau exempte de RNase pour enlever les supports de montage. Plus de déshydratation et de coloration est obtenue en utilisant des réactifs de coloration à base d’alcool. En outre, il a été constaté que supérieur à base d’alcool de coloration réactifs ont donné des résultats par rapport aux réactifs de coloration aqueuses (violet de crésyle aqueux ou l’hématoxyline) et davantage contribue à préserver l’intégrité de RNA52. Dans l’ensemble, le traitement des tissus oculaires utilise le protocole optimisé avec à base d’alcool coloration réactifs ont donné compatible oculaire-coupes de tissus qui ont été complètement immobilisés sur la diapositive de membrane de PET.

Notre objectif pour cette étude était de développer une méthode fiable et robuste pour l’isolation haute qualité ADN messagère de la TM d’yeux de souris pour l’analyse de l’expression en aval afin d’obtenir des connaissances sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’IOP surélevée et le glaucome. Comme le montre le heatmap dans la Figure 7, le protocole décrit d’isolement TM par LCM fournit une méthode très fiable pour isoler l’ARN de TM et étudier les différences dans l’expression des gènes dans TM de type sauvage et souris mutantes. La méthode décrite ici permettra aux chercheurs d’effectuer des analyses moléculaires sur un tissu central à la pathogenèse du glaucome dans un système in vivo qui est relativement facile et fiable et peut être appliquée à l’analyse de l’expression génique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

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