Мышиных дистальной колостомы, Роман модель колита утечки в мышей C57BL/6

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мышиных дистальной колостомы предоставляет мышиных модель для человека утечки колит, преимущественно лимфоцитарный колит в сегменте кишки, исключены из фекальных поток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Утечки колит (DC) является частым клинического состояния, происходящие в больных с сегментами кишечника, исключены из фекальных поток вследствие отвлечения enterostomy. Этиология этого заболевания остается нечетко, но представляется, отличается от классической воспалительных кишечника таких заболеваний, как болезнь Крона и язвенный колит. Исследования, направленные расшифровать патофизиологические механизмы, ведущие к развитию этого заболевания серьезно затрудняется отсутствием соответствующей мышиных модели. Этот протокол создает модель мышиных DC, что облегчает изучение роль иммунной системы и ее взаимодействия с микрофлора в развитии DC. В этой модели, с использованием животных C57BL/6 дистальной части толстой кишки исключены из фекальных поток, создавая дистальной колостомы, вызывая развитие легкой до умеренной воспаления в сегментах исключенных кишечника и воспроизводя признаком поражения человека Постоянного тока с умеренной системного воспалительного ответа. В отличие от модели крыса большое количество генетически модифицированные мышиных моделях на фоне C57BL/6 доступны. Сочетание этих животных с нашей моделью позволяет потенциальной роли отдельных цитокинов, chemokines или рецепторов биоактивных молекул (например, интерлейкина (IL) -17; IL-10, хемокиновых CXCL13, хемокиновых рецепторов CXCR5 и CCR7 и рецептор сфингозин-1-фосфата 4) следует оценивать в патогенезе DC. Наличие congenic мыши штаммов на фоне C57BL/6 во многом облегчает передачи эксперименты по созданию ролей типов различных клеток, участвующих в этиологии DC. Наконец, модель дает возможность оценить влияние местных вмешательств (например, модификация местных микрофлора или местных противовоспалительная терапия) на иммунитет слизистой кишечника, подверженных и не подверженных сегментов и по системного иммунного гомеостаза.

Introduction

В последние годы значительное число субъектов колит неинфекционной, отличается от классической воспалительные заболевания кишечника (IBDs; т.е., ulcerosa колит или болезнь Крона) histopathologically и клинически характеризуется в организме человека. Патофизиологические механизмы, ведущие к развитию этих форм колит не поняты полностью частично потому, что соответствующие Животные модели являются скудными. Колит утечки является одним из этих недавно описан сущностей. Хотя термин был придуман в 1980 году Glotzer1, первоначальное описание подобный фенотип было дано в 1972 Morson2. Болезнь развивается в 50% до 91% больных с отвлечения enterostomy и интенсивности ее клинические меняется3,4. Учитывая ежегодной заболеваемости около 120000 колостомы больных в Соединенных Штатах Америки, эта болезнь сущность является важной проблемой здравоохранения.

Общая цель разработки этого протокола был предоставлять мышиных DC модель опирается на триггер колит, аналогичного тому, которое наблюдалось в человека DC и что воспроизводит основной Гистопатологические особенности заболеваний человека. В отличие от других моделей мышиных колит, колит индукции в нашей модели не требуют генетически измененных животных (например, IL-7 трансгенных мышей, N-Кадгерины доминирующей негативные мышей или TGFβ- / - мышей), применение химически раздражающие вещества (например, декстран сульфата натрия (DSS) - индуцированного колит или ТРИНИТРОБЕНЗОЛ перфтороктановой сульфоновой кислоты (ТНБ) - индуцированной колит), или перемещение населения конкретных клеток в иммунной несовершенным мышей (как ввысокой передачи CD45RB модель колита) (обзор, см.5). В отличие от других моделей неповрежденной иммунной системы нашей модели постоянного тока позволяет оценки иммунологического механизма участвуют в развитии DC. Ограничение воспаления слизистых оболочек в сегмент исключенных кишечника позволяет оценить его последствия на слизистой иммунитета в других частях желудочно-кишечного тракта, на иммунного гомеостаза в другие иммунные отсеках кишечного тракта (например , Патчи и mesenteriale лимфоузлы Peyer) и на иммунного гомеостаза всего организма. Наконец наша модель представляет собой соответствующий инструмент для изучения механизмов, контролирующих местных воспалительных раздражителей, возникая от изменений в нормальных местной окружающей среды для как местные микрофлора, а также пищевых антигенов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены ветеринарные власти (шведским für сельского хозяйства, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Мекленбург-Передняя Померания, LALLF M-V).

1. предоперационной помощи и подготовки животного

  1. По прибытии в объекте животных разделите группы аналогичного размера животных (C57Bl/6), клетку каждой группы вместе и держать группы постоянной на протяжении всех экспериментов.
    Примечание: Используйте животных одного пола. Описаны результаты были получены с мышей-самцов.
    Примечание: Если используются Мыжские животные, Кейдж групп вместе начиная когда они возрасте 7 недель, чтобы иерархия может быть создана, таким образом к минимуму риск агрессивного поведения во время экспериментов.
  2. По крайней мере за одну неделю до операции, переключитесь на высокой энергии (> 14 МДж/кг) и высоким содержанием белка (> 20%) канал, содержащий все основные микроэлементы и витамины (подробности см. в список материалов).
    Примечание: Заверить всех мышей весят по крайней мере 25 g, когда операция выполняется.
  3. Вызвать анестезия и анальгезия, внутрибрюшинного введения кетамин (и.п. 87 мг/кг) и ксилазина гидрохлорид (и.п. 13 мг/кг). Подождите, пока мышь допускает механическую стимуляцию, например мыс тангажа, без мотора ответа.
  4. Безопасный наркотизированного мышь с ленты в лежачем положении на подложку тепла, дислоцированные в операции стол, гарантируя стабильный позиционирования во время операции и избегая подавляющее потерю тепла тела.
    Примечание: Тепла подложки должны иметь температуру поверхности 36 ° C до 40 ° C; Температура должна быть 21 ° C.

2. дистальной колостомы операции

  1. Бритье волос живота. Перед началом операции, операции поле три раза с использованием спирта 70% и йодофора дезинфицировать. Драпировка поле операции, чтобы гарантировать для асептических условиях.
  2. Выполнение 15-мм средний лапаротомия с промо брюшных мышц и брюшины вдоль linea alba, таким образом минимизируя потери крови.
  3. Использовать два DeBakey атравматической щипцы, осторожно потяните слепой кишки, терминал подвздошной кишки и возрастания и поперечно-ободочной кишки от брюшной полости.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы строго ограничить механические манипуляции кишечника для предотвращения травмы верхней брыжеечной структурам.
  4. Идентифицировать сенситизации полюс, восходящей толстой и тонкой кишки (цифры 1a и 1b).
    Примечание: Корректная идентификация восходящей ободочной кишки имеет основополагающее значение для правильного размещения колостомы. В тех случаях, когда Анатомия Илеоцекальной области является неоднозначным наличие Пейера определяет тонкой кишки, и присутствие сформированных табурет характеризует толстой кишки.
  5. Использование линейки для определения позиции будущего колостомы. Она должна быть размещена 20 мм дистальнее илеоцекальной клапан для дистального колостомы.
  6. Сделайте второй 3-мм разрез в брюшной стенке в правом верхнем квадранте. Вытяните ранее выявленных сегмент толстой кишки через этот разрез в форме петли, соблюдая осторожность, чтобы не исказить цикла.
  7. Тщательно пройти 22-го калибра гибкие Внутривенный катетер через mesocolon. Будьте осторожны, чтобы не повредить брыжеечных сосудов структур.
  8. Возвращение intestine в брюшной полости.
  9. Исправьте обоих концах гибкие трубки на кожу с помощью простых швов и рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Перед закрытием лапаротомия, выполните жидкости реанимации с помощью внутрибрюшинной инъекции по 0,5 мл 0,9% физиологического раствора.
  11. Закройте брюшины и слой мышц с помощью непрерывного шва с помощью рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1/2 c). Закройте кожи с непрерывного шва с помощью рассасывающимся швом (например, полиглактин 910 или polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Откройте экстериоризируется петли кишки, выполнив Итого перерезка с помощью тонкой ножниц. Избегайте всех травм в брыжейке. Не разрез толстой кишки полностью.
  13. Исправления каждого открытия колостомы, используя три один полный Толщина швов на брюшине и кожи с использованием монофил, рассасывающиеся шовные (например, полидиоксанон или монофил 6-0 3/8s). Афферентные цикл, который является функциональной конце колостомы, и эфферентных цикл, который является слизи свищей, четко разделены в этой точке (рис. 1 c).
    Примечание: Время работы должно быть меньше 20 минут ограничить жидкости и тепловые потери.
  14. После окончания операции, дезинфекция инструментов, с помощью решения альдегида дезинфекции в ультразвуковой ванне согласно инструкциям производителя.

3. Шам операции (Colotomy)

  1. Выполните шаги 1.1. через 2.4.
  2. Использование линейки для определения позиции будущего colotomy. Colotomy должен быть позиционирован на таком же расстоянии от клапана илеоцекальной колостомы в опытной группе.
  3. Откройте толстой кишки по крайней мере две трети его окружности с помощью тонкой ножницы.
  4. Закрыть colotomy с одним слоем, полная толщина прервана шовный материал с помощью монофил, рассасывающиеся шовные (например, полидиоксанон, монофил 6-0 3/8s).
    Примечание: Время работы должно быть меньше 20 минут для экспериментировали хирург, ограничение жидкости и тепловых потерь.
  5. Выполните шаги 2.10. , 2.11. и 2.14.

4. послеоперационный уход

  1. Возвращение в их клетках животных. Хорошо темперированный атмосферу 37 ° C (например, с инфракрасной лампой) до тех пор, пока мышей полностью проснуться. Затем Держите мышей в регулирование температуры и влажности окружающей среды (21 ° C, относительной влажности 30% ± 10%). Разрешить свободный доступ к продовольствию и питьевой воде. Чтобы облегчить усвоение жидкости, обеспечивают дополнительные водянистыми кормов для животных.
  2. Начать послеоперационное обезболивание путем инъекций 0,1 мг/кг тела вес бупренорфин s.c. когда животных показывают ответ на механической стимуляции. Будьте осторожны избежать угнетения дыхания.
  3. Дополнение питьевой воды с 1 мг/мл трамадол для продолжения анальгезии в течение первой недели после операции.
  4. Чтобы компенсировать снижение потребления жидкости из-за ограниченной подвижностью, Поставка твердых пить Pad в клетке в течение первой недели после операции.
  5. Вес животных и оценка поведения животных ежедневно в течение первой недели, каждый второй день, в течение оставшейся части первого месяца и каждый третий день в течение второго месяца, используя описанные в Kleinwort et al. оценка тяжести заболевания 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Хирургия хорошо переносится в экспериментальной (колостомы) и групп Шам (colotomy). Постоперационная смертность не должна превышать 10%, когда хирургии и периоперационной управление выполняется правильно. В течение первой недели после операции значительная потеря веса рассматривается в экспериментальных и Шам групп. Животные Шам группы достичь их вес Надир обычно на четвертый день после операции, но это происходит один день позже в опытной группе. Потеря веса более выражен в экспериментальной группе, достигнув 21,7% от первоначального веса. В противоположность этому Шам животные теряют 10,8% от их первоначального тела вес (рис. 2)6. После Надир вес в течение первой недели после операции вес тела поднимается непрерывно в обеих опытных группах, но с уклоном более медленными в опытной группе. Признаки и симптомы, тяжелые кишечные воспаления (то есть, кровавый опорожнения или жидкие испражнения происходят ни в экспериментальной ни Шам группы6). Общая смертность в течение первых 60 дней после операции составляет около 40% в группе колостомы и около 10% в группе colotomy. Большинство случаев смерти происходит в течение первой недели после операции (61% в экспериментальной группе, 66% в группе Шам). На рисунке 3показаны причины смерти.

Дистальная колостомы мышей приводит к развитию преимущественно лимфоцитарный колит, воспроизводя отличительной Гистологические особенности человека DC. Эти изменения повышают с продолжительностью кишечных исключения. Склеп длина значительно сокращен в сегментах исключенных кишечника. Этот сокращении достигает статистической значимости после 14 дней фекальных утечки (рис. 3a). Длина ячейки Кубок подшипник склеп уменьшается после 30 дней в сегментах исключенных кишечника (рис. 3b). Кубок абсолютные цифры также значительно уменьшается в склепы в сегменте исключенных кишечника после 14 дней после операции (рис. 3 c). Поражение Отличительной DC, развитие лимфоидных фолликулов в слизистой оболочке, требует большей продолжительности отклонения стула. Хотя две недели в кратчайшие сроки может наблюдаться увеличение количество лимфоидных фолликулах, различия становятся значительным после двух месяцев (цифры 5a-c). Все гистопатологические изменения, в описанный перед более выражены в дистальной части, чем в проксимальном регионах исключенных кишечника сегментов. Типичная нейтрофильных проникнуть как признак острого воспаления обычно не наблюдается (цифры 5 d-e).

Как знак системные последствия местного воспаления кишечника нейтрофильные графов значительно увеличиваются в колостомы животных через 14 дней после операции в кратчайшие сроки. Эта разница сохраняется до конца периода наблюдения (60 дней). Количество тромбоцитов слегка увеличилась в животных с кишечника утечки после 60 дней (рис. 6). Уровень гемоглобина и гематокрита снижаются 14 дней после того, как операция в группе колостомы по сравнению с группой Шам.

Было показано, что дефицит витамина в грызунов причин сократить средний объем эритроцитов (MCH) и означает корпускулярная гемоглобина (MCV) значения7. В нашей модели мы видим первоначальное увеличение обоих этих параметров после 14 и 30 дней. MCV и ОЗМР вернуться к нормальной стоимости после более последующей (рис. 7). Это показывает, что дистальной колостомы не приводит к клинически значимых авитаминоз во время долгосрочного наблюдения.

Figure 1
Рисунок 1: Анатомия сенситизации региона и хирургической процедуры. (a) графическое представление послеоперационной анатомии. (b) рельеф сенситизации ГСМ и анатомические ориентиры. (c) графическое представление колостомы отверстия. Рисунок 1a был изменен Kleinwort et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: тела вес развития. Вес тела отображается как процент от веса предоперационной тела. Тело вес кривых колостомы и обман (colotomy) животных показывают, что потеря веса первоначального послеоперационных был значительно выше в группе колостомы, по сравнению с группой Шам (p < 0,001). Значения ошибок средства ± стандарт среднего через 21-26 животных на группу (21 животных получил колостомы; 26 животных были в группе Шам). Эта цифра была изменена Kleinwort et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: причины смерти. Осложнения, представлены как процентные показатели смертности от всех причин и проиллюстрированы в круговой диаграмме (Группа колостомы (), (b) Шам группа). Послеоперационных осложнений были определены вскрытие. Тратя синдром был определен как непрерывный похудения больше, чем 33% от первоначального веса и другие выводы, на вскрытие. Кишечная непроходимость и анастомоза были диагностированы на вскрытие. Стома осложнений были определены как peristomal абсцессов и кожно-слизистый цветоделения. Другие осложнения входят рану зияние лапаротомия, ишемии слепой кишки, и случаев не ясно, на вскрытие. Между группами были замечены значительные различия в распределении послеоперационных осложнений (p = 0,021, анализируются с помощью точный тест Фишера для двухсторонней анализа до 6 × 6 случай таблиц). Существовали 39 животных в группе колостомы и 29 в группе Шам. Эта цифра была изменена Kleinwort et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: склеп Длина и Кубок клеток населения. Склеп длину и Кубок клеток номера были определены с помощью парафиновых срезах прямой кишки после окрашивания периодической кислоты Шифф. () склеп длина значительно уменьшилось в прямой кишке животных с утечкой колит (DC). (b Длина регионе чашу клеток подшипник склеп был измеряется и задать как отношение длины полного склеп. 30 и 60 дней после операции, доля склеп длина подшипник бокаловидных клеток была снижена в группе DC. (c) Кубок клеток номера были значительно снижены в DC животных, по сравнению с группой Шам. Графики в (a) по (c) показывают средства и стандартные ошибки через 5-9 животных для каждой группы (фиктивный колостомы 14 и 30 дней, 14 дней: n = 8; колостомы 60 дней: n = 5; липовые 30 и 60 дней: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0.01. Эта цифра была изменена Kleinwort et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: лимфоидных фолликулов и воспалительных инфильтратов. (a) лимфоидных фолликулах перенаправленных двоеточия и Шам животных были подсчитаны на парафиновых срезах прямой кишки, окрашивали гематоксилином и эозином. График показывает средства и стандартные ошибки через 5-9 животных для каждой группы (фиктивный колостомы 14 и 30 дней, 14 дней: n = 8; колостомы 60 дней: n = 5; контроль 30 и 60 дней: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0.01. (b) и (c) представитель примеры секций прямой кишки колостомы (b) и (c) Шам животных 60 дней после операции окрашивали гематоксилином и эозином. В слизистой оболочки мыши колостомы присутствовал выдающийся лимфоидных фолликулов (∗). Масштаб бары представляют 100 µm. (d) и (e) пятная с chloroacetate эстеразы реакции на парафиновых срезах была выполнена для обнаружения нейтрофильных гранулоцитов. Сечения переадресованные прямой кишки острые воспалительные нейтрофильных инфильтрата был замечен в группе колостомы (d) ни в Шам животных (e) до до 60 дней после операции. Масштаб бары представляют 100 мкм. Эта цифра была изменена Kleinwort et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: количества нейтрофилов и тромбоцитов. Количество крови в венозной крови были определены ветеринарных гематологический анализатор. () нейтрофилов графов были значительно увеличены в группе колостомы, по сравнению с фиктивным животных до 60 дней после операции. (b) тромбоцитов графов были слегка повышенный уровень в группе колостомы 60 дней после операции. График показывает средства и стандартные ошибки через 5-9 животных для каждой группы (фиктивный колостомы 14 и 30 дней, 14 дней: n = 8; колостомы 60 дней: n = 5; липовые 30 и 60 дней: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: параметры красных кровяных клеток. Количество крови в венозной крови были определены ветеринарных гематологический анализатор. () гемоглобина и гематокрита (b) были значительно снижены в группе колостомы, по сравнению с группой Шам. (c) средний объем эритроцитов (MCH) было значительно повышенные 14 и 30 дней после операции в группе колостомы по сравнению с группой Шам но вернулась в нормальное русло после 60 дней. (d) Средняя корпускулярная гемоглобина (MCV) значения были подняты после 30 дней, но не после 60 дней после операции в группе колостомы по сравнению с липовые животных. График показывает средства и стандартные ошибки через 5-9 животных для каждой группы (фиктивный колостомы 14 и 30 дней, 14 дней: n = 8; колостомы 60 дней: n = 5; липовые 30 и 60 дней: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мышиных модель DC, представленные в настоящем Протоколе надежно воспроизводит Гистопатологические особенности человека DC (например, de novo развитие лимфоидных фолликулов в подслизистой воспаление кишечника сегментов, склеп сокращения и сокращения Кубок числа клеток). Помимо этого преимущество эта модель индуцируется очень похожи пусковым фактором и представляет с клиническое течение средней и легкой степени тяжести, как это бывает в наиболее пострадавших людей.

Для получения воспроизводимых результатов и приемлемым периоперационных летальность, необходимо некоторое практике в микрохирургической техники. Однако операция колостомы и Шам (colotomy) может быть выполнена с очень низким Периоперационная смертность (< 10%). Некоторые оперативные меры имеют большое значение: 1) положительно идентифицировать подвздошной кишки двоеточие и терминал. В тех случаях, когда не ясно, Анатомия Илеоцекальной области толстой кишки может определяться присутствие сформированных стула и терминала подвздошной кишки наличием патчи Пейера в. 2) при exteriorizing цикла колостомы, заверить, что брыжейка не contorted, таким образом избегая брыжеечных ишемии и механической непроходимости кишечника. 3) когда проколов брыжейка с гибкой трубки, заверить, что судно свободный сектор выбран, таким образом предотвращая кровотечения и брыжеечных ишемии. 4) при создании небольшой разрез в брюшной стенке, проверьте наличие достаточного гемостаза. При необходимости, используйте термо коагуляция для остановки кровотечения из сосудов мышечной. 5) заверить толстой, цикл открыта по крайней мере в две трети его окружности и что задняя стена достаточно печенке, гарантируя тем самым полной закупорки табурет прохода на дистальном кишечника сегменты. 6) заверить, что оба конца колостомы хорошо крепятся к коже, чтобы избежать открытый проход в брюшной полости, что приводит к выше риск заражения или механическая кишечная непроходимость, потому что фекальных поток не может выйти. Как правило все хирургические процедуры могут выполняться без увеличительного стекла или хирургические микроскопы. В общем использование этих устройств требует дальнейшей профессиональной подготовки.

Даже когда сложности хирургических процедур только умеренный, есть много основных оперативных и периоперационной вопросов будет считаться успешно завершить эксперимент с воспроизводимые результаты.

Это имеет важное значение для долгосрочного выживания с постоянной колостомы, у мышей нетронутыми слепой кишки. Экспериментальная группа с проксимальных колостомы прилегающих к клапан илеоцекальной показал уровень смертности на 100% в течение первой недели после операции из-за необратимого похудения (данные не показаны). Таким образом это крайне важно для выбора колостомы сайта по крайней мере 20 мм дистального Bauhin клапан. Это замечание может быть за физиологии пищеварения грызунов. Ретроградная транспорт от проксимального отдела толстой кишки до слепой кишки происходит в этих видов. Слепой кишки, где синтез питательных веществ occurs8 бактериальной микрофлоры. Нормальный MCV и ОЗМР во время долгосрочного наблюдения указывают что животных с дистальной колостомы не страдают от значительных витаминной недостаточности. Кроме того копрофагия является неотъемлемой частью питания поведение грызунов в их естественной среде. При создании модели, мы были очень обеспокоены тем, что нарушается вследствие наличия постоянной колостомы копрофагия может привести к недостаточности питания, (например, витамин B). Однако хотя это является проблемой в условиях, где ограничен доступ к питательные вещества, она ранее было показано, что копрофагия теряет свое значение питания в экспериментальных условиях с свободный доступ к воде и сбалансированной питательной пищи9 . В наших условиях эксперимента жизненно важно для оптимизации условий послеоперационных рациона. Мы использовали корма для животных, высоким содержанием белка, оптимизации качества протеина и увеличение плотности энергии. Животные были акклиматизированы в этой диете по крайней мере за две недели до операции. После операции водянистыми канала была предложена libidum объявление для упрощения пищи и жидкости.

Важно использовать мышей того же пола в экспериментальных и Шам групп. Было показано, что секс существенно влияют на курс не только из внутрирастительного воспаления, но и кишечные воспаления в различных химически индуцированных колит модели10,,1112. В общем Мыжские животные разработает более выраженный болезнь с большей воспаление, урон склеп, меньше регенерации, более высокого уровня провоспалительных цитокинов и медленнее взыскивают с вес потеря10. Еще одно преимущество использования Мыжские животные — лучше соответствует возрасту предоперационной веса, приводит к лучше компенсации начальный вес послеоперационного периода потери. Тем не менее, самок мышей может использоваться в протоколе, если конкретные вопросы (например, влияние секса гормонов на проявление DC должны быть рассмотрены. Использование мышей-самцов требует больше усилий для поддержания стабильной жилищных условий. Самцов мышей, более склонны к агрессивным взаимодействий, приводит к травм и смерти. Самцов мышей живут в установленной иерархии с одной доминантный самец. После создания иерархии в группе, продолжение боевых действий является менее распространенные13,14. По этой причине мы сформировали экспериментальной группы по прибытии мышей в наших животных фонда по крайней мере за две недели до операции и поддерживали эти группы, пока экспериментов закончилась. В общем экспериментальной группы 5 – 7 животных находились в одной клетке. Поддержание стабильных социальных и жилищных условий имеет первостепенное значение не только для того, чтобы свести к минимуму агрессивное поведение экспериментальных животных. Жилищных условий было показано, влияют на увеличение веса, а также иммунологические параметры15,16,17.

Восприимчивость к химически индуцированных и генетически модифицированные колит модели значительно варьируется между мыши штаммов18,19,20. Настоящий Протокол был создан в мышей C57Bl/6, мыши штамма с четко определенными генетический фон и хорошо изученных иммунной системы21,22,23 , показывает промежуточные сильной воспалительных ответ в декстран сульфата натрия индуцированной колит модель20 и считается прототипом Th1 штамм23. Когда требуется более тяжелой болезни деятельности или среде Th2 можно считать использование других штаммов мыши.

В резюме наш протокол представляет собой ценный инструмент для оценки роли различных типов иммунных клеток, цитокины, chemokines и других сигнальных молекул в патогенезе DC. Большое количество моделей генетически модифицированные мыши доступны с фоном C57BL/6 и может сочетаться с нашей моделью (например, мышей, недостаточно для Ил-17, Ил-10, хемокиновых CXCL13, хемокиновых рецепторов CXCR5 и CCR7 и сфингозин-1-фосфата рецептор 4). Наличие congenic мыши штаммов на фоне C57BL/6 во многом облегчить передачу экспериментов установить роль типов различных клеток, участвующих в этиологии DC. Наконец модель дает возможность оценить влияние местных вмешательств (например, модификация местных микрофлора и местные противовоспалительная терапия) на иммунитет слизистой кишечника, подверженных и не подверженных сегментов и системных иммунного гомеостаза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Нет

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics