Murino colostomía Distal, un modelo novedoso de desvío Colitis en ratones C57BL/6

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Summary

Murino colostomía distal proporciona un modelo murino para la colitis de la diversión humana, una colitis linfocítica predominante en el segmento de colon excluido de la corriente fecal.

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Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

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Abstract

Desviación (DC) es una condición clínica frecuente que ocurre en pacientes con segmentos de intestino excluidos de la corriente fecal como resultado de una enterostomía desviar. La etiología de esta enfermedad sigue siendo mal definida pero parece diferir de la de enfermedades de intestino inflamatorias clásicas tales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Investigaciones encaminadas a descifrar los mecanismos fisiopatológicos principales en el desarrollo de esta enfermedad ha sido gravemente obstaculizado por la falta de un modelo murino. Este protocolo genera un modelo murino de DC que facilita el estudio del papel del sistema inmune y su interacción con el microbioma en el desarrollo de CC. En este modelo utilizando animales C57BL/6, parte distal del colon se excluye de la corriente fecal al crear una colostomía distal, provocando el desarrollo de leve a moderada inflamación en el segmento intestinal excluido y reproducir las lesiones característica distintiva del ser humano DC con una moderada respuesta inflamatoria sistémica. En contraste con el modelo de la rata, hay un gran número de modelos murinos genéticamente en el fondo de C57BL/6. La combinación de estos animales con nuestro modelo permite que las funciones potenciales de individuales citoquinas, quimiocinas y receptores de moléculas bioactivas (e.g., interleukin (IL) -17; IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptores CXCR5 y CCR7 y el receptor de la esfingosina-1-fosfato 4) a evaluarse en la patogenesia de DC. La disponibilidad de tensiones congenic ratón C57BL/6 fondo facilita en gran medida transferencia experimentos para establecer los roles de distintos tipos de células involucrados en la etiología de DC. Finalmente, el modelo ofrece la oportunidad de evaluar la influencia de las intervenciones locales (p. ej., modificación del microbioma local o terapia antiinflamatoria local) de inmunidad mucosa en los segmentos intestinales afectados y no afectados y en homeostasis inmune sistémica.

Introduction

En los últimos años, un número considerable de entidades colitis no infecciosa diferentes de las enfermedades clásicas inflamatorias intestinales (EII; ej., enfermedad enfermedad o colitis de Crohn) han caracterizado clínico e histopathologically en seres humanos. Los mecanismos fisiopatológicos principales en el desarrollo de estas formas de colitis no se entienden completamente parcialmente porque son escasos los modelos animales apropiados. Colitis de la diversión es una de estas entidades recientemente descritas. Aunque el término fue acuñado en 1980 por Glotzer1, la descripción inicial de un fenotipo similar fue dada en 1972 por Morson2. La enfermedad se desarrolla en el 50% al 91% de los pacientes con desvío de enterostomía, y su intensidad clínica varía de3,4. Dada la incidencia anual de alrededor de 120.000 pacientes de colostomía en los Estados Unidos de América, esta entidad de la enfermedad constituye un importante problema de salud.

El objetivo general de desarrollar este protocolo era proporcionar un modelo murino de DC que se apoya en un disparador de colitis similar a ése visto en DC humana y que reproduce las principales características histopatológicas de la enfermedad humana. En contraste con otros modelos de colitis murino la inducción de colitis en nuestro modelo no requiere de animales genéticamente modificados (p. ej., ratones transgénicos IL-7, N-cadherin dominante negativo ratones o ratones TGFβ- / - ), la aplicación de la química irritantes sustancias (p. ej., sulfato de dextrano sódico (DSS) - colitis inducida o ácido de trinitrobenceno sulfónico (TNBS) - inducida por colitis) o la transferencia de poblaciones celulares específicas en ratones deficientes inmunes (como en la transferenciaalta CD45RB modelo de colitis) (para una revisión, véase5). En contraste con otros modelos, el sistema inmune intacto nuestro modelo DC permite la evaluación del mecanismo inmunológico involucrado en el desarrollo de CC. La limitación de la inflamación mucosa al segmento intestinal excluido permite la evaluación de su repercusión sobre la inmunidad mucosa en otras partes del tracto gastrointestinal en la homeostasis inmune en otros compartimentos inmunes del tracto intestinal (p. ej. , Parches de Peyer y ganglios mesenteriale) y en la homeostasis inmune de todo el organismo. Por último, nuestro modelo constituye una herramienta apropiada para investigar los mecanismos de control de estímulos inflamatorios locales origina cambios en el ambiente local normal para el microbioma local, así como antígenos alimentarios.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la autoridad veterinaria (Landesamt für Landwirtschaft, und Lebensmittelsicherheit Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, LALLF M-V).

1. preoperatorio cuidado y preparación del Animal

  1. A su llegada a las instalaciones de animales, animales (C57Bl/6) se dividen en grupos de tamaño similar, jaula a cada grupo juntos y mantener constante a lo largo de los experimentos de los grupos.
    Nota: Utilizar animales del mismo sexo. Los resultados descritos se obtuvieron con ratones machos.
    Nota: Si se utilizan machos, grupos de jaula juntos a partir de cuando tienen 7 semanas de edad para que pueda establecerse una jerarquía, minimizando así el riesgo de comportamiento agresivo durante los experimentos.
  2. Por lo menos una semana antes de la cirugía, cambiar a una alta energía (> 14 MJ/kg) y alta en proteínas (> 20%) de la alimentación que contiene todos los oligoelementos esenciales y vitaminas (para detalles, ver lista de materiales).
    Nota: Asegure todos los ratones pesan al menos 25 g cuando se realiza la cirugía.
  3. Inducir analgesia y la anestesia por inyección intraperitoneal de ketamina (87 mg/kg i.p.) y el clorhidrato de xilacina (13 mg/kg i.p.). Espere hasta que el ratón tolera la estimulación mecánica, por ejemplo campo de dedo del pie, sin respuesta de motor.
  4. Asegure el ratón narcotizado con cintas en una posición supina sobre una arpillera de calor colocado en la mesa de operación, garantizando la colocación durante la operación estable y evitando una abrumadora pérdida de calor corporal.
    Nota: La arpillera de calor debe tener una temperatura de 36 ° C a 40 ° C; la temperatura de la sala de operaciones debe ser de 21 ° C.

2. distal de la colostomía operación

  1. Afeitarse el vello abdominal. Antes de comenzar la cirugía, desinfectar el campo de la operación tres veces con alcohol 70% y un yodóforo. Cubra el campo de la operación para garantizar condiciones asépticas.
  2. Realizar una laparotomía mediana 15 mm mediante la incisión de los músculos abdominales y el peritoneo a lo largo de la linea alba, minimizando así la pérdida de sangre.
  3. Utilizar dos pinzas atraumáticas de DeBakey, tire con cuidado hacia el ciego, íleon terminal y el ascendente y el colon transverso de la cavidad peritoneal.
    Nota: Tenga cuidado de limitar estrictamente la manipulación mecánica del intestino para evitar daños a las estructuras mesentéricas.
  4. Identificar el polo cecal, el colon ascendente y el intestino (Figuras 1a y 1b).
    Nota: La correcta identificación de los dos puntos ascendentes es fundamental para la correcta colocación de la colostomía. En casos donde la anatomía de la región ileocecal es ambigua, identifica a la presencia de placas de Peyer del intestino, y la presencia de heces formadas caracteriza el colon.
  5. Use una regla para determinar la posición de la futura operación del intestino grueso. Se debe colocar 20 mm distal a la válvula ileocecal para una colostomía distal.
  6. Hacer una segunda incisión de 3 mm en la pared abdominal en el cuadrante superior derecho. Tire el segmento de colon previamente identificadas a través de esta incisión para formar un círculo, teniendo cuidado de no distorsionar el bucle.
  7. Pasar con cuidado una cánula i.v. flexible calibre 22 a través del mesocolon. Tenga cuidado para no dañar estructuras vasculares mesentéricas.
  8. Devolver el intestino a la cavidad peritoneal.
  9. Fijar ambos extremos del tubo flexible a la piel con puntos simples y sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Antes de cerrar la laparotomía, realice reanimación con líquidos usando una inyección intraperitoneal de solución salina al de 0.9% 0,5 mL.
  11. Cierre del peritoneo y la capa muscular con una sutura continua usando una sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c). Cierre la piel con una sutura continua usando una sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Abrir el bucle de colon exteriorizado mediante la realización de un corte transversal subtotal con una tijera fina. Evitar toda lesión del mesenterio. Transecto no el colon completamente.
  13. Fijar cada abertura de colostomía con tres puntadas de espesor total solo al peritoneo y la piel con un monofilamento, suturas absorbibles (p. ej., Polidioxanona o monofilamento 6-0 3/8s). El aferente del lazo, que es una colostomía de final funcional, y el lazo eferente, que es una fístula mucosa, se separan claramente en este punto (figura 1C).
    Nota: Tiempo de operación debe ser menos de 20 minutos para limitar las pérdidas de fluidos y térmicas.
  14. Después de terminar la cirugía, desinfectar instrumentos usando una solución de desinfectante libre de aldehídos en un baño de ultrasonidos según las instrucciones del fabricante.

3. simulacro de operación (Colotomy)

  1. Realice los pasos 1.1. a través de 2.4.
  2. Utilice una regla para determinar la posición de futuros colotomy. El colotomy debe colocarse a la misma distancia de la válvula ileocecal que la colostomía en el grupo experimental.
  3. Abra el colon por lo menos dos tercios su circunferencia usando las tijeras finas.
  4. Cierre colotomy con una sola capa, espesor total interrumpido con un monofilamento, absorbible sutura sutura (por ejemplo, polydioxanone, monofilamento 6-0 3/8s).
    Nota: Tiempo de operación debe ser menos de 20 minutos para un cirujano experimentado, limitando las pérdidas de fluidos y térmicas.
  5. Realice los pasos 2.10. , 2.11. y 2.14.

4. posoperatorio cuidado

  1. Devolver los animales a sus jaulas. Bien templado el ambiente de 37 ° C (por ejemplo, con una lámpara infrarroja) hasta que los ratones son totalmente despiertos. A continuación, mantenga ratones en un ambiente de temperatura y Humedad reguladas (21 ° C; humedad relativa de 30% ± 10%). Permitir el libre acceso a alimentos y agua potable. Para facilitar la absorción de líquidos, proporcionar alimentación animal empapado de agua adicional.
  2. Inicio de la analgesia postoperatoria mediante la inyección de 0,1 mg/kg corporal peso buprenorfina s.c. cuando los animales muestran respuesta a la estimulación mecánica. Tenga cuidado para evitar depresión respiratoria.
  3. Suplemento de agua potable con tramadol 1 mg/mL para analgesia continua durante la primera semana postoperatoria.
  4. Para compensar la ingesta disminuida de líquidos debido a movilidad reducida, suministrar un cojín sólido de beber en la jaula durante la primera semana postoperatoria.
  5. Pesan los animales y el comportamiento animal puntuación diariamente durante la primera semana, cada dos días durante el resto del primer mes y cada tercer día durante el segundo mes el score de severidad de la enfermedad descrito en Kleinwort et al. 6.

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Representative Results

La cirugía se tolera bien tanto en los grupos de sham (colotomy) y experimental (colostomía). Mortalidad perioperatoria no debe superar el 10% cuando se realiza correctamente la cirugía y perioperative management. En la primera semana postoperatoria, pérdida de peso significativa se observa en los grupos experimentales y simulados. Animales del grupo impostor alcanzan su nadir de peso normalmente hacia el cuarto día postoperatorio, pero se da un día más tarde en el grupo experimental. Pérdida de peso es más pronunciada en el grupo experimental, llegando a 21.7% del peso corporal inicial. En cambio, sham animales pierden 10,8% de su cuerpo inicial peso (figura 2)6. Después del nadir de peso en la primera semana postoperatoria, peso del cuerpo se levanta continuamente en ambos grupos experimentales, pero con una menor pendiente en el grupo experimental. Signos y síntomas de inflamación intestinal severa (es decir, descarga sangrienta o deposiciones líquidas ocurrir ni en el experimental ni el impostor grupo6). Mortalidad total durante los primeros 60 días después de la operación es de alrededor 40% en el grupo de colostomía y cerca de 10% en el grupo de colotomy. Mayoría de las muertes ocurre durante la primera semana postoperatoria (61% en el grupo experimental, 66% en el grupo sham). Causas de muerte se muestran en la figura 3.

Intestino grueso distal en ratones resulta en el desarrollo de la colitis linfocítica predominante reproduciendo las características histológicas del sello de DC humana. Estas alteraciones aumentan con la duración de exclusión intestinal. Longitud de la cripta se acorta significativamente en los segmentos excluidos del intestino. Esta reducción alcanza significación estadística después de 14 días de la derivación fecal (figura 3a). La cripta células caliciformes-cojinete se reduce después de 30 días en segmentos de intestino excluido (figura 3b). Número absoluto de células caliciformes se reduce también significativamente en las criptas en el segmento intestinal excluido después de 14 días postoperatorio (Figura 3C). La lesión de sello de DC, el desarrollo de los folículos linfoides en la mucosa, requiere una duración más larga de la desviación del taburete. Aunque un número creciente de los folículos linfoides puede observarse tan pronto como dos semanas, las diferencias se convierten en significativas después de dos meses (Figuras 5a-c). Todos los cambios histopatológicos descritos antes son más pronunciados en distal que en las regiones proximal de los segmentos excluidos del intestino. Un típico neutrophilic infiltra como un signo de inflamación aguda generalmente no se observa (figuras 5 d-e).

Como un signo de una repercusión sistémica de la inflamación intestinal local, del número de neutrófilos se incrementaron significativamente en animales colostomía desde 14 días después de la cirugía. Esta diferencia se mantiene hasta el final del período de observación (60 días). Las cuentas de plaqueta son aumentó ligeramente en los animales con la diversión de colon después de 60 días (figura 6). Nivel de hemoglobina y hematocrito se reducen 14 días después de operación en el grupo de colostomía en comparación con el grupo sham.

Se ha demostrado que la deficiencia de vitamina en causas roedores reducido volumen corpuscular medio (MCH) y significa valores de hemoglobina corpuscular (MCV)7. En nuestro modelo, vemos aumentos iniciales en ambos estos parámetros después de 14 y 30 días. VCM y HCM volver a valores normales después de un seguimiento más largo (figura 7). Esto demuestra que eso colostomía distal no resulta en deficiencia de la vitamina clínicamente significativa durante el seguimiento a largo plazo.

Figure 1
Figura 1: Anatomía de la región cecal y el procedimiento quirúrgico. (a) gráfico representación de la anatomía postoperatoria. (b) topografía del ciego pol y puntos anatómicos. (c) gráfico representación de las aberturas de la colostomía. Figura 1a se ha modificado de Kleinwort et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: desarrollo del peso del cuerpo. Peso corporal se muestra como porcentaje del peso corporal preoperatoria. El cuerpo peso curvas de colostomía y simulado (colotomy) animales revelan que la pérdida de peso postoperatoria inicial fue significativamente mayor en el grupo de la operación del intestino grueso en comparación con el grupo de tratamiento simulado (p < 0,001). Los valores son medios ± error estándar de la media entre 21-26 animales por grupo (21 animales recibieron colostomías; 26 animales estaban en el grupo sham). Esta figura ha sido modificada desde Kleinwort et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: causas de la muerte. Las complicaciones son representadas como porcentajes de mortalidad por todas las causas y se ilustración en un gráfico de sectores (grupo b colostomía, grupo (b) sham). Las complicaciones postoperatorias fueron determinadas por la autopsia. Síndrome de emaciación se definió como la pérdida de peso continuo superior al 33% del peso corporal inicial y no otros hallazgos a la necropsia. Íleo y fuga anastomótica fueron diagnosticados en la autopsia. Complicaciones del estoma se definieron como abscesos periestomal y separación mucocutánea. Otras complicaciones compuesto por dehiscencia de la herida de la laparotomía, la isquemia del intestino ciego, y los casos no claros en la autopsia. Se observaron diferencias significativas en la distribución de las complicaciones postoperatorias entre grupos (p = 0.021, analizados mediante la prueba exacta de Fisher para el análisis dos lados de tablas de contingencia de hasta 6 × 6). Hubo 39 animales en el grupo de colostomía y 29 en el grupo sham. Esta figura ha sido modificada desde Kleinwort et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: población de cripta longitud y células caliciformes. Números de longitud y células caliciformes cripta fueron determinados usando secciones de la parafina del recto después de la tinción del ácido periódico de Schiff. (a) longitud de la cripta disminuyó significativamente en el recto de los animales con colitis de la diversión (DC). (b) la longitud de la región de la célula caliciforme-cojinete de la cripta se midió y se establezca como la relación entre la longitud de la cripta completa. Treinta y sesenta días después de la operación, el porcentaje de células caliciformes de cripta-longitud-cojinete disminuyó en el grupo de DC. (c) células caliciformes números se redujeron significativamente en los animales CC en comparación con el grupo sham. Gráficos en (a) hasta (c) muestran medias y errores estándar a través de 5 a 9 animales por grupo (días de colostomía 14 y 30, simulado 14 días: n = 8; colostomía 60 días: n = 5; 30 y 60 días de farsa: n = 9); ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Esta figura ha sido modificada desde Kleinwort et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: folículos linfoides e inflamatorio infiltra. (a) linfoides folículos de dos puntos desviados y sham animales contaron en secciones de parafina del recto teñidas con hematoxilina y eosina. El gráfico muestra las medias y errores estándar a través de 5 a 9 animales por grupo (días de colostomía 14 y 30, simulado 14 días: n = 8; colostomía 60 días: n = 5; 30 y 60 días de control: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. (b) y (c) representante ejemplos de secciones del recto del intestino grueso (b) y falso (c) animales 60 días postoperatoriamente mancharon con hematoxylin y eosina. Un folículo linfoide prominente (∗) estuvo presente en la mucosa de un ratón de colostomía. Barras de escala representan 100 μm. (d) y (e) tinción con cloroacetato esterasa reacción en secciones de parafina fue realizada para detectar los granulocitos neutrófilos. En cortes transversales del recto desviado, un infiltrado neutrofílico inflamatorio agudo se observó en el grupo de colostomía (d) ni en animales de sham (e) hasta 60 días postoperatoriamente. Barras de escala representan 100 μm. Esta figura ha sido modificada desde Kleinwort et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: cuentas de neutrófilos y plaquetas. Los recuentos sanguíneos de las muestras de sangre venosa se determinaron mediante un analizador de la hematología veterinaria. (a) número de neutrófilos aumentaron significativamente en el grupo de colostomía en comparación con animales de farsa hasta 60 días postoperatoriamente. (b) conteo de plaquetas fueron ligeramente elevado en el grupo de colostomía 60 días postoperatoriamente. El gráfico muestra las medias y errores estándar a través de 5 a 9 animales por grupo (días de colostomía 14 y 30, simulado 14 días: n = 8; colostomía 60 días: n = 5; 30 y 60 días de farsa: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: parámetros de glóbulos rojos. Los recuentos sanguíneos de las muestras de sangre venosa se determinaron mediante un analizador de la hematología veterinaria. (a) hemoglobina y (b) hematocrito disminuyeron significativamente en el grupo de la operación del intestino grueso en comparación con el grupo sham. (c) volumen corpuscular medio (MCH) fue significativamente elevado 14 y 30 días después de la operación en el grupo de la operación del intestino grueso en comparación con el grupo sham pero volvió a la normalidad después de 60 días. (d) significa valores de hemoglobina corpuscular (MCV) fueron elevados después de 30 días, pero ya no después de 60 días después de la operación en el grupo de colostomía en comparación con el tratamiento simulado animales. El gráfico muestra las medias y errores estándar a través de 5 a 9 animales por grupo (días de colostomía 14 y 30, simulado 14 días: n = 8; colostomía 60 días: n = 5; 30 y 60 días de farsa: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El modelo murino de DC presentada en este protocolo fiable reproduce las características histopatológicas de DC humana (p. ej., desarrollo de novo de los folículos linfoides en la submucosa de segmentos de intestino inflamado, cripta acortamiento y reducción de número de células caliciformes). Aparte de esta ventaja, este modelo es inducida por un factor desencadenante muy similar y presenta un curso clínico de moderado a leve gravedad como es el caso de los seres humanos más afectados.

Para obtener resultados reproducibles y mortalidad perioperatoria aceptable, es necesario algo de práctica en las técnicas microquirúrgicas. Sin embargo, se puede realizar la operación de colostomía y farsa (colotomy) con mortalidad perioperatoria muy baja (< 10%). Algunos pasos operacionales son de gran importancia: 1) identificar positivamente el íleon terminal y colon. En casos donde la anatomía de la región ileocecal no claro, los dos puntos pueden identificarse por la presencia de heces formadas y el íleon terminal por la presencia de placas de Peyer. 2) al exteriorizar el asa colostomía, asegurar que el mesenterio no es retorcido, evitando la isquemia mesentérica e íleo mecánico. 3) al pinchar el mesenterio con el tubo flexible, asegurar que un sector libre de buque es elegido, evitando la isquemia mesentérica y sangra. 4) al crear la pequeña incisión en la pared abdominal, comprobar hemostasia suficiente. Si es necesario, utilizar termo coagulación para detener el sangrado de los vasos musculares. 5) asegurar la colónica lazo abre al menos dos tercios de su circunferencia y que la pared posterior es suficientemente exteriorizada, garantizando completa obstrucción del paso de heces a los segmentos de intestino distal. 6) asegurar que ambos extremos de la operación del intestino grueso también se fijan a la piel para evitar un pasaje abierto a la cavidad peritoneal, dando por resultado un mayor riesgo de infección o de un íleo mecánico porque no puede salir de la corriente fecal. Normalmente, todos los procedimientos quirúrgicos pueden realizarse sin lupas o microscopios quirúrgicos. En general, la utilización de estos dispositivos requiere entrenamiento adicional.

Cuando la complejidad de los procedimientos quirúrgicos sólo es moderada, hay muchos problemas perioperatorios y operativa esenciales a considerar para terminar con éxito el experimento con resultados reproducibles.

Es esencial para la supervivencia a largo plazo con una colostomía permanente que los ratones tienen un ciego intacto. Un grupo experimental con colostomías proximales adyacentes a la válvula ileocecal mostró una mortalidad del 100% en la primera semana postoperatoria debido a la pérdida de peso irreversible (datos no mostrados). Por lo tanto, es de suma importancia para elegir el sitio de la colostomía distal al menos 20 mm válvula de Bauhin. Esta observación puede ser debido a la fisiología de la digestión de roedor. Transporte retrógrado desde el colon proximal al ciego se produce en estas especies. El ciego es la síntesis de nutrientes por la occurs8 de la microflora bacteriana. Valores normales de VCM y HCM durante el seguimiento a largo plazo indican que animales con colostomías distales no sufren de deficiencias de vitaminas importantes. Por otra parte, la coprofagia es una parte esencial del comportamiento alimenticio de los roedores en sus ambientes naturales. Cuando se establece el modelo, estábamos muy preocupados que perturbar la coprofagia como consecuencia de la presencia de una colostomía permanente puede resultar en deficiencias nutricionales (por ejemplo, la vitamina B). Sin embargo, si bien es un problema en condiciones donde el acceso a nutrientes es limitado, se ha demostrado previamente que coprofagia pierde su importancia nutricional en las condiciones experimentales con exceso libre al agua y alimentos nutricionalmente balanceados9 . Bajo nuestras condiciones experimentales, es vital para optimizar las condiciones de ingesta nutricional postoperatorio. Utilizamos piensos que tenían un alto contenido de proteína, optimización la calidad de la proteína y mayor densidad de energía. Animales se aclimatan a esta dieta al menos dos semanas antes de la cirugía. Postoperatoriamente, alimentación empapada en agua se ofreció ad libidum para facilitar alimentos y la ingesta de líquidos.

Es fundamental utilizar ratones del mismo sexo en los grupos experimentales y simulados. Sexo ha demostrado un impacto significativo en el curso de la inflamación sistémica, sino también de la inflamación intestinal en colitis inducida químicamente varios modelos10,11,12. En general, los animales masculinos desarrollarán enfermedad más pronunciada con mayor inflamación, mayor daño de la cripta, menos regeneración, altos niveles de citoquinas pro-inflamatorias y recuperaciones más lentas de pérdida de peso10. Otra ventaja del uso de machos es mejor pesos de edad comparable preoperatorio cuerpo, conduce a la mejor remuneración del período de pérdida de peso postoperatoria inicial. Sin embargo, ratones hembra se pueden utilizar en el Protocolo si específicas preguntas (por ejemplo, la influencia del sexo, las hormonas en la manifestación del C.C. son abordar. Utilizando ratones macho requiere más esfuerzo en el mantenimiento de las condiciones de vivienda estable. Ratones machos son más propensos a las interacciones agresivas hacia la lesión y la muerte. Ratones machos viven en jerarquías establecidas con un macho dominante. Una vez establecida la jerarquía en el grupo, lucha continua es menos común13,14. Por este motivo, formó los grupos experimentales a la llegada de los ratones en nuestras instalaciones de animales al menos dos semanas antes de la cirugía y había mantenido estos grupos hasta que terminaron los experimentos. En general, los grupos experimentales de 5 a 7 animales se mantuvieron en una jaula. Mantenimiento de social estable y las condiciones de vivienda fue de suma importancia no sólo para minimizar las conductas agresivas de los animales experimentales. Condiciones de vivienda han demostrado influir en la ganancia de peso, así como parámetros inmunológicos15,16,17.

Susceptibilidad a los modelos de colitis inducida químicamente y genéticamente varía considerablemente entre las cepas de ratón18,19,20. El presente Protocolo se estableció en ratones C57Bl/6, una cepa de ratón con un fondo genético bien definido y un sistema inmune bien caracterizado21,22,23 que muestra intermedia a fuerte inflamatoria respuesta en el dextrán sulfato colitis inducida por sodio modelo20 y se considera un prototipo Th1 cepa23. Puede considerarse el uso de otras cepas de ratón cuando se requiere un ambiente Th2 o actividades más severas de la enfermedad.

En Resumen, el Protocolo constituye una valiosa herramienta para evaluar el papel de varios tipos de célula inmune, citoquinas, quimiocinas y otras moléculas de señalización en la patogenia de la DC. Un gran número de modelos de ratón modificados genéticamente están disponible con el fondo de C57BL/6 y se puede combinar con nuestro modelo (por ejemplo, ratones deficientes de IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptores CXCR5 y CCR7 y esfingosina-1-fosfato receptor 4). La disponibilidad de tensiones congenic ratón C57BL/6 fondo facilitan en gran medida transferencia experimentos para establecer el papel de distintos tipos de células involucrados en la etiología de DC. Finalmente, el modelo ofrece la oportunidad de evaluar la influencia de las intervenciones locales (p. ej., modificación del microbioma local y terapia antiinflamatoria local) sobre inmunidad mucosa en los segmentos intestinales afectados y no afectados y sistémica homeostasis inmune.

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Disclosures

Todos los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Acknowledgments

Ninguno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

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References

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