Murine बाहर बृहदांत्रसंमिलन, C57BL में मोड़ कोलाइटिस का एक उपंयास मॉडल/

Medicine

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Summary

Murine बाहर बृहदांत्रसंमिलन मानव मोड़ कोलाइटिस, पेट खंड में एक मुख्य रूप से लिम्फोसाईटिक कोलाइटिस के लिए एक Murine मॉडल मल धारा से बाहर रखा प्रदान करता है ।

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Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

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Abstract

मोड़ कोलाइटिस (डीसी) एक चौपट enterostomy का एक परिणाम के रूप में मल धारा से बाहर रखा आंत्र क्षेत्रों के साथ रोगियों में होने वाली एक लगातार नैदानिक स्थिति है । इस रोग के एटियलजि बीमार परिभाषित रहता है, लेकिन इस तरह के Crohn रोग और अल्सरेटिव कोलाइटिस के रूप में शास्त्रीय भड़काऊ आंत्र रोगों की है कि से अलग करने के लिए प्रकट होता है । pathophysiological इस रोग के विकास के लिए अग्रणी तंत्र को समझने के उद्देश्य से अनुसंधान बुरी तरह से एक उचित murine मॉडल की कमी से प्रभावित किया गया है । इस प्रोटोकॉल डीसी के एक murine मॉडल है कि प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका और डीसी के विकास में microbiome के साथ अपनी बातचीत के अध्ययन की सुविधा उत्पंन करता है । C57BL/6 जानवरों का उपयोग कर इस मॉडल में, बृहदांत्र के बाहर के भागों एक बाहर बृहदांत्रसंमिलन बनाने के द्वारा मल धारा से बाहर रखा जाता है, बाहर आंत्र क्षेत्रों में सूजन उदारवादी के लिए हल्के के विकास को ट्रिगर और मानव की पहचान घावों reproducing एक उदारवादी प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ डीसी । चूहे मॉडल के विपरीत, C57BL/6 पृष्ठभूमि पर आनुवंशिक रूप से संशोधित murine मॉडल की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं । हमारे मॉडल के साथ इन जानवरों के संयोजन की अनुमति देता है व्यक्तिगत साइटोकिंस, chemokines, या सक्रिय अणुओं के रिसेप्टर्स की संभावित भूमिकाओं (जैसे, interleukin (IL)-17; IL-10, chemokine CXCL13, chemokine रिसेप्टर्स CXCR5 और CCR7, और sphingosine-1-फॉस्फेट रिसेप्टर 4) डीसी के रोगजनन में मूल्यांकन किया जाना है. C57BL/6 पृष्ठभूमि पर congenic माउस उपभेदों की उपलब्धता काफी हद तक डीसी के एटियलजि में शामिल विशिष्ट कोशिका प्रकार की भूमिकाओं को स्थापित करने के लिए स्थानांतरण प्रयोगों की सुविधा. अंत में, मॉडल स्थानीय हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है (जैसे, स्थानीय microbiome या स्थानीय विरोधी भड़काऊ चिकित्सा के संशोधन) प्रभावित और गैर प्रभावित आंत्र खंडों में श्लैष्मिक उन्मुक्ति पर और प्रणालीगत प्रतिरक्षा homeostasis ।

Introduction

हाल के वर्षों में, गैर संक्रामक कोलाइटिस की एक पर्याप्त संख्या संस्थाओं के शास्त्रीय भड़काऊ आंत्र रोगों से अलग (IBDs; यानी, Crohn की बीमारी या कोलाइटिस ulcerosa) मनुष्यों में चिकित्सकीय और histopathologically विशेषता रही है । इन कोलाइटिस रूपों के विकास के लिए अग्रणी pathophysiological तंत्र पूरी तरह से आंशिक रूप से समझ में नहीं हैं, क्योंकि उपयुक्त पशु मॉडल दुर्लभ हैं । मोड़ कोलाइटिस इन हाल ही में वर्णित संस्थाओं में से एक है । हालांकि शब्द Glotzer1द्वारा १९८० में गढ़ा गया था, एक समान phenotype के प्रारंभिक विवरण १९७२ में Morson2द्वारा दिया गया था । रोग चौपट enterostomy के साथ रोगियों के ९१% करने के लिए ५०% में विकसित करता है, और इसके नैदानिक तीव्रता3,4बदलता है । संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग १२०,००० बृहदांत्रसंमिलन रोगियों की वार्षिक घटनाओं को देखते हुए, इस रोग इकाई एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समस्या का गठन किया ।

इस प्रोटोकॉल के विकास के समग्र लक्ष्य के लिए एक murine डीसी मॉडल है कि एक कोलाइटिस ट्रिगर पर निर्भर करता है कि मानव डीसी में देखा और जो मानव रोग के प्राथमिक histopathological सुविधाओं reproduces के समान प्रदान किया गया । अन्य murine कोलाइटिस मॉडल के विपरीत, हमारे मॉडल में कोलाइटिस प्रेरण आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की आवश्यकता नहीं है (जैसे, IL-7 ट्रांसजेनिक चूहों, एन cadherin प्रमुख नकारात्मक चूहों, या TGFβ-/ चूहों), रासायनिक के आवेदन परेशान पदार्थ (जैसे, dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित कोलाइटिस, या trinitrobenzene sulfonic एसिड (TNBS)-प्रेरित कोलाइटिस), या प्रतिरक्षा कमी चूहों में विशिष्ट कोशिका आबादी के हस्तांतरण (CD45RBउच्च हस्तांतरण के रूप में कोलाइटिस का मॉडल) (एक समीक्षा के लिए,5देखें) । अंय मॉडलों के विपरीत, हमारे डीसी मॉडल के बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली डीसी विकास में शामिल प्रतिरक्षा तंत्र के आकलन की अनुमति देता है । बाहर आंत्र खंड के लिए श्लैष्मिक सूजन की सीमा जठरांत्र संबंधी मार्ग के अन्य भागों में श्लैष्मिक उन्मुक्ति पर इसके नतीजे का आकलन की अनुमति देता है, आंत्र पथ के अन्य प्रतिरक्षा डिब्बों में प्रतिरक्षा homeostasis पर (उदा. , Peyer के धब्बे और mesenteriale लिम्फ नोड्स), और पूरे जीव की प्रतिरक्षा homeostasis पर । अंत में, हमारे मॉडल स्थानीय भड़काऊ दोनों स्थानीय microbiome के रूप में अच्छी तरह से पाचन प्रतिजनों के लिए सामांय स्थानीय वातावरण में परिवर्तन से उत्पंन उत्तेजनाओं को नियंत्रित करने के तंत्र की जांच के लिए एक उपयुक्त उपकरण का गठन किया ।

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Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को पशु चिकित्सा सरकारी प्राधिकरण (Landesamt फर Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF एम-वी)) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. शल्य चिकित्सा देखभाल और पशु की तैयारी

  1. पशु सुविधा में आगमन पर, जानवरों को विभाजित (C57Bl/समान आकार के समूहों में, पिंजरा प्रत्येक समूह एक साथ, और लगातार प्रयोगों भर में समूहों रखें ।
    नोट: एक ही लिंग के जानवरों का प्रयोग करें । वर्णित परिणाम पुरुष चूहों के साथ प्राप्त किए गए.
    नोट: यदि पुरुष जानवरों का इस्तेमाल कर रहे हैं, पिंजरे समूहों के साथ शुरू जब वे उंर के 7 सप्ताह इतना है कि एक पदानुक्रम स्थापित किया जा सकता है, इस प्रकार प्रयोगों के दौरान आक्रामक व्यवहार के जोखिम को कम करने ।
  2. सर्जरी से पहले, एक उच्च ऊर्जा के लिए स्विच करने के लिए एक सप्ताह से कम (> 14 माइकल/) और उच्च प्रोटीन (> 20%) सभी आवश्यक ट्रेस तत्वों और विटामिन युक्त फ़ीड (विवरण के लिए, सामग्री की सूची देखें) ।
    नोट: जब सर्जरी की जाती है तो सभी चूहों का वजन कम से 25 ग्राम करने का आश्वासन दें ।
  3. ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण और analgesia प्रेरित (८७ मिलीग्राम/kg आईएफसआई) और xylazine हाइडरोक्लॉराइड (13 mg/आईएफसआई) । रुको जब तक माउस यांत्रिक उत्तेजना, जैसे पैर की अंगुली पिच, मोटर प्रतिक्रिया के बिना सहन ।
  4. एक गर्मी बुनियाद आपरेशन डेस्क पर तैनात, आपरेशन के दौरान स्थिर स्थिति की गारंटी और शरीर की गर्मी का एक भारी नुकसान से बचने पर एक लापरवाह स्थिति में टेप के साथ narcotized माउस सुरक्षित ।
    नोट: हीट बुनियाद ४० डिग्री सेल्सियस के लिए ३६ ° c की सतह तापमान होना चाहिए; ऑपरेटिंग कमरे का तापमान 21 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए ।

2. बाहर का बृहदांत्रसंमिलन ऑपरेशन

  1. पेट के बाल दाढ़ी । सर्जरी शुरू करने से पहले, तीन बार शराब ७०% और एक iodophor का उपयोग कर आपरेशन क्षेत्र को संक्रमित । अपूतित शर्तों के लिए गारंटी के लिए आपरेशन क्षेत्र कपड़ा ।
  2. इस प्रकार रक्त की कमी को कम करने, पेट की मांसपेशियों और लीनिया अल्बा के साथ incising द्वारा एक 15 मिमी माध्य laparotomy प्रदर्शन करते हैं ।
  3. दो बेकरी atraumatic संदंश का प्रयोग करें, ध्यान से अंधान्त्र, टर्मिनल लघ्वान्त्र, और आरोही और अनुप्रस्थ गुहा से बृहदांत्र खींचना ।
    नोट: mesenteric संरचनाओं के लिए चोट को रोकने के लिए कड़ाई से आंत के यांत्रिक हेरफेर की सीमा के लिए सावधान रहें ।
  4. cecal पोल, आरोही बृहदांत्र, और छोटी आंत (आंकड़े 1a और 1b) की पहचान करें ।
    नोट: आरोही बृहदांत्र की सही पहचान बृहदांत्रसंमिलन के सही स्थान के लिए मौलिक है । मामलों में जहां ileocecal क्षेत्र के एनाटॉमी अस्पष्ट है, Peyer के पैच की उपस्थिति छोटी आंत की पहचान करता है, और गठन मल की उपस्थिति बृहदांत्र की विशेषता है ।
  5. भावी बृहदांत्रसंमिलन की स्थिति निर्धारित करने के लिए किसी मापनी का उपयोग करें. यह 20 मिमी एक बाहर बृहदांत्रसंमिलन के लिए ileocecal वाल्व के लिए बाहर रखा जाना चाहिए ।
  6. ऊपरी सही वृत्त का चक्र में पेट की दीवार में एक दूसरे 3 मिमी चीरा बनाओ । पाश विकृत करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, एक पाश फार्म के लिए इस चीरा के माध्यम से पहले से पहचान की बृहदांत्र खंड खींचो ।
  7. ध्यान से mesocolon के माध्यम से एक 22 गेज लचीला i.v. प्रवेशनी पारित । mesenteric संवहनी संरचनाओं को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
  8. पेरिटोनियल गुहा के लिए आंत वापस ।
  9. सरल टांके और एक resorbable टांका का उपयोग कर त्वचा के लिए लचीला ट्यूब के दोनों सिरों को ठीक करें (जैसे, polyglactin ९१० या polyfil 4-0 1/
  10. laparotomy बंद करने से पहले, द्रव पुनर्जीवन प्रदर्शन ०.५ मिलीलीटर ०.९% खारा के एक intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग कर ।
  11. एक resorbable टांका (जैसे, polyglactin ९१० या polyfil 4-0 1/2c) का उपयोग कर एक सतत सीवन के साथ और मांसपेशी परत बंद करें । एक resorbable टांका (जैसे, polyglactin ९१० या polyfil 4-0 1/2c) का उपयोग कर एक सतत टांका के साथ त्वचा को बंद करें ।
  12. ठीक कैंची का उपयोग कर एक उप-योग transection प्रदर्शन करके बाहरी बृहदांत्र लूप खोलें । अन्त्रपेशी को सभी चोट से बचें । कोलन को पूरी तरह से transect न करें.
  13. एक monofil, अवशोषित टांका (जैसे, polydioxanone या monofil 6-0 3/8s) का उपयोग कर एक बृहदांत्रसंमिलन और त्वचा के लिए तीन एकल पूर्ण मोटाई टांके का उपयोग कर खोलने को ठीक करें । afferent पाश, जो एक कार्यात्मक अंत बृहदांत्रसंमिलन है, और efferent पाश, जो एक श्लेष्म नालव्रण है, स्पष्ट रूप से इस बिंदु पर अलग कर रहे हैं (चित्रा 1c).
    नोट: ऑपरेशन समय से कम 20 द्रव और थर्मल नुकसान की सीमा मिनट होना चाहिए ।
  14. सर्जरी परिष्करण के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अल्ट्रासोनिक स्नान में एक एल्डिहाइड-मुक्त संक्रमण समाधान का उपयोग कर उपकरणों को संक्रमित ।

3. अन्तर्वासना ऑपरेशन (Colotomy)

  1. १.१ चरण निष्पादित करें । २.४ के माध्यम से ।
  2. भावी colotomy स्थिति निर्धारित करने के लिए किसी मापनी का उपयोग करें । colotomy प्रयोगात्मक समूह में बृहदांत्रसंमिलन के रूप में ileocecal वाल्व से एक ही दूरी तैनात किया जाना चाहिए ।
  3. ठीक कैंची का उपयोग करते हुए दो तिहाई से कम इसकी परिधि बृहदांत्र खोलें ।
  4. एक परत, पूर्ण मोटाई बाधित एक monofil, अवशोषित टांका (जैसे, polydioxanone, monofil 6-0 3/8s) का उपयोग कर सीवन के साथ colotomy बंद करें ।
    नोट: ऑपरेशन समय एक प्रयोग सर्जन के लिए 20 मिनट से कम होना चाहिए, द्रव और थर्मल नुकसान सीमित.
  5. २.१० चरण निष्पादित करें । , २.११. और २.१४.

4. पश्चात की देखभाल

  1. उनके पिंजरों में जानवरों को लौटें । ३७ ° c (जैसे, एक अवरक्त दीपक के साथ) जब तक चूहों पूरी तरह से जाग रहे है की एक अच्छी तरह से स्वभाव का माहौल प्रदान करें । फिर, एक तापमान और आर्द्रता विनियमित वातावरण में चूहों रखें (21 ° c; 30% ± 10% सापेक्षिक आर्द्रता). भोजन और पीने के पानी के लिए नि: शुल्क प्रवेश की अनुमति । तरल पदार्थ उठाने की सुविधा के लिए, अतिरिक्त पानी से लथपथ पशु चारा प्रदान करते हैं ।
  2. इंजेक्शन द्वारा प्रारंभ पश्चात analgesia ०.१ मिलीग्राम/kg शरीर का वजन buprenorphine एस॰सी॰ जब जानवरों यांत्रिक उत्तेजना की प्रतिक्रिया दिखाते हैं । श्वसन अवसाद से बचने के लिए सावधान रहें ।
  3. पहले पश्चात सप्ताह के दौरान जारी analgesia के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल tramadol के साथ पूरक पेयजल ।
  4. कम गतिशीलता की वजह से कम तरल पदार्थ का सेवन करने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, पहले पश्चात सप्ताह के दौरान पिंजरे में एक ठोस पेय पैड की आपूर्ति ।
  5. पहले सप्ताह के दौरान जानवरों और स्कोर पशु व्यवहार दैनिक वजन, हर दूसरे दिन पहले महीने के शेष के दौरान, और दूसरे महीने के दौरान हर तीसरे दिन रोग गंभीरता Kleinwort एट अल में वर्णित स्कोर का उपयोग कर । 6.

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Representative Results

सर्जरी अच्छी तरह से दोनों प्रयोगात्मक (बृहदांत्रसंमिलन) और अन्तर्वासना (colotomy) समूहों में सहन कर रहा है । शल्य चिकित्सा और Perioperative प्रबंधन सही ढंग से किया जाता है जब Perioperative मृत्यु दर 10% से अधिक नहीं होना चाहिए । प्रथम पश्चात सप्ताह में, महत्वपूर्ण वजन घटाने प्रयोगात्मक और अन्तर्वासना दोनों समूहों में देखा जाता है । अन्तर्वासना समूह के पशु आमतौर पर चौथे पश्चात दिन की ओर अपने वजन नादिर प्राप्त करते हैं, लेकिन यह प्रयोगात्मक समूह में एक दिन बाद होता है । वजन घटाने प्रयोगात्मक समूह में अधिक स्पष्ट है, प्रारंभिक शरीर के वजन के २१.७% तक पहुंचने । इसके विपरीत, शम पशु अपने प्रारंभिक शरीर के वजन का १०.८% खो (चित्रा 2)6। पहले पश्चात सप्ताह में वजन नादिर के बाद, शरीर के वजन दोनों प्रयोगात्मक समूहों में लगातार बढ़ जाती है, लेकिन प्रयोगात्मक समूह में एक धीमी ढलान के साथ. लक्षण और गंभीर आंत्र सूजन के लक्षण (यानी, खूनी स्राव या तरल आंत्र आंदोलनों न तो प्रयोगात्मक में होते हैं और न ही शम समूह6). पहले ६० दिनों के दौरान कुल मृत्युदर बृहदांत्रसंमिलन समूह में ४०% के आसपास और colotomy समूह में लगभग 10% है । सबसे अधिक मौतें पहले पश्चात सप्ताह के दौरान होती हैं (प्रायोगिक समूह में ६१%, शम समूह में ६६%) । मौत के कारणों चित्रा 3में दिखाया गया है ।

मुख्य रूप से लिम्फोसाईटिक कोलाइटिस के विकास में चूहों के परिणाम में बाहर बृहदांत्रसंमिलन मानव डीसी की पहचान ऊतकवैज्ञानिक सुविधाओं reproducing । इन परिवर्तन आंत्र अपवर्जन की अवधि के साथ वृद्धि हुई है । तहखाना लंबाई काफी बाहर रखा आंत्र खंडों में छोटा है । यह छोटा मल मोड़ (चित्रा 3ए) के 14 दिनों के बाद सांख्यिकीय महत्व तक पहुंचता है । प्याला कोशिका असर तहखाना लंबाई छोड़ दिया आंत्र क्षेत्रों (चित्र बी) में 30 दिनों के बाद कम है । निरपेक्ष प्याला कोशिका संख्या 14 पश्चात दिन (चित्रा 3सी) के बाद छोड़ दिया आंत्र खंड में तहखाने में भी काफी कम कर रहे हैं । डीसी की पहचान घाव, म्यूकोसा में लसीकावत् कूप के विकास, मल विचलन की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है । हालांकि लसीकावत् कूप की एक वृद्धि की संख्या के रूप में दो सप्ताह के रूप में जल्दी मनाया जा सकता है, मतभेदों को दो महीने के बाद महत्वपूर्ण बन (आंकड़े धारा 5-सी) । पहले से वर्णित सभी histopathological परिवर्तन बाहर निकाले गए आंत्र खंडों के समीपस्थ क्षेत्रों की तुलना में अधिक स्पष्ट हैं । तीव्र सूजन की निशानी के रूप में एक ठेठ neutrophilic घुसपैठ आमतौर पर (आंकड़े 5d-ई) नहीं मनाया जाता है ।

स्थानीय आंत्र सूजन के एक प्रणालीगत नतीजे का संकेत के रूप में, न्युट्रोफिल गिनती काफी बृहदांत्रसंमिलन पशुओं में वृद्धि हुई है के रूप में 14 दिनों के सर्जरी के बाद के रूप में जल्दी । यह अंतर अवलोकन अवधि (६० दिन) के अंत तक बनाए रखा है । प्लेटलेट गिनती ६० दिनों (चित्रा 6) के बाद बृहदांत्र मोड़ के साथ पशुओं में थोड़ा बढ़ रहे हैं । बृहदांत्रसंमिलन ग्रुप की तुलना में अन्तर्वासना ग्रुप में ऑपरेशन के बाद हीमोग्लोबिन लेवल और हेमाटोक्रिट 14 दिन कम हुए हैं ।

यह दिखाया गया है कि कुतर में विटामिन की कमी के कारण कम मतलब कणिका मात्रा (एमसीएच) और मतलब कणिका हीमोग्लोबिन (MCV) मान7. हमारे मॉडल में, हम इन दोनों मापदंडों में 14 और 30 दिनों के बाद प्रारंभिक वृद्धि देखते हैं । अब फ़ॉलो-अप (चित्रा 7) के बाद सामान्य मानों पर MCV और एमसीएच दोनों वापस लौटें. यह पता चलता है कि बाहर बृहदांत्रसंमिलन दीर्घकालिक अनुवर्ती के दौरान नैदानिक महत्वपूर्ण विटामिन की कमी में परिणाम नहीं है ।

Figure 1
चित्रा 1: cecal क्षेत्र और शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के एनाटॉमी । (क) पश्चात शरीर रचना विज्ञान की चित्रमय प्रतिनिधित्व । (ख) cecal पोल और संरचनात्मक स्थलों की स्थलाकृति । (ग) बृहदांत्रसंमिलन के उद्घाटन के चित्रमय प्रतिनिधित्व । चित्रा 1a Kleinwort एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: शरीर का वजन विकास । शरीर के वजन को ऑपरेटिव शरीर के वजन के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है । बृहदांत्रसंमिलन और शम (colotomy) जानवरों के शरीर का वजन घटता पता चलता है कि प्रारंभिक पश्चात वजन घटाने बृहदांत्रसंमिलन समूह में काफी अधिक था अन्तर्वासना समूह की तुलना में (p < ०.००१). मूल्यों का मतलब है ± प्रति समूह 21-26 पशुओं के पार अर्थ के मानक त्रुटियों (21 colostomies प्राप्त जानवरों; अन्तर्वासना ग्रुप में 26 पशु थे) । यह आंकड़ा Kleinwort एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मौत का कारण बनता है । जटिलताओं का प्रतिनिधित्व सभी कारण मृत्यु दर के प्रतिशत के रूप में किया जाता है और एक पाई चार्ट ((क) बृहदांत्रसंमिलन समूह, (ख) शम समूह) में सचित्र हैं । पश्चात की जटिलताओं necropsy द्वारा निर्धारित किया गया । सिंड्रोम बर्बाद सतत वजन प्रारंभिक शरीर के वजन के ३३% से अधिक और necropsy में कोई अंय निष्कर्षों के रूप में परिभाषित किया गया था । necropsy पर Ileus और anastomotic लीकेज का पता चला । Stoma जटिलताओं peristomal फोड़े और mucocutaneous जुदाई के रूप में परिभाषित किया गया । अंय जटिलताओं laparotomy के घाव dehiscence शामिल, अंधान्त्र के ischemia, और necropsy पर स्पष्ट नहीं मामलों । पश्चात जटिलताओं के वितरण में महत्वपूर्ण अंतर समूहों के बीच देखा गया (p = ०.०२१, दो के लिए फिशर सटीक परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण के लिए 6 × 6 आकस्मिक तालिकाओं) । इसमें बृहदांत्रसंमिलन ग्रुप में ३९ पशु थे और 29 अन्तर्वासना ग्रुप में । यह आंकड़ा Kleinwort एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तहखाना लंबाई और प्याला सेल जनसंख्या. तहखाना लंबाई और प्याला कोशिका संख्या आवर्ती एसिड Schiff धुंधला के बाद मलाशय के तेल वर्गों का उपयोग कर निर्धारित किया गया. (क) तहखाना लंबाई काफी मोड़ कोलाइटिस (डीसी) के साथ जानवरों के मलाशय में कमी आई थी । (ख) तहखाना के प्याला कोशिका-असर क्षेत्र की लंबाई मापा गया था और पूर्ण तहखाना लंबाई करने के लिए एक अनुपात के रूप में सेट. तीस और ६० दिन पश्चात, तहखाना-लंबाई-असर प्याला कोशिकाओं के प्रतिशत डीसी समूह में कमी आई थी । (ग) प्याला कक्ष संख्याएं अन्तर्वासना समूह की तुलना में डीसी पशुओं में काफी कम थीं । (क) के माध्यम से (ग) शो में रेखांकन का अर्थ है और समूह प्रति 5 से 9 पशुओं के पार मानक त्रुटियों (बृहदांत्रसंमिलन 14 और 30 दिन, अन्तर्वासना 14 दिन: n = 8; बृहदांत्रसंमिलन ६० दिन: n = 5; अन्तर्वासना 30 और ६० दिन: एन = 9); ∗ p < ०.०५; ∗ ∗ p < ०.०१ । यह आंकड़ा Kleinwort एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लसीकावत् कूप और भड़काऊ घुसपैठ । (क) चौपट कालोनियों और शम पशुओं के लसीकावत् कूप hematoxylin और eosin के साथ सना हुआ मलाशय के आयल वर्गों पर गिने जाते थे. ग्राफ से पता चलता है मतलब है और समूह के प्रति 5 से 9 पशुओं के पार मानक त्रुटियों (बृहदांत्रसंमिलन 14 और 30 दिन, अन्तर्वासना 14 दिन: n = 8; बृहदांत्रसंमिलन ६० दिन: n = 5; नियंत्रण 30 और ६० दिन: n = 9), ∗ p < ०.०५; ∗ ∗ p < ०.०१ । (ख) और (ग) बृहदांत्रसंमिलन के मलाशय के वर्गों के प्रतिनिधि उदाहरण (ख) और शम (ग) पशु ६० दिन पश्चात hematoxylin और eosin के साथ दाग. एक प्रमुख लसीकावत् कूप (∗) एक बृहदांत्रसंमिलन माउस की श्लेष्मा झिल्ली में मौजूद था । स्केल बार्स १०० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) और (ङ) आयल वर्गों पर chloroacetate esterase प्रतिक्रिया के साथ धुंधला न्युट्रोफिल granulocytes का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया. पार के वर्गों पर, एक तीव्र भड़काऊ neutrophilic घुसपैठ बृहदांत्रसंमिलन समूह (डी) में न तो मनाया गया था और न ही शम जानवरों (ई) में ६० दिनों के लिए पश्चात । स्केल पट्टियां १०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा Kleinwort एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: न्युट्रोफिल और प्लेटलेट मायने रखता है । शिरापरक रक्त के नमूनों की रक्त गणना एक पशु चिकित्सा रुधिर विश्लेषक द्वारा निर्धारित किया गया । (क) न्युट्रोफिल के मायने बृहदांत्रसंमिलन समूह की तुलना में शम पशुओं के मुकाबले ६० दिन पश्चात तक काफी बढ़ गए थे. (ख) बृहदांत्रसंमिलन समूह ६० दिन पश्चात् में प्लेटलेट काउंटों को थोड़ा ऊंचा किया गया. ग्राफ़ दिखाता है कि समूह के प्रति 5 से 9 पशुओं (बृहदांत्रसंमिलन 14 और 30 दिन, शम 14 दिन: n = 8; बृहदांत्रसंमिलन ६० दिन: n = 5; शम 30 और ६० दिन: n = 9), ∗ p < ०.०५; ∗ ∗ p < ०.०१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: लाल रक्त कोशिका मापदंडों । शिरापरक रक्त के नमूनों की रक्त गणना एक पशु चिकित्सा रुधिर विश्लेषक द्वारा निर्धारित किया गया । (a) हीमोग्लोबिन और (b) हेमाटोक्रिट के बृहदांत्रसंमिलन समूह की तुलना में शम समूह में काफी कमी आई. (ग) मतलब कणिका खंड (एमसीएच) काफी ऊंचा था 14 और 30 दिनों के बाद बृहदांत्रसंमिलन समूह में, अन्तर्वासना समूह की तुलना में, लेकिन सामान्य करने के बाद वापस ६० दिन. (घ) मतलब कणिका हीमोग्लोबिन (MCV) मूल्यों को 30 दिनों के बाद ऊंचा किया गया था, लेकिन अब ६० दिनों के बाद बृहदांत्रसंमिलन समूह में बाद में शम पशुओं की तुलना में । ग्राफ़ दिखाता है कि समूह के प्रति 5 से 9 पशुओं (बृहदांत्रसंमिलन 14 और 30 दिन, शम 14 दिन: n = 8; बृहदांत्रसंमिलन ६० दिन: n = 5; शम 30 और ६० दिन: n = 9), ∗ p < ०.०५; ∗ ∗ p < ०.०१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत डीसी के murine मॉडल मज़बूती से मानव डीसी (जैसे, सूजन आंत्र क्षेत्रों के म्यूकोसा में लसीकावत् कूप के de नोवो विकास के histopathological सुविधाओं reproduces, तहखाना छोटाहै, और में कटौती प्याला कक्ष संख्याएं) । इस लाभ के अलावा, इस मॉडल के एक बहुत ही ट्रिगर कारक द्वारा प्रेरित है और हल्के गंभीरता के लिए उदारवादी के एक नैदानिक पाठ्यक्रम के साथ प्रस्तुत करता है के रूप में सबसे अधिक प्रभावित मनुष्यों में मामला है ।

reproducible परिणाम और स्वीकार्य perioperative घातकता प्राप्त करने के लिए, microsurgical तकनीकों में कुछ अभ्यास आवश्यक है । हालांकि, दोनों बृहदांत्रसंमिलन और शम आपरेशन (colotomy) बहुत कम perioperative नश्वरता के साथ किया जा सकता है (< 10%) । कुछ संचालन कदम बहुत महत्व के हैं: 1) सकारात्मक बृहदांत्र और टर्मिनल लघ्वान्त्र की पहचान । मामलों में जहां ileocecal क्षेत्र के एनाटॉमी स्पष्ट नहीं है, बृहदांत्र की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है स्टूल और टर्मिनल लघ्वान्त्र है Peyer पैच की उपस्थिति से । 2) जब exteriorizing बृहदांत्रसंमिलन पाश, आश्वासन अन्त्रपेशी, इस प्रकार mesenteric ischemia और यांत्रिक ileus से परहेज नहीं है । 3) जब लचीला ट्यूब के साथ अन्त्रपेशी puncturing, एक पोत मुक्त क्षेत्र चुना है, इस प्रकार खून बह रहा है और mesenteric ischemia को रोकने का आश्वासन दिया । 4) पेट की दीवार में छोटा सा चीरा बनाते समय, पर्याप्त रक्तस्तम्भन की जांच करें । यदि आवश्यक हो, मांसपेशियों वाहिकाओं से खून बह रहा बंद करने के लिए थर्मामीटर-जमावट का उपयोग करें । 5) कालोनी पाश अपनी परिधि के दो तिहाई से कम में खुला है और आश्वासन दिया है कि पीछे की दीवार पर्याप्त बाहरी है, इस प्रकार बाहर आंत्र क्षेत्रों के लिए मल बीतने की पूरी रुकावट की गारंटी । 6) विश्वास दिलाता हूं कि दोनों बृहदांत्रसंमिलन समाप्त होता है अच्छी तरह से त्वचा के लिए तय पेरिटोनियल गुहा उच्च संक्रमण जोखिम या एक यांत्रिक ileus में जिसके परिणामस्वरूप के लिए एक खुले मार्ग से बचने के कारण मल धारा से बाहर नहीं कर सकते । आम तौर पर, सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं चश्मा या सर्जिकल सूक्ष्मदर्शी शीशा के बिना किया जा सकता है । सामांय में, इन उपकरणों के उपयोग और प्रशिक्षण की आवश्यकता है ।

यहां तक कि जब शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की जटिलता केवल उदारवादी है, वहां कई आवश्यक ऑपरेटिव और perioperative मुद्दों को सफलतापूर्वक reproducible परिणामों के साथ प्रयोग को समाप्त करने पर विचार किया जाएगा रहे हैं ।

यह एक स्थाई बृहदांत्रसंमिलन कि चूहों एक बरकरार अंधान्त्र है के साथ दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए आवश्यक है । समीपस्थ ileocecal वाल्व से सटे colostomies के साथ एक प्रयोगात्मक समूह के पहले पश्चात सप्ताह में १००% की मृत्यु दर दिखाया क्योंकि अपरिवर्तनीय वजन घटाने (दिखाया नहीं डेटा) । इसलिए, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है बृहदांत्रसंमिलन साइट का चयन करने के लिए है Bauhin वाल्व से बाहर से कम 20 मिमी । यह अवलोकन कुतर पाचन के फिजियोलॉजी के कारण हो सकता है । अंधान्त्र के समीपस्थ बृहदांत्र से प्रतिगामी परिवहन इन प्रजातियों में होता है । अंधान्त्र है जहां जीवाणु माइक्रोफ्लोरा occurs8 द्वारा पोषक तत्वों का संश्लेषण । सामांय MCV और एमसीएच मूल्यों लंबी अवधि के अनुवर्ती के दौरान संकेत मिलता है कि बाहर colostomies के साथ पशुओं महत्वपूर्ण विटामिन की कमी से ग्रस्त नहीं है । इसके अलावा, coprophagy उनके प्राकृतिक वातावरण में कुतर के पोषण व्यवहार का एक अनिवार्य हिस्सा है । जब मॉडल की स्थापना, हम बहुत चिंतित थे कि एक स्थाई बृहदांत्रसंमिलन की उपस्थिति का एक परिणाम के रूप में coprophagy perturbing पोषक तत्वों की कमी में परिणाम सकता है, (जैसे, विटामिन बी) । हालांकि, जबकि यह शर्तों के तहत एक समस्या है जहां पोषक तत्वों के लिए उपयोग सीमित है, यह पहले से दिखाया गया है कि coprophagy प्रयोगात्मक शर्तों के तहत अपने पोषण का महत्व पानी और पोषण के लिए मुफ्त अतिरिक्त के साथ खो देता है-संतुलित भोजन9 . हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, यह पश्चात पोषण की मात्रा की स्थिति का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक उच्च प्रोटीन सामग्री, अनुकूलित प्रोटीन की गुणवत्ता, और वृद्धि की ऊर्जा घनत्व था कि पशु फ़ीड का इस्तेमाल किया । पशु शल्य चिकित्सा से कम से दो सप्ताह पहले इस आहार को acclimatized थे. पश्चात, पानी से लथपथ फ़ीड faciliate भोजन और तरल पदार्थ का सेवन करने के लिए विज्ञापन libidum की पेशकश की थी ।

यह दोनों प्रयोगात्मक और अन्तर्वासना समूहों में एक ही लिंग के चूहों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । सेक्स के लिए महत्वपूर्ण रूप से न केवल प्रणालीगत सूजन के पाठ्यक्रम को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी आंत्र सूजन के विभिन्न रासायनिक-प्रेरित कोलाइटिस मॉडल10,11,12. सामान्य में, पुरुष जानवरों अधिक सूजन के साथ अधिक स्पष्ट रोग का विकास होगा, अधिक तहखाना नुकसान, कम पुनर्जनन, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के उच्च स्तर, और वजन घटाने से धीमी वसूली10. पुरुष जानवरों का उपयोग करने का एक और लाभ बेहतर उम्र मिलान ऑपरेटिव शरीर के वजन, प्रारंभिक पश्चात वजन घटाने की अवधि के बेहतर मुआवजे के लिए अग्रणी है. फिर भी, महिला चूहों प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर विशिष्ट प्रश्न (जैसे, डीसी की अभिव्यक्ति पर सेक्स हार्मोन के प्रभाव को संबोधित किया जाना है । पुरुष चूहों का उपयोग स्थिर आवास की स्थिति को बनाए रखने में और अधिक प्रयास की आवश्यकता है । पुरुष चूहों चोट और मौत के लिए अग्रणी आक्रामक बातचीत करने के लिए अधिक प्रवण हैं । पुरुष चूहे एक प्रमुख पुरुष के साथ स्थापित पदानुक्रम में रहते हैं । एक बार समूह में पदानुक्रम की स्थापना की है, जारी लड़ाई कम13,14आम है । इस कारण से, हम सर्जरी से पहले हमारे पशुओं की सुविधा में चूहों के आगमन पर प्रयोगात्मक समूहों का गठन किया है और इन समूहों को बनाए रखा जब तक प्रयोगों समाप्त हो गया । सामांय में, 5 से 7 पशुओं के प्रयोगात्मक समूहों के एक पिंजरे में रखा गया था । स्थिर सामाजिक और आवास की स्थिति का रखरखाव अत्यंत महत्वपूर्ण नहीं केवल प्रयोगात्मक पशुओं के आक्रामक व्यवहार को कम करने के लिए किया गया था । आवास की स्थिति के लिए वजन के साथ ही प्रतिरक्षा मानकों15,16,17को प्रभावित दिखाया गया है ।

रासायनिक प्रेरित और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोलाइटिस मॉडल के लिए संवेदनशीलता माउस उपभेदों के बीच काफी बदलता है18,19,20। वर्तमान प्रोटोकॉल C57Bl/6 चूहों में स्थापित किया गया था, एक अच्छी तरह से परिभाषित आनुवंशिक पृष्ठभूमि और एक अच्छी तरह से विशेषता प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक माउस तनाव21,22,23 कि मजबूत करने के लिए मध्यवर्ती से पता चलता है भड़काऊ dextran सल्फेट सोडियम-प्रेरित कोलाइटिस मॉडल20 में प्रतिक्रिया और एक prototypical Th1 तनाव23माना जाता है । अधिक गंभीर रोग गतिविधियों या एक Th2 वातावरण की आवश्यकता है जब अन्य माउस उपभेदों के उपयोग पर विचार किया जा सकता है ।

संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल डीसी के रोगजनन में विभिंन प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार, साइटोकिंस, chemokines, और अंय संकेत अणुओं की भूमिका का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का गठन किया । आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों मॉडल की एक बड़ी संख्या C57BL/6 पृष्ठभूमि के साथ उपलब्ध हैं और हमारे मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है (जैसे, चूहों आईएल के लिए कमी-17, आईएल-10, chemokine CXCL13, chemokine-रिसेप्टर्स CXCR5 और CCR7, और sphingosine-1-फॉस्फेट रिसेप्टर 4). C57BL/6 पृष्ठभूमि पर congenic माउस उपभेदों की उपलब्धता मुख्यतः डीसी के एटियलजि में शामिल विशिष्ट कोशिका प्रकार की भूमिका स्थापित करने के लिए स्थानांतरण प्रयोगों की सुविधा । अंत में, मॉडल स्थानीय हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है (जैसे, स्थानीय microbiome और स्थानीय विरोधी भड़काऊ चिकित्सा के संशोधन) प्रभावित और गैर प्रभावित आंत्र क्षेत्रों में श्लैष्मिक उन्मुक्ति पर और प्रणालीगत प्रतिरक्षा homeostasis.

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Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

कोई

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

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