Murine distale Colostomy, en ny modell av avledning kolitt i C57BL/6 mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Murine distale colostomy gir en murine modell for menneskelig avledning kolitt, en overveiende lymfatisk kolitt i kolon segmentet ekskludert fra fecal strømmen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Avledning kolitt (DC) er en hyppig klinisk tilstand forekommer hos pasienter med tarm segmenter ekskludert fra fecal strømmen som følge av en viderekobling enterostomy. Etiologien for denne sykdommen er fortsatt dårlig definerte men vises forskjellig fra det klassiske inflammatorisk tarm sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt. Forskning å dechiffrere patofysiologiske mekanismer fører til utvikling av denne sykdommen har vært hardt hindret av mangelen på en passende murine modell. Denne protokollen genererer en murine modell av DC som muliggjør studiet av immunsystemets rolle og dets interaksjon med microbiome i utviklingen av DC. I denne modellen bruke C57BL/6 dyr er distale deler av kolon utelukket fra fecal strømmen ved å opprette en distale colostomy, utløser utviklingen av mild til moderat betennelse i ekskluderte tarm segmenter og gjengi hallmark lesjoner av menneskelig FM med et moderat systemisk inflammatorisk respons. I motsetning til rotte modell finnes det et stort antall genetisk endret murine modeller på C57BL/6 bakgrunn. Kombinasjonen av disse dyrene med vår modell gjør det mulig for potensielle rollene personlige cytokiner, chemokines eller reseptorer bioaktive molekyler (f.eksinterleukin (IL) -17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine reseptorer CXCR5 og CCR7 og sphingosine-1-fosfat reseptoren 4) skal vurderes i patogenesen av DC. Tilgjengeligheten av congenic musen stammer på C57BL/6 bakgrunn forenkler i stor grad overføringen eksperimenter for å etablere rollene forskjellige celletyper involvert i etiologien FM. Endelig modellen tilbyr muligheten til å vurdere påvirker av lokale tiltak (f.eks, endring av lokale microbiome eller lokale anti-inflammatorisk terapi) på slimhinnene immunitet i berørt og uberørt tarm segmenter og på systemisk immun homeostase.

Introduction

De siste årene, et betydelig antall ikke-smittsomme kolitt enheter forskjellig fra klassisk inflammatorisk tarm sykdommer (IBDs; dvs., Crohns sykdom eller kolitt ulcerosa) har vært klinisk og histopathologically preget hos mennesker. Patofysiologiske mekanismer fører til utvikling av disse kolitt former er ikke helt forstått delvis fordi aktuelle dyremodeller er knappe. Avledning kolitt er en ansetter nylig beskrevet. Selv om begrepet ble lansert i 1980 av Glotzer1, ble første beskrivelsen av en lignende fenotypen gitt i 1972 av Morson2. Sykdommen utvikler seg i 50% til 91% av pasienter med viderekobling enterostomy, og kliniske intensiteten varierer3,4. Entiteten sykdom gitt årlige forekomsten av rundt 120000 colostomy pasienter i de forente stater, og utgjør en viktig helseproblem.

Det overordnede målet med utvikling av denne protokollen var å gi en murine DC modell som er avhengig av en kolitt utløser lik som sett i menneskelig DC og som gjengir histopathological hovedfunksjonene sykdom av menneskelig. I motsetning til andre murine kolitt modeller, kolitt induksjon i modellen krever ikke genmodifiserte dyr (f.eks, IL-7 transgene mus, N-cadherin dominerende negative mus eller TGFβ- / - mus), bruk av kjemisk irriterende stoffer (f.eks, dekstran sulfat natrium (DSS) - indusert kolitt, eller trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) - indusert kolitt) eller overføring av bestemt celle populasjoner i immun mangelfull mus (som CD45RBhøy overføring modell av kolitt) (for en vurdering, se5). I motsetning til andre modeller lar intakt immunsystemet til våre DC-modellen vurdering av immunologiske mekanismen involvert i DC utvikling. Begrensning av slimhinnene betennelse ekskluderte tarm segmentet lar vurdering av sin ettervirkning mucosal immunitet i andre deler av gastrointestinaltraktus, på immun homeostase i andre immun avdelinger av tarmkanalen (f.eks , Peyers oppdateringer og mesenteriale lymfeknutene), og immun homeostase av hele organismen. Endelig, vår modell utgjør et velegnet verktøy for å undersøke mekanismene som styrer lokale inflammatorisk stimuli fra endringer i den normale lokale miljøet for både den lokale microbiome samt fordøyelsessystemet antigener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av veterinær myndighetene (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei elver, (LALLF M-V)).

1. preoperativ omsorg og utarbeidelse av dyret

  1. Ved ankomst i dyr anlegget, dele dyr (C57Bl/6) inn i grupper av samme størrelse, bur hver gruppe sammen og holde grupper konstant gjennom eksperimenter.
    Merk: Bruk dyr av samme kjønn. Resultatene som beskrives ble innhentet med mannlige mus.
    Merk: Hvis mannlig dyr brukes, bur grupper sammen når de er 7 ukens av alderen slik at et hierarki kan etableres, således minimere risikoen for aggressiv atferd under eksperimenter.
  2. Minst en uke før operasjonen, bytte til energi (> 14 MJ/kg) og høy protein (> 20%)-feed som inneholder alle viktige sporstoffer og vitaminer (for detaljer, se liste over materialer).
    Merk: Forsikre alle mus veie minst 25 g når operasjonen utføres.
  3. Indusere anestesi og analgesi ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (87 mg/kg IP) og xylazine hydroklorid (13 mg/kg IP). Vent til musen tåler mekanisk stimulering, f.eks tå pitch, uten motor.
  4. Sikre narcotized musen med bånd i supine posisjon på en varme underlag plassert ved drift, garantere stabil posisjonering under operasjonen og unngå en overveldende tap av kroppsvarme.
    Merk: Den varme underlag bør ha en overflate temperatur på 36 ° C til 40 ° c. operating romtemperaturen bør være 21 ° C.

2. distale Colostomy operasjon

  1. Barbere abdominal håret. Før du starter operasjonen, Desinfiser feltet drift tre ganger med alkohol 70% og en iodophor. Drapere feltet operasjonen garantere for aseptiske forhold.
  2. Utføre en 15 mm median laparotomy ved incising magemusklene og peritoneum langs linea alba, således minimere blodtap.
  3. Bruk to DeBakey atraumatiske tang, trekk forsiktig cecum, terminal ileum, og stigende og transverse kolon fra bukhulen.
    Merk: Pass på å strengt begrense mekanisk manipulering av tarmen kan hindre skade hvem strukturer.
  4. Identifisere cecal pole, stigende kolon og tynntarmen (tall 1a og 1b).
    Merk: Riktig identifikasjon av stigende kolon er grunnleggende for riktig plassering av colostomy. I tilfeller der anatomien i regionen ileocecal er tvetydig, tilstedeværelse Peyers lapper identifiserer tynntarm og tilstedeværelsen av formet avføring karakteriserer kolon.
  5. Bruk en linjal til å bestemme plasseringen av den fremtidige colostomy. Den skal plasseres 20 mm distale til ileocecal ventilen for en distale colostomy.
  6. Gjør andre 3 mm snitt i bukveggen i øvre høyre kvadrant. Tre tidligere identifisert kolon segmentet gjennom denne snitt å danne en løkke, være forsiktig med å forvrenge løkken.
  7. Forsiktig bestå en 22-gauge fleksibel IV kanyle gjennom mesocolon. Ta vare ikke for å skade hvem vaskulære strukturer.
  8. Tilbake tarmen til bukhulen.
  9. Løse begge ender av fleksible rør til huden med enkel masker og en resorbable Sutur (f.eks, polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Før du lukker laparotomy, utføre væske lungeredning med en intraperitoneal injeksjon av 0,5 mL 0,9% saltløsning.
  11. Lukk peritoneum og muskel laget med en Sutur kontinuerlig med en resorbable Sutur (f.eks polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c). Lukk huden med en Sutur kontinuerlig med en resorbable Sutur (f.eks polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Åpne exteriorized kolon løkken ved å utføre en delsum transection med en fin saks. Unngå alle skader på mesentery. Ikke mudderbunn kolon helt.
  13. Løse hver colostomy åpning bruker tre enkelt full-tykkelse masker til peritoneum og huden med en monofil, absorberbare Sutur (f.eks, polydioxanone eller monofil 6-0 3/8s). Afferente løkken, som er en funksjonell slutten-colostomy, og efferent loop, som er en slimete fistel, skilles klart på dette punktet (figur 1 c).
    Merk: Operasjonstid bør være mindre enn 20 minutter å begrense flytende og termisk tap.
  14. Etter endt kirurgi, desinfisere instrumenter med en aldehyd-fri desinfeksjon løsning i ultralydbad ifølge instruksjonene fra produsenten.

3. humbug operasjon (Colotomy)

  1. Utfør trinnene 1.1. gjennom 2.4.
  2. Bruk en linjal bestemme fremtidige colotomy plasseringen. Colotomy bør plasseres i samme avstand fra ileocecal ventilen som colostomy i forsøksgruppen.
  3. Åpne kolon minst to tredjedeler omkretsen med fine saks.
  4. Lukk colotomy med ett lag, full-tykkelse avbrutt Sutur bruker en monofil, absorberbare Sutur (f.eks polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
    Merk: Operasjonstid bør være mindre enn 20 minutter for en experimented kirurg, begrense flytende og termisk tap.
  5. Utfør trinnene 2.10. , 2.11. og 2,14.

4. postoperativ pleie

  1. Tilbake dyr til deres burene. Gi en godt varmebehandlet atmosfære av 37 ° C (f.eksmed en infrarød lampe) til mus er fullt våken. Så, holde mus i en temperatur og fuktighet-regulert miljø (21 ° C, 30% ± 10% relativ fuktighet). Gir gratis tilgang til mat og drikkevann. For å lette væske opptak, gi ekstra vann-gjennomvåt dyrefôr.
  2. Starte postoperativ analgesi ved å injisere 0,1 mg/kg kroppen vekt buprenorfin SC når dyr viser respons til mekanisk stimulering. Være forsiktig for å unngå Respirasjonsdepresjon.
  3. Supplere drikkevann med 1 mg/mL tramadol for fortsatt analgesi i første postoperativ uke.
  4. For å kompensere for redusert fluid inntak skyldes nedsatt mobilitet, levere en Solid drikke pute i buret i første postoperativ uke.
  5. Veie dyrene og score dyr oppførsel daglig under den første uken, hver annen dag under resten av den første måneden, og hver tredje dag i den andre måneden med sykdom alvorlighetsgrad score beskrevet i Kleinwort et al. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kirurgi er godt tolerert både i eksperimentelle (colostomy) og humbug (colotomy) grupper. Perioperative dødelighet bør ikke overstige 10% når kirurgi og perioperative utføres riktig. I den første postoperative uken sett betydelig vekttap i både eksperimentelle og falske grupper. Dyr av gruppen humbug oppnå sine vekttap nadir vanligvis mot den fjerde postoperative dagen, men det oppstår en dag senere i forsøksgruppen. Vekttap er mer uttalt i forsøksgruppen, nå 21,7% første kroppsvekt. Derimot mister humbug dyrene 10,8% av deres første kroppen vekt (figur 2)6. Etter vekt nadir den første postoperativ uken stiger kroppsvekt kontinuerlig i begge eksperimentelle grupper, men med en langsommere skråning i forsøksgruppen. Tegn og symptomer på alvorlig intestinal betennelser (dvs., blodig utslipp eller flytende avføring oppstår verken i den eksperimentelle eller humbug gruppe6). Total dødelighet i løpet av første 60 dager er postoperatively rundt 40% i gruppen colostomy og 10% i gruppen colotomy. De fleste dødsfall forekommer i første postoperativ uke (61% i forsøksgruppen, 66% i gruppen humbug). Dødsårsaker er vist i Figur 3.

Distale colostomy i mus resulterer i utviklingen av hovedsakelig lymfatisk kolitt gjengivelse funksjonene hallmark histologiske menneskelige FM. Disse endringene øker med varigheten av intestinal eksklusjon. Krypten lengde betydelig forkortet i ekskluderte tarm segmenter. Denne forkorte når statistiske betydning etter 14 dager av fecal avledning (figur 3a). Goblet celle-bærende krypten lengden reduseres etter 30 dager i ekskluderte tarm segmenter (figur 3b). Absolutt goblet cellen tallene er også betydelig redusert i Krypter i ekskluderte tarm segmentet etter 14 postoperativ dager (Figur 3 c). Hallmark lesjonen FM, utvikling av lymfoide follikler i mucosa, krever en lengre varighet av avføring avvik. Selv om et økt antall lymfoide follikler kan observeres så tidlig som to uker, bli forskjeller betydelig etter to måneder (tall 5a-c). Alle histopathological endringer beskrevet før er mer uttalt i distale enn i proksimale regioner i ekskluderte tarm segmentene. En typisk neutrophilic infiltrere som et tegn på akutt betennelse er vanligvis ikke observert (tall 5 d-e).

Som et tegn på en systemisk ettervirkning av lokale intestinale betennelsen, er nøytrofile teller betydelig økt i colostomy dyr så tidlig som i 14 dager etter operasjonen. Denne forskjellen opprettholdes til slutten av observasjon perioden (60 dager). Blodplater teller er litt økt dyr med colonic avledning etter 60 dager (figur 6). Hemoglobin nivå og hematokrit reduseres 14 dager etter operasjonen i gruppen colostomy forhold til gruppen humbug.

Det har vist at vitaminmangel i gnagere årsaker redusert gjennomsnittlig corpuscular volumet (MCH) og mener corpuscular hemoglobin (MCV) verdier7. I vår modell ser vi første øker begge disse parameterne etter 14 og 30 dager. Både MCV og MCH tilbake til normal verdier etter lengre oppfølging (figur 7). Dette viser at distale colostomy ikke resulterer i klinisk signifikant vitaminmangel under langsiktig oppfølging.

Figure 1
Figur 1: anatomi i cecal regionen og den kirurgiske prosedyren. (a) grafisk fremstilling av postoperativ anatomi. (b) topografi cecal pol og anatomisk landemerker. (c) grafiske fremstilling av colostomy åpningene. Figur 1a er endret fra Kleinwort et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kropp vekt utvikling. Kroppsvekt vises som prosent av preoperativ kroppsvekten. Kroppen vekt kurver av colostomy og humbug (colotomy) dyr viser at første postoperativ innflytelsen forlis var betydelig høyere i gruppen colostomy forhold til gruppen humbug (p < 0,001). Verdier er ± standardfeil for gjennomsnittet over 21-26 dyr per gruppe (21 dyr mottatt colostomies, 26 dyrene var i gruppen humbug). Dette tallet er endret fra Kleinwort et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: dødsårsaker. Komplikasjoner representeres som prosenter all-årsak dødelighet og er illustrert i et sektordiagram (a colostomy gruppe, (b) humbug gruppen). Postoperative komplikasjoner ble fastsatt av obduksjon. Herjer syndrom ble definert som kontinuerlig vekttap større enn 33% av den opprinnelige kroppsvekten og ingen andre funn på obduksjon. Ileus og anastomotisk lekkasje ble diagnostisert på obduksjon. Stomi komplikasjoner ble definert som peristomal abscesser og mucocutaneous separasjoner. Andre komplikasjoner består sår dehiscence av laparotomy, iskemi av cecum, og tilfeller klart ikke på obduksjon. Betydelige forskjeller i fordelingen av postoperativ komplikasjoner ble sett mellom grupper (p = 0.021, analysert ved hjelp av Fisher eksakt test for tosidig analyse av opptil 6 × 6 contingency tabeller). Det var 39 dyr i gruppen colostomy og 29 i gruppen humbug. Dette tallet er endret fra Kleinwort et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: krypten lengde og goblet celle befolkningen. Krypten lengde og goblet celle tall var bestemmes ved hjelp av parafinsnitt i endetarmen etter periodiske acid-Schiff farging. (a) krypten lengde ble betydelig redusert i endetarmen dyr med avledning kolitt (DC). (b) ble regionen goblet celle-bærende på crypt målt og satt som et forhold til full krypten lengden. Tretti og seksti dager postoperatively, ble prosentandelen av crypt-lengde-bærende fangen celler redusert i DC-gruppen. (c) Goblet cellen tallene ble betydelig redusert i DC dyr sammenlignet med gruppen humbug. Grafene i (a) til (c) viser betyr og standardfeil over 5 til 9 dyr per gruppe (colostomy 14 og 30 dager, humbug 14 dager: n = 8; colostomy 60 dager: n = 5; humbug 30 og 60 dager: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Dette tallet er endret fra Kleinwort et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: lymfoide follikler og provoserende infiltrerer. (a) lymfoide follikler viderekoblet kolon og humbug dyr ble regnet på parafinsnitt i endetarmen med hematoxylin og eosin. Grafen viser betyr og standardfeil over 5 til 9 dyr per gruppe (colostomy 14 og 30 dager, humbug 14 dager: n = 8; colostomy 60 dager: n = 5; kontrollere 30 og 60 dager: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. (b) og (c) Representative eksempler på deler av endetarm colostomy (b) og humbug (c) dyr 60 dager farget postoperatively med hematoxylin og eosin. En fremtredende lymfoide hårsekken (∗) hadde mucosa i colostomy mus. Skala stolper representerer 100 µm. (d) og (e) farging med chloroacetate esterase reaksjon på parafinsnitt ble utført for å oppdage nøytrofile granulocytter. På tverrsnitt av viderekoblet endetarmen, ble en akutt inflammatoriske neutrophilic infiltrere observert i gruppen colostomy (d) verken i humbug dyr (e) opp til 60 dager postoperatively. Skala barer representerer 100 µm. Dette tallet er endret fra Kleinwort et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: nøytrofile og blodplater teller. Blod teller av venøs blodprøver ble fastsatt av en veterinær hematologi analysator. (a) nøytrofile teller økte betydelig i gruppen colostomy forhold til humbug dyr opp til 60 dager postoperatively. (b) Platederivert teller var litt forhøyet i gruppen colostomy 60 dager postoperatively. Grafen viser betyr og standardfeil over 5 til 9 dyr per gruppe (colostomy 14 og 30 dager, humbug 14 dager: n = 8; colostomy 60 dager: n = 5; humbug 30 og 60 dager: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: røde blodlegemer parametere. Blod teller av venøs blodprøver ble fastsatt av en veterinær hematologi analysator. (a) hemoglobin og (b) hematokrit ble betydelig redusert i gruppen colostomy sammenlignet med humbug gruppe. (c) gjennomsnittlig corpuscular volumet (MCH) var betydelig opphøyet 14 og 30 dager postoperatively i gruppen colostomy forhold til gruppen humbug men tilbake til det normale etter 60 dager. (d) mener corpuscular hemoglobin (MCV) verdier ble hevet etter 30 dager, men ikke lenger etter 60 dager postoperatively i gruppen colostomy sammenlignet med humbug dyr. Grafen viser betyr og standardfeil over 5 til 9 dyr per gruppe (colostomy 14 og 30 dager, humbug 14 dager: n = 8; colostomy 60 dager: n = 5; humbug 30 og 60 dager: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Murine modellen av DC presentert i denne protokollen pålitelig gjengir histopathological funksjonene menneskelige FM (f.eks, de novo utvikling av lymfoide follikler i submucosa betent tarm segmenter, krypten forkorte og reduksjoner i Goblet celle tall). Bortsett fra denne nytte, denne modellen er indusert av en svært lik utløsende faktor og gir en klinisk løpet av moderat til mild alvorlighetsgrad som er mest berørt mennesker.

Å få reproduserbar resultater og akseptabel perioperative dødelighet, noen praksis i Mikrokirurgiske teknikker er nødvendig. Men både colostomy og humbug operasjonen (colotomy) kan utføres med svært lav perioperative dødelighet (< 10%). Noen operative er av stor betydning: 1) identifisere kolon og terminal ileum. I tilfeller der anatomien i regionen ileocecal ikke klart kan kolon identifiseres ved tilstedeværelsen av formet avføring og terminal ileum av tilstedeværelsen Peyers lapper. 2) når exteriorizing colostomy løkken, sikre mesentery ikke er forvridd, dermed unngår hvem iskemi og mekanisk ileus. 3) når punktering mesentery med fleksibel røret, forsikre en fartøy-fri sektor er valgt, dermed hindre blødning og hvem ischemia. 4) når du oppretter den små snittet i bukveggen, sjekk for tilstrekkelig hemostasen. Om nødvendig kan du bruke thermo-coagulation for å stoppe blødning fra muskel fartøy. 5) forsikre det colonic loop er åpen minst to tredjedeler av omkretsen og at bakre veggen er tilstrekkelig exteriorized, dermed garantere fullstendig blokkering av avføring passasje til de distale tarm segmentene. 6) forsikre at begge colostomy ender er godt festet til huden å unngå en åpen passasje til bukhulen som resulterer i høyere smitte risiko eller en mekanisk ileus fordi fecal strømmen ikke kan avsluttes. Normalt kan alle kirurgiske prosedyrer utføres uten forstørrelsesglass briller eller kirurgisk mikroskop. Generelt krever utnyttelse av disse enhetene opplæring.

Selv om kompleksiteten i de kirurgiske prosedyrene er bare moderat, er det mange viktige operative og perioperative saker skal kunne avslutte forsøket med reproduserbar resultater som.

Det er viktig for langsiktig overlevelse med en permanent colostomy at mus har en intakt cecum. En eksperimentell gruppe med proksimale colostomies ved ileocecal ventilen viste en dødelighet på 100% i første postoperativ uke på grunn av irreversible vekttap (data ikke vist). Derfor er det av største betydning å velge området colostomy minst 20 mm distale fra den Bauhin valve. Denne observasjonen kan skyldes fysiologi av Red fordøyelse. Retrograd transport fra proksimale kolon til cecum oppstår i disse artene. Cecum er syntesen av næringsstoffer av bakteriell mikroflora occurs8. Normal MCV og MCH verdiene under langsiktig oppfølging indikerer at dyr med distale colostomies ikke lider betydelig vitaminmangel. Videre er coprophagy en viktig del av ernæringsmessige virkemåten til gnagere i sine naturlige omgivelser. Når etablering modellen, var vi svært opptatt av at perturbing coprophagy at tilstedeværelsen av en permanent colostomy kan resultere i ernæringsmessige mangler, (f.eks, vitamin B). Men det er et problem under forhold der tilgang til næringsstoffer er begrenset, har tidligere vist at coprophagy mister sin ernæringsmessige betydning under eksperimentelle forhold med gratis overskytende vann og ernæringsmessig balansert mat9 . Under vår eksperimentelle forhold er det viktig å optimalisere betingelsene for postoperativ matinntak. Vi brukte dyrefôr som hadde en høy proteininnhold optimalisert protein kvalitet og økt energi tetthet. Dyrene var akklimatisert til denne dietten minst to uker før operasjonen. Postoperatively, ble vann-gjennomvåt feed tilbudt annonse libidum gjør mat og fluid inntak.

Det er avgjørende å benytte mus av samme kjønn i både eksperimentelle og falske grupper. Sex har vist betydelig innvirkning på kurset ikke bare av systemisk betennelse, men også av tarm betennelse i ulike kjemisk indusert kolitt modeller10,11,12. Generelt, vil mannlig dyr utvikle mer uttalt sykdom med større betennelse, mer krypten skade, mindre gjenfødelse, høyere nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner, og tregere inngang fra vekt tap10. Enda en fordel med å bruke mannlig dyr er bedre alder-matchet preoperativ kroppen vekter, fører til bedre kompensasjon av opprinnelig postoperativ vekt tap perioden. Likevel kvinnelige mus kan brukes i protokollen hvis spesifikke spørsmål (f.eks, påvirkning av sex hormoner på manifestasjonen av DC er håndteres. Bruke mannlige mus krever mer innsats i å opprettholde stabile boforhold. Mannlige mus er mer utsatt for aggressiv samhandling fører til skader og død. Mannlige mus bor i etablerte hierarkier med en dominerende hann. Når hierarkiet i gruppen er opprettet, er fortsatt kjemper mindre vanlig13,14. Derfor vi dannet eksperimentelle gruppene ved ankomst av mus i våre dyr anlegget minst to uker før operasjonen og vedlikeholdt disse gruppene til eksperimenter endte. Generelt, ble eksperimentelle grupper på 5 til 7 dyr holdt i et bur. Vedlikehold av stabilt sosial og levekårsundersøkelse var av utmost betydning ikke bare å minimere aggressiv atferd av forsøksdyr. Bolig forhold har blitt vist å påvirke vektøkning samt immunologiske parametere15,16,17.

Mottakelighet for kjemisk indusert og genetisk endret kolitt modeller varierer mellom musen stammer18,19,20. Nåværende protokollen ble etablert i C57Bl/6 mus, en mus stamme med veldefinerte genetisk bakgrunn og et godt karakterisert immunsystem21,22,23 som viser middels til sterk inflammatorisk svaret i dekstran sulfate natrium-indusert kolitt modell20 og er en prototypiske Th1 belastning23. Bruk av andre musen stammer kan betraktes når mer alvorlig sykdom aktiviteter eller Th2 miljøer er nødvendig.

Oppsummert utgjør våre protokollen et verdifullt verktøy for å vurdere rollen til ulike immun celletyper, cytokiner, chemokines og andre signalerer molekyler i patogenesen av DC. Et stort antall genetisk endret mus modeller er tilgjengelige med C57BL/6 bakgrunnen og kan kombineres med vår modell (f.eks, mus mangelfull for IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine-reseptorer CXCR5 og CCR7, og sphingosine-1-fosfat reseptor 4). Tilgjengeligheten av congenic musen stammer på C57BL/6 bakgrunn i stor grad lette overføringen eksperimenter å etablere rollen forskjellige celletyper involvert i etiologien FM. Endelig tilbyr modellen muligheten til å vurdere påvirkning av lokale tiltak (f.eksmodifisering av lokale microbiome og lokale anti-inflammatorisk terapi) på slimhinnene immunitet i berørt og uberørt tarm segmenter og systemisk immun homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics