Murino colostomia Distal, um novo modelo de colite de diversão em camundongos C57BL/6

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Murino colostomia distal fornece um modelo murino para colite de diversão humana, uma colite linfocítica predominantemente no segmento de cólon excluído do fluxo fecal.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Colite de diversão (DC) é uma condição clínica frequente, ocorrendo em pacientes com segmentos intestinais excluídos o fluxo fecal como resultado de um desvio enterostomy. A etiologia desta doença permanece mal definida mas parece diferir da clássica Enteropatias inflamatórias tais como a doença de Crohn e colite ulcerativa. Pesquisa teve como objetivo decifrar os mecanismos fisiopatológicos, levando ao desenvolvimento desta doença tem sido severamente dificultada pela falta de um adequado modelo murino. Este protocolo gera um modelo murino de DC que facilita o estudo da função do sistema imunológico e sua interação com o microbiome no desenvolvimento da DC. Nesse modelo, usando animais C57BL/6, partes distais do cólon são excluídas do fluxo fecal, criando uma colostomia distal, provocando o desenvolvimento de leve a moderada inflamação nos segmentos excluídos do intestino e reproduzindo as lesões de marca registrada do ser humano DC com uma resposta inflamatória sistêmica moderada. Em contraste com o modelo de rato, um grande número de modelos de murino geneticamente modificados no fundo C57BL/6 está disponível. A combinação destes animais com o nosso modelo permite que as funções potenciais de individuais citocinas, quimiocinas ou receptores de moléculas bioativas (por exemplo, interleucina (IL) -17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptores CXCR5 e CCR7 e o receptor de esfingosina-1-fosfato 4) para ser avaliado na patogénese da DC. Em grande parte a disponibilidade de cepas de congenic do mouse sobre o fundo de C57BL/6 facilita a transferência de experiências para estabelecer os papéis de tipos de células distintas envolvidos na etiologia da DC. Finalmente, o modelo oferece a oportunidade de avaliar as influências de intervenções locais (por exemplo, modificação do local microbiome ou terapia anti-inflamatória local) sobre imunidade mucosal em segmentos intestinais afetados e não afetados e na homeostase imune sistêmica.

Introduction

Nos últimos anos, um número substancial de colite não-infecciosas entidades diferentes de doenças clássica inflamatória intestinal (IBD; i. e., ulcerosa de Crohn doença ou colite) tem sido clinicamente e histopatologicamente caracterizada em seres humanos. Os mecanismos fisiopatológicos, levando ao desenvolvimento destas formas de colite não são completamente compreendidos parcialmente, porque os modelos animais apropriados são escassos. Colite de diversão é uma dessas entidades recentemente descritas. Embora o termo foi inventado em 1980 por Glotzer1, a descrição inicial de um fenótipo semelhante foi dada em 1972 por Morson2. A doença se desenvolve em 50% a 91% dos pacientes com desvio de enterostomy, e sua intensidade clínica varia de3,4. Tendo em conta a incidência anual de cerca de 120.000 pacientes de colostomia em Estados Unidos da América, esta entidade de doença constitui um importante problema de saúde.

O objetivo geral de desenvolver este protocolo foi fornecer um modelo murino de DC que se baseia em um gatilho de colite semelhante ao observado em humano DC e que reproduz as características histopatológicas primárias da doença humana. Em contraste com outros modelos de colite murino, indução de colite em nosso modelo não requer animais geneticamente modificados (por exemplo, ratos transgénicos de IL-7, caderina N dominante negativos ratos ou camundongos TGFβ- / - ), o aplicativo de quimicamente irritante de substâncias (por exemplo, dextrano sulfato de sódio (DSS) - colite induzida, ou trinitrobenzeno sulfônico (neutrófilos) - induzido colite), ou a transferência de populações de células específicos em camundongos deficientes imunes (como a transferência dealta CD45RB modelo de colite) (para uma revisão, ver5). Em contraste com outros modelos, o sistema imunológico intacto do nosso modelo DC permite avaliação do mecanismo imunológico envolvido no desenvolvimento da DC. A limitação de inflamação da mucosa do segmento intestinal excluído permite a avaliação de sua repercussão na imunidade da mucosa em outras partes do trato gastrintestinal, sobre a homeostase imune em outros compartimentos imunes do trato intestinal (por exemplo, , Do Peyer patches e mesenteriale dos gânglios linfáticos) e sobre a homeostase imune de todo o organismo. Finalmente, o nosso modelo constitui um instrumento apropriado para investigar os mecanismos de controlo locais estímulos inflamatórios provenientes de alterações no ambiente local normal para o local microbiome tanto antígenos alimentares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela autoridade veterinária do governo (turismo für Landwirtschaft, und Lebensmittelsicherheit Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF M-V)).

1. pré-operatório cuidados e preparação do Animal

  1. Após a chegada na instalação de animais, dividir os animais (C57Bl/6) em grupos de tamanho similar, cada grupo da gaiola juntos e manter grupos constante em todas as experiências.
    Nota: Use animais do mesmo sexo. Os resultados descritos foram obtidos com ratos masculinos.
    Nota: Se animais machos são usados, começando juntos quando eles são 7 semanas de idade, para que possa estabelecer-se uma hierarquia de grupos de gaiola, minimizando assim o risco de comportamento agressivo durante as experiências.
  2. Pelo menos uma semana antes da cirurgia, alternar para uma alta energia (> 14 MJ/kg) e rica em proteínas (> 20%) alimentar contendo todos os oligoelementos essenciais e vitaminas (para obter detalhes, consulte lista de materiais).
    Nota: Assegurar todos os ratos pesar pelo menos 25 g quando a cirurgia é realizada.
  3. Induzi a anestesia e analgesia pela injeção intraperitoneal de cetamina (87 mg/kg, i.p.) e cloridrato de xilazina (13 mg/kg, i.p.). Espere até que o mouse tolera estimulação mecânica, por exemplo, arremesso de dedo do pé, sem resposta motora.
  4. Prenda o mouse seguiram com fitas na posição supina sobre uma subjacência de calor posicionada a mesa de operação, garantindo o posicionamento durante a operação estável e evitando uma esmagadora perda de calor do corpo.
    Nota: A subjacência de calor deve ter uma temperatura de superfície de 36 ° C a 40 ° C; a temperatura de operação deve ser de 21 ° C.

2. distal colostomia operação

  1. Raspe o cabelo abdominal. Antes de iniciar a cirurgia, desinfecte o campo de operação três vezes, utilizando álcool 70% e um Iodofor. Cubra o campo de operação, a garantia de condições assépticas.
  2. Realizar uma laparotomia mediana de 15 mm por incisão da musculatura abdominal e o peritônio ao longo da linea alba, minimizando assim a perda de sangue.
  3. Use dois DeBakey atraumática pinça, puxe cuidadosamente o ceco, íleo terminal e ascendente e o cólon transverso da cavidade peritoneal.
    Nota: Tenha cuidado para limitar estritamente a manipulação mecânica do intestino para evitar danos às estruturas mesentéricas.
  4. Identifica o polo cecal, o cólon ascendente e intestino delgado (figuras 1a e 1b).
    Nota: A identificação correta do cólon ascendente é fundamental para colocação da colostomia. Em casos onde a anatomia da região ileocecal é ambígua, a presença de Peyer identifica o intestino delgado, e a presença de fezes formadas caracteriza o cólon.
  5. Use uma régua para determinar a posição da futuro da colostomia. Ele deve ser colocado 20mm distal à válvula ileocecal para uma colostomia distal.
  6. Efectue uma segunda incisão de 3 mm na parede abdominal no quadrante superior direito. Puxe o segmento de cólon anteriormente identificados através desta incisão para formar um loop, tomando cuidado para não distorcer o loop.
  7. Passe cuidadosamente uma cânula de calibre 22 i.v. flexível através do mésocôlon. Tome cuidado para não danificar estruturas vasculares mesentéricas.
  8. Retorno do intestino para a cavidade peritoneal.
  9. Corrigi as duas extremidades do tubo flexível para a pele com pontos simples e uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0).
  10. Antes de fechar a laparotomia, realizar ressuscitação com fluidos usando uma injeção intraperitoneal de soro fisiológico a 0,9% 0,5 mL.
  11. Feche o peritônio e a camada muscular com uma sutura contínua usando uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0). Feche a pele com uma sutura contínua usando uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0).
  12. Abra o loop exteriorização do cólon através da realização de uma transecção subtotal usando uma tesoura bem. Evite todos os ferimentos para o mesentério. Não transecto completamente o cólon.
  13. Corrigir a cada abertura da colostomia usando três pontos único da cheio-espessura no peritônio e pele usando um monofil, sutura absorvível (por exemplo, polydioxanone ou monofil 3 de 6-0/8s). O loop aferente, que é uma final-colostomia funcional, e o loop eferente, que é uma fístula mucosa, sejam claramente separadas neste momento (Figura 1C).
    Nota: O tempo de operação deve ser menos de 20 minutos para limitar as perdas térmicas e fluidas.
  14. Após terminar a cirurgia, desinfectar instrumentos usando uma solução de desinfecção aldeído livre em um banho ultra-sônico de acordo com as instruções do fabricante.

3. operação sham (Colotomy)

  1. Execute as etapas 1.1. através de 2.4.
  2. Use uma régua para determinar a posição de futuros colotomy. O colotomy deve ser posicionado à mesma distância da válvula ileocecal como a colostomia no grupo experimental.
  3. Abra o cólon pelo menos dois terços sua circunferência usando tesouras bem.
  4. Fechar o colotomy com uma única camada, espessura total interrompido sutura usando um monofil, sutura absorvível (por exemplo, polydioxanone, monofil 3 de 6-0/8s).
    Nota: O tempo de operação deve ser menos de 20 minutos para um cirurgião tarimbado, limitando perdas térmicas e fluidas.
  5. Execute os passos 2.10. , 2.11. e 2.14.

4. pós-operatório cuidados

  1. Retorno de animais de suas gaiolas. Proporcionam um ambiente bem temperado de 37 ° C (por exemplo, com uma lâmpada infravermelha) até que os ratos são totalmente acordados. Em seguida, manter os ratos em um ambiente de temperatura e umidade-regulamentados (21 ° C; 30% ± 10% umidade relativa). Permita o livre acesso à comida e água potável. Para facilitar a penetração de fluidos, fornecem adicional ensopados de água alimentação animal.
  2. Iniciar analgesia pós-operatória injetando buprenorfina de peso de corpo de 0,1 mg/kg s.c. quando animais mostram resposta à estimulação mecânica. Tenha cuidado para evitar a depressão respiratória.
  3. Suplemento de água potável com tramadol 1mg/mL para analgesia contínua durante a primeira semana pós-operatória.
  4. Para compensar a diminuição da ingestão de líquidos devido à mobilidade reduzida, fornecer um bloco sólido beber na gaiola durante a primeira semana pós-operatória.
  5. Pesar os animais e o escore de comportamento animal diariamente durante a primeira semana, em dois dias durante o restante do primeiro mês e a cada três dias durante o segundo mês usando o escore de severidade de doença descrito em Kleinwort et al 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cirurgia é bem tolerada no experimental (colostomia) e grupos de Souza (colotomy). Mortalidade perioperatória não deve exceder 10%, quando a gestão de cirurgia e perioperatório é executada corretamente. Na primeira semana pós-operatória, perda de peso significativa é vista em ambos os grupos, experimentais e sham. Animais do grupo farsa atingir seu nadir de peso, geralmente em direção ao quarto dia de pós-operatório, mas ocorre um dia depois no grupo experimental. Perda de peso é mais pronunciada no grupo experimental, alcançando 21,7% do peso corporal inicial. Em contraste, os animais de Souza perdem 10,8% de seu corpo inicial de peso (Figura 2)6. Após o nadir de peso na primeira semana pós-operatória, peso corporal aumenta continuamente em ambos os grupos experimentais, mas com uma inclinação mais lenta no grupo experimental. Sinais e sintomas de inflamação intestinal grave (i.e., descarga sangrenta ou líquidas evacuações ocorrem nem no experimental, nem o grupo sham6). Mortalidade total durante os primeiros 60 dias no pós-operatório é de cerca de 40% no grupo de colostomia e cerca de 10% no grupo colotomy. A maioria das mortes ocorrem durante a primeira semana pós-operatória (61% no grupo experimental, 66% no grupo sham). Causas de morte são mostradas na Figura 3.

Colostomia distal em camundongos resulta no desenvolvimento de colite linfocítica predominantemente reproduzindo as características histológicas de marca da DC humana. Estas alterações aumentam com a duração de exclusão intestinal. Comprimento da cripta é significativamente reduzido em segmentos excluídos do intestino. Este encurtamento atinge a significância estatística após 14 dias de desvio fecal (Figura 3a). O comprimento da cripta cálice célula-rolamento é reduzido após 30 dias em segmentos excluídos do intestino (Figura 3b). Números de célula absoluta do cálice são também significativamente reduzidos em criptas no segmento intestinal excluído após 14 dias de pós-operatório (Figura 3C). A lesão de marca da DC, o desenvolvimento de folículos linfoides na mucosa, requer uma maior duração do desvio de fezes. Apesar de um aumento do número de folículos linfoides pode ser observado logo em duas semanas, as diferenças se tornam significativas depois de dois meses (figuras 5a-c). Todas as alterações histopatológicas descritas antes são mais acentuadas na distal do que nas regiões proximais dos segmentos excluídos do intestino. Um infiltrado neutrofílico típico como um sinal de inflamação aguda geralmente não é observado (figuras 5 d-e).

Como um sinal de uma repercussão sistêmica de inflamação intestinal local, contagens dos neutrófilos são aumentou significativamente em animais de colostomia logo em 14 dias após a cirurgia. Esta diferença é mantida até o final do período de observação (60 dias). Contagens de plaquetas são aumentou ligeiramente em animais com desvio do cólon após 60 dias (Figura 6). Hematócrito e hemoglobina são reduzidos a 14 dias após a operação no grupo de colostomia em relação ao grupo de Souza.

Ficou demonstrado que deficiência de vitamina em causas de roedores reduzido volume corpuscular médio (MCH) e significa valores de hemoglobina corpuscular médio (MCV)7. Em nosso modelo, vemos iniciais aumentos em ambos estes parâmetros após 14 e 30 dias. Tanto MCV e MCH retornam aos valores normais após longo acompanhamento (Figura 7). Isto mostra que a colostomia distal não resulta em deficiência vitamínica clinicamente significativa durante o seguimento a longo prazo.

Figure 1
Figura 1: Anatomia da região cecal e o procedimento cirúrgico. (a) gráfica representação da anatomia no pós-operatório. (b) topografia do cecal pol e pontos anatômicos. (c) gráfico representação das aberturas da colostomia. Figura 1a foi modificado de Kleinwort et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: desenvolvimento do peso do corpo. Peso de corpo é mostrado como porcentagem do peso do corpo no pré-operatório. O corpo de peso curvas de colostomia e sham (colotomy) animais revelam que a perda de peso no pós-operatório inicial foi significativamente maior no grupo de colostomia em relação ao grupo de Souza (p < 0,001). Valores são meios ± erros-padrão da média entre 21 a 26 animais por grupo (21 animais receberam colostomias; 26 animais estavam no grupo sham). Esta figura foi modificada de Kleinwort et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: causas de morte. São representadas como porcentagens de mortalidade e complicações são ilustradas em um gráfico de pizza (colostomia (um) grupo, grupo b Souza). Complicações pós-operatórias foram determinadas pela necropsia. Síndrome de emaciação foi definido como a perda de peso contínua superior a 33% do peso corporal inicial e sem outros achados na necropsia. Íleo e fuga anastomótica foram diagnosticados na necropsia. Complicações do estoma foram definidas como abcessos peristomal e separações mucocutâneas. Outras complicações composta por deiscência de ferida da laparotomia, isquemia do ceco, e casos não está claro na necropsia. Diferenças significativas na distribuição de complicações pós-operatórias foram vistas entre os grupos (p = 0.021, analisados utilizando o teste exato de Fisher para análise de dois lados de tabelas de contingência até 6 × 6). Havia 39 animais no grupo de colostomia e 29 no grupo sham. Esta figura foi modificada de Kleinwort et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: população de comprimento e célula de cálice de cripta. Números de comprimento e cálice célula cripta foram determinados utilizando cortes de parafina do reto após coloração ácido periódico-Schiff. (a) comprimento cripta foi diminuiu significativamente no reto dos animais com colite de diversão (DC). (b) o comprimento da região de célula cálice-rolamento da cripta foi medido e definido como uma relação para o comprimento total da cripta. Trinta e sessenta dias no pós-operatório, a percentagem de células de goblet cripta-comprimento-rolamento foi diminuída no grupo DC. (c) Taça celulares foram significativamente reduzidos em animais de DC em relação ao grupo de Souza. Gráficos em (a) a (c) mostram meios e erros-padrão através de 5 a 9 animais por grupo (dias de colostomia 14 e 30, sham 14 dias: n = 8; colostomia 60 dias: n = 5; sham a 30 e 60 dias: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Esta figura foi modificada de Kleinwort et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: folículos linfoides e infiltrados inflamatórios. (a) linfoides folículos dos cólons desviadas e animais de Souza foram contados em cortes de parafina do reto corados com hematoxilina e eosina. O gráfico mostra meios e erros-padrão entre 5 a 9 animais por grupo (dias de colostomia 14 e 30, sham 14 dias: n = 8; colostomia 60 dias: n = 5; 30 e 60 dias de controle: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. (b) e (c) representante exemplos de seções do reto de colostomia (b) e Souza (c) os animais 60 dias no pós-operatório corados com hematoxilina e eosina. Um proeminente folículo linfoide (∗) esteve presente na mucosa de um rato de colostomia. Barras de escala representam 100 µm. (d) e (e) coloração com Cloracetato reação de esterase em cortes de parafina foi realizada para detectar granulócitos neutrófilos. Em secções transversais do reto desviado, infiltrado neutrofílico inflamatório agudo foi observado no grupo de colostomia (d), nem em animais de Souza (e) até 60 dias no pós-operatório. Barras de escala representam 100 µm. Esta figura foi modificada de Kleinwort et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: contagens de neutrófilos e plaquetas. Contagens de sangue de amostras de sangue venoso foram determinadas por um analisador de hematologia veterinária. (a) neutrófilos contagens foram aumentou significativamente no grupo de colostomia em comparação com animais Souza até 60 dias no pós-operatório. (b) contagem de plaquetas foram ligeiramente elevada no grupo de colostomia 60 dias no pós-operatório. O gráfico mostra meios e erros-padrão entre 5 a 9 animais por grupo (dias de colostomia 14 e 30, sham 14 dias: n = 8; colostomia 60 dias: n = 5; sham a 30 e 60 dias: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: parâmetros de células vermelhas do sangue. Contagens de sangue de amostras de sangue venoso foram determinadas por um analisador de hematologia veterinária. (a) hemoglobina e hematócrito (b) foram significativamente menores no grupo de colostomia, comparado ao grupo de Souza. (c) volume corpuscular médio (MCH) foi significativamente elevado 14 e 30 dias no pós-operatório, no grupo de colostomia em comparação com o grupo farsa mas voltou ao normal após 60 dias. (d) significa valores de hemoglobina corpuscular médio (MCV) eram elevados após 30 dias, mas já não depois de 60 dias no pós-operatório, no grupo de colostomia comparado ao sham a animais. O gráfico mostra meios e erros-padrão entre 5 a 9 animais por grupo (dias de colostomia 14 e 30, sham 14 dias: n = 8; colostomia 60 dias: n = 5; sham a 30 e 60 dias: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O modelo murino de DC apresentado neste protocolo confiável reproduz as características histopatológicas de DC humana (por exemplo, de novo desenvolvimento de folículos linfoides da submucosa de segmentos intestinais inflamados, cripta encurtamento e reduções em número de células de Goblet). Além desta vantagem, este modelo é induzido por um fator desencadeante muito semelhante e apresenta-se com um curso clínico de moderada a leve gravidade como é o caso em humanos mais afetados.

Para obter resultados reprodutíveis e letalidade aceitável perioperatória, alguma prática em técnicas microcirúrgicos é necessária. No entanto, tanto da colostomia e sham operação (colotomy) pode ser executada com mortalidade perioperatória muito baixa (< 10%). Algumas etapas operacionais são de grande importância: 1) identificar positivamente o íleo cólon e terminal. Em casos onde não está claro a anatomia da região ileocecal, cólon pode ser identificado pela presença de fezes formadas e íleo terminal pela presença de Peyer. 2) quando exteriorizing o loop de colostomia, assegurar que o mesentério não está contorcido, evitando Isquemia mesentérica e íleo mecânico. 3) quando perfurando o mesentério com o tubo flexível, assegurar-se de que um sector isento de navio é escolhido, evitando Isquemia mesentérica e sangramento. 4) ao criar a pequena incisão na parede abdominal, verificar hemostasia suficiente. Se necessário, use thermo-coagulação para parar o sangramento de vasos do músculo. 5) assegura a Colônica loop é aberto pelo menos em dois terços de sua circunferência e que a parede posterior é suficientemente exteriorizada, garantindo assim o bloqueio completo da passagem de fezes para os segmentos de intestino distal. 6) assegurar que ambas as extremidades da colostomia são bem fixadas à pele para evitar uma passagem aberta para a cavidade peritoneal, resultando em maiores riscos de infecção ou um íleo mecânico porque o fluxo fecal não pode sair. Normalmente, todos os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sem lupas ou microscópios cirúrgicos. Em geral, a utilização destes dispositivos requer uma formação complementar.

Mesmo quando a complexidade dos procedimentos cirúrgicos é apenas moderada, há muitas questões agente e perioperatório essenciais a ser considerado para finalizar com sucesso a experiência com resultados reprodutíveis.

É essencial para a sobrevivência a longo prazo com uma colostomia permanente que os ratos têm um ceco intacto. Um grupo experimental com colostomia proximal adjacente à válvula ileocecal mostrou uma taxa de mortalidade de 100% na primeira semana pós-operatória devido à perda de peso irreversível (dados não mostrados). Portanto, é de extrema importância para escolher o local da colostomia distal no mínimo 20 mm válvula de Bauhin. Esta observação pode ser devido a fisiologia da digestão de roedor. Transporte retrógrado do cólon proximal ao ceco ocorre nestas espécies. O ceco é onde a síntese de nutrientes por occurs8 a microflora bacteriana. MCV normal e MCH valores durante o seguimento a longo prazo indicam que animais com colostomia distal não sofrem de deficiências de vitaminas importantes. Além disso, a coprofagia é uma parte essencial do comportamento nutricional de roedores em seus ambientes naturais. Ao estabelecer o modelo, estávamos muito preocupados que distorçer a coprofagia em consequência da presença de uma colostomia permanente pode resultar em deficiências nutricionais, (por exemplo, vitamina B). No entanto, apesar de ser um problema em condições onde o acesso aos nutrientes é limitado, anteriormente mostrou que coprofagia perde sua importância nutricional nas condições experimentais com livre excesso de água e alimento nutricionalmente equilibrada9 . Nas nossas condições experimentais, é vital para otimizar as condições de ingestão nutricional pós-operatório. Usamos ração animal que tinha um teor elevado de proteínas, otimizado qualidade de proteína e aumento da densidade de energia. Animais foram aclimatados para essa dieta pelo menos duas semanas antes da cirurgia. No pós-operatório, ensopados de água de alimentação foi oferecida ad libidum para facilitar alimentar e ingestão de líquidos.

É fundamental utilizar ratos do mesmo sexo em ambos os grupos, experimentais e sham. Sexo foi mostrado para afetar significativamente o curso não só de inflamação sistêmica, mas também de inflamação intestinal em colite induzida quimicamente vários modelos10,11,12. Em geral, animais machos irão desenvolver a doença mais pronunciada com inflamação maior, mais dano de cripta, menos regeneração, níveis mais elevados de citocinas pró-inflamatórias e recuperações mais lentas de perda de peso10. Uma vantagem adicional do uso de animais machos é melhores pesos de idade correspondente corpo pré-operatória, levando a melhor compensação do período de perda de peso inicial de pós-operatório. No entanto, ratos fêmeas podem ser usados no protocolo se específicas perguntas (por exemplo, a influência dos hormônios sobre a manifestação da DC estão a tratar de sexo. Usar ratos masculinos requer mais esforço na manutenção de condições de habitação estável. Camundongos machos são mais propensos a interações agressivas, levando a lesões e morte. Camundongos machos vivem em hierarquias estabelecidas com um macho dominante. Uma vez estabelecida a hierarquia no grupo, continuou lutando é menos comum13,14. Por esta razão, formamos os grupos experimentais à chegada dos ratos em nossas instalações animais pelo menos duas semanas antes da cirurgia e mantido estes grupos até experimentos terminaram. Em geral, grupos experimentais de 5 a 7 animais foram mantidos em uma gaiola. Manutenção de condições de alojamento e social estável foi de extrema importância não só para minimizar comportamentos agressivos de animais experimentais. Condições de habitação foram mostradas para influenciar o ganho de peso, bem como parâmetros imunológicos15,16,17.

Susceptibilidade aos modelos de colite induzida quimicamente e geneticamente modificados varia consideravelmente entre estirpes de rato a18,19,20. O presente protocolo foi estabelecido em camundongos C57Bl/6, uma cepa de rato com um fundo genético bem definido e um bem caracterizadas sistema imunológico21,22,23 que mostra intermediário para forte inflamatória resposta no dextran sulfato de sódio-induzida colite modelo20 e é considerado um protótipo de estirpe Th123. O uso de outras tensões do rato pode ser considerado quando atividades de doença mais graves ou um ambiente de Th2 é necessário.

Em resumo, o nosso protocolo constitui uma ferramenta valiosa para avaliar o papel de vários tipos de células imunes, citocinas, quimiocinas e outras moléculas de sinalização na patogénese da DC. Um grande número de modelos de camundongos geneticamente modificados estão disponível com o fundo C57BL/6 e pode ser combinado com o nosso modelo (por exemplo, ratos deficientes de IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine-receptores CXCR5 e CCR7 e esfingosina-1-fosfato receptor 4). A disponibilidade de cepas de congenic do mouse sobre o fundo de C57BL/6 largamente facilitar a transferência de experiências para estabelecer o papel dos tipos de células distintas envolvidos na etiologia da DC. Finalmente, o modelo oferece a oportunidade de avaliar a influência das intervenções locais (por exemplo, modificação do local microbiome e terapia antiinflamatória local) sobre imunidade mucosal em segmentos intestinais afetados e não afetados e sistêmica homeostase imune.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Todos os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Acknowledgments

Nenhum

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics